In Situ Caractérisation des Biofilms MR1 Shewanella oneidensis par SALVI et ToF-SIMS

Chemistry

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Summary

Cet article présente une méthode pour cultiver un biofilm pour in situ de microanalyse ions secondaires de temps de vol pour la cartographie chimique à l’état hydraté, activée par un réacteur de la microfluidique, système d’analyse à l’Interface liquide de vide. La MR de Shewanella oneidensis -1 avec la protéine fluorescente verte a été utilisé comme modèle.

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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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Abstract

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui sont largement étudiées pour comprendre leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leurs rôles en microbiologie environnementale. Cette étude décrit une méthode pour cultiver le biofilm attachement au système pour l’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI) et réaliser in situ une cartographie chimique d’un biofilm vivant par spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS). Ceci est fait par le biais de la mise en culture des bactéries dans le chenal SALVI avec notre configuration spécialisé tant à l’extérieur, ainsi que par le biais de techniques d’imagerie optiques pour détecter la présence de biofilm et l’épaisseur avant l’analyse par ToF-SIMS. Nos résultats montrent les pics caractéristiques du biofilm Shewanella dans son état naturel hydraté, mettant en valeur son environnement de cluster eau localisée, ainsi que les EPS fragments qui sont radicalement différents de même du biofilm déshydraté État. Ces résultats démontrent la capacité de la percée de SALVI qui permet pour l’imagerie de biofilm in situ avec un instrument d’imagerie chimique axée sur le vide.

Introduction

Biofilms bactériens sont associés à la surface des communautés qui ont évolué au fil du temps comme un moyen de défense aux bactéries pour survivre variant des stimuli physiques et mécaniques indésirables, dans lequel les cellules sont capables de fixer et de survivre dans de nombreux environnements possibles. 1 , 2 les Biofilms sont largement étudiées et ont des applications dans de nombreux domaines tels que la biomédecine, de génie biomédical, de l’agriculture et de recherche industrielle et de développement. 1 , 2 comprendre la cartographie chimique de ces communautés microbiennes complexes, y compris leurs auto-produit substances polymériques extracellulaires (EPS) et leur environnement local eau-cluster, est essentiel pour obtenir un précis et détaillé représentation de leurs activités biologiques. 2

Biofilms exister et se développer au sein d’un état fortement hydraté. Cela représente un grand défi en utilisant des techniques d’analyse de surface axée sur le vide comme la spectrométrie de masse à ions secondaires de temps de vol (ToF-SIMS) en raison des difficultés dans l’étude des liquides volatils dans le vide. Ainsi, les techniques d’analyse de surface axée sur le vide sont limitaient presque exclusivement à l’étude des échantillons de biofilm à seulement leur état séché. Toutefois, étudier un biofilm dans son état séché inhibe l’enquête précise de son microenvironnement vrai biologique. Il provoque souvent des changements drastiques à la morphologie de l’intégrité et le biofilm EPS, qui a été démontrée après avoir comparé les résultats spectraux biofilm sec aux études in situ liquide. 3 , 4 cet article présente une solution pour l’étude des biofilms dans leur état naturel hydratée grâce à l’utilisation de notre système d’analyse à l’Interface liquide de vide (SALVI),5,6 un réacteur microfluidique qui contient le liquide sous sa membrane silicium mince de nitrure (NAS) dans un MICROCANAL de polydiméthylsiloxane (PMDS), offrant ainsi un accès direct au faisceau sonde ionique secondaire tout en conservant l’intégrité structurale de la matrice liquide sous vide chambre. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 muté pour exprimer la protéine de fluorescence verte (GFP) a été choisie comme organisme modèle dans cet exemple de procédure de biofilm en raison de sa polyvalence métabolique et l’utilisation commune en microbiologie environnementale et appliquée, qui reposait lourdement sur sa capacité unique pour la réduction de métal et de transfert d’électron extracellulaire. 9 , 10 , 11 en outre, la présence de GFP tolérée pour facile biofilm-épaisseur continue par l’intermédiaire de la microscopie en fluorescence, à l’aide d’un filtre de fluorescéine isothiocyanate (FITC). Nos études antérieures ont montré des preuves de cette bactérie favorisant l’attachement à la fenêtre de péché en l’utilisant dans operando imagerie de fluorescence pour la croissance de biofilm d’une épaisseur de jusqu'à une centaine de micromètres. 4 , 12 alors que cet article discutera seulement la confirmation de la présence de biofilm par microscopie à fluorescence, la SALVI est compatible avec d’autres méthodes d’imagerie optiques comme la Super-résolution imagerie de fluorescence (c.-à-d., structurée illumination microscopie (SIM)9) et confocale microscopie à balayage laser (CLSM) imagerie4). Imagerie optique peut servir à mesurer l’épaisseur du biofilm et obtenir une image 3D de la forme du biofilm, tel qu’il apparaît, confirmant son épaisseur et son attachement à la fenêtre de péché. 9 tandis que GFP a été utilisé dans l’analyse de SIMS, s. oneidensis sans GFP a été utilisé pour la courbe de croissance, comme cette seule mesure requise de la densité optique et ne nécessitait pas de toute imagerie de fluorescence. En général, la différence entre la GFP tag et espèces non balisés dans la courbe de croissance sont insignifiante. En outre, alors que ce protocole utilise S. oneidensis MR-1 GFP comme un organisme modèle pour décrire la procédure, cette procédure est conçue pour une souche bactérienne pouvant être requises pour la culture au sein de SALVI. Bien que, compte tenu des connaissances de la souche bactérienne nécessaire, certaines conditions de croissance tels que temps, température et oxygène environnement peuvent doivent être modifiées pour tenir compte de la souche de la bactérie à utiliser. Pour le milieu de croissance, cette procédure utilise « nanofils » bouillon de medium, trypticase soja (TSB) sans dextrose et gélose trypticase soja (TSA) sans dextrose pour la culture. La composition du milieu « nanofils » a été spécialement formulée pour la croissance et pour la surveillance des prolongements de la membrane et le périplasme S. oneidensis qui semblent prendre la forme de petits fils et la composition du milieu a été établi dans des recherches antérieures. 13 , 14

Notre protocole précédent sur in situ liquide ToF-SIMS a illustré l’avantage que SALVI a à offrir pour l’immobilisation de la protéine et l’attachement pour le péché, mais aussi un protocole détaillé sur la réduction des données et analyse ToF-SIMS. 12 plutôt que de répéter les étapes de réduction de données, ce document servira à plutôt se concentrer sur l’approche unique de mise en place et en cultivant des biofilms dans notre microchannel SALVI, ainsi que les mesures d’imagerie pour détecter la présence de biofilm et épaisseur préalable à l’analyse de ToF-SIMS. Alors que les biofilms ont été jusque-là limités aux séchées uniquement des échantillons au sein de la chambre du vide basé sur des techniques d’analyse surfaces, EPS et biofilm cartographie chimique détaillée des biofilms vivants peut maintenant être obtenue in situ en raison de cette nouvelle capacité.

