La morfologia dei capelli di radice di semenzali di Arabidopsis in una piattaforma di Microfluidic di due-strato di imaging

Bioengineering

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Summary

In questo articolo viene illustrato come Arabidopsis thaliana semenzali in una piattaforma di due-strato microfluidici che limita la radice principale e peli radicali per un singolo piano ottico della coltura. Questa piattaforma può essere utilizzata per imaging ottico in tempo reale della morfologia di radice bene anche per quanto riguarda imaging ad alta risoluzione con altri mezzi.

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Aufrecht, J. A., Ryan, J. M., Hasim, S., Allison, D. P., Nebenführ, A., Doktycz, M. J., Retterer, S. T. Imaging the Root Hair Morphology of Arabidopsis Seedlings in a Two-layer Microfluidic Platform. J. Vis. Exp. (126), e55971, doi:10.3791/55971 (2017).

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Abstract

Peli radicali aumentare la superficie di radice per migliore assorbimento di acqua e assorbimento delle sostanze nutritive dalla pianta. Perché sono di piccole dimensioni e spesso oscurata dal loro ambiente naturale, funzione e morfologia dei capelli di radice sono difficili da studiare e spesso esclusi dalla ricerca sulle piante. Negli ultimi anni, microfluidica piattaforme hanno offerto un modo per visualizzare la radice sistemi ad alta risoluzione senza disturbare le radici durante il trasferimento di un sistema di imaging. La piattaforma microfluidica presentato qui compilazioni su ricerca precedente pianta-on-a-chip incorporando un dispositivo di due-strato per confinare la radice principale di Arabidopsis thaliana allo stesso piano ottico come i capelli di radice. Questo design consente la quantificazione di peli radicali su un cellulare e organello livello e inoltre impedisce l'asse z alla deriva durante l'aggiunta di trattamenti sperimentali. Descriviamo come conservare i dispositivi in un ambiente confinato e idratato, senza la necessità di pompe fluidiche, pur mantenendo un ambiente gnotobiotici per il semenzale. Dopo l'esperimento di imaging ottico, il dispositivo può essere smontato e utilizzato come substrato per forza atomica o microscopia elettronica a scansione pur mantenendo intatta la strutture delle radici fini.

Introduction

Caratteristiche di radice bene aumentano acqua e acquisizione dei nutrienti per la pianta, esplorare nuovi spazi di terreno e aumentando la superficie di radice totale. Il fatturato di queste caratteristiche del bene principale svolge un ruolo importante nello stimolare la catena alimentare della metropolitana1 e il numero di radici fini in alcune specie di piante è previsto a doppia sotto anidride carbonica atmosferica elevata2. Radici fini sono generalmente definite come quelli inferiori a 2 mm di diametro, anche se nuove definizioni di avvocato per la caratterizzazione di radici fini dalla loro funzione3. Come molte radici fini, peli radicali forniscono la funzione di assorbimento e di assorbimento, ma occupano uno spazio molto più piccolo con diametri dell'ordine di micron. A causa delle loro piccole dimensioni, peli radicali sono difficili da immagine in situ e sono spesso trascurati come parte dell'architettura complessiva radice nel campo scala esperimenti e modelli.

Ex terra dei capelli di radice studia, come nel caso di piantine coltivate su piastre di agar, hanno fornito preziose informazioni sulla crescita cellulare e trasporti4,5la comunità scientifica. Mentre piastre di agar consentono sistemi della radice essere imaged in modo non distruttivo e in tempo reale, essi non offrono alta controllo ambientale per l'aggiunta di trattamenti sperimentali come le sostanze nutrienti, ormoni vegetali o batteri. Una soluzione emergente a facilitare la formazione immagine di alta risoluzione mentre anche offrendo dinamico controllo ambientale è stato l'avvento di piattaforme di microfluidica per studi di pianta. Queste piattaforme hanno permesso la crescita distruttiva e la visualizzazione di diverse specie vegetali per throughput elevato phenotyping6,7,8,9, trattamenti chimici isolati 10, vigore misure11,12e l'aggiunta di microrganismi13. Disegni di piattaforma microfluidica si sono concentrati sull'uso di strati fluidico unico ambiente open space in cui le radici possono propagare, permettendo i capelli di radice alla deriva dentro e fuori di messa a fuoco ottica durante la crescita o il trattamento.

Qui presentiamo una procedura per lo sviluppo di una piattaforma di due-strato microfluidici utilizzando foto e metodi soft-Litografia che si basa su disegni di pianta-on-a-chip precedenti di confinare i semenzale di peli radicali allo stesso piano imaging come la radice principale. Questo ci permette di monitorare lo sviluppo dei capelli di radice in tempo reale, ad alta risoluzione e durante tutto il processo di trattamento sperimentale. I nostri metodi di coltura permettono di Arabidopsis thaliana piantine essere germinati dal seme all'interno della piattaforma e colta per fino ad una settimana in un ambiente sterile e idratata che non richiede l'uso di attrezzature pompa siringa. Una volta che l'esperimento di time-lapse imaging ha concluso, la piattaforma qui presentata possa essere aperti senza disturbare la posizione delle funzioni radice più fini. Questo consente l'utilizzo di altri metodi di imaging ad alta risoluzione. Qui forniamo risultati rappresentativi per la quantificazione e la visualizzazione della morfologia dei capelli di radice in questa piattaforma di microscopia ottica, scansione (SEM) e a forza atomica (AFM) di tecniche di microscopia.

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Protocol

1. due-strato piattaforma Fabrication

  1. Fabbricazione dei maestri multistrati
    1. Spin cappotto photoresist negativo a base epossidica (~63.45% solidi, 1.250 cSt) secondo le specifiche del produttore (2.000 giri/min per 45 s) su un wafer di silicio del diametro di 4 pollici per ottenere l'altezza desiderata di 20 µm per il primo strato di design.
    2. Soft-cuocere le cialde di resistere rivestito per 4 min a 95 ° C. Consentire la cialda raffreddare per 5 min. esporre la cialda ai raggi UV per 15 s (~ 150 mJ/cm2 a 365 nm) attraverso un photomask in un UV contatto Allineatore per definire la geometria dello strato inferiore.
    3. Post-esposizione cuocere la cialda per 5 min a 95 ° C. Senza sviluppo, torna il wafer alla spalmatrice di spin e spin su un secondo strato di photoresist negativo a base epossidica (~76.75% solidi, 80.000 cSt) a 3.000 giri/min per raggiungere un secondo strato di altezza di 150-200 µm.
    4. Consentire la cialda riposare per 5 minuti prima di trasferire in una piastra di 95 ° C per 45 min. Dopo la cottura sulla piastra riscaldante, rimuovere la cialda e consentire il resistere a raffreddare e indurire a temperatura ambiente per un altro 5 minuti su una superficie piana. Allineare ed esporre la cialda per il secondo strato fotomaschere per 30 s in un allineatore contatto UV (dose di circa 300 mJ/cm2).
    5. Eseguire un post-esposizione cuocere mettendo la cialda su una piastra per 15 min a 95 ° C e quindi consentire la cialda a raffreddare su una superficie piana per 5 min prima di sviluppare.
    6. Sviluppare contemporaneamente entrambi gli strati resistere mettendo la cialda in un piatto di plastica e sommergendo la cialda in sviluppatore appropriato (Vedi Materiali tavolo). Scuotere delicatamente il piatto occasionalmente per lavare sviluppatore fresco sopra la cialda.
    7. Dopo 17 min, sciacquare la cialda con isopropanolo (IPA). Se viene visualizzata la finestra di una patina bianca, continuino ad iterare tra risciacquo la cialda con sviluppatore e IPA, fino a quando il film scomparirà. Asciugare il wafer di silicio a motivi con azoto.
  2. Polydimethylsiloxane Soft-Litografia
    1. Esporre il wafer di silicio per un plasma ad aria per 30 s in un plasma cleaner impostato su high (Vedi materiali tavolo) per pulire. Silanizzare la cialda con tricloro (1h, 1h, 2H, 2h-perfluoro-n-octil) Silano in una cappa chimica su una piastra sotto il punto di infiammabilità del silano (85 ° C) per 2 h.
    2. Versare un rapporto 10:1 di polidimetilsilossano (PDMS) per agente indurente sul master di wafer di silicio. Degassare il PDMS misto in una camera a vuoto e poi curare il polimero in forno a 70 ° C per 1 ora o fino a quando il PDMS è completamente guarito.
    3. Usando un bisturi, tagliare i dispositivi PDMS e sbucciatele da master di wafer di silicio. Utilizzare un punzone di biopsia di 1,5 mm per creare insenature seme e trattamento, l'ingresso di seme ad un angolo di 45° per incoraggiare la crescita delle radici nel canale principale di punzonatura.
    4. Utilizzare nastro adesivo trasparente per rimuovere i detriti dal dispositivo PDMS e posizionare il lato di progettazione del dispositivo su un vetrino coprioggetti. Autoclave i dispositivi assemblati.

