Perles base essai Multiplex pour l’analyse des profils de Cytokine de larme

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Analyse du film lacrymal permet de cytokines dans l’étude de diverses maladies oculaires. Dosages multiplex perle basé sont simples et sensibles et permettent l’essai de plusieurs cibles dans les échantillons de petits volumes. Nous décrivons ici un protocole pour tear film cytokine profilage à l’aide d’une perle basé essai multiplex.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Balne, P. K., AU, V. B., Tong, L., Ghosh, A., Agrawal, M., Connolly, J., Agrawal, R. Bead Based Multiplex Assay for Analysis of Tear Cytokine Profiles. J. Vis. Exp. (128), e55993, doi:10.3791/55993 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Film lacrymal est un mélange complexe de lipides, de protéines et de minéraux qui recouvre la surface externe de le œil, fournissant ainsi la lubrification, de nutrition et de protection pour les cellules sous-jacentes. Analyse des larmes est un domaine émergent pour l’identification de biomarqueurs pour la prédiction, diagnostic et pronostic des maladies oculaires différents. Larmes sont facilement accessibles et leur collection est non invasif. Donc, technologies avancées gagnent en importance pour l’identification de plusieurs analytes en larmes pour étudier les changements dans la composition de protéines ou de métabolite et son association avec certaines pathologies. Larme de cytokines sont des biomarqueurs idéales pour l’étude de la santé de la surface oculaire et aussi aider à comprendre les mécanismes des différents troubles de la surfaces oculaire comme maladie de le œil sec et conjonctivite vernal. Dosages multiplex perle basé ont la capacité de détecter plusieurs analytes dans une petite quantité d’échantillon avec une sensibilité plus élevée. Nous décrivons ici un protocole normalisé de prélèvement d’échantillons de larme, extraction et analyse des cytokines profilage à l’aide d’un cordon fonction essai multiplex.

Introduction

Larmes sont produites par la glande lacrymale et les glandes accessoires et enduire la surface externe de le œil. Film lacrymal est constitué d’une couche de lipides externe et une couche interne aqueuse contenant des protéines solubles, mucines et membrane liée mucines. Larmes prévenir les invasions microbiennes, fournissent des nutriments et fourniront une lubrification à la surface oculaire. Larmes agissent comme interface entre l’air et le tissu pour le transport de l’oxygène à la cornée. 1 film lacrymal est composé de protéines, des glucides, des lipides et des électrolytes. L’association entre les protéines de déchirure avec les maladies systémiques et oculaires comme le glaucome, maladie de sécheresse oculaire, conjonctivite vernal, mellitus de diabète, le cancer et l’Orbitopathie associé à la glande thyroïde a été identifiée dans plusieurs études. 2 , 3 , 4 échantillons lacrymal peuvent être recueillis par microcapillaire tubes ou écoulement lacrymal bandes (bandes Schirmer). En outre, test de la Schirmer est une procédure standard suivie dans la cornée et les cliniques de chirurgie réfractive, dont les résultats peuvent servir pour les tests d’analyse de cytokine. Prélèvement d’échantillons non invasifs, accessibilité du bio-spécimen et l’association de la composition de la déchirure avec diverses conditions physiologiques et pathologiques faire déchirer le film une source potentielle de biomarqueurs pour plusieurs maladies oculaires et systémiques. 4 , 5 , 6

Larme de cytokines joue un rôle important dans l’étude de la santé oculaire de surface et des inflammations des diverses maladies oculaires. 7 des concentrations anormales de plusieurs cytokines dans les échantillons de le lacrymogènes ont été signalées à être associée à la maladie de l’oeil sec, kératoconjonctivite vernal (VKC), kératoconjonctivite atopique (AKC), la conjonctivite allergique saisonnière et uvéite. 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 larme protéines peuvent être analysées par les méthodes traditionnelles comme la spectrométrie de masse, western blot et dosages immuno-enzymatiques (ELISA). 14 , 15 Toutefois, les limitations de ces méthodes sont une sensibilité médiocre et un plus grand volume d’échantillon requis pour l’analyse de plusieurs cytokines larme chez chaque patient. 16 , 17 épreuves multiplex perle basé ont été développés afin d’analyser plusieurs analytes dans des échantillons de mélange complexe et appliqués avec succès sur des échantillons de larme d’analyser plusieurs cytokines dans différentes maladies. 6 , 18 A combinaison de sandwich ELISA et techniques de cytométrie en flux permettent à ces tests devenir plus sensible que le test ELISA pour la quantification des analytes multiples dans un seul échantillon. 19 cette méthode peut être appliquée sur une variété d’échantillons cliniques et les surnageants de culture cellulaire et contribue à l’étude des réactions immunitaires dans plusieurs conditions physiopathologiques. 20 , 21 , 22 , 23 , 24

