In Situ Karakterisering af Shewanella oneidensis MR1 biofilm af SALVI og ToF-SIMS

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Denne artikel præsenterer en metode til dyrkning af en biofilm for i situ time of flight sekundære ion massespektrometri for kemiske kortlægning i sin hydreret tilstand er aktiveret af et mikrofluid reaktor, System til analyse på grænsefladen flydende vakuum. Shewanella oneidensis hr.-1 med grønne fluorescens protein blev brugt som en model.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, der studeres langt for at forstå deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres roller i miljøet Mikrobiologi. Denne undersøgelse beskriver en metode til at dyrke biofilm vedhæftet fil system til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI) og opnå i situ kemiske kortlægning af en levende biofilm ved time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS). Dette gøres gennem dyrkning af bakterier både uden for og inden for SALVI kanalen med vores specialiserede opsætning samt gennem optiske billeddannelse teknikker til at opdage biofilm tilstedeværelse og tykkelse før ToF-SIMS analyse. Vores resultater viser karakteristiske toppene af Shewanella biofilm i sin naturlige hydreret tilstand, fremhæve ved sin lokaliserede vand klyngemiljø samt EPS-fragmenter, der er drastisk anderledes fra den samme biofilm dehydreret stat. Disse resultater viser gennembrud evne til SALVI, der giver mulighed for i situ biofilm imaging med en vakuum-baserede kemiske imaging instrument.

Introduction

Bakterielle biofilm er overflade-associerede Fællesskaber, som har udviklet sig over tid som et forsvar for bakterier at overleve varierende negative fysiske og mekaniske stimuli, hvori celler er i stand til at vedhæfte og overleve i mange mulige miljøer. 1 , 2 biofilm undersøges langt og har anvendelsesmuligheder inden for mange områder som biomedicin, Biomedicinsk teknik, landbrug, og industriel forskning og udvikling. 1 , 2 forståelse den kemiske kortlægning af disse komplekse mikrobielle samfund, herunder deres egen-producerede ekstracellulære polymere stoffer (EPS) og deres lokale vand-cluster miljø, er afgørende for at få en præcis og detaljeret skildring af deres biologiske aktiviteter. 2

Biofilm eksistere og vokse inden for en meget hydreret tilstand. Dette er en stor udfordring i at bruge vakuum-baserede overflade analyseteknikker såsom time of flight sekundære ion massespektrometri (ToF-SIMS) på grund af vanskeligheden ved at studere flygtige væsker i vakuum. Som et resultat, har vakuum-baserede overflade analyseteknikker været begrænset næsten udelukkende til at studere biofilm prøver på kun deres tørret tilstand. Dog hæmmer at studere en biofilm i tørret tilstand den nøjagtige undersøgelse af dens sande biologiske mikromiljø. Det bevirker ofte drastiske ændringer til EPS-integritet og biofilm morfologi, som er påvist efter sammenligner tør biofilm masse spektrale resultater i situ flydende undersøgelser. 3 , 4 i denne artikel præsenterer en løsning for at studere biofilm inden for deres naturlige hydreret tilstand ved at ansætte brug af vores System til analyse på flydende vakuum Interface (SALVI),5,6 en mikrofluid reaktor der indeholder væske under sin tynde silicon nitride (synd) membran i en microchannel lavet af Polydimethylsiloxan (PMDS), således giver direkte adgang til sekundære ion sonde beam samtidig bibeholde den strukturelle integritet af den flydende matrix i et vakuum kammer. 7 , 8

S. oneidensis hr.-1 muteret for at udtrykke grønne fluorescens protein (NGL) blev valgt som en model organisme for denne biofilm procedure illustration på grund af dens metaboliske alsidighed og fælles brug i miljøet og anvendt mikrobiologi, som var baseret stærkt på sin unikke kapacitet for metal reduktion og ekstracellulære elektron overførsel. 9 , 10 , 11 Derudover tilstedeværelsen af normal god landbrugspraksis tilladt for let løbende biofilm-tykkelse overvågning via Fluorescens mikroskopi, ved hjælp af en fluorescein isothiocyanat (FITC) filter. Vores tidligere undersøgelser har vist tegn på denne bakterier favorisere vedhæftet fil til vinduet synd bruger i operando fluorescens imaging til biofilm vækst til en tykkelse på op til 100 mikrometer. 4 , 12 mens dette papir vil kun diskutere bekræftelse af biofilm's tilstedeværelse gennem Fluorescens mikroskopi, SALVI er kompatibel med andre optiske billeddannelse metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerede belysning mikroskopi (SIM)9) og konfokal laser scanning mikroskopi (CLSM) imaging4). Optiske billeddannelse kan tjene til at måle biofilm tykkelse, og få en 3D-billede af formen af biofilm, som det vises, bekræfter dens tykkelse og dens tilknytning til vinduet synd. 9 mens normal god landbrugspraksis var brugte i SIMS analyse, S. oneidensis uden normal god landbrugspraksis var brugt i vækstkurven, som denne kun kræves måling af ekstinktionen og ikke kræver nogen fluorescerende billeddannelse. Generelt, forskellen mellem normal god landbrugspraksis mærket og umærket arter i vækstkurven er ubetydelig. Derudover, mens denne protokol bruger S. oneidensis hr.-1 NGL som en model organisme til at beskrive proceduren, er denne procedure designet til enhver bakteriel stamme, der kan være behov for dyrkning i SALVI. Selvom får kendskab til bakteriel stammen behov, muligvis nogle vækstbetingelser som tid, temperatur og ilt miljø skal ændres for at imødekomme stammen af bakterier til at blive brugt. For vækstmediet bruger denne procedure "nanowires" medium, tryptic soja bouillon (TSB) uden dextrose og tryptic soja agar (TSA) uden dextrose til dyrkning. Sammensætningen af "nanowires" medium har været specielt formuleret for væksten og for overvågning af udvidelser af membranen og periplasm af S. oneidensis , der synes at tage form af små ledninger, og de mellemstore sammensætning har været etableret i tidligere forskning. 13 , 14