2. dispositivi di impianto

  1. Preparazione del seme di Arabidopsis thaliana
    1. Superficie sterilizzare semi di a. thaliana in un tubo di microfuge con una soluzione di candeggina commercialmente disponibili 30% diluito in detergente di Triton X deionizzata acqua e 0,1% per minimo 7 semi di lavare 4 volte con acqua sterile.
    2. Stratificare i semi di microfuge tubo di refrigerazione durante la notte o fino ad una settimana a 4 ° C.
  2. Preparazione del dispositivo
    1. Posizionare i dispositivi sterilizzati in un vuoto degasaggio camera per eliminare l'aria dal gas permeabile PDMS e fluidici canali per migliorare la facilità di riempimento.
    2. Rimuovere i dispositivi dalla camera a vuoto e immergere immediatamente i dispositivi in una capsula Petri riempiti di liquido ¼ forza basata vegetale media a pH 5.7.
    3. Utilizzando una pipetta, tirare liquido attraverso le insenature per riempire il dispositivo. Assicuratevi che nessun bolle d'aria rimangano all'interno dei canali mediante ispezione visiva.
    4. Trasferire i singoli dispositivi di nuovo asciutto Petri. Versare o pipetta agar caldo intorno al dispositivo fino a quando il livello di agar è quasi a filo con la parte superiore del dispositivo PDMS. Consentire l'agar solidificare.
      Nota: I dispositivi sono ora pronti per piantare i semi o possono essere conservati a 4 ° C fino a quando necessario.
  3. Piantare i semi all'interno dei dispositivi
    1. In un ambiente sterile, trasferire un seme sterilizzato all'ingresso di ogni dispositivo usando una pipetta piccola.
    2. Copertina di Petri con cera film (Vedi Materiali tavolo) e posto in una camera di crescita in bicicletta di chiaro/scuro o davanzale a temperatura ambiente. Orientare la piastra di Petri in modo che i dispositivi sono verticali e gravità incoraggerà le radici di crescere attraverso il canale.

3. trattamento

  1. Trattamenti sperimentali
    1. Al momento desiderato nello sviluppo del semenzale, aggiungere il trattamento sperimentale al semenzale aggiungendo una quantità prescritta del trattamento per ciascuna delle porte 8 lato tramite pipetta.
    2. Richiudere la capsula di Petri e tornare alla camera di crescita o davanzale.
    3. Procedere con imaging campioni all'ora desiderata per catturare momenti individuali o iniziare la formazione immagine di lasso di tempo.

4. optical Imaging

  1. Abbassare l'Imaging ad alta risoluzione (4-20 X)
    1. Posto l'intera capsula di Petri contenente il dispositivo ed il semenzale sotto un microscopio invertito campo luminoso per campo luminoso ad alta risoluzione (4-20 X) più basso o imaging (DIC) contrasto differenziale di interferenza. Ottimizzare le condizioni di illuminazione per delucidare le caratteristiche morfologiche di interesse regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata della radice e concentrarsi sulla radice o root hair(s) di interesse.
    2. Acquisire un punto di tempo singolo o una serie temporale di immagini. Per visualizzare la crescita dei peli radicali, immagine cresciti peli radicali una volta al minuto. Per visualizzare la crescita della radice principale, acquisire una sola immagine ogni 30 min ritorno di Petri e le piantine per camera di crescita o davanzale in posizione verticale dopo formazione immagine è completa.
  2. Maggiore formazione immagine ad alta risoluzione (20-63 X)
    1. Una volta che il semenzale è cresciuto per un tempo desiderato, è possibile utilizzare pinze per rimuovere vetrino coprioggetto e dispositivo da agar. Pulire fuori la parte inferiore del coprivetrino utilizzando un tessuto di laboratorio di etanolo a contatto.
    2. Applicare i supporti consigliati immersione all'obiettivo come suggerito dal costruttore della lente del microscopio. Posare il coprioggetto sul palco di microscopio e alzare il tavolino per contattare il supporto di immersione sull'obiettivo. Ottimizzare le condizioni di illuminazione regolando i tempi di esposizione, luminosità della lampada, l'apertura e la polarità della luce. Guidare la fase per l'area desiderata e la messa a fuoco su root hair(s) di interesse.
      Nota: Per visualizzare il flusso citoplasmatico è necessario DIC e marcatori di fluorescenza sono necessari per visualizzare il movimento degli organelli.
    3. Per quantificare la crescita dei capelli di radice nel corso del tempo, acquisire un'immagine per min. Per visualizzare il movimento degli organelli, ridurre al minimo il tempo di esposizione di fluorescenza pur mantenendo un segnale di fluorescenza identificabili dagli organelli. Più velocemente il tempo di esposizione consente di acquisire immagini degli organelli. Più time-lapse imaging, per utilizzare un'incubatrice di fase imaging di cellule vive per mantenere l'umidità e temperatura ambiente.
      Nota: Un obiettivo di olio X 63 è consigliato per imaging dei capelli di radice organelli.

5. non-Optical Imaging

  1. Preparazione del dispositivo
    1. Una volta che il semenzale è cresciuta per il tempo desiderato,
rimuovere il dispositivo e il vetrino coprioggetto da di Petri.
  • Capovolgere il dispositivo e Sbucci delicatamente il vetrino coprioggetti in modo che la radice rimane all'interno del canale PDMS.
  • Procedere per utilizzare il dispositivo PDMS come substrato per la radice nella maggiore forza atomica di risoluzione o microscopia elettronica a scansione.
  • Microscopia elettronica a scansione
    1. Depositare un sottile (~ 20 nm) strato di cromo sulla radice e dintorni di PDMS utilizzando una pistola Electron Beam evaporazione bicamerale.
    2. Trasferire la radice e il dispositivo PDMS alla Camera microscopio elettronico a scansione.
      Nota: Imaging condizioni, cioè tensione, corrente e lavora a distanza dovrà essere ottimizzati per ottenere la risoluzione desiderata per una determinata applicazione.
  • Microscopia a forza atomica (AFM)
    1. Montare il lato di radice del dispositivo PDMS fino il titolare di un esemplare AFM. Per aumentare il contrasto nella fotocamera e distinguere più facilmente la radice dal PDMS, posizionare il dispositivo PDMS su un substrato piatto riflettente (come mica rivestita in oro) prima di montare il dispositivo sul portacampioni AFM.
    2. Fissare un attacco ben liquido sopra il dispositivo PDMS e riempirlo con acqua per mantenere le radici idratate durante la formazione immagine.
    3. Caricare il portacampioni in AFM. Regolare il controllo di z per lo spessore del dispositivo PDMS e guidare il cantilever nella regione di interesse sulla radice usando una macchina fotografica come guida.
    4. Allineare il laser con la punta del cantilever. Per ottenere risultati ottimali con formazione immagine modalità di contatto, utilizzare cantilever con costanti delle molle di 0,01 o 0,03 N/m per esercitare una forza minima sulla radice durante la scansione.
    5. Abbassare lentamente il meccanismo di scansione fino a mensola appena entra in contatto con il campione. Regolare le dimensioni di scansione per la regione desiderata e scegliere una velocità di scansione di 1 linea/s con 256 punti di tensione per ogni riga. Acquisire la scansione.
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    Representative Results

    I dispositivi microfluidici di due-strato PDMS qui descritti hanno un canale alta 200 µm per la radice principale di Arabidopsis e una camera alta di 20 µm per confinare lateralmente cresciti peli radicali (Figura 1A). Questo disegno può essere utilizzato per le specie vegetali con diametri di radice simile come Arabidopsis thaliana e possa essere facilmente modificato per ospitare specie di diverse dimensioni. Il disegno incorpora un ingresso per l'impianto e 8 entrate laterali per qualsiasi trattamento chimico o biologico desiderato. Prefilling i dispositivi con i media e versando agar intorno al dispositivo mantiene l'ambiente di radice idratata per tutta la durata dell'esperimento senza bisogno di apparecchiature esterne fluidico. (Figura 1B) L'agar si stabilizza anche il dispositivo all'interno della capsula di Petri, permettendo i semenzali può essere coltivata in verticale per favorire la crescita di radice giù il canale principale. Di Petri mantiene le piantine contenute in un ambiente di gnotobiotici e permette al sistema di radice di essere imaged attraverso la capsula di Petri per ingrandimenti fino a 20x. Un'altra opzione sarebbe per sigillare direttamente al dispositivo PDMS di un capsula di Petri con fondo di vetro per ingrandimenti ottici anche superiori.

    Arabidopsis thaliana semi possono essere piantati direttamente nell'ingresso dell'apparecchio che è perforata per facilitare la crescita delle radici nel canale principale con un'angolazione di 45 gradi. (Figura 1) L'altezza del dispositivo PDMS non deve superare pochi millimetri, come le foglie devono essere in grado di crescere fuori dalla sommità della piattaforma. A causa delle loro piccole dimensioni, Arabidopis semi sono molto difficili da orientare in modo che il radicale di radice emergenti affronta il canale su germinazione. Di conseguenza, circa la metà dei semi piantati germineranno con le loro foglie nei canali e non può essere utilizzata per gli esperimenti di visualizzazione principale. Dispositivi da queste piantine possono essere re-autoclavato e usate nuovamente a partire dal punto 2.2. Per incoraggiare phototrophic crescita di germogli di Arabidopsis thaliana , la camera di visualizzazione del dispositivo può essere coperti in foglio di alluminio per bloccare la luce e migliorare il tasso di successo. Arabidopsis thaliana radici sono cresciute costantemente in questa piattaforma per una settimana, al punto che la crescita diventa diretto verso la formazione delle radici laterali. (Figura 1) Il tasso di crescita delle radici in questa piattaforma sono paragonabili ai tassi di crescita delle radici di Arabidopsis thaliana in altre piattaforme di microfluidica. 13 il disegno di due-strato limita correttamente i capelli di radice allo stesso piano imaging come la radice principale. (Figura 1E) Tuttavia, alcuni peli radicali possono continuare a crescere nel canale principale fuori fuoco ottico e progetti futuri dovrebbero mirare a guidare più gradualmente peli radicali nella camera di radice dei capelli.

    Figure 1
    Figura 1: Crescita di Arabidopsis thaliana in due strati Microfluidic Platform. (A) dispositivo è costituito da due strati di confinare i peli radicali allo stesso piano imaging come la radice principale (scala 1 mm). A. thaliana semenzali possono essere (B) contenute in un ambiente gnotobiotici, (C) germinato dal seme all'interno del dispositivo, scala bar = 400 µm, (D) e al controllo di crescita nel corso di una settimana (barre di errore sono deviazione standard, deviazione standard) . (E) A radice rappresentante è ripreso nella piattaforma, scala bar = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    All'interno della piattaforma microfluidica, peli radicali possono essere quantificati a livello cellulare in termini di loro lunghezza, densità e l'angolarità della loro crescita dalla radice. (Figura 2A) Lunghezza dei capelli di radice e densità di tipo selvaggio di a. thaliana piantine coltivate nella nostra piattaforma sono all'interno di gamma di piantine coltivate in verticale su piastre di agar. 14 l'angolo di crescita dei capelli di radice è in genere perpendicolare alla superficie della radice. Nella nostra piattaforma, la spigolosità di crescita dei capelli di radice verso la punta può essere un artefatto di confinamento dei peli root ad un piano 2-dimensionale. Lo stimolo meccanico, in questo caso dalle mura del dispositivo microfluidico, è stato indicato per indurre cambiamenti nella crescita delle radici e l'orientamento che può spiegare la discrepanza tra una piattaforma microfluidica ristretti e una piastra di agar aperta. 15 è improbabile che questo fenotipo è il risultato di un nutriente stress nella nostra piattaforma come piantine di a. thaliana utilizzano riserve di cibo conservato dal seme nei primi giorni di crescita. Anche se l'ipossia può essere una preoccupazione nei sistemi di radice completamente saturi, la permeabilità all'ossigeno di PDMS ha precedentemente dimostrato la biocompatibilità del polimero con tessuti dipendente dell'ossigeno. 16 , 17

    Uno dei vantaggi più forti di microfluidica piattaforme su metodi di piastra di agar è la possibilità di aggiungere uniformemente precise concentrazioni di trattamenti chimici per gli organismi. Nelle piattaforme di microfluidica monocanale, l'aggiunta di trattamenti potenzialmente può spiazzare peli sottili radice da messa a fuoco ottica. Qui dimostriamo il mantenimento della radice dei capelli messa a fuoco ottica nella nostra piattaforma di due-strato microfluidici durante l'aggiunta di perline fluorescenti. In Figura 2B un semenzale è imaged (i) prima e (ii) dopo l'aggiunta di perle di polistirolo carboxylated fluorescente (blu e rossi). L'aggiunta di questo trattamento abiotico non ha rovinato l'orientamento o la messa a fuoco ottica di peli radicali del semenzale.

    Maggiore ingrandimento fluorescente e imaging marcatori possano essere usati per immagine e quantificare i cambiamenti di livello organello in fase di sviluppo dei capelli di radice (Figura 2). Flusso citoplasmatico può essere visto in un radice dei capelli da un (i) immagine contrasto differenziale di interferenza e, in un'altra radice dei capelli da un semenzale contenente un organello triple marker18, la traiettoria e la distribuzione spaziale degli tre organelli ii) Golgi (mCherry), (iii) dei perossisomi (PCP) e (iv) nei mitocondri (YFP) possono essere visto dalla proiezione di massima intensità in ogni rispettivo pannello. Il movimento di questi tre organelli vengono catturato in una trama di distribuzione cumulativa in Figura 2.

    Figure 2
    Figura 2: caratterizzazione di radice dei capelli e trattamento. Capelli di radice sono stati quantificati su un cellulare lEvel da (A) lunghezza, densità e spigolosità per n = 4 piantine di wild type (WT) (barre di errore sono SD). Angolarità è determinato come l'angolo tra la punta della radice principale e punta di radice dei capelli con la punta di radice principale, definita come il marchio di 0°. (B) la messa a fuoco ottica dei peli root rimane invariato (i) prima e (ii) dopo trattandoli con perle di polistirolo fluorescente (barra della scala = 100 µm). (C) organello livello quantificazione è dimostrato da imaging il flusso (i) citoplasmatico da un'immagine di contrasto differenziale di interferenza e, in un separato dei capelli di radice, la fluorescenza degli tre organelli: Golgi (ii) (iii) dei perossisomi e (iv) mitocondri (barra della scala = 10 µm). Sono state visualizzate traiettorie organello unendo fluorescente immagini scattate ogni s 23-32 per 20 s. I movimenti degli tre organelli sono stato rilevati automaticamente e distribuzioni di velocità cumulativo tracciati sulla destra. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