Il existe plusieurs études comparant multiplex perle basé dosages avec ELISA et ont signalé une corrélation entre les méthodes. Loo et coll. comparé perle basé essai multiplex avec classique ELISA pour la détection de l’adiponectine, résistine, la leptine et la ghréline dans des échantillons de sérum ou de plasma humain et a signalé une forte corrélation (r > 0,9) entre les essais. 25 Dupont et coll. a signalé une forte corrélation entre les dosages multiplex perle basé et ELISA pour la détection de l’IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IFN-ϒ et le TNF-α de la phytohémagglutinine et lipopolysaccharide stimulent le sang total recueillis auprès de femmes enceintes. 26 Pickering et coll. ont une autre forte corrélation entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection d’anticorps sériques à Haemophilus influenza type b polysaccharide (r = 0,96), anatoxines de Clostridium tetani (r = 0,96) et Corynebacterium diphtheriae (r = 0,91). 27 Biagini et coll. a signalé une forte corrélation positive (r = 0,852) entre essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection de Bacillus anthracis anti-PA IgG dans le sérum. 28 Wang et coll. a signalé une corrélation entre l’essai multiplex perle basé et ELISA pour la détection des biomarqueurs de la maladie d’Alzheimer amyloïde-β 42 (r = 0,77), tau totale (r = 0,94) et tau phosphorylée sur acides aminés 181 (r = 0,82) dans échantillons de liquide céphalorachidien. 29 de ces études ont démontré que l’applicabilité de perle issu des épreuves multiplex divers échantillons cliniques, exigences de volume plus petits échantillon et une corrélation avec la technique ELISA, qui rendent les épreuves multiplex perle basé à un prometteur alternative aux méthodes traditionnelles de ELISA pour la détection de plusieurs analytes dans différent type d’échantillons à des phénotypes différents de la maladie. Nous décrivons ici un protocole normalisé pour essai multiplex perle basé pour le profilage de la cytokine pour 41 analytes en larme échantillons prélevés sur des sujets en bonne santé en utilisant des bandes de Schirmer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

les protocoles utilisés dans cette étude ont été approuvées par la Commission de révision institutionnelle de Tan Tock Seng Hospital, Singapour.