Vores tidligere protokollen om in situ flydende ToF-SIMS har illustreret den fordel, at SALVI har at tilbyde for protein immobilisering og tilknytning til synden, samt en detaljeret protokol om ToF-SIMS analyse og data reduktion. 12 snarere end gentage data reduktion trin, dette papir vil tjene i stedet fokusere på den unikke tilgang af opsætning og dyrke biofilm inden for vores SALVI microchannel samt billedbehandling trin for at registrere biofilm tilstedeværelse og tykkelse forudgående ToF-SIMS analyse. Mens biofilm har tidligere været begrænset til kun tørrede prøver i kammeret af vakuum-baserede overflade analytiske teknikker, kan detaljeret EPS og biofilm kemiske kortlægning af levende biofilm nu fås i situ på grund af denne funktion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af materialer

  1. Forberedelse af Medium slanger
    1. Serum flasker (en nødvendig pr. biofilm kultur og tre nødvendige per vækstkurve)
      Bemærk: som nævnt i indledningen, nogen vækst medium egner sig til at levere de næringsstoffer, der er nødvendige for stammen af bakterier af interesse kan udnyttes til denne procedure; i dette tilfælde, " nanowires " medier og TSB uden dextrose medium blev brugt til vækst af S. oneidensis hr.-1 NGL. 13
      1. depositum 20 mL af vækstmediet i en 70 mL serum flaske, cap proppen og krympe flasken. Cover toppen med et stykke af rene steril aluminiumfolie.
      2. Autoklave flaske med en flydende cyklus for 30 min ved 121 ° C. Afterward, gemme steriliseret serum flaske ved stuetemperatur.
    2. Anaerob kultur rør
      1. indbetale 5 mL af vækstmediet på en anaerob kultur tube med luft headspace, sætte på proppen og krympe flasken. Cover toppen med steril folie.
  2. Forbereder boble fælde slanger
    1. ved hjælp af en 22 gauge kanyle, omhyggeligt punch et hul igennem en serum flaske gummiprop.
    2. Skære 20 i 1/32 " polytetrafluorethylen (PTFE) slanger med en barberkniv sådan at den ene ende af segmentet af slangen er spidse.
    3. Ved hjælp af den spidse ende, tråd PTFE slangen gennem hullet i den øverste del af gummiprop. Skubbe røret indtil ca 2 cm er gennem proppen og skære den spidse ende af PTFE-røret med en skraber til at have en flad slutningen.
    4. Fjerne stemplet en 5 mL sprøjte og passe gummiprop fra trin 1.2.3 ind i den åbne ende af sprøjten. 2 cm enden af PTFE slanger er inden for tønde af sprøjten. Dette er den boble fælde.
    5. Wrap boble fælden (PTFE slanger, gummiprop, og sprøjte) lavet i trin 1.2.4 med aluminiumsfolie og fastgør med autoklave tape. Autoklave folie pakke til at sterilisere slangen med en tyngdekraft cyklus ved 121 ° C i 30 min. gemme den forseglede folie pakke ved stuetemperatur indtil klar til brug i trin 2.4.
  3. Bakteriel vækstkurve
    Bemærk: denne protokol bruger S. oneidensis hr.-1 NGL som en model organisme for voksende biofilm i SALVI. Men denne procedure kan tilpasses andre bakterier vokser aerobt eller anaerobt. Afhængigt af hvilken stamme er brugt, vækst tid og miljø skal muligvis justeres.
    Bemærk:-80 ° C bakteriel fryser bestande bestod af en 1:1 blanding af TSB uden dextrose og glycerol. Vækst kurve eksempel vist i figur 1 B blev udarbejdet ved hjælp af en igangsætter kultur af TSB med ingen dextrose, overføres i respektive 0,2 mL mængder tre gange til 70 mL serum flasker med 20 mL " nanowires " medium at fjerne spor af TSB. Men denne protokol forudsætter, at kun én vækstmediet vil blive anvendt, og at efterfølgende overførsler ikke vil blive gennemført, som det blev gjort med disse særlige medium løsninger for S. oneidensis. Selv om ikke beskrevet i denne protokol, anbefales ekstra overførsler som dette som i første omgang indbetale bakterier til de rige TSB hjælper de frosne celler inddrive; og tre efterfølgende overførsler til " nanowires " sikrer at alle TSB er væk og at typiske vækst dynamics forekommende.
    1. Vaccination Starter kultur
      1. fjernes bakteriel glycerol lager fra-80 ° C fryser og varm bestand med en behandskede hånd at tø så hurtigt som muligt. Flytte denne fryser materiel til den biologiske sikkerhed kabinet (BSC).
      2. Inden for BSC, bruge en 1 mL sprøjte med 22G nål knyttet til at overføre 0,1 mL af fryser lager til et udjævnet og krympede anaerob kultur rør der indeholder 5 mL af vækstmediet med ingen dextrose, forberedt i trin 1.1.2. Disponere over den resterende fryser bestand i den passende biologisk affald container, som indefrysning igen kunne chokere cellerne.
      3. Ruger starter kultur i en shaker/inkubator ved 30 ° C på 150 rotationer pr. minut (rpm) og sørg for at tage en optisk tæthed på 600 nm (OD 600) læsning, når du er klar til brug. Registrere tidspunktet for vækst og OD 600 sådan, at det kan gøres på samme tid for hver efterfølgende anvendelse, sådan at resultaterne er reproducerbare. Som et eksempel, denne starter kultur var lov til at vokse for 15 h og anvendes på en OD 600 af ca 1,0.
    2. Vaccination vækstmediet
      1. tage tre serum flasker forberedt i trin 1.1.1.2, og starter kultur forberedt i 1.3.1.3, og bringe begge til BSC.
      2. Inden for the BSC, med en steril 1 mL sprøjte med 22G nål knyttet, overførsel 0,1 mL af opløsning fra starteren kultur til hver af serum flasker, hhv.
      3. Sterilize toppen af serum flasker med 70% ethanol og dække med steriliseret aluminiumsfolie, etiket korrekt, og overføre til en orbitalryster i en inkubator. Skal den orbitalryster til 150 omdr. / min. og angive rugemaskine til 30 ° C. Incubate indtil de første OD 600 data punkt er taget, inden for trin 1.3.3.
    3. At opnå OD 600 datapunkter
      1. forberede en tom ved at indbetale 100 µL af filter-steriliseret destilleret deioniseret vand (DI) vand i en steril kuvette. Wrap plast paraffin film omkring toppen af kuvette, således at vandet ikke vil være forurenet. Opbevares ved stuetemperatur. Brug dette blank med UV/Vis Spektrofotometer før du tager nogen datapunkter for vækstkurven ved indsættelse i kuvette og trykke på " tomt ".
        Bemærk: Hver 48 h en ny tom skal være parat til at undgå forkert læsning, som regelmæssigt udskiftning af en tom er god praksis.
      2. For hver OD 600 datapunkt, fjerne serum flaskerne tilberedes i trin 1.3.2.3 fra rugemaskinen, og overførsel til en steriliseret BSC. Tage 0,1 mL af det podede medium fra hver serum flaske og indbetaling til tre særskilt mærket sterile kuvetter.
      3. Efter afblænding, Indsæt kuvette med kulturen i den ultraviolette synlige (UV/Vis) Spektrofotometer og læse OD 600 én ad gangen, og registrere alle tre behandlinger for at tidspunkt.
        Bemærk: For S. oneidensis hr.-1, datapunkter blev taget på 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 og 105 h efter podning. Væksten er fuldført, når bakterierne har afsluttet fasen for død. Disse punkter bør justeres, hvis der er mangel på viden om særlige vækst tid og tendens af bakterier anvendes i denne protokol. Hvis der er usikkerhed om vækst tendens, data punkter bør indsamles oftere, for eksempel, alle tre h for de første 12 h, hver seks h for efterfølgende 36 h, 12 h mellemrum det følgende 100 h og med 24-timers intervaller for de endelige 124 h.
      4. Med OD 600 datapunkter som y-aksen og tid som x-aksen, afbilde en kurve af gennemsnittet af de tre punkter taget med standardafvigelse fejllinjer for hvert tidspunkt ved hjælp af en graftegning software. S. oneidensis hr.-1 vækstkurven er vises i figur 1 B i afsnittet repræsentative resultater.
      5. Ved hjælp af grafen forberedt i trin 1.3.3.4, identificere tidsrammen for sektionen log-fase af vækstkurven. For Shewanella er mellem 12 og 33 h vækst; Derfor kan det udledes, at på 24 h af vækst, Shewanella vil være inden for sin log-fase af vækst, under forudsætning af at bakterier vil blive kulturperler ved hjælp af samme media og behandling før brug, der blev brugt til vækstkurven.

2. Dyrkning af bakterier

  1. dag ét: vaccination Agar plade
    Bemærk: denne sektion af proceduren blev brugt med en Agarosen plate at tage én kolonidannende enhed (CFU) på log-fase, i stedet for flydende starter kultur anvendes til vækstkurven. Dette kunne antages for at reproducere de samme vækstbetingelser, skyldes, at TSA uden dextrose blev brugt og senere overført til " nanowires " medium i vækst kurve procedure og TSA har de samme ingredienser, der udgør TSB.
    1. Fjerne S. oneidensis hr.-1 GFPbacteria lager fra-80 ° C fryser og sted i en isspand, placere denne spand inde i steriliseret BSC.
    2. Inden for BSC, bruge en steril 1 µL podning løkke til at skrabe overfladen af frosne bakterier lager og bruge loop til T-stribe overfladen af en Agarosen plade.
    3. Efter forsegling sider af pladen med plast paraffin film, Vend pladen og opbevares i en 30 ° C inkubator i 24 timer, før enkelte kolonier vises.
  2. Dag to: vaccination Serum flaske
    1. fjerne pladen fra rugemaskinen og åbne i BSC.
    2. Inden for BSC, rengøre overfladen af gummiprop på en rede serum flaske fra trin 1.1.1 med 70% ethanol i osmosevand.
    3. Vælg en individuel CFU agar plade og ved hjælp af en steril sprøjte med en vedhæftet 22 gauge kanyle, deponere nok vækst medier for at løsne koloni fra pladen uden at røre nogen nærliggende kolonier og bland kolonien med medium med spidsen af nålen.
      Bemærk: En enkeltvis koloni bør vælges der er langt nok væk fra andre bakterier på pladen, sådan at medium kan deponeres på det uden at røre nogen andre kolonier.
    4. Ved hjælp af den samme sprøjte, udtrække væske fra overfladen af pladen.
    5. Efter aflytning ud bobler i sprøjten, injicere væske i serum flasken og placere på en orbitalryster inden for 30 ° C på 150 rpm for 24 h.
      Bemærk: Trykke boblerne ud af sprøjten er vigtigt for at undgå at indføre mere ilt til serum flasken, som indfører mere ilt at flasken kan ændre forsøgsbetingelser og reducere sammenhængen mellem vækst gange for bakterier.
  3. Dag to: Sterilisation af SALVI Microchannel
    Bemærk: for at fremme sterilitet af ordningen med slanger, trin, der kræver afmontering sprøjten fra slangen og udskiftning med en ny sprøjte bør gøres inden for BSC. For at gøre dette, blot fjern sprøjten fra sprøjten pumpe ved at skrue metal sprøjte indehaveren og bringe sprøjten med slangen er knyttet til en steril BSC. Når slanger system er nævnt i procedurerne, refererer dette til sprøjte indeholdende den flydende reservoir, fastgjort med et polyetheretherketon (PEEK) injektor til PTFE slanger, knyttet til dråbekammeret, som har en PEEK injektor montering knyttet til den SALVI inlet slanger, samt objektbeholderen outlet, der SALVI outlet slangen er beseglet til.
    1. Bruger en ny SALVI enhed og vedhæfte en PEEK montering og injektor til den ene ende af en PTFE slanger.
      Bemærk: SALVI enheder er forberedt friske til hvert eksperiment følgende enhed fabrikation detaljeret i tidligere forskning og patenter. 5 , 6 , 8 , 15
    2. tage 2 mL af 70% ethanol i en sprøjte og tilsluttes PEEK montering på SALVI. Efter tilslutning sprøjten til en sprøjten pumpe og vedhæftes en affald flaske outlet af SALVI, tillade ethanol DI vand løsning til at køre gennem SALVI 20 µL/min. for 1,5 h.
    3. Tager 4 mL steriliseret DI vand ind i en sprøjte og oprette forbindelse til den samme SALVI indfaldende. Efter tilslutning sprøjten til en sprøjten pumpe, så vandet kan løbe igennem SALVI 20 μL/min. for mindst 3 h.
    4. Inden for et BSC, åbne folie pakke forberedt i trin 1.2.5 og forbinde en steril PEEK indsprøjtning montering til slutningen af 5 mL sprøjte og sterile PEEK fittings til slutningen af TFE slangen. Tage ~ 3 mL sterilt medium i en sprøjte og tillægger TFE tube. Invertere dråbekammeret 5 mL og ved hjælp af en steril sprøjte, injicere vækstmediet ind i dråbekammeret indtil den når et volumen paa 1 mL.
    5. Tilslut udgangen af 5 mL sprøjte dråbekammeret til indgang af SALVI.
    6. Tage 10 mL af vækstmediet i en steril sprøjte og oprette forbindelse til indfaldende drop slanger. Efter tilslutning sprøjten til en sprøjten pumpe, tillade medium til at køre gennem SALVI 20 µL/min. til 12 timer (eller natten over). Bruge dobbeltklæbende tape til at sikre disse dele. Dække outlet flasken med folie eller plast paraffin film for at minimere sandsynligheden for støvpartikler og organismer deri for at forurene mediet. En detaljeret skildring af hvordan dette setup skal se kan findes i figur 1 A.
      1. Tillade drop slanger skal være lodret, hvilket betyder, at sprøjten pumpe skal placeres på en ophøjet overflade med drop slanger sikret med tape og SALVI sikret på en flad overflade nedenfor.
      2. Køre medium gennem SALVI til 12 h at sikre, at alle spor af ethanol er blevet fjernet fra microchannel og slanger af SALVI før vaccination med bakterier.
      3. For ekstra beskyttelse, holde SALVI microchannel kammer i en steriliseret petriskål med siderne skåret til at passe ind- og udtag slanger. Derudover holder tape altid på vinduet for at beskytte synd membran og kanal før imaging analyse.
  4. Dag tre: podning af SALVI Microchannel