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Protocol

1. préparation des matériaux

  1. Préparation du tube support
    1. flacons de sérum (un par culture de biofilm et trois par la courbe de croissance)
      Remarque : comme indiqué dans l’introduction, toute croissance moyen approprié de fournir les nutriments nécessaires pour la souche de bactéries d’intérêt peut être utilisé pour cette procédure ; dans ce cas, " nanofils " médias et BST sans milieu de dextrose a été utilisé pour la croissance de S. oneidensis MR-1 GFP. 13
      1. dépôt 20 mL de milieu de culture dans une bouteille de sérum de 70 mL, bouchon le bouchon et la bouteille à sertir. Couvrez le dessus avec un morceau de papier d’aluminium propre stérile.
      2. Autoclave la bouteille avec un cycle de liquide pendant 30 minutes à 121 ° C. Afterward, conservez le flacon de sérum stérilisé à température ambiante.
    2. Tubes de Culture anaérobie
      1. déposer 5 mL de milieu de culture dans un tube à culture anaérobie espace aérien, mettre sur le bouchon et la bouteille à sertir. Couvrez le dessus avec une feuille stérile.
  2. Préparation bulle piège tube
    1. à l’aide d’une aiguille de 22 calibre, soigneusement percer un trou à travers un bouchon de bouteille de sérum.
    2. 20 couper en 1/32 " en polytétrafluoroéthylène (PTFE) tube avec un rasoir tel qu’une extrémité du tronçon de tuyau est pointée.
    3. à l’aide de la pointe, enfiler le tube PTFE à travers le trou dans la partie supérieure du bouchon en caoutchouc. Poussez le tube à travers jusqu'à environ 2 cm à travers le bouchon et couper l’extrémité pointue du tube PTFE avec un rasoir pour avoir une plate fin.
    4. Enlever le piston d’une seringue de 5 mL et monter le bouchon en caoutchouc à l’étape 1.2.3 dans l’extrémité ouverte de la seringue. La fin de 2 cm de tuyau de PTFE est dans le canon de la seringue. Il s’agit du barboteur.
    5. Envelopper le barboteur (le PTFE tube, bouchon en caoutchouc et seringue) fait en étape 1.2.4 une feuille d’aluminium et fixez avec du Ruban autoclave. Autoclave, le paquet de feuilles pour stériliser le tube avec une gravité cycle à 121 ° C pendant 30 min. stocker le paquet de feuilles de scellés à température ambiante jusqu’au moment de l’utiliser à l’étape 2.4.
  3. Courbe de croissance bactérienne
    Remarque : ce protocole utilise S. oneidensis MR-1 GFP comme un organisme modèle pour cultiver le biofilm dans SALVI. Toutefois, cette procédure peut être adaptée pour tenir compte des autres bactéries de plus en plus par voie aérobie ou anaérobie. Selon quelle souche est utilisé, temps de croissance et de l’environnement peuvent devoir être ajustée en conséquence.
    NOTE : stocks de bactérienne congélateur-80 ° C se composait d’un mélange de 1:1 du BST sans dextrose et du glycérol. L’exemple de courbe de croissance illustré à la Figure 1 B a été préparé en utilisant une culture starter du BST avec aucun dextrose, transféré en quantités respectives de 0,2 mL trois fois pour flacons de sérum de 70 mL par 20 mL " nanofils " moyen pour éliminer les traces du BST. Toutefois, ce protocole suppose que seul milieu sera utilisée, et que les transferts ultérieurs ne seront pas conduits, comme cela a été fait avec ces solutions moyennes particuliers pour S. oneidensis. Bien que non décrites dans le présent protocole, des transferts supplémentaires comme ça sont recommandées car au départ du dépôt les bactéries au BST riche aide les cellules congelées à récupérer ; et trois transferts ultérieurs à " nanofils " veille à ce que tous les TSB a disparu et que la dynamique de croissance typique se produisent.
    1. Ensemencer la Culture Starter
      1. enlever le stock de glycérol bactérienne du congélateur-80 ° C et réchauffer le stock avec une main gantée pour décongeler plus rapidement possible. Déplacez ce stock de congélateur à l’armoire de sécurité biologique (BSC).
      2. Au sein de la BSC, utiliser une seringue de 1 mL avec une aiguille de 22G attachée pour transférer 0,1 mL de congélateur étalon dans un tube à culture anaérobie plafonnés et sertie contenant 5 mL de milieu de culture avec aucun dextrose, préparé à l’étape 1.1.2. Éliminer le stock restant de congélateur dans le conteneur à déchets biologique approprié, comme gel nouveau pourrait choquer les cellules.
      3. Incuber la culture starter dans un shaker/incubateur à 30 ° C à 150 rotations par minute (tr/min) et n’oubliez pas de prendre une densité optique à 600 nm (OD 600) lecture lorsqu’il est prêt pour utilisation. Enregistrer l’heure de la croissance et l’OD 600 telle qu’il peut être fait à ce moment-là pour une utilisation ultérieure, telle que les résultats sont reproductibles. À titre d’exemple, cette culture starter était laissée croître pendant 15 h et utilisée à une OD 600 environ 1.0.
    2. Milieu de croissance inoculant
      1. prendre les trois sérum bouteilles préparées à l’étape 1.1.1.2 et la culture de départ établi au 1.3.1.3 et amener les deux à la GCS.
      2. Dans le BSC, en utilisant une seringue stérile 1 mL avec une aiguille de 22G attachée, transfert 0,1 mL de solution de la culture de départ à chacun des flacons sérum, respectivement.
      3. Stériliser le dessus des bouteilles sérum avec 70 % éthanol et recouvrir d’aluminium stérilisé, étiqueter correctement et transférer dans un agitateur orbital dans un incubateur. L’agitateur orbital 150 tr/min et valeur de l’incubateur à 30 ° C. laisser incuber jusqu'à ce que les premières données de 600 OD point est pris, au sein de l’étape 1.3.3.
    3. OD obtenir 600 Points de données
      1. préparer un blanc de déposer 100 µL de stérilisée par filtration distillée désionisée (DI) de l’eau dans une cupule stérile. Envelopper de film plastique paraffine autour du dessus de la cuvette afin que l’eau ne va pas s’encrasser. Conserver à température ambiante. Ce champ avec le spectrophotomètre UV/Vis avant de prendre des points de données pour la courbe de croissance en insérant la cuvette et en appuyant sur utiliser " vide ".
        Remarque : Chaque 48 h un nouveau vide doivent être prêts à éviter des mesures erronnées, comme remplaçant régulièrement un blanc est une bonne pratique.
      2. Pour chaque point de données de 600 OD, retirer les flacons de sérum préparées à l’étape 1.3.2.3 de l’incubateur et le transfert à un GCS stérilisé. Prendre de 0,1 mL de milieu ensemencé de chaque bouteille de sérum et de dépôt en trois marqués séparément des cuves stériles.
      3. Après découpage, insérer la cuvette contenant la culture dans le spectrophotomètre UV visible (UV/Vis) et lire l' OD 600, un à la fois et enregistrer tous les trois lectures pour ce point de temps.
        Remarque : Pour S. oneidensis MR-1, les points de données ont été prises à 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 et 105 h après inoculation. La croissance est terminée lorsque la bactérie a terminé la phase de mort. Ces points devaient être ajustés en conséquence s’il y a manque de connaissances sur le temps de croissance particulier et la tendance des bactéries utilisées dans le présent protocole. S’il y a incertitude quant à la tendance de croissance, les points doivent être des données recueillies plus fréquemment, par exemple, toutes les trois heures pour les 12 premières heures, toutes les six heures pendant les 36 h, à 12 h d’intervalle pour le 100 h suivant et à intervalles de 24 h pour la finale h 124.
      4. à l’aide de l' OD 600 points de données sous l’axe des y et le temps que l’axe des abscisses, graphique une courbe de la moyenne des trois points pris avec des barres d’erreur écart-type pour chaque point de temps à l’aide d’un logiciel graphique. La courbe de croissance de S. oneidensis MR-1 est illustrée à la Figure 1 B dans la section résultats représentatifs.
      5. En utilisant le graphique établi à l’étape 1.3.3.4, déterminer le calendrier de la section de la phase logarithmique de la courbe de croissance. Pour Shewanella, c’est entre 12 et 33 h de croissance ; On peut donc déduire qu’après 24 h de croissance, Shewanella sera dans sa phase logarithmique de croissance, en supposant que la bactérie va être mis en culture en utilisant les mêmes médias et le traitement avant l’utilisation qui a été utilisé pour la courbe de croissance.

2. Cultivant les bactéries

  1. premier jour : inoculer la gélose
    Remarque : cette section de la procédure a été utilisée avec un gel d’agarose plate prendre une unité formant colonie (UFC) à phase logarithmique, au lieu de la culture de départ liquide utilisé pour la courbe de croissance. Cela pourrait supposer que pour reproduire les mêmes conditions de croissance, dû au fait que TSA sans dextrose a été utilisé et par la suite transféré à " nanofils " moyen dans la procédure de courbe de croissance et la TSA a les mêmes ingrédients qui composent le BST.
    1. Enlever GFPbacteria MR-1 S. oneidensis stock de congélateur-80 ° C et la placer dans un seau à glace, placez ce seau à l’intérieur de la BSC stérilisé.
    2. Au sein de la BSC, utiliser une anse à inoculation stérile 1 µL de gratter la surface de l’action de bactéries congelées et d’utiliser la boucle pour T-ensemencer la surface d’une plaque de gel d’agarose.
    3. Après avoir scellé les côtés de la plaque avec le film plastique paraffine, inverser la plaque et le stocker dans une étuve à 30 ° C pendant 24 h, jusqu'à apparaissent des colonies individuelles.
  2. Deuxième journée : inoculer le flacon de sérum
    1. enlever la plaque de l’incubateur et ouverts dans la GCS.
    2. Au sein de la BSC, nettoyer la surface du bouchon en caoutchouc sur une bouteille de sérum préparée à l’étape 1.1.1 avec 70 % d’éthanol dans l’eau distillée.
    3. Sélectionner un CFU individuel dans la gélose et, à l’aide d’une seringue stérile avec un joint 22 aiguille de calibre, déposer assez milieux de croissance pour déloger la colonie de la plaque sans toucher les colonies voisines et mélanger la colonie avec le milieu du bout du l’aiguille.
      NOTE : A seuls colonie doit être sélectionné qui est assez éloigné des autres bactéries de la plaque, telle que moyen peut être déposé sur celui-ci sans toucher les autres colonies.
    4. Extraire à l’aide de la même seringue, le liquide de la surface de la plaque.
    5. Après le tapement des bulles dans la seringue, injecter le liquide dans le flacon de sérum et placer sur un agitateur orbital dans les 30 ° C, fixé à 150 tr/min pendant 24 h.
      NOTE : Les bulles dans la seringue de Tapping sont important afin d’éviter d’introduire plus d’oxygène dans la bouteille de sérum, comme présentant le plus d’oxygène dans la bouteille peut changer les conditions expérimentales et réduire la cohérence entre les temps de croissance pour les bactéries.
  3. Deuxième journée : stérilisation de la Microchannel SALVI
    Remarque : afin de favoriser la stérilité du système de tuyauterie, les étapes qui nécessitent de détacher la seringue de la tubulure et le remplacement avec une nouvelle seringue doivent s’effectuer dans le BSC. Pour ce faire, simplement détacher la seringue de la pompe de seringue en dévissant le titulaire de la seringue métallique et apportent la seringue avec tuyau attaché à un GCS stérile. Quand le système de tuyauterie est mentionné dans les procédures, cela se réfère à la seringue contenant le réservoir de liquid, attaché avec un injecteur polyetheretherketon (PEEK) au tuyau PTFE, attaché à la chambre compte-gouttes, qui a un injecteur de PEEK raccord attaché à la Entrée SALVI tubes, ainsi que le conteneur de sortie que le tube de sortie SALVI est scellé à.
    1. Utiliser un nouvel appareil SALVI et fixer un raccord de PEEK et l’injecteur à une extrémité d’un tube PTFE.
      NOTE : Dispositifs SALVI sont préparés frais pour chaque expérience qui suit la fabrication de dispositifs détaillée sur des recherches antérieures et des brevets. 5 , 6 , 8 , 15
    2. tenir une seringue de 2 mL d’éthanol à 70 % et se connecter pour le montage de coup d’oeil sur le SALVI. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue et fixer la sortie de la SALVI à une bouteille pour eaux usées, laisser la solution eau éthanol DI traversent la SALVI à 20 µL/min pendant 1,5 h.
    3. Take 4 mL de DI stérilisée d’eau dans une seringue et raccorder à l’entrée de la même SALVI. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue, laisser l’eau traversent le SALVI à 20 μL/min pendant au moins 3 h
    4. Dans un BSC, ouvrir le paquet de feuilles préparé à l’étape 1.2.5 et connectez une injection PEEK stérile, raccord à l’extrémité de la seringue de 5 mL et les raccords de PEEK stériles à l’extrémité de la tubulure de TFE. Prendre ~ 3 mL de milieu stérile dans une seringue et fixer le tube de TFE. Inverser la chambre compte-gouttes de 5 mL et, à l’aide d’une seringue stérile, injecter le milieu de croissance dans la chambre compte-gouttes jusqu'à ce qu’il atteigne un volume total de 1 mL.
    5. Connectez l’extrémité de la chambre compte-gouttes de 5 mL seringue à l’entrée de la SALVI.
    6. Prélever 10 mL de milieu de culture dans une seringue stérile et raccorder à l’entrée du tuyau goutte à goutte. Après avoir connecté la seringue d’un pousse-seringue, laisser le milieu parcourent la SALVI à 20 µL/min pendant 12 h (ou pendant la nuit). Utiliser du ruban adhésif pour garantir les éléments suivants. Couvrir le flacon sortie papier ou film plastique paraffine pour minimiser la probabilité de particules de poussière et les organismes qui y figurent pour contaminer le milieu. On trouvera une description détaillée de la façon dont cette configuration devrait ressembler à la Figure 1 A.
      1. Laisser le tuyau goutte à goutte d’être vertical, ce qui signifie que le pousse-seringue doit être placé sur une surface surélevée avec goutte à goutte tube sécurisé avec du ruban adhésif et avec le SALVI fixé sur une surface plane ci-dessous.
      2. Traversent moyen le SALVI pendant 12 h pour s’assurer que toute trace d’éthanol ont été retirés des microcanaux et tuyaux de la SALVI avant d’inoculer avec bactéries.
      3. Pour une protection supplémentaire, garder la chambre de microcanaux SALVI dans une boîte de Pétri stérile, avec les bords coupés pour s’adapter à l’entrée et le tube de sortie. En outre, gardez tape toujours sur la fenêtre pour protéger la membrane de péché et le canal avant l’analyse d’imagerie.
  4. Jour trois : l’Inoculation de la Microchannel SALVI
    1. Retirez le système de tube entier (seringue connecté pour goutte à goutte chambre reliée à SALVI relié à la bouteille pour eaux usées) de la pompe seringue et l’amener à un BSC stérilisé. En outre, retirer le flacon de sérum étape 2.2.5 de l’incubateur et l’amener à la GCS.
    2. Nettoyer la surface du bouchon de bouteille de sérum avec éthanol à 70 % afin d’éviter toute contamination et ensuite utiliser une seringue stérile avec une aiguille stérile 22G pour extraire 4 mL de bactéries de la bouteille.
    3. Détacher la SALVI de la chambre de 5 mL de tuyau goutte à goutte et connecter la seringue avec inoculé directement à l’entrée de la SALVI. Laisser le tuyau goutte à goutte dans un paquet de feuille d’aluminium stérile ou dans la GCS.
    4. Connecter la seringue avec bouteille SALVI et prise de courant à la pompe de seringue pour courir à 20 µL/min pendant 3 h inoculer le canal de la SALVI, afin de permettre plusieurs variations de volume du liquide contenu dans les SALVI.
    5. Après l’inoculation, déconnecter la seringue avec SALVI le pousse-seringue et apportent à la GCS. Après avoir fixé l’entrée de la SALVI à la chambre de goutte à goutte 5 mL de l’étape 2.4.3, prélever 20 mL de milieu de culture dans une seringue stérile et fixer à l’entrée du tuyau goutte à goutte.
    6. Mettre le tuyau attaché à la SALVI des GCS de la seringue et laisser le moyen de passer à travers la tubulure à raison de 2 µL/min pendant six à dix jours, ou jusqu'à ce que l’imagerie de fluorescence (voir étape 3) montre une croissance favorable biofilm visible pour Analyse de ToF-SIMS. Remplissez un milieu frais, comme il s’épuise dans la GCS en remplissant une nouvelle seringue stérile de 10mL de milieu de croissance et en fixant à la SALVI après le milieu de croissance précédente est épuisée.
      Remarque : Après le début de l’inoculation à 2 µL/min, le débit ne doit jamais être augmenté ou diminué, comme changer la vitesse d’écoulement créerait la contrainte de cisaillement dans le chenal et détacher le biofilm. Il est essentiel que ce débit ne doit jamais être changé ; pour préparer ce, ~ 24h avant SIMS, observer le tube étroitement pour s’assurer qu'il n’y a pas de bulles afin qu’il n’y a pas besoin de pousser plus moyen à un rythme plus rapide tout au long de la tubulure.
      1. Eviter bulles dans le microcanaux, comme ils peuvent pousser le biofilm sorti du chenal. Il est important d’être prudent lorsque des bulles dans le bas du tuyau goutte à goutte 5 mL où elle se raccorde au tuyau SALVI. Un milieu frais peut être injecté dans l’extrémité de l’injecteur PEEK pour s’assurer qu’aucun flux d’air ne sera forcé dans la SALVI.

3. Optique d’imagerie du Biofilm dans les microcanaux SALVI

  1. Microscopie de Fluorescence Imaging
    Remarque : l' Shewanella utilisée comme organisme modèle dans le présent protocole est muté pour exprimer la GFP ; par conséquent, il ne nécessite pas la coloration. Si les bactéries exigent une coloration, cela devrait toujours se faire au même débit (p. ex., 2 µL/min) pour éviter le détachement du biofilm. En outre, quand les cellules vont sans la disponibilité des nutriments, ils seront détachera. Par conséquent, si un marquage supplémentaire est nécessaire, la tache doit être injectée au milieu de croissance plutôt que l’eau avant de fournir pour souiller les cellules.
    1. Détacher la SALVI du goutte à goutte tube à l’intérieur de la BSC et fermer le SALVI en vissant les raccords de PEEK pour serrez l’union PEEK.
    2. Tape le tube de la chambre de microcanaux SALVI solidement sur une lame de verre, telle que la fenêtre est complètement plat et orienté vers le haut. Retirez la pellicule protectrice de la fenêtre. Fixez la lame sur la scène du microscope en plaçant la lame de verre entre les mâchoires de phase sur la plate-forme.
    3. Plus bas la scène du microscope telle que la partie supérieure de la SALVI est positionnée assez proche de l’extrémité de l’objectif 10 X, où réglage du focus ne causera pas l’objectif de toucher la fenêtre.
    4. Interrupteur sur le rétro-éclairage et de trouver le canal à l’aide de la 10 x objectif de microscope en ajustant la mise au point. Pour l’instant, assurez-vous que la présence de l’attachement des bactéries à la fenêtre de péché de la SALVI est apparente par rapport à la fenêtre d’un canal de contrôle avec aucune des bactéries inoculées. Pour l’imagerie plus près des cellules, basculez vers l’objectif 20 x. Par rapport à un canal vide de SALVI, la présence de bactéries, attaché à la fenêtre doit avoir une forte fluorescence verte.
    5. Désactiver le rétro-éclairage et allumez la source de mercure microscope. Attendre 2-3 min et passer au filtre FITC situé sur le microscope à vue et capture des images du biofilm attaché à la fenêtre. À titre d’exemple de ce que le biofilm ayant subi une maturation va ressembler une fois prêt, voir Figure 1 C.
    6. Tour de la source de mercure et détacher la SALVI de la diapositive. Si nécessaire, joindre au 2 µL/min Débit moyen une fois de plus pour permettre une croissance plus avant encore d’imagerie, ou transférer le SALVI à usage de confinement secondaire pour l’analyse de ToF-SIMS. Ceci est nécessaire si l’épaisseur du biofilm est conclu pour ne pas être assez épais, et plus de temps pour la croissance est nécessaire avant l’analyse par ToF-SIMS. Pour joindre au débit moyen une fois de plus, reportez-vous à l’étape 2.3.6.
      Remarque : Si remis en vertu de l’écoulement moyen, imagerie de fluorescence doit être effectué à nouveau avant l’analyse par ToF-SIMS.
      1. Donner le biofilm croissance moyenne à le nourrir jusqu'à ce que ToF-SIMS peuvent être analysés. Bien que ne pas recommandée, si nécessaire, le SALVI fermée peut être conservé à 4 ° C durant la nuit, mais devrait pouvoir se réchauffer à température ambiante avant de l’insérer à la chambre à vide de la ToF-SIMS. Toutefois, analyser le biofilm immédiatement après détaché de débit moyen pour réduire le biofilm détachement.

4. Acquisition de données de ToF-SIMS

Remarque : cette section sert à une vue d’ensemble et est discutée plus en détail dans notre protocole antérieure décrivant analyse de SIMS liquide de la molécule adsorbée protéine. 12

  1. SALVI installer dans la chambre de Loadlock ToF-SIMS
    Remarque : gants doivent être portés à tout moment lorsque l’appareil SALVI et installation sur la ToF-SIMS stade afin d’éviter des contaminations potentielles au cours de la surface analyse.
    1. SALVI de monter sur scène et fixez-le avec plusieurs vis. Assurez-vous que la fenêtre de péché est plat par serrage de vis réglage et insertion plaquette de silicium morceaux au fond de la chambre de microcanaux PDMS. Retirer la pellicule protectrice de la fenêtre, puis chargez la scène dans la chambre de loadlock ToF-SIMS.
    2. Ouvrir la loadlock ToF-SIMS, organiser et préparer un horizontalement sur la rampe de chargement et fermer la porte de loadlock. Amorcer la pompe à vide et attendre pour s’assurer que ce vide approprié est atteint.
    3. Déplacer la SALVI dans la chambre principale, une fois que le vide est stabilisé à 1 x 10 -7 mbar.
  2. Profondeur de profilage et de Points de données de collecte
    1. trouver le canal microfluidique à l’aide du microscope optique équipé en ToF-SIMS.
    2. Sélectionner le mode positif ou négatif avant l’acquisition de données. Utilisation le 25 keV Bi 3 + du faisceau comme le faisceau d’ions primaires dans toutes les mesures et utiliser le canon à électrons inondation pour neutraliser la surface de charge au cours de toutes les mesures.
    3. Balayage du faisceau de 3 + Bi avec une impulsion de ns 150 largeur sur une zone ronde d’un diamètre de ~ 2 µm avec 64 pixels par 64 pixels de résolution. Après avoir percé à travers la fenêtre de SiN 100 nm, continuer à rechercher un autre 150 s pour recueillir des données de haute intensité pour l’imagerie. Après distancia, comtes augmentera de manière significative dans la profondeur, région de profilage. Après la stabilisation, ceci peut être dénommé la région de haute intensité.
    4. Réduire la largeur d’impulsion de 50 ns pour la collecte de données d’acquérir des spectres avec une meilleure résolution de masse. Continuer cette acquisition pour environ 200 un autre s.
    5. Répétez ces étapes pour recueillir au moins trois résultats positifs et trois points de données négatives.
      Remarque : N’oubliez pas d’espacer les zones distancia, telle que la fenêtre de péché ne cassera pas et fuite dans la chambre du vide du compromis fenêtre intégrité.

5. Analyse de données de ToF-SIMS

  1. masse d’étalonnage à l’aide de logiciel de IonToF
    1. Ouvrez le logiciel d’analyse de ToF-SIMS (mesure Explorer), puis cliquez sur le " profils ", " les spectres " et " image " boutons, respectivement, au profil de profondeur des processus, spectre de m/z et des données image.
    2. Ouvrir les fichiers de données obtenues tout au long de l’acquisition de données de ToF-SIMS.
    3. Sélectionner la profondeur de profilage des données d’intérêt et de reconstruire les spectres selon la série temporelle du profil profondeur.
    4. Presse " F3 " pour ouvrir le " masse de calibrage " fenêtre. Choisissez des pics pour l’étalonnage basé sur des composés chimiques qui sont censées exister dans l’échantillon spécifique.
  2. Pics de sélection de l’intérêt
    1. sélection de pointe étant nécessaire pour l’analyse de l’échantillon, déterminer pics caractéristiques de l’échantillon selon la littérature ou des autres, le cas échéant. Comparer l’intensité des pics d’intérêt dans les spectres de m/z. Si nécessaire, ajouter de nouveaux pics ou supprimer des pics d’interférence dans la liste PIC.
    2. Clic sur un pic, trouver les lignes rouges à la fenêtre en bas à gauche. Déplacer les lignes rouges pour encadrer le sommet entier.
    3. Sélectionner un pic correspondant à la formule chimique dans la fenêtre principale de spectre, puis de cliquer sur le " ajouter pic " bouton au-dessus de la fenêtre. < /Li >
  3. Exporter les données calibrées masse
    1. pour exporter une liste de pointe, dans le " Peak liste " menu, sélectionnez " sauver … " la liste PIC dans le " itmil " format.
    2. D’exporter un profil de profondeur, dans le " profil " fenêtre, cliquez sur le " fichier " menu, puis sélectionnez " exportation ", puis sélectionnez " enregistrer en tant que " un " .txt " fichier.
    3. D’exporter un fichier du spectre de m/z, dans le " Spectra " fenêtre, cliquez sur le " fichier " menu, puis sélectionnez " exportation ", puis sélectionnez " enregistrer en tant que " un " .txt " fichier.
    4. D’exporter un fichier image, dans la " Image " fenêtre, Impr écran et enregistrer le fichier image.

6. ToF-SIMS données traçant et présentation

  1. utiliser un outil graphique pour importer les données.
  2. Faire un tracé à l’aide de m/z comme l’axe des abscisses et le pic intensité comme l’axe des ordonnées pour montrer le spectre reconstitué. Un exemple est donné dans la Figure 2 A.
  3. Combine reconstruit des images bidimensionnelles (2D) de différente m/z et forme une matrice pour afficher chaque mappage d’ion positif ou négatif. Un exemple est donné dans la Figure 2 B.

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Representative Results

Ces résultats représentatifs servent à montrer comment le profil chimique du biofilm ci-joint peut être identifié et interprété, obtenus par le biais de ToF-SIMS. Après traçage des spectres de masse d’acquisition de données de ToF-SIMS, a souligné brièvement dans la section procédures, identification des pics devrait être effectuée afin d’affecter des identités à chaque valeur de m/z respectifs. Ceci est possible grâce à l’analyse documentaire approfondie sur la spectrométrie de masse sur les bactéries et les fragments chimiques spécifiques qui devraient être présents dans les bactéries étudiées, telles que les divers agrégats d’eau, acides gras et des fragments de protéine. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 ces résultats représentatifs ne montrent que les spectres de masse négatives obtenus par le biofilm S. oneidensis MR-1 et un échantillon d’eau de DI. Interprétation des spectres positifs suivre une procédure similaire.

Figure 1 A montre la configuration schématique selon ce protocole, en cultivant un biofilm dans le microcanaux SALVI. En haut à gauche, la seringue est attachée à un pousse-seringue, qui maintient la moyenne s’écoulant à une vitesse constante dans tout le système de tuyauterie de PTFE et à l’intérieur de la microchannel. Le pousse-seringue est placé au-dessus de la chambre compte-gouttes, qui empêche la contamination vers le réservoir moyen d’empêcher les organismes mobiles de la natation en amont en arrière. Le milieu s’écoule du réservoir de chambre de goutte à goutte directement dans le tube PTFE de la SALVI, qui passe par le biais de la microchannel et le tube de sortie à une bouteille scellée prise. Les lignes pointillées point depuis la fenêtre de péché à l’image d’une maturité S. oneidensis cellules MR-1 GFP capturés par microscopie de fluorescence, détaillée à l’étape 3.1. Figure 1 B montre un exemple d’une courbe de croissance établie à l’aide de l’organisme modèle pour ce protocole, S. oneidensis MR-1. Depuis les phases de croissance dans ce graphique, on peut conclure que la phase logarithmique de croissance se produit entre 15-32 h dans ces conditions de culture spécifiques. Informations supplémentaires de ce graphique montrent que 0-15 h est la phase de latence de la croissance, et 33-105 h représente la phase stationnaire de croissance. Figure 1 C est une image acquise avec la microscopie en fluorescence, montrant un exemple d’un biofilm mûri.

Figure 2 A montre les spectres de masse négatives d’un hydraté S. oneidensis MR-1 biofilm dans le chenal de la microfluidique, obtenus par in situ liquide ToF-SIMS. Ce graphique montre un exemple de la comparaison de la gamme sélectionnée de la masse (m/z 100-350) entre le biofilm d’eau S.oneidensis MR-1 et DI, ce dernier a été obtenu comme un système de contrôle. Figure 2 B présente une comparaison des images 2D des pics d’intérêt dans le biofilm MR-1 et de l’eau distillée obtenue par ToF-SIMS. Une fois intéressant les valeurs de m/z peut être identifié par l’étude des spectres de masse, identification potentielle des pics des valeurs de m/z sont correctement attribuées à fragments chimiques, comme pris en charge par l’enquête de littérature et de la bibliothèque de logiciels IonToF SIMS. Pics d’intérêt dans la Figure 2A incluent des agrégats d’eau (m/z 107 (H2O)5OH, 125 (H2O)6OH, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 O) OH8, 179 (H2O)9OH, 197 (H2O)10OH, 215 (H2O)11OH, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH, 269 (H2O)14OH, 287 (H2O)15OH, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH))9, comme dénotée par lignes rouges au-dessus des sommets respectifs, quorum sensing relatifs composés marqueurs biologiques (c.-à-d., m/z 175 C10H92), sous-produits de l’EPS (m/z 123 C2H4PO4-, 159P 2 O8H, 216 Cr2O7, 285 octadecanoethiols, 325 composés polaires, C12 composés polaires)15,16,18et la chaîne d’acide gras fragments (c'est-à-dire m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, acide gras C16 : 0 255 279 325 C21H40O2 , C18H31O2, l’acide linoléique -, 341 surface lipides, 18-MEA, lié par une liaison thioester, acide stéarique C18H35O2, ions de monoacylglyceryls de l’acide palmitique C19H17O6 -). 16 , 19

Étant donné que le biofilm est hydraté, il n’est pas surprenant que certains sommets vus dans l’exemple de biofilm sont similaires à celles retrouvées dans l’eau distillée. Ces pics de cluster eau sont marquées par une ligne rouge au-dessus de chaque pic en Figure 2A, y compris à m/z, 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 et 341 et correspondant à (H2O)5OH (H2O) 6 OH (H2O)7OH (H2O)8OH (H2O)9OH (H2O)10OH (H2 O)11OH (H2O)12OH (H2O)13OH (H2O)14OH (H2O)15OH- (H2O)17OH (H2O)19OH-, respectivement. 9 étant donné que la prévalence de nombreux agrégats d’eau caractéristique dans ce spectre de masse, il en résulte fournit une preuve solide de l’environnement de cluster chimique de l’eau présente dans un biofilm hydraté. En outre, l’eau non cluster associés pics observés dans les deux spectres couramment peuvent être attribuées comme des pics d’interférence, généralement à partir du PDMS, un composant du canal microfluidique. Par exemple, un pic d’interférences connues commune de PDMS est le m/z 137 en mode d’ions négatifs.

En comparant le biofilm SIMS de masse spectres à celui de l’eau distillée, comme illustré à la Figure 2A, certains sommets ne sont pas présents dans l’eau DI, encore qu’ils apparaissent dans le biofilm. Par exemple, le pic à m/z 255 ([CH3(CH2)14COO]-, acide palmitique) est présente à haute intensité dans l’échantillon de biofilm, mais pas du tout dans l’échantillon d’eau de DI. Cela donne à penser que le signaux cOME de dans le biofilm, très probablement le biofilm et/ou ses EPS autoproduite. De nombreux pics intéressants ont été identifiés dans la Figure 2A. Par exemple, EPS associés pics, notamment m/z 123-, trouvé à C2H4PO4-, 159 (P2O8H), 216 (Cr2O7), 285 (octadecanoethiols) et 325 (composés polaires, C 12 les composés polaires). 17 , 18 , 20 pics associés à des acides gras se sont avérées 127 ([C2H3(CH2)3COO]), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, acide palmitique), 279 ([3 CH (CH2)15COO]-, acide linoléique), 341 (lipides de Surface, 18-MEA liés via 317 (C21H33O2) et 325 (C21H40O2) thioester linkage, acide stéarique C18H35O2-, ions de monoacylglyceryls de l’acide palmitique C19H17O6). 16 , 19 Enfin, un signal de détection quinolone signal quorum associés pic de C10H92 a été observée à m/z 175.

Figure 2 B affiche des images 2D de la répartition des quatre différents ions intéressantes entre le biofilm s. oneidensis MR-1 (rangée du haut) et l’eau distillée (rangée du bas). La valeur m/z 107 ((H2O)5OH) montre un cluster eau d’intensité significative au sein des échantillons, la valeur de m/z 175 (C10H92) dépeint un quorum sensing signal connexe, m/z 255 est un acide gras ([CH3(CH2)14COO]-, acide palmitique), et m/z 341 (C21H41O2) peut représenter les deux fragments de lipides et eau grappes en raison de la précision de masse 1 amu. 9 régions plus lumineuses des images 2D indiquent un nombre plus élevé de l’ion moléculaire présent dans l’image. Comme prévu, composé de signaux pour les QS, et lipides ont été bien plus grande quantité dans l’échantillon de biofilm. Alors que le signal pour le pôle de l’eau (m/z 107) a été plus fort dans l’ensemble de l’échantillon de biofilm, il était également présent dans l’échantillon d’eau DI, comme prévu. Enfin, le signal à m/z 341 s’est avéré pour être homogène au sein de l’échantillon de biofilm, mais très faiblement au sein de l’échantillon d’eau de DI. M/z 341 était un pic de cluster de l’eau, c’est aussi représentatif de plusieurs différents acides gras et lipides de surface. 16 sa présence plus forte au sein de l’échantillon de biofilm après que normalisation des données suggère que la présence de fragments de lipides dépasse de loin la présence d’agrégats d’eau.

Figure 1
Figure 1 : Schéma expérimental. (A) affiche le schéma expérimental de la configuration du biofilm telle qu’elle apparaît au sein du laboratoire. Commençant en haut à gauche, le flux moyens de la seringue (1), qui est attachée à la seringue (2), contrôler la vitesse à laquelle se liquide déplace à travers. Les flèches indiquent le sens de circulation dans tout le système. La seringue (1) est connectée via un injecteur de PEEK encastrement (3) au tuyau TFE (4). Moyen traverse une chambre compte-gouttes (5) pour éviter la contamination et finalement se déplace à travers la SALVI (6) au conteneur scellé prise (7). Le pousse-seringue est placé sur une surface surélevée (9) tels que la chambre compte-gouttes (5) peut être perpendiculaire à la surface plane (8) qui le SALVI (6) est placé sur. (B) croissance courbe pour Shewanella oneidensis MR-1 dans un milieu « nanofils ». Temps 0-15 h représente la phase de latence, durée 15-33 h représente la phase logarithmique, temps 33-105 h représente la phase stationnaire et l’heure h 105 ou représente plus la phase de mort. Barres d’erreur représentent déviation standard. (C), une photo d’un biofilm mûri acquis avec la microscopie de fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Comparaisons de ToF-SIMS négatif les spectres de l’hydraté Shewanella oneidensis biofilm et MR-1 moyen dans le microcanaux SALVI. Spectres de masse (A), le m/z SIMS du biofilm Shewanella oneidensis dans un milieu MR-1 et de l’eau distillée. Ce dernier a été utilisé comme témoin. Lignes rouges indiquent les emplacements des pics de cluster eau caractéristique. Comparaison de l’image 2D (B) des pics d’intérêt entre le biofilm et l’eau distillée. De gauche à droite, les images s’afficher un amas d’eau (m/z 107 (H2O)5OH), un signal de détection/hormone quorum (m/z 175, C10H92), un acide gras (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, acide palmitique) et des fragments de lipides/EPS (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2) de la surface. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Après inoculation à la phase logarithmique, il est important de tester le nombre de jours et de la température à laquelle le biofilm devrait croître avant qu’il soit sain et assez épais pour l’imagerie, comme indiqué au point 3.1. Cette procédure couvre spécifiquement cultivant un S. oneidensis MR1 biofilm à température ambiante ; Cependant, des températures ambiantes différentes peuvent influencer le taux de croissance. Par conséquent, il est essentiel d’utiliser l’imagerie optique pour comprendre si le biofilm est prêt avant de procéder à l’analyse de ToF-SIMS. De même, différentes souches de bactéries exigent différentes conditions de croissance et de la longueur pour atteindre une épaisseur souhaitable pour l’analyse. Alors que la courbe de croissance dans la Figure 1 b représente la phase logarithmique 200 des bactéries à 12-32 h, et cela a été utilisé après 24 h tout au long de la procédure, il est important de noter que cette fois ne peut pas être utilisée comme phase logarithmique pour les autres souches de bactéries sans établir la courbe de croissance indépendamment. Alors que la phase logarithmique était entre 12 et 33 h de croissance pour S. oneidensis, 24h a été choisi en raison du fait que c’était dans la partie de la croissance où l’oxygène commence à limiter le taux de croissance de l’organisme, vers la fin de la phase logarithmique. Des expériences ont montré que c’était les cellules de temps a commencé à produire des nanofils, ainsi amorcée à forme biofilms réussie qui pourrait survivre dans un environnement pauvre en oxygène. 3 , 13 par conséquent, du moment qu’il choisi d’utiliser les bactéries au cours de la phase logarithmique devrait être influencée par la recherche expérience et connaissance tirée de la littérature concernant une étude expérimentale de la bactérie étudiée. En outre, une courbe de croissance distincts s’impose pour comprendre la phase logarithmique pour toutes les différentes souches de bactéries qui seront utilisés pour la croissance de biofilm en utilisant cette approche. Le taux de croissance de 2 µL/min était alors calculé comme ne devant pour pas dépasser le taux de croissance maximal de S. oneidensis MR-1 et le temps total a été choisi pour obtenir un biofilm mature qui n’a pas envahi et sujet à détacher. Ces taux peuvent être ajustés en conséquence à la connaissance des différentes bactéries pour être utilisé avec cette configuration.

Certaines limitations à l’utilisation de SALVI pour la croissance de biofilm incluent biofouling dans le canal ainsi que la probabilité de bactéries pour fixer sur les parois planes de la chaîne. Malgré une croissance à un rythme constant, recommandé à 2 µL/min dans ce protocole, encrassement biologique peut encore se produire si le biofilm est autorisé à se développer pendant trop longtemps. Dans un tel cas et sans préavis, le biofilm peut se détacher de la fenêtre et sortez la SALVI à l’endiguement de la sortie. Biofouling peut également se produire par simple ajout de force mécanique (c'est-à-diredéplacer) la SALVI, qui ne peut être évité. Toutefois, cela peut être maîtrisé en affichant l’attachement du biofilm à la fenêtre de péché avant l’analyse par ToF-SIMS sous un microscope optique. Une autre limitation comprend la finesse de la microchannel PDMS qui peut rendre difficile pour certaines bactéries d’attacher. Cependant, ceci peut être changé dans la conception de la SALVI pour accueillir en créant des bords côtes sur le canal, si la fixation de la bactérie est un problème. Enfin, du nombre de cellules peut se faire au lieu de lectures600 OD pour détermination de courbe de croissance. Par exemple, les études ont montré une corrélation directe et cohérente de globules aux lectures de600 OD. 21 c’est pourquoi, OD600 est jugée suffisante pour évaluer la croissance de biofilm.

Limites de cette technique sont rares, comme le SALVI agit essentiellement comme une boîte de Petri qui a beaucoup de polyvalence pour une utilisation dans de nombreuses applications, telles qu’en anaérobiose dans une boîte à gants ou dans n’importe quel chambre environnementale à température contrôlée. Quelques limitations mineures incluent les conditions de salle incontrôlables tels que l’humidité relative, température, placement près du soleil, que l'on peut encore être hébergés pendant, pour les conditions optimales de croissance de chaque bactérie spécifique. En outre, certains de ces défis techniques peuvent être surmontées avec un incubateur avec la température ou de dispositifs de médiation RH dans la configuration du biofilm.

SALVI est une interface compatible vide microfluidiques. Dans cet ouvrage, un canal microfluidique de 200 x 300 µL servait à la culture des biofilms suivis avec SIMS liquides et optique d’imagerie. Liquides présentent un défi technique pour l’étude en utilisant des techniques de base vide, parce qu’ils sont instables et difficiles à conserver dans la phase liquide dans le vide. Ainsi les techniques du vide comme ToF-SIMS ont été traditionnellement réservés aux échantillons seulement secs et cryogéniques. 22 en outre, SALVI peut être utilisé pour divers imagerie et la spectroscopie en utilisant une variété de techniques de microscopie et spectroscopie. 4 , 9 notre groupe s’efforce d’élargir continuellement les diverses applications de SALVI dans l’analyse in situ des liquides et des interfaces solide-liquide. 15 , 23 , 24 notre plus récent effort a effectivement montré bactéries attachement à la membrane du péché. 9 après fixation initiale, un flux continu de milieu au fil du temps a été démontré à cultiver avec succès un biofilm directement sur la fenêtre du péché de le SALVI. Au cours de la ToF-SIMS, le faisceau d’ions primaires est utilisé pour bombarder les orifices de 2 µm de diamètre. Cette dimension est similaire à la longueur de la cellule du biofilm attaché à la fenêtre de péché, offrant ainsi un profil chimique du biofilm dans son microenvironnement naturellement hydratée. C’est très important en raison de la différence de dénomination chimique du biofilm, la présence d’EPS et environnement de cluster eau lorsque l'on compare les biofilms dans son état hydraté avec les échantillons séchés. 9 sans l’utilisation de SALVI, ToF-SIMS pourrait seulement être effectué sur des échantillons secs et cryogéniques, prodiguant cartographie chimique qui ne parvient pas à capturer le profil chimique d’un échantillon à l’état hydraté naturel.

Comme le montre la Figure 1A, il est important de garder la pompe seringue au-dessus du tube d’égouttement afin de permettre le tuyau goutte à goutte à être perpendiculaire à la microchannel SALVI. En outre, les bulles seront moins susceptibles d’être coincé dans le tuyau de l’appareil, si le tube PTFE de sortie (dans la bouteille de sortie) est plus bas que le tuyau d’arrivée (attaché à la chambre compte-gouttes). Une autre étape critique de la culture de bactéries pour la croissance de SALVI doit d’abord obtenir une courbe de croissance de la souche de bactéries particulières qui est utilisée, comme décrit dans l’étape 1.3. Cela peut être fait en obtenant des courbes de croissance avec des mesures de densité optique. Une courbe de croissance, comme illustré à la Figure 1B, est importante pour comprendre la période au cours de laquelle les bactéries se trouve à la phase logarithmique de croissance, quand on peut supposer que les bactéries sont plus sains. Utilisant des bactéries au sein de cette phase de croissance facilite la création d’un micro-environnement biofilm en bonne santé et veille à ce que le biofilm se développera au rythme prévu. Le microcanaux SALVI est stérilisé à température ambiante avec 70 % d’éthanol et de l’eau distillée, car il ne peuvent pas être stérilisés à l’autoclave pour la stérilisation avant de les utiliser avec ToF-SIMS. Cela est dû au fait qu’autoclavage peut endommager la fenêtre de la SALVI et introduire la vapeur d’eau sur le canal. Après plusieurs jours de croissance, le microcanaux doit être vérifiée avec la microscopie de fluorescence pour valider l’attachement des bactéries. On trouvera un exemple dans la Figure 1C, cette image a été prise pour montrer un biofilm mûri. En raison de la voie d’acheminement du milieu, les bactéries plus favorablement attache et pousse le long des bords de la microcanaux, comme cet endroit est où les flux et les forces de cisaillement sont lowest.

En résumé, SALVI est une excellente méthode pour qui à la culture et l’étude des biofilms utilisation in situ une cartographie chimique, car elle permet de fournir le biofilm vivant dans son état naturel hydraté pour le spectromètre de masse d’imagerie axée sur le vide. Cette approche unique peut fournir plus d’informations sur eau cluster microenvironnement d’un biofilm, aussi bien quant à acquérir une meilleure compréhension de ses sous-produits de l’EPS. Cette information pourrait servir à comprendre les activités biologiques de biofilm et peut être utilisée dans diverses applications telles qu’en biomédecine, de génie biomédical, de l’agriculture et de recherche industrielle et de développement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Nous sommes reconnaissants à la Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) la terre et des Sciences biologiques (EBD) mission réalisé laboratoire de recherche et développement (LDRD) Fonds d’amorçage pour la prise en charge. Accès instrumental a été fourni par une proposition d’utilisation générales de W. R. Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL). EMSL est une installation utilisateur scientifique national parrainée par la Office of Biological and Environmental Research (BER) à PPNL. Les auteurs remercient Dr Yuanzhao Ding pour preuve lire le manuscrit et fournir une rétroaction utile. PPNL est exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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