1. analyse de Cytokine déchirer

  1. Collection de larmes :
    1. demander l’objet s’asseoir confortablement sur un fauteuil d’examen et de placer sa tête contre l’appui-tête.
    2. Poser la question à chercher, ouvrir les bandes de Schirmer (en filtre Whatman no 41) et placez délicatement l’extrémité arrondie de la bande sur le cul-de-sac inférieur de le œil et instruire le sujet à fermer les yeux pendant 5 min. Alors qu’elles ramassaient les larmes prennent particulièrement soin de minimiser le contact avec la surface oculaire. 30
    3. demander l’objet pour ouvrir ses yeux pour enlever la bande et le placer dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL. Transférer immédiatement le tube pour le laboratoire ou les conserver à-80 o C jusqu’au test pour le profilage de la cytokine.
  2. Élution d’échantillon de larme de languette d’écoulement :
    1. couper la languette de flux sur une longueur de 0,5 cm (pour normaliser la quantité de larmes à tester) et le placer dans un tube de microtubes stériles de 1,5 mL.
    2. Ajouter 30 µL de tampon de dosage et incuber à température ambiante pendant 5 min, suivi par centrifugation du tube à 14 000 x g pendant 1 min.
    3. Transvaser le surnageant dans un autre tube de microtubes de 1,5 mL et jetez la bandelette. Placer l’échantillon contenant le tube sur la glace et utiliser l’exemple de larme éluées immédiatement pour le profilage de la cytokine.
  3. Préparation des réactifs :
    Remarque : les analytes de quarante un à tester dans chaque échantillon de dosage multiplex perle basé sont interleukine (IL)-1α, IL-1β, IL-Rα, il-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 p40, p70 de IL-12, IL-13, IL-15, IL-17 a, interféron alpha (IFN-α) 2, IFN-γ, IFN-gamma-inducible protein 10 (IP-10, CXCL10), dérivé de macrophage chemokine (MDC), protéine inflammatoire macrophage (MIP)-1α et MIP-1β, monocyte protéine chimiotactique (MCP) -1, MCP-3, le facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), TNF-β, croissance régulée oncogène (GRO), alpha de facteur de croissance de tumeur (TGF-α), facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), facteur de croissance épidermique (EGF), fibroblastes facteur de croissance (FGF) -2, plaquettes dérivées de facteur de croissance (PDGF)-AA, PDGF-AB/BB, facteur stimulant les colonies de granulocytes (G-CSF), facteur de stimulation des colonies de granulocytes et macrophages (GM-CSF), éotaxine, fractalkine, soluble CD40 ligand (sCD40L), Fms-like ligand de tyrosine kinase 3 (Flt - 3L) et réglé lors de l’activation, lymphocytes normaux exprimée et sécrétée protéine (RANTES).
    1. Mettre les flacons de solution (50 X) anticorps perle à température ambiante (20-25 o C) et vortex les flacons pendant 1 min.
    2. Compter le nombre de puits nécessaires pour le dosage et calculer la quantité d’anticorps total perle cocktail solution (25 µL / puits) et chaque anticorps perle (50 X) requis pour le test.
    3. Préparer la solution cocktail en ajoutant le montant calculé de chaque anticorps perle solution et le remplissage jusqu’au volume final souhaité en ajoutant le montant restant de perle diluant. S’assurer que la concentration finale de chaque anticorps dans le cocktail est 1 X. Préparez toujours au moins 20 % volume supplémentaire de cocktail solution en cas d’erreur de pipettage.
      NOTE : À titre d’exemple, pour un dosage de 96 puits préparer 3000 µL de solution cocktail d’anticorps perle. La quantité nécessaire de chaque solution de perle anticorps = 3000/stock concentration de chaque solution de perle d’anticorps ; 3000/50 = 60 µL de chaque solution de perle d’anticorps
      1. ajouter 60 µL de chacune des solutions perle 41 anticorps (60 X 41 = 2460 µL) en cocktail bouteille et 540 µL de solution de diluant de perle s’ajoute le mélange de perle d’anticorps à faire 3000 µL de finale solution de travail (X 1).
      2. Avant toute utilisation, mélanger la solution cocktail perle correctement. Après le test de stocker le volume restant à 2-8 o C pendant 30 jours.
    4. Préparer les contrôles de qualité (QC) en ajoutant 250 µL désionisée eau aux stocks QC 1et 2 QC.
    5. Mélanger correctement de coucher les bouteilles plusieurs fois et vortex pendant 10 s. transfert la solution à correctement étiqueté polypropylène microtubes à centrifuger et stocker le reste de la solution à-20 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.
    6. Préparation du tampon de lavage en ajoutant 30 mL 10 X 270 mL d’eau désionisée solution tampon de lavage et bien mélanger (avant dilution, porter le tampon de X 10 à température ambiante et dissoudre tous les précipités de sels en mélangeant). Stocker le tampon de lavage inutilisés (1 X) à 2-8 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.
    7. Préparer le stock standard de cytokine humaine (10 000 pg/mL de tous les analytes) en ajoutant 250 µL désionisée eau le flacon en stock. Mélangez bien en inversant plusieurs fois et vortex le flacon pour 10 s. laissez-le reposer pendant 10 min et transférer la solution mère à correctement étiqueté polypropylène microtubes à centrifuger. Après l’essai, ranger le reste de la solution à-20 ° C, qui peut être utilisé jusqu'à 30 jours.
    8. Préparer les étalons de travail humain cytokine par dilutions successives 5 fois (50 µL - > 200 µL) avec tampon pour obtenir 2000, 400, 80, 16 et 3,2 pg/mL.
    9. Après une préparation standard, utiliser les normes de travail dans les 60 min et utilisez le tampon blanc/fond (-pg/mL).
  4. Cytokine profilage de perle basé essai multiplex :
    1. ramener tous les réactifs à température ambiante puis vortexer pendant 5-10 secondes avant de les ajouter à la Microplaque 96 puits. Si le lacrymogènes éluées échantillons sont conservés à -80 o C avant le test, décongeler les extraits de larme congelés sur la glace et centrifuger à 1000 X g pendant 5 min.
    2. Préparer une feuille de travail de dosage dans une configuration verticale pour étalons de cytokines humaines [0 (vide), 3.2, 16, 80, 400, 2 000 et 10 000 pg/mL], QC1, QC2 et échantillons.
    3. Ajouter 200 µL de 1 X tampon de lavage à chaque puits de la plaque, fermez-le hermétiquement avec film adhésif et gardez-le sur un agitateur de plaque à température ambiante (20-25 o C) pendant environ 10 minutes
    4. Décanter le tampon de lavage X 1 en inversant la plaque et tapez-le sur serviettes absorbantes plusieurs fois pour enlever toute la quantité résiduelle de tampon de lavage dans les puits.
    5. Ajouter 25 µL de chaque travail humain cytokine standard, QC1, QC2, vierge (tampon) et d’échantillons dans les puits appropriés.
    6. Ajouter 25 µL de tampon dans chaque puits.
    7. Ajouter 25 µL de 1 X anticorps perle cocktail solution dans chaque puits. Comme la solution de perle d’anticorps est sensible à la lumière, la flasque avec film adhésif et couvrez-la de papier d’aluminium pour protéger de la lumière pendant le test.
    8. Incuber la plaque à 4 o C pendant la nuit sur un agitateur.
    9. Placer la plaque sur la grille de la plaque d’une machine à laver automatique de plaques magnétiques. Laisser reposer pendant 1 min régler les billes magnétiques au fond du puits et aspirer le contenu bien. Ajouter 200 µL de tampon de lavage / puits et laisser reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Répéter le lavage une fois de plus (pour le lavage de la plaque, suivre le fabricant du kit ' instructions de s).
    10. Ajouter 25 µL de solution de détection des anticorps dans chaque bien, sceller la plaque, couvrez-la de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 60 min sur un agitateur.
    11. Ajouter 25 µL de Streptavidisolution n-phycoérythrine dans chaque puits, sceller la plaque, couvrez-la de papier d’aluminium et laisser incuber à température ambiante pendant 30 min sur un agitateur.
    12. Placer la plaque sur une rondelle plaque magnétique. Laissez-la reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Ajouter 200 µL de tampon de lavage par puits. Laissez-la reposer pendant 1 min et puis aspirer le contenu bien. Répéter le lavage.
    13. Ajouter 150 µL de liquide de gaine pour chaque bien et placer la plaque sur un agitateur pendant 5 min à température ambiante pour remettre en suspension les perles anticorps.
    14. Lire la plaque immédiatement à l’aide du talon basé lecteur de plaques d’essai multiplex et d’analyser les concentrations de cytokines à l’aide d’un algorithme de lissage 5 paramètres. Un diagramme de flux du profilage de cytokine de larme est illustré à la Figure 1.
  5. Lecture de la plaque d’essai (instrument mis en place) et l’analyse des données :
    1. Switch sur la pastille basé lecteur essai multiplex et chaud avant le laser pendant 30 min.
    2. Lancer le logiciel d’essai multiplex perle basé. En vertu de la ' Maintenance automatisée ' onglet, sélectionnez le ' Etalonnage-vérification ' option. Vortex chaque réactif flacon des perles d’étalonnage et de vérification pour 30 s. déposer 5 gouttes de chaque réactif dans les puits désignés. Remplir les réservoirs désignés d’éthanol 70 % et de l’eau désionisée.
    3. Créer un nouveau protocole
      1. ouvrir la ' protocoles ' page puis la ' protocoles ' onglet " créer un nouveau ProtocolŔ le ' paramètres ' onglet s’ouvrira.
      2. Dans le ' nom ', tapez le nom du protocole.
      3. Tapez une description dans la zone à droite de la ' nom ' boîte.
      4. Dans la ' Version ', tapez la version du protocole.
      5. Dans la ' fabricant ', tapez les informations du fabricant pour le protocole.
      6. Définir les paramètres dans le ' réglages d’Acquisition ' section comme suit. La valeur ' Volume ' : 100 µL, ' Timeout ' : 60 s ; ' DD Gating ' : 8 000 à 15 000 ; ' Reporter Gain ' : PMT Standard ; ' Type de perles ' : billes magnétiques.
      7. Définir les paramètres dans le ' paramètres d’analyse ', l’article en sélectionnant ' Quantitative ' comme le type d’analyse. La valeur ' nombre des normes ' : 6 ; ' Nombre de contrôles ' : 0 ; Cochez la ' signifie de réplique ' boîte ;
        Cochez la ' analyser les résultats tout en acquérant des échantillons ' boîte.
      8. Clic " NextŔ la ' Analytes ' onglet s’ouvre, cliquez sur les analytes désirés (ID de billes) dans la grille numérotée analyte.
      9. Click et le type de l’analyte correspondant le nom dans le ' nom ' colonne à droite de la grille de l’analyte (analytes ' noms et leurs détails de région perle correspondants ont été mentionnés dans le tableau 1).
      10. Cliquez sur et tapez l’unité de mesure (c'est-à-dire pg/mL) dans le ' unités ' case à gauche de la ' appliquer tout ' bouton. Puis cliquez sur " appliquer tout ".
      11. Cliquez sur et tapez le talon souhaité compter pour chaque analyte (c.-à-d. 50) dans le ' comte ' boîte. Cliquez sur " s’appliquent à tous les ".
      12. Clic " NextŔ ouvre l’onglet disposition de la plaque. Mettre en évidence les puits pour les normes et sélectionnez " 2 " moins comte de répliquer et cliquez sur le " S " bouton Standard. Répétez cette étape pour l’arrière-plan " B " et échantillons " U " puits.
      13. Cliquez " sauver ".
    4. Créer de nouveaux Lots de normes/contrôle
      1. ouvert le ' protocoles ' page et puis le ' normes & contrôles ' onglet " créer de nouveaux Lots Standard/contrôle ".
      2. Ouvert le ' sélectionner le protocole ' boîte. Sélectionnez le protocole qui a été créé à l’étape 1.5.3.
      3. -Clés dans la dénonciation des normes en conséquence : numéro du kit Std/Ctrl, nom kit Std/Ctrl, expiration et fabricant.
      4. Clé à la valeur de la norme plus élevée pour chaque analyte (c'est-à-dire 10000 pg/mL). Saisissez 5 en vertu de la dilution et cliquez sur " appliquer tout " pour générer automatiquement les concentrations prévues pour le reste des normes.
      5. Cliquez " sauver ".
    5. Créer un nouveau lot d’un protocole existant
      1. ouvert le ' lots ' page et cliquez sur " créer un onglet nouveau lot à partir d’un protocole existant ".
      2. Tapez le nom de la feuille dans le ' nom de la feuille ' zone, puis tapez une description du lot dans la ' Description facultative entrer ' boîte.
      3. Cliquez sur le protocole généré précédemment (à l’étape 1.5.3).
      4. Clic " NextŔ l’onglet suivant qui s’ouvre est la ' MST & baguettes ' onglet Afficher les détails des normes de test et sélectionnez " prochain ".
      5. Sur la ' schéma ' onglet, assigner des commandes bien pour ce lot et cliquez sur " enregistrer " pour enregistrer les informations de traitement par lots à le ' en attente de traitement par lots ' liste.
      6. Charger la plaque dans le lecteur de plaques d’essai multiplex perle basé, secouez-la pendant 5 min et exécuter le lot dans la liste de commandes en attente. Les données acquises seront enregistrées dans le format de fichier .csv.
  6. Analyse
    1. convertir le fichier .csv généré à partir du logiciel d’essai multiplex perle basé au format de fichier (fichier de données de résultats) .rbx en utilisant le logiciel de conversion de rbx. Lancez le logiciel de conversion, sélectionnez le fichier .csv sous xPONENT sélectionner fichier (s) et cliquez sur le " générer " bouton ; le fichier .rbx sera sauvegardé dans le dossier de sortie sélectionné.
    2. Lancer le logiciel d’analyse et ouvrez le fichier .rbx.
    3. Optimiser les courbes d’étalonnage à l’aide de l’ajustement de la courbe 4PL/5PL.
      1. Sélectionnez ce qui suit dans la ' courbe Standard ' onglet : ' régression Type ' : ' Logistic-5PLƆ ' axe Transformation ' : ' log - tique Ɔ linéaire (y) le ' afficher les lignes de gamme Conc ' boîte ; cochez la ' Show inconnu Échantillons ' boîte ; Cochez la ' montrer des échantillons de contrôle ' boîte ; Cochez la ' appliquer à travers tous les analytes ' boîte ; Cochez la ' afficher le rapport après optimisation ' boîte.
      2. Cliquez sur le " Optimize " bouton pour auto-optimisation.
    4. L’identité de l’échantillon sous l’étiquette ' entrez échantillon Info ' Tab
    5. Obtenir les concentrations observées dans les ' rapport Table ' onglet et cliquez sur " Exporter rapport table " pour générer les données dans un fichier de feuille de calcul pour une analyse ultérieure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Larme échantillons ont été prélevés de 8 yeux de 4 sujets sains en utilisant des bandes de flux lacrymal et des niveaux de cytokine ont été analysées à l’aide du protocole mentionné ci-dessus. Tous les sujets étaient des hommes et l’âge des quatre sujets était de 36, 42, 44 et 52 ans respectivement. Santé de surface oculaire et sécheresse oculaire la maladie a été évaluée par des tests cliniques (larme film rompre temps, de Schirmer test, coloration cornéenne, coloration conjonctive, examen de la glande de couvercle/Meibomius, larme cornée signes et signes visuels et symptômes) conformément à la Atelier international de l’oeil sec, lignes directrices 2007 et aucun des sujets a montré des signes et symptômes des maladies des yeux secs. 31

Hors les 41 cytokines analysés, 31 cytokines ont été détectés dans tous les échantillons de larme, TNF-α, MIP-1β et IL-17 a ont été détectés dans 7 yeux de 4 sujets, IL-4 a été détecté dans 6 yeux de 4 sujets, IFN-γ a été détecté dans 6 yeux de 3 sujets, IL-1 a a été détecté dans 5 yeux de subj 3 ECTS, éotaxine et IL-9 ont été détectés dans les 3 yeux de 2 sujets, IL-3 a été détecté dans 1 oeil et MIP-1α dans aucun des échantillons. Les concentrations moyennes ± écart-type des 41 cytokines détectés chez des sujets sains, à l’aide de dosage multiplex perle basé (Figure 2) ont été mentionnées dans le tableau 2. Hors des 41 cytokines analysés, IL-1ra a été trouvé à être fortement exprimée dans tous les échantillons avec la moyenne ± écart type de 203,9 ± 52,6 ng/mL et variait de 129.64 ng/mL à 271.7 ng/mL. Cytokines IP-10, GRO, MCP-1, PDGF-AA, Fractalkine, IL-8, EGF, PDGF-BB, VEGF et G-CSF étaient également fortement exprimée (quantités ng/mL) dans les larmes de sujets sains et les cytokines restants ont été exprimés en quantités pg/mL (tableau 2). La concentration la plus faible mesurée de cytokine de larme était TNF-α avec la moyenne ± écart-type de 27,25 ± 19.97 pg/mL et variait de 10.75 pg/mL et 56.02 pg/mL. 31 cytokines qui ont été détectés dans tous les échantillons, aucun n’a montré aucune différence statistiquement significative dans la concentration (p> 0,05) entre le œil droit et gauche t-test (Figure 3).

Figure 1
Figure 1 : diagramme schématique du profilage de cytokine de larme. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : déchirer les profils de cytokines chez les personnes saines. Nuage de points représentant montrant le journal moyenne ± SD concentrations de 41 cytokines en larme échantillons prélevés sur des sujets en santé. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : inter-oeil larme cytokine profil différences entre les sujets en bonne santé. Nuage de points représentant ne montrant aucune différence statistiquement significative (p> 0,05) en concentrations moyennes inter-oeil de 31 tear cytokines chez des sujets sains. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

S. n ° Analytes Région de perle
1 EGF 12
2 FGF-2 13
3 Éotaxine 14
4 TGF-Α 15
5 G-CSF 18
6 FLT - 3L 19
7 GM-CSF 20
8 Fractalkine 21
9 IFNΑ2 22
10 IFNΓ 25
11 GRO 26
12 IL-10 27
13 MCP-3 28
14 IL - 12P 40 29
15 MDC 30
16 IL - 12P 70 33
17 PDGF-AA 34
18 IL-13 35
19 PDGF-AB/BB 36
20 IL-15 37
21 sCD40L 38
22 IL-17 A 39
23 IL-1RA 42
24 IL-1Α 44
25 IL-9 45
26 IL-1Β 46
27 IL-2 48
28 IL-3 51
29 IL-4 53
30 IL-5 55
31 IL-6 57
32 IL-7 61
33 IL-8 63
34 IP-10 65
35 MCP-1 67
36 MIP-1Α 72
37 MIP-1Β 73
38 RANTES 74
39 TNFΑ 75
40 TNFΒ 76
41 VEGF 78

Tableau 1 : Des Analytes noms et les détails correspondants de région perle.

S. n ° Cytokine Nombre d’yeux Nombre de sujets Les concentrations moyennes SD
1 EGF 8 4 2610.29 1711.56
2 Éotaxine 3 2 404.73 260.76
3 FGF-2 8 4 827.73 262.44
4 FLT - 3L 8 4 475,4 133,6
5 Fractalkine 8 4 4179.08 1888.38
6 G-CSF 8 4 1287.57 633.16
7 GM-CSF 8 4 93.03 28.1
8 GRO 8 4 23176.87 18692.07
9 IFNa2 8 4 641.4 253.55
10 IFNg 6 3 76,6 42,81
11 IL-10 8 4 101,32 41,52
12 IL-12 p40 8 4 245.46 133.01
13 IL-12
P70 8 4 165.53 73.09 14 IL-13 8 4 685.84 272.92 15 IL-15 8 4 104.4 30,66 16 IL-17 A 7 4 164.32 28.69 17 IL-1 a 5 3 286.79 166.87 18 IL-1 b 8 4 63.98 18.29 19 IL-1ra 8 4 203892.58 52593.48 20 IL-2 8 4 78.35 25.15 21 IL-3 1 1 38,2 0 22 IL-4 6 4 268.94 120,84 23 IL-5 8 4 74.96 23,8 24 IL-6 8 4 86,97 27,78 25 IL-7 8 4 384.08 153.57 26 IL-8 8 4 3615.21 4677.5 27 IL-9 3 2 35.22 5.11 28 IP-10 8 4 87546.26 33256.53 29 MCP-1 8 4 10074.73 8205.5 30 MCP-3 8 4 376.13 120.68 31 MDC 8 4 968.08 309.39 32 MIP-1 b 7 4 199,72 84.79 33 PDGF-AA 8 4 5174.06 4103.97 34 PDGF-BB 8 4 2567.61 919.01 35 RANTES 8 4 742.41 457,57 36 TGF-a 8 4 407.82 339.12 37 TNFa 7 4 27,25 19.97 38 TNFb 8 4 124 24.16 39 VEGF 8 4 1601.2 776.85 40 sCD40L 8 4 932.1 509,27 41 MIP-1 a 0 0 0 0

Tableau 2 : Larme de profils de cytokines chez des sujets sains. Concentrations moyennes ± SD des 41 cytokines détectés chez des sujets sains, à l’aide de dosage multiplex perle basé.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Cytokines sont de petites protéines sécrétées cellulaires et puissants immunomodulateurs, régulation des réponses immunitaires. 32 les profils d’expression des cytokines divers échantillons sont associés à diverses pathologies de le œil et les études sur les cytokines profils aident à comprendre les mécanismes de la pathogenèse de la maladie, de déterminer l’état de santé oculaire, la larme gravité de la maladie, le diagnostic et la progression. 2 , 5 des concentrations de protéines plus faibles volumes petit échantillon sont les principaux défis des méthodes traditionnelles, limitant l’utilisation des dosages comme ELISA pour l’analyse des profils de cytokine de larme. 33 épreuves multiplex perle basé sont immuno-essais, qui ont des avantages distincts sur ELISA. Dosages multiplex perle basé nécessitent des volumes d’échantillon pour l’analyse de plusieurs analytes et sont très sensibles, capables de détecter des concentrations de picogramme de protéines dans les liquides biologiques. 34

Nous rapportons ici un protocole standardisé pour l’analyse quantitative des 41 larme cytokines chez les personnes saines à l’aide de dosage multiplex perle basé. Sur les 41 cytokines dans le panneau, essai multiplex perle basé 40 cytokines a détecté dans des échantillons de larme et ne pouvait pas détecter MIP-1α. Ce résultat négatif peut être parce qu’il y avait un niveau indétectable de MIP-1α dans des échantillons de larme en santé ou en raison d’un plus petit volume de larmes. Larme échantillons prélevés à l’aide de bandes de Schirmer ont un avantage sur les autres méthodes de collection telles que tube microcapillaire et éponges. Par exemple, dans plusieurs conditions cliniques, du volume du liquide lacrymal peut être mesuré par bandes de Schirmer et la larme fluide peut être élue de la bande de même après la mesure et utilisée pour l’analyse de cytokine. 35 si microcapillaire tubes sont régulièrement utilisés pour recueillir des larmes et de produire des profils plus cohérents de larme, la procédure prend plus de temps que la méthode de la bande est plus fastidieuse et peut être inconfortable pour les enfants et les autres patients. En outre, cette méthode peut également induire la production de larme réflexe en touchant la conjonctive et produire des résultats variables des profils de cytokine par rapport aux larmes basales, cela n’affecte la reproductibilité du dosage. 36 dans certaines affections comme la maladie de l’oeil sec, larme prélèvement de bandelettes de Schirmer est fiable pour l’analyse des protéines et aide à l’identification de biomarqueurs. 37 , 38

Dosages multiplex perle basé sont une combinaison de cytométrie en flux et ELISA multiplexe dans lequel analytes de l’échantillon sont pris en sandwich entre le recouverts d’anticorps spécifiques et la couleur codée billes magnétiques ou des anticorps de détection des microsphères et biotinylés. Ces complexes peuvent être détectés en ajoutant le conjugué de streptavidine-phycoérythrine (PE) molécule journaliste et exposition subséquente à un système de double laser dans un instrument mis à jour le flow cytometry. 39 dans un système de double laser, un laser excite les colorants internes et son signal représente l’enduit anticorps spécifique. Le deuxième laser excite le conjugué de molécule PE considérée lié à l’anticorps de détection complexe et l’intensité des signaux représentent la concentration de l’analyte.

La capacité des microsphères à être codés avec des teintures d’intensités variables permettent le dosage détecter jusqu'à 100 différents analytes dans un petit volume d’échantillon dans un puits unique. 39 bien que perle basé dosages multiplex sont rapide, reproductible et comparable au standards tests ELISA,34,40 cette méthode requiert des instruments consacrés, évaluation de kits et de la normalisation des protocoles pour spécimens biologiques différents. 39 la présence d’autoanticorps dans les échantillons cliniques peut-être affecter les résultats de multiplex perle basé. 34 , 39 pour utilisation en routine de ces tests en milieu clinique, il est recommandé d’utiliser les kits de test d’un fabricant spécifique. La sensibilité, la détection des concentrations absolues de cytokines et de reproductibilité faisaient varier avec les différents kits. Microarrays d’anticorps 41 ou puces à membrane sont très sensibles, des techniques de bon marché alternatif à haut débit qui détecte plusieurs analytes dans un petit volume d’échantillons et peuvent être appliquées avec succès sur larme échantillons pour l’analyse des cytokines et autres protéines. 35 , 42 Toutefois, nombreuses limitations existent, car ces tests sont temps consommé, semi quantitative, présentent un rapport signal sur bruit élevé et manquent des protocoles standardisés. 19 , 43

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer. Aucun intérêt financier ou les conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Le travail de recherche a été appuyé par la subvention du Centre de Tan Tock Seng Hospital personnalisé semences financement programme 2015 ; Singapour Eye Research Institut pilote Grant et Tan Tock Seng Hospital Pitch pour fonds de subvention.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Milliplex MAP human cytokine / chemokine magnetic bead panel -1 kit Merck, USA HCYTOMAG-60K-41
Flexmap 3D luminex instrument  Luminex Corp, Austin, TX, USA
xPonent software  Luminex Corp, Austin, TX, USA
RBXGenerator software BIO-RAD, France
Bio-Plex Manager 6.1 BIO-RAD, France
Plate shaker Corning, USA
TECAN Microplate Washer Tecan, Switzerland HydroSpeed
Vortex Genie 2 Scientific Industries inc, USA G560E
Pipettes Mettler Toledo, CA, USA
1.5ml microcentrifuge tube Axygen, USA MCT-150-C
Schirmer tear flow test strip Eye Care and Cure, USA 101657
Flexmap 3D Calibration Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-028
Flexmap 3D Verfication Kit Luminex Corp, Austin, TX, USA 40-029
Ocular examination chair

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. J Ophthalmol. 7542929, (2016).
  2. von Thun Und Hohenstein-Blaul, N., Funke, S., Grus, F. H. Tears as a source of biomarkers for ocular and systemic diseases. Exp Eye Res. 126-137 (2013).
  3. Pieragostino, D., D'Alessandro, M., di Ioia, M., Di Ilio, C., Sacchetta, P., Del Boccio, P. Unraveling the molecular repertoire of tears as a source of biomarkers: beyond ocular diseases. Proteomics Clin Appl. 9, (1-2), 169-186 (2015).
  4. Azkargorta, M., Soria, J., Acera, A., Iloro, I., Elortza, F. Human tear proteomics and peptidomics in ophthalmology: Toward the translation of proteomic biomarkers into clinical practice. J Proteomics. 150, 359-367 (2017).
  5. Hagan, S., Martin, E., Enríquez-de-Salamanca, A. Tear fluid biomarkers in ocular and systemic disease: potential use for predictive, preventive and personalised medicine. EPMA J. 7, 15 (2016).
  6. Rentka, A., et al. Membrane array and multiplex bead analysis of tear cytokines in systemic sclerosis. Immunol Res. 64, (2), 619-626 (2016).
  7. Zhou, L., Beuerman, R. W. Tear analysis in ocular surface diseases. Prog Retin Eye Res. 31, (6), 527-550 (2012).
  8. Jackson, D. C., et al. Tear Interferon-Gamma as a Biomarker for Evaporative Dry Eye Disease. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57, (11), 4824-4830 (2016).
  9. Agrawal, R., et al. A distinct cytokines profile in tear film of dry eye disease (DED) patients with HIV infection. Cytokine. 88, 77-84 (2016).
  10. Uchio, E., Ono, S. Y., Ikezawa, Z., Ohno, S. Tear levels of interferon-gamma, interleukin (IL) -2, IL-4 and IL-5 in patients with vernal keratoconjunctivitis, atopic keratoconjunctivitis and allergic conjunctivitis. Clin Exp Allergy. 30, (1), 103-109 (2000).
  11. Leonardi, A., Curnow, S. J., Zhan, H., Calder, V. L. Multiple cytokines in human tear specimens in seasonal and chronic allergic eye disease and in conjunctival fibroblast cultures. Clin Exp Allergy. 36, (6), 777-784 (2006).
  12. Enríquez-de-Salamanca, A., Calonge, M. Cytokines and chemokines in immune-based ocular surface inflammation. Expert Rev Clin Immunol. 4, (4), 457-467 (2008).
  13. Carreño, E., et al. Cytokine and chemokine tear levels in patients with uveitis. Acta Ophthalmol. (2016).
  14. Bjerrum, K. B., Prause, J. U. Collection and concentration of tear proteins studied by SDS gel electrophoresis. Presentation of a new method with special reference to dry eye patients. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 232, (7), 402-405 (1994).
  15. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31, (20), 3420-3427 (2010).
  16. Thakur, A., Willcox, M. D. Cytokine and lipid inflammatory mediator profile of human tears during contact lens associated inflammatory diseases. Exp Eye Res. 67, (1), 9-19 (1998).
  17. Wei, Y., Gadaria-Rathod, N., Epstein, S., Asbell, P. Tear cytokine profile as a noninvasive biomarker of inflammation for ocular surface diseases: standard operating procedures. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54, (13), 8327-8336 (2013).
  18. Topcu-Yilmaz, P., et al. Determination of tear and serum inflammatory cytokines in patients with rosacea using multiplex bead technology. Ocul Immunol Inflamm. 21, (5), 351-359 (2013).
  19. Hagan, S., Tomlinson, A. Tear fluid biomarker profiling: a review of multiplex bead analysis. Ocul Surf. 11, (4), 219-235 (2013).
  20. Choi, R., et al. Serum inflammatory profiles in pulmonary tuberculosis and their association with treatment response. J Proteomics. 149, 23-30 (2016).
  21. Kang, J. H., Vanderstichele, H., Trojanowski, J. Q., Shaw, L. M. Simultaneous analysis of cerebrospinal fluid biomarkers using microsphere-based xMAP multiplex technology for early detection of Alzheimer's disease. Methods. 56, (4), 484-493 (2012).
  22. Staples, E., Ingram, R. J., Atherton, J. C., Robinson, K. Optimising the quantification of cytokines present at low concentrations in small human mucosal tissue samples using Luminex assays. J Immunol Methods. 394, (1-2), 1-9 (2013).
  23. Inic-Kanada, A., et al. Comparison of ophthalmic sponges and extraction buffers for quantifying cytokine profiles in tears using Luminex technology. Mol Vis. 18, 2717-2725 (2012).
  24. Moncunill, G., Aponte, J. J., Nhabomba, A. J., Dobaño, C. Performance of multiplex commercial kits to quantify cytokine and chemokine responses in culture supernatants from Plasmodium falciparum stimulations. PLoS One. 8, (1), e52587 (2013).
  25. Loo, B. M., Marniemi, J., Jula, A. Evaluation of multiplex immunoassays, used for determination of adiponectin, resistin, leptin, and ghrelin from human blood samples, in comparison to ELISA assays. Scand J Clin Lab Invest. 71, (3), 221-226 (2011).
  26. Dupont, N. C., Wang, K., Wadhwa, P. D., Culhane, J. F., Nelson, E. L. Validation and comparison of luminex multiplex cytokine analysis kits with ELISA: determinations of a panel of nine cytokines in clinical sample culture supernatants. J Reprod Immunol. 66, (2), 175-191 (2005).
  27. Pickering, J. W., Martins, T. B., Schroder, M. C., Hill, H. R. Comparison of a multiplex flow cytometric assay with enzyme-linked immunosorbent assay for auantitation of antibodies to tetanus, diphtheria, and Haemophilus influenzae Type b. Clin Diagn Lab Immunol. 9, (4), 872-876 (2002).
  28. Biagini, R. E., Sammons, D. L., Smith, J. P., MacKenzie, B. A., Striley, C. A., et al. Comparison of a multiplexed fluorescent covalent microsphere immunoassay and an enzyme-linked immunosorbent assay for measurement of human immunoglobulin G antibodies to anthrax toxins. Clin Diagn Lab Immunol. 11, (1), 50-55 (2004).
  29. Wang, L. S., Leung, Y. Y., Chang, S. K., Leight, S., Knapik-Czajka, M., et al. Comparison of xMAP and ELISA assays for detecting cerebrospinal fluid biomarkers of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 31, (2), 439-445 (2012).
  30. Kalsow, C. M., Reindel, W. T., Merchea, M. M., Bateman, K. M., Barr, J. T. Tear cytokine response to multipurpose solutions for contact lenses. Clin Ophthalmol. 7, 1291-1302 (2013).
  31. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). The ocular surface. 5, (2), 75-92 (2007).
  32. Stenger, S., Röllinghoff, M. Role of cytokines in the innate immune response to intracellular pathogens. Ann Rheum Dis. 60, (2001).
  33. Li, S., et al. Antibody protein array analysis of the tear film cytokines. Optom Vis Sci. 85, (8), 653-660 (2008).
  34. Tighe,, Negm, O., Todd, I., Fairclough, L. Utility, reliability and reproducibility of immunoassay multiplex kits. Methods. 61, (1), 23-29 (2013).
  35. Dionne, K., Redfern, R. L., Nichols, J. J., Nichols, K. K. Analysis of tear inflammatory mediators: A comparison between the microarray and Luminex methods. Mol Vis. 22, 177-188 (2016).
  36. Sitaramamma, T., Shivaji, S., Rao, G. N. HPLC analysis of closed, open, and reflex eye tear proteins. Indian J Ophthalmol. 46, (4), 239-245 (1998).
  37. Saijyothi, A. V., et al. Two dimensional electrophoretic analysis of human tears: collection method in dry eye syndrome. Electrophoresis. 31, (20), 3420-3427 (2010).
  38. VanDerMeid, K. R., Su, S. P., Krenzer, K. L., Ward, K. W., Zhang, J. Z. A method to extract cytokines and matrix metalloproteinases from Schirmer strips and analyze using Luminex. Mol Vis. 17, 1056-1063 (2011).
  39. Khalifian, S., Raimondi, G., Brandacher, G. The use of luminex assays to measure cytokines. J Invest Dermatol. 135, (4), e31 (2015).
  40. Richens, J. L., Urbanowicz, R. A., Metcalf, R., Corne, J., O'Shea, P., Fairclough, L. Quantitative validation and comparison of multiplex cytokine kits. J Biomol Screen. 15, (5), 562-568 (2010).
  41. Berthoud, T. K., et al. Comparison of commercial kits to measure cytokine responses to Plasmodium falciparum by multiplex microsphere suspension array technology. Malar J. 10, 115 (2011).
  42. Boehm, N., Riechardt, A. I., Wiegand, M., Pfeiffer, N., Grus, F. H. Proinflammatory cytokine profiling of tears from dry eye patients by means of antibody microarrays. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52, (10), 7725-7730 (2011).
  43. Sack, R., Conradi, L., Beaton, A., Sathe, S., McNamara, N., Leonardi, A. Antibody array characterization of inflammatory mediators in allergic and normal tears in the open and closed eye environments. Exp Eye Res. 85, (4), 528-538 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics