Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Immunology and Infection

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Summary

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

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Hunt, A. M., Gibson, J. A., Larrivee, C. L., O'Reilly, S., Navitskaya, S., Busik, J. V., Waters, C. M. Come to the Light Side: In Vivo Monitoring of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections in Chronic Wounds in a Diabetic Hairless Murine Model. J. Vis. Exp. (128), e55991, doi:10.3791/55991 (2017).

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Abstract

La présence de bactéries comme les biofilms structurés dans les plaies chroniques, surtout chez les patients diabétiques, est censée empêcher la cicatrisation des plaies et la résolution. Murin de plaies chroniques ont été utilisés pour comprendre les interactions sous-jacentes entre les micro-organismes et l’hôte. Les modèles développés à ce jour s’appuient sur l’utilisation des animaux à poil et collection terminale d’un tissu pour la détermination des bactéries viables. Bien que la perspicacité significative a été acquise avec ces modèles, cette procédure expérimentale nécessite un grand nombre d’animaux et échantillonnage prend du temps. Nous avons développé un nouveau modèle murin qui intègre plusieurs innovations optimales afin d’évaluer la progression du biofilm dans les plaies chroniques : une) qu’il utilise des souris sans poils, éliminant le besoin pour l’épilation ; b) s’applique pré-formé biofilms sur les blessures permettant l’évaluation immédiate de la persistance et l’effet de ces communautés sur hôte ; c) surveille la progression du biofilm en quantifiant la production de lumière par une souche génétiquement modifiée bioluminescente Pseudomonas aeruginosa, ce qui permet une surveillance en temps réel de l’infection, réduisant ainsi le nombre d’animaux requis par l’étude. Dans ce modèle, une plaie pleine profondeur unique est produite sur le dos des souris sans poils diabétiques par STZ et inoculée avec des biofilms de la souche de P. aeruginosa bioluminescente Xen 41. Rendement lumineux de la blessure est enregistré chaque jour dans in vivo système d’imagerie, permettant une visualisation rapide de biofilm in vivo et in situ et la localisation des biofilms bactéries dans les plaies. Cette nouvelle méthode est souple car elle permet d’étudier d’autres micro-organismes, y compris les espèces génétiquement modifiées et des biofilms multi-espèces et peut être d’une valeur spéciale dans l’essai de stratégies anti-biofilm, y compris les antimicrobiens pansements occlusifs.

Introduction

Les biofilms sont des communautés complexes de micro-organismes noyées dans une matrice de substances polymériques qui ont été soulignées comme un facteur qui contribue à la faible résolution des plaies chroniques1. L’étude de ces populations microbiennes hautement organisées et persistantes est particulièrement important pour les patients diabétiques où mauvaise circulation dans les membres et l’altération des mécanismes sensoriels périphériques conduire à des lésions non détecté2. Aux États-Unis, on estime que 15 % des patients diabétiques se développera au moins un ulcère au cours de leur vie. Cela se traduit par une dépense économique d’environ 28 milliards dollars en traitement3,4, sans oublier le fardeau émotionnel et social rafraîchit. Comprendre les facteurs qui permettent à des communautés microbiennes à persister dans le lit de la plaie et l’impact de ces biofilms dans les événements de guérison est impératif pour conduire les meilleurs soins pour les patients atteints et propulser le développement de nouvelles approches de traitement. Par conséquent, la mise en place de traduisible et reproductible le in vivo modèles pour explorer les interactions bactériennes-hôtes est primordiale.

Modèles murins ont été avec succès développés pour étudier l’impact des biofilms dans les plaies chroniques. Ces modèles, cependant, souvent utilisent des espèces aux cheveux et évaluer biofilm clairance de dénombrements de cellules bactériennes viables de tissus excisés d’animaux sacrifiés, ce qui les rend fastidieuse et coûteuse.

Une alternative de biophotonique à l’échantillonnage de point de terminaison des animaux dans l’évaluation de l’infection a été proposée par Contag et al. (1995) 5 , qui a développé une méthode pour capturer la luminescence de constitutivement bioluminescentes Salmonella typhimurium pour mesurer l’efficacité du traitement antibiotique. D’autres études en profitant des bactéries émettrices de bioluminescence suivi. Par exemple, Rochetta et al. (2001) 6 valider un modèle d’infection afin d’étudier les infections de cuisse Escherichia coli chez des souris en mesurant la luminescence à l’aide d’un dispositif de couplage charge intensifié et plus tard, Kandolo et al. (2003) 7 a profité du photon émettant des propriétés d’une souche Staphylococcus aureus d’enquêter sur l’efficacité de plusieurs antibiotiques dans un modèle de plaie cathéter chez la souris modifiée.

La méthode caractérisée ici présente un protocole simple pour induire le diabète chez des souris sans poils, produire et ensemencer des plaies avec pré-formé biofilms bioluminescentes de P. aeruginosa et biophotonique une surveillance de l’infection en utilisant un en vivo système d’imagerie. Il offre une directe, rapide, sur place, processus non invasif et quantitatifs d’évaluation des biofilms dans les plaies chroniques et permet en outre, pour des analyses supplémentaires telles que l’imagerie microscopique de la guérison des plaies, prélèvement de sang intermittent pour les mesures de cytokine et collection de tissus terminal pour l’histologie.

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Protocol

des expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d’utilisation de la Michigan State University et d’institutionnels animalier.

1. préparation des pansements occlusifs et les entretoises de Silicone

  1. couper le pansement occlusif transparent pour faire carrés environ 1 cm x 1 cm avec des ciseaux.
  2. Couper 10 mm cercles sur une feuille de silicone épaisseur 0,5 mm avec une biopsie punch. Centre de 10 mm une biopsie 5 mm coup de poing au milieu du cercle de 10 mm et appuyez fermement pour créer un trou pour former un " donut "-comme le disque qui sera utilisé comme une gouttière.

2. les animaux de laboratoire

  1. utilisation âgés de 8 semaine (22-26 g) de souris mâles SKH-1 chez un éleveur commercial. Garder des souris dans des conditions standards de 21 ° C et un cycle lumière-obscurité de 12 h avec accès libre à la nourriture et l’eau.
  2. Pour induire le diabète, injecter souris intraperitonially avec un solutionand de streptozotocine (STZ) de 13 mg/ml 25 % Glucose (250 µl par / souris) sur 5 jours consécutifs.
    1. Faire la solution STZ par dilution à 65 µg de STZ à 5 µL de 100 mM d’acide citrique, pH 4.5.
    2. Régler le volume injecté pour chaque souris à une masse finale de 65 mg STZ / 1 kg de poids corporel de souris. Injecter des souris témoins avec les pH de la solution de l’acide citrique 100 mM 4,5 sur les mêmes jours.
  3. Sang surveillance de la glycémie avec un glucomètre 14 jours après la dernière injection de STZ pour confirmer l’hyperglycémie. Les souris diabétiques peuvent avoir une polyurie et donc leur literie doive être changé plus fréquemment afin d’éliminer l’humidité et leurs poids doivent être surveillées à 3 fois par semaine.

3. Biofilms

  1. préparation de Biofilm
    1. Grow colonie biofilms 8 pour ensemencer les blessures. Deux jours avant le début de l’intervention chirurgicale une culture nuitée de bioluminescent P. aeruginosa Xen 41 dans un bouillon trypticase soja (TSB) incubée à 37 ° C et secouant à 200 tr/min et stériliser les filtres à membrane en polycarbonate avec 0.2 µm taille de pores par l’exposition aux UV lumière dans une hotte de sécurité biologique pour 15 min par face.
    2. Un jour avant l’intervention chirurgicale Centrifuger la culture nuitée à 20 000 x g pendant 2 min et laver 3 fois avec 1 mL de Dulbelcco ' tamponnée au phosphate s saline (SPD) en pipettant également, up et down.
    3. Diluer suspension au SPD à une absorbance de 0,05 à 600 nm.
    4. Pipette 10 µL de la culture diluée sur chaque membrane reposant sur une gélose trypticase soja (TSA). Après avoir laissé sécher, incuber les membranes à 35 ° C pendant 72 h à cultiver des biofilms transférant aux plaques de TSA fraîches chaque 24 h.
  2. Courbe standard
    1. avant le début de l’expérience, faire une courbe standard de corréler les comtes de bioluminescence et bactérien.
    2. Préparer les biofilms comme décrit au point 3.1.
    3. Faire des dilutions successives des biofilms allant de ½ à 1/24 en mélangeant le biofilm à SPD et mélangé au vortex jusqu'à ce qu’une solution visuellement homogène est produite. Pipette de 200 µl des solutions diluées dans une plaque à 96 puits noir et image in vivo système d’imagerie.
    4. Propagation des dilutions de gélose sur des plaques de TSA et incuber à 35 ° C pendant 24 h.
    5. Compter (UFC) d’unités formant des colonies sur plaques et créer une courbe d’étalonnage pour corréler les comtes de bioluminescence et bactérien.

4. Plaie de chirurgie

  1. induire une anesthésie générale l’isoflurane dans 95 % oxygen/5% CO 2 (pour éviter la mort d’acidocétose) à un débit de 1 L/min et maintenir l’anesthésie à l’isoflurane 1 à 3 %. Maintenir les animaux sur les tapis de chaleur pendant la chirurgie.
  2. Assurer les réflexes profonds de pédale de la souris sont supprimés en pinçant le pied avec des pincettes et placez votre souris en décubitus ventral.
  3. Administrer le meloxicam (0,2 mg/kg) par injection sous-cutanée (30 μl) pour la gestion de la douleur.
  4. Essuyer la peau du dos avec la povidone iodée 10 % trois fois et un tampon d’alcool isopropylique.
  5. Utiliser un poinçon de biopsie stérile de 4 mm d’esquisser un motif circulaire pour la blessure d’un côté de la souris ' médiane s au niveau des épaules. Contournez le modèle avec un marqueur permanent.
  6. Pince dentelée permet de soulever la peau au milieu les ciseaux contour et iris pour créer une blessure de pleine épaisseur qui s’étend à travers le tissu sous-cutané, y compris le panniculus carnosus et excise le morceau de tissu circulaire et.
  7. Appliquer une colle médicale peau imperméable à l’eau sur la peau des souris et placer l’attelle de silicone appliquant une légère pression. Couvrir la plaie avec un pansement occlusif transparent. Après la chirurgie, les animaux en cage individuellement.

5. Gestion postopératoire

  1. administrer le meloxicam (0,2 mg/kg) une fois par jour par injection sous-cutanée pour le soulagement de la douleur post-opératoire pour les 2 prochains jours.
  2. Animaux de surveiller tous les jours pour les manifestations de douleur et perte de poids. Les animaux diabétiques ont besoin d’injections d’insuline quand ils ont perdu 15 % ou plus du poids du corps.

6. Préparation des inoculums biofilm et Infection

  1. ensemencer souris 48 h après la chirurgie, comme décrit dans les étapes suivantes.
  2. Les biofilms
  3. gratter 72 h des membranes à l’aide d’une spatule stérile, placez-le dans un tube de microcentrifuge et diluer 1:2 dans le SPD. Mix en pipettant également brièvement, up et down.
  4. Plaque de propagation inoculum sur des plaques de TSA pour calculer le total UFC. Pour s’assurer que les comptes sont exacts, briser l’inoculum de biofilm encore par une série de deux étapes de Vortex 1 min intercalés par une étape de sonication 2 min à 40 kHz dans un nettoyeur à ultrasons.
  5. Retirer matériel de pansement, la plaie et la silicone attelle et prennent une micrographie de la plaie avec un microscope avec caméra attachée à l’aide d’une règle pour référence.
  6. Couper l’extrémité des pointes de pipette 200 µL et déposer 10µl de l’inoculum de biofilm sur chaque plaie.
  7. Image de souris à l’aide de l' in vivo à l’aide de réglages automatiques de système d’imagerie : exposition temps 5-300 s, moyenne binning 1 f/arrêt et ouvrir le filtre et de champ C (12,9 cm x 12,9 cm).
  8. Couverture enroulée avec vinaigrette fraîche.

7. Mesure et imagerie

  1. évaluer les signes cliniques des animaux tous les jours 9.
  2. Fournir de la nourriture, l’eau et modifiez les cages si nécessaire.
  3. Vérification de l’intégrité des pansements tous les jours. Lorsque le pansement est présent, seulement la bioluminescence peut être mesurée en raison de l’occlusion de la plaie. Au jour 8, les pansements sont enlevés et remplacés pas des mesures permettant de refermer les plaies.
  4. Pèse animaux alternats.
  5. Pour tous les jours, placez la souris individuellement dans une chambre d’isolement équipé d’un filtre HEPA et l’image en utilisant l' in vivo d’imagerie système tous les jours ou tous les deux jours jusqu'à ce que les valeurs de luminescence inférieur à fond.
  6. Après jour 8, induire l’anesthésie générale et prendre les micrographies de la plaie avec un microscope avec caméra attachée une règle en utilisant comme référence tous les deux jours jusqu'à ce que les plaies sont cicatrisées.

8. L’analyse histologique

  1. euthanasier les souris avec un débit de 2 l/min de CO 2 dans une euthanasie de chambre après luminescence tombe en dessous des niveaux de fond et les plaies sont complètement guéries. Confirmer la mort par dislocation cervicale comme une deuxième méthode d’euthanasie.
  2. Ciseaux iris permet de créer une excision large, pleine, autour et dans la région de la plaie (environ 1 cm de diamètre) et de préserver le tissu de paraformaldéhyde à 4 % pour faire une analyse histologique.
  3. Autre analyse : détection de cytokines
    1. rétro-orbitalement recueillir le sang des animaux sous anesthésie à l’aide d’un tube capillaire de verre et transférez-la sur tubes EDTA traités.
    2. Centrifuger sang à 2 000 tr/min pendant 20 min à 4 ° C et de congeler le plasma pour la détection de la cytokine.

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Representative Results

Dans l’élaboration de ce nouveau modèle, nous avons observé beaucoup d’avantages en utilisant glabres SKH-1 sur les souris C57BL/6J, que nous avons utilisée dans le passé. Animaux soumis à des injections de STZ normalement l’expérience perte de poids progressive avec l’apparition du diabète ; Cependant, dans la plaie expériences de guérison menée précédemment par nos laboratoires reproduisant le modèle présenté par Dunn et al. (2012) 9 à l’aide de perte de poids C57BL/6J et drastique a été observée (Figure 1). En revanche, quand à l’aide de cette plaie modèle avec souris SKH-1, une perte de poids plus faible statistiquement significative a été observée (P < 0,0001, test U de Mann-Whitney). En outre, aucun décès n’est survenu dans la cohorte de souris diabétique SKH-1 infectée par P. aeruginosa Xen 41 biofilms, tandis qu’un taux de mortalité de 40 % a été observé chez les souris C57BL/6J infectés dans des expériences antérieures (Figure 2).

Un autre avantage pour le modèle présenté ici est que la procédure expérimentale pour l’étape de suppression de cheveux obligatoire pour les souris C57BL/6J est inutile pour les souris SKH-1. Bien que dans nos expériences précédentes sur des souris aux cheveux, une attention particulière a été accordée à minimiser l’irritation de la peau, des dommages ont eu lieu inévitablement (Figure 3). Notamment, cependant, le plus grand avantage en utilisant des souris sans poils dans ce modèle est l’élimination du problème de la repousse des poils observé dans les études à long terme de la cicatrisation. Dans notre expérience avec les souris C57BL/6J, repousse des poils varie d’un animal à l’autre mais compte tenu de la nature à long terme des études, il toujours est apparu et trafiqué, mesures de surface des plaies ou plaie disloqué attelles et/ou les pansements utilisés pour couvrir les infectés plaies, pouvant résulter en l’assèchement de la plaie (Figure 4).

Dans le modèle de guérison SKH-1 blessure, diabète est confirmé, la chirurgie peut facilement être exécutée pour créer une circulaire pleine épaisseur enroulée sur le dos de l’animal. L’attelle de silicone est maintenue en place par un adhésif médical peau imperméable à l’eau et évite le contact direct entre le pansement occlusif avec le lit de la plaie nouvellement créé (Figure 5).

P. aeruginosa Xen 41 bioluminescentes biofilms cultivés sur la membrane en polycarbonate (Figure 6) sont facilement et de façon aseptique transférés à une seringue d’être préparé pour la livraison sur les blessures et les souris inoculées on surveille quotidiennement pour clinique signes d’infection (Figure 7). Pour ce modèle, nous avons mis en place deux phases distinctes. Dans la première phase, après inoculation du biofilm, la plaie était entourée par une attelle recouverte d’un pansement occlusif transparent. Cela se traduit par l’accumulation de pus qui a obstrué la plaie. Plaies contenant du biofilm ont été imagées quotidiennement avec l' in vivo d’imagerie système pour surveiller le développement de l’infection et évaluer l’évolution de biofilm (Figure 8 et Figure 9). Bioluminescence, enregistré comme flux total (p/s), peut être corrélée avec la densité bactérienne à l’aide d’une courbe d’étalonnage (Figure 10).

Au jour 8, l’attelle et l’habillage ont été retirés pour permettre la visualisation de la guérison des plaies. Bioluminescence tombe par la suite en raison de la perte de la pus entourant la plaie ; Cependant, les bactéries est resté associés à la plaie, tel que déterminé par l’histologie. Cette approche consistant à enlever le pansement pour mesurer la cicatrisation a été utilisée dans d’autres plaies chroniques guérison études (REFs). Progression de cicatrisation peut être déterminée en prenant des photographies au microscope avec une caméra attachée à un microscope (Figure 11).

Figure 1
Figure 1 : perte de poids de pourcentage comparatif de souris diabétiques SKH-1 et C57BL/6J. Jour zéro correspond au poids au jour de la dernière (5ème) injection de STZ. n = 10 souris SKH-1 et n = 12 souris de C57BL/6J. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : pourcentage de survie des souris diabétiques SKH-1 et C57BL/6J après application de biofilm P. aeruginosa Xen 41 (jour 1). n = 5 souris SKH-1 et n = 10 souris de C57BL/6J. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Lacérations de la peau blessée à l’avenir zone après rasage et crème dépilatoire sur les souris C57BL/6J. (A) : jour de la procédure ; (B) : 4 jours après la procédure. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : (A) C57BL/6J souris avec une plaie partiellement enlevé l’attelle. Levage (B) de la gouttière a révélé une blessure guérie entourée de cheveux re-maturité. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : intervention chirurgicale pour blessant souris SKH-1. (A) démarcation avec punch biopsie ; (B) aperçu de la démarcation ; (C) blessant terminé ; (D) application d’adhésif médical peau imperméable à l’eau ; Attelle de collage (E) ; (F) plaie recouverte de pansement occlusif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 6
Figure 6 : préparation de l’inoculum de biofilm. (A) 72 h colonie biofilms de Pseudomonas aeruginosa Xen 41 cultivés sur la membrane en polycarbonate ; (B) mesure du biofilm en utilisant un syrinGE. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 7
Figure 7 : SKH-1 souris diabétique 6 jours après la blessure a été inoculé avec le biofilm P. aeruginosa Xen 41. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 8
Figure 8 : surveillance de l’infection de biofilm grâce au suivi d’évolution de la bioluminescence au fil du temps chez des souris diabétiques de SKH-1. (A) jour de la demande de biofilm ; (B) 5 jours post-biofilm ; (C) 8 jours post-biofilm ; (D) 12 jours post-biofilm ; (E) 16 jours post-biofilm ; (F) 20 jours post-biofilm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 9
Figure 9 : Total des flux de blessures chez les souris diabétiques SKH-1 infectés par P. aeruginosa Xen 41 biofilms au cours de l’expérience. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 10
Figure 10 : UFC a estimé par la plaie à l’aide de la courbe d’étalonnage de la bioluminescence par UFC produite avec des biofilms P. aeruginosa Xen 41. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 11
Figure 11 : micrographie chronologie des plaies infectées par P. aeruginosa Xen 41 biofilms dans diabétique SKH-1 souris, montrant la progression de la guérison. Les jours après l’infection de biofilm sont indiqués dans le coin inférieur gauche de chaque image. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici un nouveau modèle de souris pour l’étude des biofilms dans les plaies chroniques diabétiques qui présente de nombreux avantages pour créer un modèle reproductible, traduisible et flexible.

La première innovation est l’utilisation de souris sans poils. Autres modèles de souris ont été développés pour étudier les diabétique chroniques de cicatrisation de10,11, mais tous se sont fondés sur l’utilisation de souris poil exigeant le retrait de la fourrure par les processus qui impliquent l’épilation à la cire ou combiné avec sabot pour cheveux crèmes dépilatoires. Cette étape est non seulement beaucoup de temps et salissant, mais potentiellement blesse la peau des animaux dans la zone où sera placée la plaie. Alors que la chauves souris ont été utilisés dans une série d’études de cancérogenèse12,13, ces souris n’ont pas été utilisés pour évaluer la persistance du biofilm dans les plaies chroniques. Un autre problème courant résolu par l’utilisation d’animaux sans poil, surtout dans les études à long terme, est la repousse des poils dans la région de la plaie, qui peut compromettre l’évaluation de la cicatrisation des plaies et perturber le pansement.

SKH-1 animaux également prouvé à par STZ diabète de Type I et, en comparaison avec des souris C57BL/6J, a perte de poids plus faible statistiquement significative au cours de l’expérience, rendant le dosage avec l’insuline inutile. C’est une caractéristique particulièrement intéressante, car le traitement par insuline peut avoir une incidence sur le résultat de l’infection comme en témoigne par Watters et coll. (2014)14 qui décrit une augmentation du nombre de bactéries chez les animaux diabétiques traités à l’insuline infectés par P. aeruginosa biofilms comparativement à aucune homologues de l’insuline. En outre, dans notre modèle, il y avait une réduction drastique des taux de mortalité dans la cohorte glabre, indiquant que les animaux sont potentiellement plus résistantes en traitant de l’infection.

Une deuxième caractéristique de ce modèle est l’application de lisier inoculum biofilm pré-formé mesurée à infecter les plaies contrairement aux cellules cultivées planctoniques. En livrant une communauté bactérienne déjà métaboliquement complexe et structurée sur la plaie, les cellules bactériennes sont en mesure d’échapper au système immunitaire et les effets immédiats des biofilms sur les lésions peuvent être déterminés.

Le troisième avantage de ce nouveau modèle de la plaie est l’utilisation d’une souche microbienne capable de produire la bioluminescence pouvant être mesurée avec un in vivo d’imagerie pour localiser dans l’espace et de quantifier les bactéries. Cela permet un suivi en temps réel de l’évolution de biofilm au fil du temps. La souche de Xen 41 P. aeruginosa possède une seule copie stable de l’opéron luminescences P. luxCDABE sur le chromosome bactérien qui entraîne l’émission constitutive de la luminescence, qui peut être capturée par la caméra ultra-sensible dans le système d’imagerie. Cette fonctionnalité en temps réel, non invasif, le in situ permet de mesurer du biofilm par bioluminescence, alors même que l’attelle et le couvercle sont en place. Cette caractéristique diminue drastiquement le nombre d’animaux nécessaires par l’étude, tel qu’il est inutile de sacrifier les animaux à certains moments pour la surveillance du biofilm. Toutefois, la présence de biofilm et pus occlus mesure la cicatrisation des plaies. Dans cette étude, nous avons enlevé le pansement au jour 8 pour permettre la visualisation de la guérison des blessures, mais ce paramètre peut être modifié selon les questions abordées.

Enfin, comme le système d’imagerie est capable de détecter la bioluminescence jusqu'à 2,5 cm de profondeur, le modèle proposé est se prêtent à des thérapies antimicrobiennes des tests sous forme de solution ou de gels ou incorporés aux pansements occlusifs. Un modèle de surveillance de l’infection en temps réel permet la plus grande flexibilité mesurer l’impact des différentes concentrations de dosage et de durées par opposition à un essai statique de point final. Ce modèle peut contribuer à la validation de potentiels nouveaux traitements pour éradiquer les biofilms dans les plaies chroniques.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Les auteurs tiennent à remercier l’American Diabetes Association pour soutenir ce travail (Grant # #7-13-BS-180), la facilité de soutien Michigan State University Research technologie pour fournir la formation et l’accès à l' in vivo système d’imagerie et de la Michigan State University d’investigation histopathologie Lab pour traiter les biopsies de souris pour examen histopathologique.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Opsite Smith & Nephew Model 66000041 Smith & Nephew Flexfix Opsite Transparent Adhesive Film Roll 4" x 11yards
SKH-1 mice Crl:SKH1-Hrhr Charles River Breeding Laboratories SKH1 Hairless mice, 8 weeks old
Streptozotocin (STZ) Sigma Aldrich S0130-1G Streptozocin powder, 1g
AccuChek glucometer Accu-Chek Roche Art No. 05046025001 ACCU-CHEK CompactPlus Diabetes Monitoring Care Kit
Pseudomonas aeruginosa Xen 41 Perkin Elmer 119229 Bioluminescent Pseudomonas aeruginosa
Polycarbonate membrane filters Sigma Aldrich P9199 Millipore polycarbonate membrane filters with 0.2 μm pore size
Dulbelcco phosphate buffer saline (DPBS) Sigma Aldrich D8537 PBS
Tryptic soy agar Sigma Aldrich 22091 Culture agar
Meloxicam Henry Schein Animal Health 49755 Eloxiject (Meloxicam) 5mg/mL, solution for injection
10% povidone-iodine (Betadine) Purdue Products LP 301879-OA Swabstick, Betadine Solution. Antiseptic. Individ. Wrapped, 200/case
4% paraformaldehyde Fisher Scientific AAJ61899AK Alfa Aesar Paraformaldehyde, 4% in PBS
Capillary glass tube Fisher Scientific 22-362-566 Heparinized Micro-Hematocrit Capillary Tubes
Silicone to make splints Invitrogen Life Technologies Corp P-18178 Press-to-Seal Silicone Sheet, 13cm x 18cm, 0.5mm thick, set of 5 sheets
Tryptic soy broth Sigma Aldrich 22092 Culture broth
IVIS Spectrum Perkin Elmer 124262 In vivo imaging system
IVIS Spectrum Isolation chamber Perkin Elmer 123997 XIC-3 animal isolation chamber
HEPA filter Teleflex 28022 Gibeck ISO-Gard HEPA Light number 28022
Biopsy punches VWR International Inc 21909-142 Disposable Biopsy Punch, 5mm, Sterile, pack of 50.
Biopsy punches VWR International Inc 21909-140 Disposable Biopsy Punch, 4mm, Sterile, pack of 50.
Glucose J.T.Baker 1916-01 Dextrose, Anhydrous, Powder
Citric acid Sigma Aldrich C2404-100G Citric Acid
Mastisol Eloquest Healthcare HRI 0496-0523-48 Mastisol Medical Liquid Adhesive 2/3 mL vial, box of 48
Corning 96-well black plates Fisher Scientific 07-200-567 96-well clear bottom black polysterene microplates
25 gauge 5/8 inch needle BD 305122 Regular bevel needle
Bransonic M Ultrasonic Cleaning Bath Branson Ultrasonics N/A Ultrasonic Cleaner

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References

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  2. Gordois, A., Scuffham, P., Shearer, A., Oglesby, A., Tobian, J. A. The health care costs of diabetic peripheral neuropathy in the US. Diabetes Care. 26, (6), 1790-1795 (2003).
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