    Il dispositivo PDMS presentato qui non ha stato chimicamente legato ad un vetrino coprioggetti ma piuttosto forma un legame fisico più debole che viene stabilito durante la fase di sterilizzazione in autoclave. Questo consente al dispositivo di essere smontato dopo l'esperimento di imaging ottico è completa. Il dispositivo PDMS può essere sbucciato dal vetro, invertito e usato come substrato per maggiore imaging non ottici ad alta risoluzione della morfologia radice (Figura 3A). La piattaforma tiene comodamente la radice in posto durante il contatto con un cantilever durante la microscopia a forza atomica (Figura 3B). Inoltre, se la cura è presa durante il processo di smontaggio, peli radicali rimarrà in posizione sul substrato PDMS. Questo è dimostrato dall'immagine ottica della radice prima dello smontaggio (Figura 3) e dopo lo smontaggio della piattaforma e rivestimento il semenzale in uno strato di cromo conduttivo 20 nm per l'imaging con un microscopio elettronico a scansione (Figura 3D ). Per preservare ulteriormente la piantina prima di decostruzione della piattaforma, un fissativo a base di aldeide può essere iniettato nella piattaforma a reticolare le proteine dei tessuti vegetali in luogo.

    Figure 3
    Figura 3: dispositivo decostruzione e Imaging ottico-. (A), la piattaforma microfluidica può essere smontato e utilizzato come substrato per i metodi di imaging non ottici ad alta risoluzione. (B), la topografia di superficie (immagine della diffrazione) di una punta di radice di thaliana di Arabidopsis è Imaging utilizzando la modalità a contatto microscopia a forza atomica, scala bar = 2 µm. La posizione dello sbalzo sulla radice è indicata da una freccia nera nella rientranza, scala bar = 100 µm. (C) ottico immagine e (D) corrispondente microscopio elettronico a scansione del semenzale stesso prima e dopo il dispositivo è smontato. Sottolineano le frecce di peli radicali che rimangono indisturbati, scala bar = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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    Discussion

    Il metodo descritto in questo articolo per la creazione di una piattaforma di pianta-on-a-chip è unico in quanto i due strati di design confini i capelli di radice di un unico piano di formazione immagine e la piattaforma può essere decostruiti ed usati come substrato per l'imaging non ottici ad alta risoluzione . Usando la formazione immagine non ottici ad alta risoluzione può fornire informazioni preziose su tessuto della pianta che non poteva essere ottenuto da imaging ottico da solo. Ad esempio, formazione immagine AFM può fornire misure di forza per calcolare l'elasticità dei tessuti radice durante lo sviluppo o dopo un trattamento chimico o biologico specifico. Allo stesso modo, la formazione immagine SEM può fornire dettagli ad alta risoluzione della topografia di superficie del tessuto principale e, quando accoppiato con formazione immagine chimica, può fornire informazioni sulla composizione elementare dei tessuti. 19 le generazioni future di questa piattaforma microfluidica includerà ottimizzazione per la compatibilità con altri sistemi di imaging chimici come la spettroscopia di massa-desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice (MALDI-MS) e coerente anti-Stokes Raman spettroscopia (automobili).

    Fasi critiche in questo metodo comportano l'utilizzo di agar per fissare il dispositivo e fornire idratazione all'impianto senza la necessità di procedure di flusso del fluido complicati. Deve anche prestare attenzione quando decostruire il dispositivo PDMS del substrato di vetro al fine di mantenere intatta la morfologia della radice. Se l'obiettivo sperimentale è esclusivamente per basso per imaging ottico di media risoluzione senza la necessità di decostruzione del dispositivo, la procedura può essere modificata chimicamente legame il dispositivo al sottostante substrato di vetro utilizzando il plasma ad ossigeno. Maggiore risoluzione immagini ottiche possono essere ottenute senza rimuovere il dispositivo dal suo ambiente gnotobiotici legando chimicamente il PDMS direttamente in un bicchiere con fondo capsula di Petri e poi versando agar intorno il PDMS come precedentemente descritto.

    Il design di 8 canali laterali di trattamento era un tentativo di limitare i trattamenti a determinate regioni della radice. Tuttavia, questo disegno era infruttuoso nell'impedire la diffusione del trattamento ad altre aree della radice a causa di conduttanza di spazio all'aperto nel canale della radice principale. Per poter trattare localmente la radice, l'architettura del dispositivo sarà necessario essere riprogettato per confinare trattamenti o il trattamento dovrà essere introdotto attraverso un viscosi per rallentare temporaneamente la diffusione in tutto il dispositivo.

    Se è auspicabile per trattamenti sperimentali essere aggiunte tramite flusso, modifiche sarà anche richieste per questa piattaforma. Attualmente l'aggiunta del flusso a qualsiasi delle insenature piattaforma provoca l'espulsione del seme dal suo ingresso e la difficoltà nel controllare la posizione dei trattamenti fluidici. Questo metodo funziona bene per piantine fino ad una settimana di età. È limitato in quanto tempo i semenzali possono continuare a crescere nella piattaforma, a causa della lunghezza del canale principale. Future modifiche comporterà allungando il canale principale e incorporando più canali alta 200 µm per radici laterali mantenendo la camera alta di 20 µm per confinamento dei capelli di radice. Questa modifica richiede conoscenza sulla posizione prevista dell'emersione di radici laterali al fine di progettare un dispositivo appropriato.

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    Disclosures

    Gli autori non hanno nulla a rivelare.

    Acknowledgments

    Questo manoscritto è stato autore di UT-Battelle, LLC sotto contratto no. DE-AC05-00OR22725 con l'US Department of Energy. Mantiene il governo degli Stati Uniti e l'editore, accettando l'articolo per la pubblicazione, riconosce che il governo degli Stati Uniti mantiene una licenza non esclusiva, liberata, irrevocabile, mondiale per pubblicare o riprodurre il modulo pubblicato di Questo manoscritto, o consentire ad altri di farlo, per scopi di governo degli Stati Uniti. Il dipartimento dell'energia fornirà accesso del pubblico a questi risultati di ricerca sponsorizzato dal governo federale conformemente al piano di accesso pubblico DOE (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan).

    Questo lavoro è stato supportato in parte dalla genomica Science Program, US Department of Energy, Office of Science, biologiche e ricerca ambientale, nell'ambito dell'impianto microbo interfacce scientifica Focus Area (http://pmi.ornl.gov). La fabbricazione delle piattaforme microfluidiche è stata effettuata nel laboratorio di ricerca di nanofabbricazione al centro per Nanophase Materials Sciences, che è un DOE Office of Science utente Facility. JAA è supportato da una borsa di ricerca laureato NSF DGE-1452154

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Silicon Wafer WRS Materials 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100>
    Quintel Contact Aligner Neutronix Quintel Corp NXQ 7500 Mask Aligner
    Fluorescent Microscope Nikon Eclipse Ti-U
    laboratory tissue Kimberly Clark Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155
    Negative Photoresist Epoxy Microchem SU-8 2000s series
    Photoresist developer Microchem Su-8 developer
    trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane Sigma Aldrich use in chemical hood
    Air Plasma Cleaner Harrick Plasma
    PDMS Dow Corning Sylgard 184 Silicone elastomer base
    PDMS curing agent Dow Corning Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent
    Dessicator Bel-Art F42010-000
    Scalpel X-acto knife
    Biopsy Punch Ted Pella 15110-15
    Adhesive tape Staples Invisible Tape
    Microfuge tube Eppendorf
    Triton X J.T.Baker XI98-07
    Bleach Chlorox concentrated
    Plant-Based Media Phyto Technology Laboratories M524
    Agar Teknova A7777
    Wax film Parafilm
    microscope Olympus IX51
    Atomic Force Microscope Keysight Technologies 5500 PicoPlus AFM
    Petri dish VWR
    Scanning Electron Microscope JEOL 7400
    Dual Gun Electron Beam Evaporator Thermionics Custom Dual Electron Gun Evaporation System

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