    1. fjerner hele slangen system (sprøjte tilsluttet til at dryppe kammer tilsluttet SALVI tilsluttet affald flasken) fra sprøjten pumpe og bringe det til en steriliseret BSC. Derudover fjerne serum hætteglasset fra trin 2.2.5 fra rugemaskinen og bringe det til BSC.
    2. Rengør overfladen af serum flaske prop med 70% ethanol til at forhindre enhver forurening, og derefter bruge en steril sprøjte med en vedhæftet steril 22G kanyle til at udtrække 4 mL af bakterier fra flasken.
    3. Frigør SALVI fra 5 mL kammer drop slanger, og forbinde sprøjten med podede medium direkte til fjorden af SALVI. Lader drop slanger en steril aluminium folie pakke eller inden BSC.
    4. Lægger sprøjte med SALVI og outlet flaske på sprøjten pumpe til at køre 20 µL/min. til 3 h til podes kanal af SALVI, at give mulighed for flere volumen forandringer af den væske, der er indeholdt i SALVI.
    5. Efter podning, afbryde sprøjte med SALVI fra sprøjten pumpe og bringe til BSC. Efter vedlægger SALVI indfaldende tilbage til 5 mL dråbekammeret fra trin 2.4.3, tages en steril sprøjte 20 mL af vækstmediet og vedhæfte til drop slanger indfaldende.
    6. Bringe slangen knyttet til SALVI fra BSC til sprøjten pumpe og tillade medium til at passere gennem slangen med en hastighed på 2 µL/min for seks til ti dage, eller indtil fluorescens imaging (drøftet i trin 3) viser gunstige synlige biofilm vækst for ToF-SIMS analyse. Refill frisk medium som det løber ud i BSC ved at udfylde en ny steril sprøjte med 10mL af vækstmediet og knyttet til SALVI efter tidligere vækstmediet er kørt.
      Bemærk: Efter begynder inokulation 2 µL/min., strømningshastigheden bør aldrig forhøjes eller faldt, som skiftende strømningshastigheden ville oprette shear-stress i kanalen og løsrive biofilm. Det er afgørende, at denne strømningshastighed aldrig bør ændres; for at forberede denne, ~ 24 h før SIMS, observere slangen nøje at sørge for der er ingen bobler, så der er ingen grund til at skubbe mere medium i et hurtigere tempo i hele slangen.
      1. Undgå bobler i microchannel, som de kan skubbe biofilm ud af kanalen. Det er vigtigt at være forsigtig med bobler i bunden af 5 mL drop slanger hvor det forbinder til SALVI slangen. Frisk medium kan injiceres i slutningen af PEEK injektor til at sikre, at ingen luft vil blive tvunget til at SALVI.

3. Optiske billeddannelse af Biofilm i SALVI Microchannel

  1. Fluorescens mikroskopi Imaging
    Bemærk: Shewanella anvendes som en model organisme i denne protokol er muteret for at give udtryk for normal god landbrugspraksis, som sådan, det kræver ikke farvning. Hvis bakterier kræver farvning, bør dette altid ske ved den samme flowhastighed (fx, 2 µL/min.) at undgå biofilm detachement. Derudover når celler går uden næringsstoftilgængelighed, vil de frigøre. Derfor, hvis nogen yderligere farvning er påkrævet, pletten bør sprøjtes til vækstmediet snarere end vand før levering for at plette cellerne.
    1. Frigør SALVI fra drop slanger inde BSC og lukke SALVI ved at skrue PEEK fittings at finger-stramme Unionens PEEK.
    2. Tape slangen SALVI microchannel kammerets sikkert på et glas dias, sådan at vinduet er helt flad og vender opad. Fjern den beskyttende tape fra vinduet. Klemme dias til fase af mikroskopet ved at placere glas dias mellem fase klemmer på platformen.
    3. Lavere fase af mikroskopet, så toppen af SALVI er placeret tæt, nok til slutningen af det 10 X mål, hvor justering af fokus ikke vil forårsage linse at røre vinduet.
    4. Switch på baggrundslys og finde kanalen ved hjælp af 10 x mikroskop mål ved at justere fokus. På dette tidspunkt, Sørg for tilstedeværelsen af bakterielle udlæg til vinduet synd i SALVI er tilsyneladende i forhold til vinduet i en kanal med ingen podede bakterier. For tættere billeddannelse af celler, skifte til 20 x mål. I forhold til en tom SALVI kanal, tilstedeværelsen af bakterier knyttet til vinduet bør have en stærk grøn fluorescens.
    5. Slukke baggrundsbelysningen og tænde mikroskopet kviksølv kilde. Vente 2-3 min. og Skift til FITC-filteret sat på mikroskop til at se og tage billeder af biofilm knyttet til vinduet. Som et eksempel på hvad den modne biofilm vil se ud når du er klar, se figur 1 C.
    6. Turn off kviksølv kilde og frigøre SALVI fra diaset. Hvis det er nødvendigt, tillægger 2 µL/min medium flow igen at give mulighed for mere vækst før imaging igen, eller overføre SALVI til sekundære indeslutning brug for ToF-SIMS analyse. Dette er nødvendigt hvis biofilm tykkelse konkluderes at ikke være tyk nok, og mere tid til vækst er nødvendig før ToF-SIMS analyse. Du kan vedhæfte til medium flow igen, se trin 2.3.6.
      Bemærk: Hvis sat tilbage under medium flow, fluorescens imaging skulle blive gjort igen før ToF-SIMS analyse.
      1. Give biofilm vækstmediet at fodre den indtil ToF-SIMS analyse kan gennemføres. Mens anbefales ikke, hvis det er nødvendigt, de lukkede SALVI kan lagres i 4 ° C natten over, men bør være tilladt at varme til stuetemperatur før du indsætter til vakuumkammer ToF-Sims. Men analysere biofilm umiddelbart efter løsrevet fra medium flow til at reducere biofilm detachement.

4. ToF-SIMS dataopsamling

NOTE: dette afsnit tjener som en oversigt, og diskuteres nærmere i vores tidligere protokol beskriver adsorberet protein molekyle flydende SIMS analyse. 12

  1. Installere SALVI i ToF-SIMS Loadlock kammer
    Bemærk: handsker skal bæres på alle gange når håndtering SALVI enhed og installere det på ToF-SIMS fase for at undgå potentielle forureninger under overfladen analyse.
    1. Mount SALVI på scenen og Fastgør det med adskillige skruer. Kontroller, at vinduet synd er flad ved at justere skruen tæthed og indsætte silicium wafer stykker i bunden af PDMS microchannel kammer. Fjern den beskyttende tape fra vinduet og derefter indlæse fase i ToF-SIMS loadlock kammer.
    2. Åbne ToF-SIMS loadlock, hold og sætte scenen vandret på lastning platform, og luk loadlock. Indlede vakuumpumpen og vente med at sikre, at passende vakuum nås.
    3. Flytte SALVI i det vigtigste kammer, når vakuum er stabiliseret til 1 x 10 -7 mbar.
  2. Dybde profilering og indsamling datapunkter
    1. finde den mikrofluid kanal ved hjælp af optisk mikroskop udstyret i ToF-SIMS.
    2. Vælg positive eller negative tilstand før dataopsamling. Brug 25 keV Bi 3 + stråle som den primære ion stråle i alle målinger, og bruge oversvømmelse elektronkanon for at neutralisere overfladen opladning under alle målingerne.
    3. Scan Bi 3 + stråle med 150 ns pulse bredde på en runde område med en diameter på ~ 2 µm med 64 pixels af 64 pixels opløsning. Efter stansning gennem vinduet 100 nm synd, fortsætte med at søge efter en anden 150 s indsamle høj intensitet data til billedbehandling. Efter punch-through, vil tæller stige betydeligt i dybden profilering region. Efter stabilisering, dette kan betegnes som regionen højintensive.
    4. Reducer pulse bredde 50 ns for dataindsamling for at erhverve spektre med bedre masse opløsning. Fortsæt denne erhvervelse for omkring en anden 200 s.
    5. Gentag disse trin for at indsamle mindst tre positive og tre negative datapunkter.
      Bemærk: Sørg for at space punch-gennem områder, således at vinduet synd ikke vil bryde og lække ind i kammeret af vakuum fra kompromitteret vindue integritet.

5. ToF-SIMS dataanalyse

  1. masse kalibrering ved hjælp af IonToF Software
    1. åben den analyse programmel af ToF-SIMS (måling Explorer) og derefter klikke på den " profiler ", " spectra " og " image " knapper, henholdsvis, at processen dybde profil, m/z spektrum og billeddata.
    2. Åben datafilerne fremstillet i hele ToF-SIMS dataopsamling.
    3. Vælg dybden profilering data af interesse og rekonstruere spectra ifølge dybde profil tidsmæssige serien.
    4. Tryk " F3 " at åbne den " masse kalibrering " vindue. Vælg toppe til kalibrering baseret på kemiske forbindelser, som forventes at eksistere i den specifikke prøve.
  2. Toppe af interesse udvalg
    1. peak udvælgelse er nødvendig for analysen, bestemme karakteristiske toppene af prøven efter litteratur eller andre tidligere resultater, hvis nogen. Sammenligne intensiteten af toppene af interesse i m/z spektre. Eventuelt tilføje nye toppe eller slette indblanding toppe på listen peak.
    2. Klik på et højdepunkt, finde de røde streger på den nederste venstre rude. Flytte de røde linjer til at omslutte hele toppen.
    3. Vælg en top, matchende den kemiske formel i vinduet vigtigste spektrum og derefter klikke på den " tilføje peak " knappen ovenfor vinduet. < /Li >
  3. Eksportere masse kalibreret Data
    1. at eksportere en top liste, i den " Peak liste " menu, Vælg " Spar … " listen peak i den " itmil " format.
    2. Til at eksportere en dybde profil, i den " profil " vindue, klik på den " fil " menuen, vælg derefter " eksportere ", og derefter vælge " Gem som " en " .txt " fil.
    3. Til at eksportere en m/z spektrum fil, i den " Spectra " vindue, klik på den " fil " menu, vælg derefter " eksportere ", og vælg derefter " Gem som " en " .txt " fil.
    4. Til at eksportere en billedfil, i den " billedet " vinduet Udskriv skærmbilledet og gemme som billedfilen.

6. ToF-SIMS Data plotte og præsentation

  1. Brug et grafisk værktøj til at importere dataene.
  2. Gøre et plot med m/z som x-aksen og peak intensiteten som y-aksen til at vise den rekonstruerede spektrum. Et eksempel er vist i figur 2 et.
  3. Kombinerer rekonstrueret todimensionale (2D) billeder af forskellige m/z og form en matrix til at vise enten positiv eller negativ ion tilknytning. Et eksempel er vist i figur 2 B.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Disse repræsentative resultater tjene til at vise hvordan den kemiske profil af den vedlagte biofilm kan identificeres og fortolket, som opnås gennem ToF-SIMS. Efter plotte massespektre fra ToF-SIMS dataopsamling, fremhævet kortvarigt i afsnittet procedurer bør peak identifikation gennemføres for at tildele hver respektive m/z værdi identiteter. Dette kan ske gennem omfattende litteraturgennemgang på massespektrometri på bakterier og specifikke kemiske fragmenter, der forventes at være til stede i bakterier studerede, som forskellige vand klynger, fedtsyrer og proteiner fragmenter. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 disse repræsentative resultater kun vise de negative massespektre som fremstillet ved S. oneidensis hr.-1 biofilm og en DI vandprøve. Fortolkning af positive spectra følge en lignende procedure.

Figur 1 A viser skematisk opsætningen efter denne protokol, når dyrke en biofilm i SALVI microchannel. Øverst til venstre, er sprøjten knyttet til en sprøjte pumpen, som holder medium flyder med en konstant hastighed hele PFTE slanger system og inde microchannel. Sprøjten pumpe er placeret over dråbekammeret, som forhindrer baglæns forurening til den mellemstore reservoir til at forhindre motile organismer fra svømning op-stream. Medium løber fra drop kammer reservoir direkte ud PFTE slangen af SALVI, der passerer gennem microchannel og outlet rør til en forseglet outlet flaske. De stiplede linjer peg fra vinduet synd til et billede af en modnet S. oneidensis hr.-1 NGL celler fanget af Fluorescens mikroskopi, detaljerede taktfast 3.1. Figur 1 B viser et eksempel på en vækstkurve oprettet ved hjælp af model organismen for denne protokol, S. oneidensis hr.-1. Fra vækst faser i denne graf, kan det konkluderes, at log-fase af vækst opstår mellem 15-32 h i disse specifikke dyrkning betingelser. Yderligere oplysninger fra denne graf viser, at 0-15 h er den mellemliggende fase af vækst, og 33-105 h repræsenterer den stationære fase af vækst. Figur 1 C er et billede, der er erhvervet med Fluorescens mikroskopi viser et eksempel på en modnet biofilm.

Figur 2 A viser de negative massespektre af en hydreret S. oneidensis hr.-1 biofilm inden for mikrofluid kanalen, som fremkommer ved i situ væske ToF-SIMS. Denne graf viser et eksempel på den valgte masseinterval (m/z 100-350) sammenligning mellem biofilm S.oneidensis hr.-1 og DI vand, sidstnævnte var fremstillet som en systemkontrol. Figur 2 B viser en sammenligning af 2D billeder af toppene af interesse for hr.-1 biofilm og DI vand fremstillet ved ToF-SIMS. Når interessant m/z-værdier kan identificeres fra studerer de massespektre, potentielle peak identifikation af m/z-værdier er korrekt tilskrives kemiske fragmenter, som understøttes af IonToF SIMS software bibliotek og litteratur undersøgelsen. Toppene af interesse i figur 2A omfatter vand klynger (dvs. m/z 107 (H2O)5OH-, 125 (H2O)6OH-, 143 (H2O)7OH-, 161 (Hansen2 O)8OH-, 179 (H2O)9OH-, 197 (H2O)10OH-, 215 (H2O)11OH-, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH-, 269 (H2O)14OH-, 287 (H2O)15OH-, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH-))9, som angivet ved røde linjer over respektive toppe, quorum sensing relaterede forbindelser biomarkører (dvs. m/z 175 C10H92-), EPS biprodukter (m/z 123 C2H4PO4-, 159 Pedersen 2 O8H-, 216 Cr2O7-, 285 octadecanoethiols, 325 polære forbindelser, C12 Polar forbindelser)15,16,18, og fedtsyre kæde fragmenter (dvs. m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, 255 C16:0 fatty syre, 279 linolsyre, C18H31O2-, 325 C21H40O2 -, 341 overflade lipider, 18-MEA bundet gennem thioester Hejseværk, stearinsyre C18H35O2-, ioner af monoacylglyceryls af palmitinsyre C19H17O6 -). 16 , 19

Da biofilm er hydreret, er det ikke overraskende, at nogle toppe ses i eksemplet biofilm svarende til dem fundet i vand fra DI. Disse vand-klynge toppe er markeret med en rød streg over hver top i figur 2A, herunder m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, og 341 og tilsvarende for (H2O)5OH- (H2O) 6 ÅH- (H2O)7OH- (H2O)8OH- (H2O)9OH- (H2O)10OH- (H2 O)11OH- (H2O)12OH- (H2O)13OH- (H2O)14OH- (H2O)15OH- (H2O)17OH- (H2O)19OH-, henholdsvis. 9 der er forekomsten af mange karakteristiske vand klynger i denne masse spektrum, denne resultater giver en stærk tegn på kemiske vand klynge miljøet findes i en hydreret biofilm. Derudover relateret ikke vand klynge toppe observeret i begge spektre kan almindeligvis tilskrives som indblanding toppe, typisk fra PDMS, en del af mikrofluid kanalen. Eksempelvis er én fælles kendt indblanding peak fra PDMS m/z 137 i negative ion mode.

Når sammenligne biofilm SIMS masse spectra til DI vand, som vist i figur 2A, nogle toppe er ikke til stede i DI vand, men de vises i biofilm. For eksempel, peak på m/z 255 ([CH3(CH2)14COO]-, palmitinsyre) er til stede ved høj intensitet i eksemplet biofilm, men slet ikke i DI vandprøve. Dette tyder på, at signaler cogle af biofilm, mest sandsynligt biofilm og/eller dets selvstændige genereret EPS. Mange interessante toppe blev identificeret i figur 2A. For eksempel EPS relateret toppe omfatter m/z 123-, anset for at være C2H4PO4-, 159 (P2O8H-), 216 (Cr2O7-), 285 (octadecanoethiols) og 325 (polære forbindelser, C 12 Polar forbindelser). 17 , 18 , 20 toppe er forbundet med fedtsyrer fandtes for at være 127 ([C2H3(CH2)3COO]-), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, palmitinsyre), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, linolsyre), 317 (C21H33O2-), 325 (C21H40O2-) og 341 (overflade lipider, 18-MEA bundet gennem thioester kobling, stearinsyre C18H35O2-, ioner af monoacylglyceryls af palmitinsyre C19H17O6-). 16 , 19 endelig et quinolon signal quorum sensing signal relateret peak af C10H92- blev observeret på m/z 175.

Figur 2 B viser 2D billeder af fordelingen af fire forskellige interessante ioner mellem S. oneidensis hr.-1 biofilm (øverste række) og DI vand (nederste række). Værdien m/z 107 ((H2O)5OH-) viser en vand klynge af betydelig intensitet inden for prøver, m/z-værdi 175 (C10H92-) skildrer en quorum sensing relaterede signal, m/z 255 er en fedtsyre ([CH3(CH2)14COO]-, palmitinsyre), og m/z 341 (C21H41O2-) kan repræsentere begge lipid fragmenter og vand klynger på grund af 1 amu masse nøjagtighed. 9 lysere områder af de 2D billeder viser et højere antal molekylarionen stede i billedet. Som forventet, signaler for QS sammensatte, og lipider var langt større i antal i eksemplet biofilm. Mens signal for vand-klynge (m/z 107) var stærkere i hele biofilm prøven, var det også til stede i vandprøve DI som forventet. Endelig blev signal på m/z 341 fundet for at være homogene inden for eksemplet biofilm, men meget svagt inden for DI vandprøve. Mens m/z 341 var en vand klynge peak, var det også repræsentant for flere forskellige fedtsyrer og overflade lipider. 16 sin stærkere tilstedeværelse inden for biofilm prøven efter normalisering af data tyder på, at tilstedeværelsen af lipid fragmenter langt opvejer tilstedeværelsen af vand klynger.

Figure 1
Figur 1 : Eksperimenterende skematisk. (A) viser den eksperimentelle skematisk af biofilm setup som det vises i laboratoriet. Start øverst til venstre, mellemstore strømme fra sprøjten (1), som er knyttet til sprøjten pumpe (2), kontrollere hastigheden, som flydende bevæger sig gennem. Pilene angiver strømningsretning i hele systemet. I sprøjten (1) er tilsluttet via en PEEK injektor montering (3) til TFE slange (4). Medium løber gennem en dråbekammeret (5) at undgå kontaminering, og til sidst bevæger sig gennem SALVI (6) til objektbeholderen forseglet outlet (7). Sprøjten pumpe er placeret på en ophøjet overflade (9) sådan at dråbekammeret (5) kan være vinkelret på den flade del (8) der SALVI (6) er placeret på. (B) vækst kurve for Shewanella oneidensis hr.-1 i "nanowires" medium. Tid 0-15 h repræsenterer mellemliggende fase, 15-33 h repræsenterer log fase, tid 33-105 h repræsenterer stationær fase og tid 105 h eller længere repræsenterer død fase. Fejllinjer udgør standardafvigelse. (C) en billede af en modnet biofilm erhvervet med Fluorescens mikroskopi. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Sammenligninger af ToF-SIMS negative spektre af den hydreret Shewanella oneidensis biofilm og hr.-1 medium i SALVI microchannel. (A) m/z SIMS massespektre af Shewanella oneidensis biofilm i hr.-1 medium og Deioniseret vand. Sidstnævnte blev brugt som et kontrolelement. Røde linjer angiver placeringer af karakteristiske vand klynge toppe. (B) 2D billede sammenligning af toppene af interesse mellem biofilm og Deioniseret vand. Fra venstre mod højre, billederne viser en vand klynge (m/z 107 (H2O)5OH-), et quorum sensing/hormon signal (m/z 175, C10H92-), en fedtsyre (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, palmitinsyre), og overfladen lipider/EPS fragmenter (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2-). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Efter vaccination på log-fase, er det vigtigt at teste antallet dage og temperatur hvor biofilm bør vokse, før det er sundt og tyk nok for billeddannelse, som beskrevet i trin 3.1. Denne procedure omfatter specifikt dyrkning en S. oneidensis MR1 biofilm ved stuetemperatur; dog kan forskellige rumtemperaturer påvirke væksten. Derfor er det kritisk at bruge optisk imaging til at forstå om biofilm er klar, før du fortsætter til ToF-SIMS analyse. Forskellige stammer af bakterier kræver ligeledes forskellige vækstbetingelser og længde for at opnå en ønskværdig tykkelse for analyse. Mens vækstkurve i figur 1b skildrer log fase 200 af bakterier til at blive 12-32 h, og dette blev anvendt på 24 h gennem hele proceduren, er det vigtigt at bemærke, at denne gang ikke kan bruges som log-fase for andre stammer af bakterier uden oprettelse af vækstkurven uafhængigt af hinanden. Mens log fasen var mellem 12 og 33 h af vækst for S. oneidensis, blev 24 h valgt at det var i del af vækst, hvor ilt var begyndt at begrænse væksten af organismen, mod slutningen af log-fase. Eksperimenter viste, at dette var gang cellerne begyndte at producere nanowires, dermed primet til form vellykket biofilm, der kunne overleve i lav ilt miljøer. 3 , 13 derfor, den tid valgt at anvende bakterier i log fase bør være påvirket af forskning erfaring og viden opnået fra litteratur på eksperimentel undersøgelse af bakterierne ved at blive undersøgt. Derudover fastsættes et separat vækstkurven til at forstå log-fasen for alle forskellige stammer af bakterier, der vil blive brugt til biofilm vækst ved hjælp af denne fremgangsmåde. Vækstrate på 2 µL/min. var beregnet så som ikke for at overskride den maksimale vækst af S. oneidensis hr.-1, og den samlede tid blev valgt til at få en ældre biofilm, der ikke var tilgroet og tilbøjelige til at afmonterer. Disse satser kan blive justeret i overensstemmelse hermed at viden om forskellige bakterier skal bruges med denne installation.

Nogle begrænsninger at bruge SALVI til biofilm vækst omfatter biofouling inden for kanalen samt sandsynligheden for bakterier at tillægge de flade vægge af kanalen. Trods vækst med en konstant hastighed, anbefales at være 2 µL/min i denne protokol, kan biofouling stadig forekomme, hvis biofilm er lov til at vokse for længe. I så fald og uden advarsel, kan biofilm løsne sig fra vinduet og udgang SALVI til outlet indeslutning. Biofouling kan også opstå blot ved at tilføje mekanisk kraft (dvs.flytte) SALVI, som ikke kan undgås. Dette kan dog holdes i skak ved at få vist den vedhæftede fil af biofilm til vinduet synd før ToF-SIMS analyse under et lysmikroskop. En anden begrænsning omfatter glathed af PDMS microchannel, som kan gøre det vanskeligt for nogle bakterier til at vedhæfte. Dette kan dog ændres i udformningen af SALVI at imødekomme ved at oprette ribbede kanter til kanal, hvis udlæg af bakterier er et problem. Endelig, celletal kan gøres i stedet for OD600 aflæsninger for vækst kurve bestemmelse. For eksempel, har undersøgelser vist direkte og konsekvent korrelation af celletal til OD600 aflæsninger. 21 derfor, OD600 anses for tilstrækkelig ved bedømmelsen af biofilm vækst.

Begrænsninger til denne teknik er få, som SALVI hovedsagelig fungerer som en kultur fad, som har meget alsidighed til brug i mange applikationer, såsom anaerobt en handske boks, eller inden for enhver temperatur-kontrolleret miljø kammer. Nogle mindre begrænsninger omfatter ukontrollabel lokaleforhold som relativ luftfugtighed, temperatur, placering i nærheden af sollys, som er stadig muligt at blive indkvarteret for, for hver specifikke bakterier optimale vækstbetingelser. Desuden, kan nogle af disse tekniske udfordringer overvindes med en inkubator med temperatur eller RH mægling funktioner i opsætningen af biofilm.

SALVI er et vakuum-kompatible mikrofluid interface. I dette arbejde, blev en 200 x 300 µL mikrofluid channel brugt til kultur biofilm efterfulgt med optisk og flydende SIMS imaging. Væsker udgør en teknisk udfordring at studere ved hjælp af vakuum baseret teknikker, fordi de er flygtige og svære at fastholde i den flydende fase i vakuum. Således har vakuum teknikker såsom ToF-SIMS været traditionelt begrænset til kun tør og kryogene prøver. 22 desuden SALVI kan bruges til forskellige billeddannelse og spektroskopi ved hjælp af en række teknikker til mikroskopi og spektroskopi. 4 , 9 vores gruppe har arbejdet for at løbende udvide forskellige SALVI applikationer i i situ analyse af flydende og fast-flydende grænseflader. 15 , 23 , 24 vores seneste indsats har effektivt vist bakterier tilknytning til synd membran. 9 efter indledende udlæg, kontinuerlig medium over tid har vist sig at kunne dyrke en biofilm direkte på vinduet synd for SALVI. Under ToF-SIMS bruges den primære ion stråle at bombardere huller på 2 µm i diameter. Denne dimension er magen til celle længden af biofilm knyttet til vinduet synd, hvilket giver en kemiske profil af biofilm i sin naturligt hydreret mikromiljø. Dette er meget vigtigt på grund af forskellen i en biofilm kemiske identitet, tilstedeværelsen af EPS- og vand-klyngemiljø, når man sammenligner biofilm i sin hydreret tilstand med tørrede prøver. 9 uden brug af SALVI ToF-SIMS kunne kun blive udført på tør og kryogene prøver, giver kemiske kortlægning, som undlader at fange den kemiske profil af en prøve i sin naturlige hydreret tilstand.

Som vist i figur 1A, er det vigtigt at holde sprøjten pumpe ovenfor drop slanger for at muliggøre drop slanger skal være vinkelret på SALVI microchannel. Derudover vil bobler være mindre tilbøjelige til at blive fanget i slangen af enheden, hvis outlet PFTE slangen (indenfor outlet flaske) er lavere end inlet slangen (knyttet til i dråbekammeret). En anden kritisk trin i dyrke bakterier for SALVI vækst er først få en vækstkurve af bestemte bakterier-stamme, der skal bruges, som beskrevet i trin 1.3. Dette kan gøres ved at opnå vækstkurver med optisk tæthed målinger. En vækstkurve, er som vist i figur 1B, vigtigt for at forstå den tidsramme, hvor bakterier bliver inden for log-fase af vækst, da det kan antages, at bakterier er sundeste. Udnytter bakterier i denne fase af vækst letter oprettelsen af en sund biofilm mikromiljø og sikrer at biofilm vil vokse med den forventede hastighed. SALVI microchannel er steriliseret i stuetemperatur med 70% ethanol og DI vand, da det ikke kan autoklaveres for sterilisation forudgående til brug med ToF-SIMS. Det er grund, at autoklavering kan både skade vinduet i SALVI og indføre vanddamp til kanalen. Efter flere dage af vækst, bør microchannel kontrolleres med Fluorescens mikroskopi til at validere bakteriel vedhæftet fil. Et eksempel kan ses i figur 1C, dette billede blev taget til at vise en modnet biofilm. På grund af strømningsbane af medium, bakterierne mere positivt lægger og vokser langs kanterne af microchannel, som dette sted er, hvor flow og shear-styrker er lowest.

Sammenfattende er SALVI en fremragende metode som til kultur og undersøgelse biofilm ved hjælp af i situ kemiske kortlægning, da det giver mulighed for at give levende biofilm i sin naturlige hydreret tilstand til det vakuum-baseret tænkelig massespektrometer. Denne unikke tilgang kan give flere oplysninger om en biofilm vand klynge mikromiljø, samt at få en dybere forståelse af sin EPS biprodukter. Denne information kan bruges til at forstå en biofilm biologiske aktiviteter, og kan bruges i forskellige applikationer som i biomedicin, Biomedicinsk teknik, landbrug, og industriel forskning og udvikling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) jorden og biologiske videnskaber (EBD) mission frø laboratorium instrueret forskning og udvikling (LDRD) Fonden for støtte. Medvirkende var adgang gennem et W. R. Wiley miljømæssige Molecular Sciences Laboratory (EMSL) generel bruger forslag. EMSL er en national videnskabelig bruger facilitet sponsoreret af Office af biologiske og miljømæssige forskning (BER) på PNNL. Forfatterne takke Dr. Yuanzhao Ding for bevis læsning af manuskript og giver nyttig feedback. PNNL drives af Battelle for DOE under kontrakt DE-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36, (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8, (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79, (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139, (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29, (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11, (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9, (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8, (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284, (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. John Wiley & Sons Inc. 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72, (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136, (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21, (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44, (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77, (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52, (73), 10952-10955 (2016).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics