طرق ونصائح للإدارة عن طريق الحقن الوريدي من الفيروسات المرتبطة بالغدد للفئران والتقييم لتوصيل الجهاز العصبي المركزي

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

وتغطي الطرق لتسليم الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع جينات في الفئران. في هذا المثال، الغرض هو تقليد مرض الذي يؤثر على كامل الحبل الشوكي. يمكن استخدام تنبيغ على نطاق واسع لتقديم بروتين علاجي للجهاز العصبي المركزي من إدارة مرة واحدة، والأجهزة الطرفية.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

نواقل الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) كاشف رئيسية في علوم الأعصاب متفاوت يكرر المتناوب القصير إينتيرسباسيد بانتظام (كريسبر)، أوبتوجينيتيكس، واستهداف لوكس cre، إلخ. والغرض من هذه المخطوطة مساعدة المحقق محاولة توسعية الجهاز العصبي المركزي (CNS) نقل الجينات في الفئران عن طريق حقن الوريد الذيل من إف. التعبير على نطاق واسع ذات الصلة للشروط مع علم الأمراض على نطاق واسع، ونموذج فأر كبير نظراً لحجم أكبر وأوجه التشابه الفسيولوجي للبشر مقارنة بالفئران. في تطبيق هذا المثال، يستخدم توصيل الخلايا العصبية على نطاق واسع لتقليد مرض الأعصاب يؤثر على كامل الحبل الشوكي، التصلب العضلي الجانبي (المرض). يمكن أيضا استخدام توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع كفاءة إيصال العوامل العلاجية البروتين في الدراسات ما قبل السريرية. بعد فاصل تعبير بعد حقن لعدة أسابيع، يتم تقييم الآثار المترتبة توصيل. لناقل تحكم البروتينات فلورية خضراء (التجارة والنقل)، تقدر كمية بروتينات فلورية خضراء في المخيخ بسرعة وبشكل موثوق بها برنامج تصوير أساسية. تعمل المرض الحركية التي هي الناجمة عن المرض ذات الصلة استجابة ترانساكتيفي البروتين البروتين الحمض النووي ملزم من كاتشين 43 (ماساتشوستس-43)، وسجل العجز منعكس الهروب وروتارود. أبعد من النمذجة المرض والعلاج الجيني، هناك مختلف التطبيقات المحتملة لاستهداف الجينات على نطاق واسع وصفها هنا. التوسع في استخدام هذا الأسلوب سوف تساعد في التعجيل بفرضية اختبار في علوم الأعصاب ونيوروجينيتيكس.

Introduction

الناقلة المؤتلف الفيروسات المرتبطة بالغدة (إف) أدوات لا غنى عنها للجهاز العصبي المركزي للبحث نظراً لأنها تتسم بالكفاءة حتى ترانسدوسينج الحية في الخلايا العصبية. إف الناقلة مرنة جداً لدراسة المتسلسلات مختلفة و isoforms البروتين والأنسجة المختلفة والمضيف مختلفة الأنواع وطرق مختلفة للإدارة. على سبيل المثال، يمكن أن تدار إف للفئران بأحد الأجهزة الطرفية، نسبيا غير الغازية، الحقن الوريدي ترانسدوسي الخلايا العصبية في جميع أنحاء الجهاز العصبي المركزي صيغته الأولى الموصوفة في فوست et al. ودوكي et al. (انظر ورقة جوف من جومباش et al. (2014)). 1 , 2 , 3 يستخدم هذا النهج إيصال الجينات في الفئران للتعبير عن كفاءة أما البروتينات الفلورية الخضراء (بروتينات فلورية خضراء) أو المتصلة المرض بالبروتين، استجابة ترانساكتيفي البروتين الحمض النووي ملزم من كاتشين 43 (ماساتشوستس-43) في الجهاز العصبي المركزي. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 العامل في الفئران هام للمعلمات الفسيولوجية والأيضية للفئران أقرب إلى البشر بالمقارنة مع الفئران وهناك فحوصات السلوكية والسمية التي صممت خصيصا للفئران. وعلاوة على ذلك، أصبحت أكثر من خطوط الفئران المعدلة وراثيا المتوفرة التي يمكن استخدامها في الدراسات نقل الجينات إف.

وترد تفاصيل أساليب لنقل الجينات CNS توسعية في الفئران، وتقدير النتائج سريعة وموثوق بها. توصيل الجهاز العصبي المركزي على نطاق واسع يستخدم لتقليد الأعراض للمرض في الفئران بالإعراب عن ماساتشوستس-43 في الحبل الشوكي. الأسلوب حقن الوريد ذيل ناقل ماساتشوستس-43 الفئران البالغين الشباب كالمستخدمة في جاكسون et al. 6 , 8 , 9 وبعد عدة أسابيع، هي سجل العجز الحركي الناجم عن ماساتشوستس-43 بطريقتين: الهروب العاكسة وروتارود كما استخدمت في دايتون وآخرون وجاكسون et al. 5 , 6 , 7 , 9 الذي يحسب لناقل بروتينات فلورية خضراء السيطرة، في تحليل الجثة، منطقة المخيخ فلوري كمؤشر لكفاءة توصيل المستخدمة في جاكسون et al. 6 , 8 تحليل المخيخ ثبت أن مؤشر سريع وموثوق بها لدرجة توصيل الجهاز العصبي المركزي بعد تسليم الجينات المحيطية، وينبغي أن تنطبق على مجموعة متنوعة من النهج محاولة نقل الجينات الطرفية للوسطي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات اتبعت المبادئ التوجيهية الملائمة للمعاهد الوطنية للصحة. كافة الإجراءات المتبعة البروتوكولات الحيوانية التي أقرتها لجنة الاستخدام في مركز العلوم الصحية خدمات المتعلمين في شريفبورت ورعاية الحيوان. واستخدمت هذا الإجراء إناث الفئران سبراغ داولي في 6 أسابيع عمر-

1-تحديد الجرعات/وحدات تخزين ناقل بحاجة

  1. وزن الفئران حقن وتحديد كمية النواقل الفيروسية اللازمة لكل الحيوانات استناداً إلى عيار (تركيز) لإعداد ناقلات الأمراض. استخدام جرعات المتجهات التي نجحت سابقا للتعبير الفعال في الفئران الجهاز العصبي المركزي (انظر جاكسون et al. 6).
    ملاحظة: ل AAV9، ماساتشوستس-43 أو بروتينات فلورية خضراء AAV9، جرعة نموذجية بين 3 × 10 13-1 × 10 14 ناقل جينومات/كغ. على الفئران البالغين الشباب في 6 أسابيع عمر تزن حوالي 150 غ.
  2. جعل جرعة مكافئة للكيلو في جميع الحيوانات لمقارنات منهجية. تأمين وحدة التخزين لا تتجاوز كميات حقن نصح القياسية (250-500 ميليلتر للفئران 250 غرام). وحدة تخزين حقن نموذجية 200 ميكروليتر للفئران البالغين صغار.

2. إعداد محطة العمل

  1. جمع كل ما يلزم من لوازم: واحد البارافين الفيلم ساحة (حوالي 5 × 5 سم) كل الحيوان، والكحول أحد إعداد لوحة كل الحيوانات، شاش منصات (2-3 للحيوان الواحد)، نصائح بيبيت، وميكروبيبيتي.
  2. تحضير السطح العامل عن طريق تنظيف السطح مع الإيثانول 70%. ضع وسادة تدفئة أسفل مع درجة حرارة تعيين إلى منخفض (~ 37 درجة مئوية). ضع وسادة مقعد على رأس لوحة تدفئة.
  3. التخدير
  4. تحضير الغاز (إيسوفلوراني). ضمان كافية الأوكسجين وغاز التخدير لهذا الإجراء. تنظيف القناع الدائرة والتخدير التعريفي مع الإيثانول 70%، ووضع قناع التخدير على لوح مقاعد البدلاء.

3. إعداد الموجه

  1. ذوبان الجليد في الموجه في درجة حرارة الغرفة، وتسمية أنبوب ميكروسينتريفوجي العقيمة واحد لكل الحيوانات.
  2. بيبيت تحدد حجم إف في خطوة 1.1 إلى الأنبوب المناسب وتحقيق حجم ما يصل إلى حجم الحقن المطلوب (هنا، 200 ميكروليتر) مع لاكتاتيد في المسابقة ' المالحة أو حل s-
  3. نبض دوامة العينة s 1-2 والنبض ثم الطرد المركزي ل 5 ق إحضار العينة إلى الجزء السفلي من الأنبوب.
  4. بيبيت حجم مجموع الحقن للفئران من الأنبوب وعلى الساحة من الفيلم البارافين.
  5. مكان إبرة قياس 30 على حقنه 1 مل.
  6. مكان الإبرة مع المجسم مشطوف الحواف أسفل داخل المتجهة على الفيلم البارافين. سحب على المكبس حقنه حتى تصبح جميع الفيروس في الإبر والمحاقن. كن حذراً لتجنب رسم فقاعات الهواء إلى الإبرة، الذي يصبح أسهل مع الممارسة.

4. إعداد الفئران

  1. بدوره الأوكسجين يصل إلى 1 لتر في الدقيقة وتعيين التخدير إيسوفلوراني إلى 5%. التأكد من أن تتدفق التخدير الغاز إلى قاعة التعريفي بالتحقق من جميع خراطيم توصيل وتوجهات محبس الحنفية.
  2. مكان الفئران في قاعة تحريض التخدير الغاز حوالي 3 دقائق، حتى الجرذان لا يستجيب.
  3. ضمان العمق الكافي للتخدير معسر إصبع القدم. ينبغي أن يكون هناك أي حركة في القدم أو الساق بعد رشة تو.
  4. تقليل التخدير isoflurane إلى 2% للمحافظة على التخدير وضبط محبس الحنفية حيث تتدفق إلى قناع التخدير التخدير.
  5. مكان الفئران ' s الآنف في قناع التخدير وضبط الفئران بحيث أنه يكذب على جانبها.
  6. التعرف على المنوال الذيل الأفقي.
    ملاحظة: عروق الذيل الأفقي تكمن في حوالي 10 و 2 س ' على مدار الساعة مع الظهرية أعلى الذيل 12 س ' على مدار الساعة. مع الفئران ملقاة على جانبها، يجب أن تواجه على المنوال الذيل الأفقي المكياج.
  7. مسح منطقة الحقن مع لوحة إعداد الكحول. موقع الحقن هو الثلثين أسفل طول الذيل.

5. حقن الناقل

  1. اعتقادا راسخا بالذيل قليلاً فوق منطقة الحقن باستخدام إصبع واحد مباشرة عبر الوريد الذيل الأفقي؛ وهذا سوف تمدد الوريد.
  2. مع المجسم مشطوف الحواف مواجها لأعلى، قم بمحاذاة الإبرة بالوريد الذيل مرئية في نفس الاتجاه.
  3. بيرس الجلد على المنوال ذيل بينما أخذ الحيطة لتجنب من ناحية أخرى عقد الذيل والضغط في هذا السياق ذيل.
  4. الإفراج عن ضغوط على المنوال الذيل للسماح بتدفق الدم الطبيعي.
  5. تحريك
  6. الإبرة الوريد. للتأكد من أن الإبرة قد ثقب الوريد الذيل، سحب قليلاً على المكبس. إذا كانت الإبرة في الوريد، وسوف تدفق الدم في الإبرة.
    1. تغيير موضع الإبرة حسب الحاجة. ثم تثبيت الإبرة، نقل اليد فوق موقع الحقن إلى أسفل موقع الحقن ويعقد نهاية المحاقن ضد الذيل.
  7. ببطء بحقن الناقل الذيل (حوالي 20 ميليلتر/s)-
    ملاحظة: السياق قد تفقد اللون كالتدفقات المتجهة من خلال ذلك. تتضمن علامات أن الحل تم حقن خارج هذا السياق بلبينغ، تبييض البشرة، أو مقاومة عند الحقن المتجه. مع الممارسة، يمكن التقليل من التعرض خارج الأوعية الدموية-
  8. بعد قد تم إدارته الناقل، إزالة الإبرة من الفئران واضغط وسادة شاش ضد موقع الحقن للمساعدة في وقف النزيف عن 30-60 س.

6. تنظيف

  1. إيقاف isoflurane التخدير والأوكسجين. مراقبة الفئران حتى أنه يستعيد وعيه، ومن ثم إعادته إلى قفصة.
  2. ضع
  3. بعناية جميع الإبر في حاوية الأدوات الحادة. التخلص من جميع المواد المتاح الأخرى التي يحتمل أن تكون ملوثة مع إف في حاوية واقية مناسبة. تنظيف محطات العمل مع الإيثانول 70%-

7. تقييم منعكس الهروب اللكتات

ملاحظة: العجز اللكتات تنشأ عادة من 2-6 أسابيع بعد نقل الجينات، ماساتشوستس-43، اعتماداً على الجرعة متجه.

  1. على سطح مستو واضحة من الحطام، مع اثنين من أصابع الاستيلاء على الفئران ' s الذيل حوالي 2 سم من الجسم. رفع الفئران بلطف حتى شنقاً الأمامية أثناء عرض الجانب البطني السفلي من الفئران.
    1. تنفيذ الإجراء أسبوعيا طوال الوقت-الدورة التجريبية بعد نقل الجينات (مثلاً، تصل إلى 12 أسبوعا بعد نقل الجينات).
      ملاحظة: أيضا نقاط العجز في فوريليمب بهذه الطريقة، ولكن العجز اللكتات أكثر من المحتمل أن يحدث في هذا النموذج، اعتماداً على الجرعة النواقل المستخدمة.
  2. مراقبة في هيندليمبس لملاحظة س. 10 إذا كان أحد أو كلا هيندليمبس نكشر نحو خط الوسط خلال 10 س.
  3. تكرار هذا الاختبار لما مجموعة ثلاث مرات مع 30 ثانية بين المحاكمات. إذا كان يتم مثبت هيندليمبس أحدهما أو كليهما لكل من ثلاث محاكمات، تظهر الفئران الخلل في السيارات. تسجيل البيانات (يدوياً في المذكرات) أما أحادية أو ثنائية اللكتات العجز الحالي إذا كان هناك انقباض عبر جميع المحاكمات الثلاث متسقة.

8. تقييم السيارات الدالة على روتارود

  1. لإعداد روتارود، ضع وسادة مقعد تحت روتارود وتعيين تسريع للثورات 4-40 في الدقيقة (لفة في الدقيقة) أكثر من 2 دقيقة (المعدل يزيد بدوره في الدقيقة ~0.3/s). وقت أسبوع 12-دورة تدريبية، تشغيل المواضيع في 2، 4، 8، ونقل 12 أسبوعا بعد الجينات.
  2. السماح
  3. الفئران لتأقلم إلى غرفة الاختبار عن 20 دقيقة
  4. لتدريب الفئران لاستخدامها في روتارود للمرة الأولى، أولاً ابدأ روتارود بسرعة تعيين 4 لفة في الدقيقة، ثم وضع الفئران في روتارود. السماح للفئران لسيرا على الأقدام للثورة كامل واحد لفة في الدقيقة 4، ثم البدء في تسريع والسماح للفئران للمشي على روتارود حتى أنه يقع. مواصلة التدريب حتى يمكن استمرار سيرا على الأقدام الفئران لمالا يقل عن 40 ثانية. وسيدرب سهولة الفئران صحية، والشباب البالغين بهذه الطريقة.
    1. في حالة الفئران مع إعاقة حركية ملحوظة، التي قد تمنع الفأر من تحقيق كمون أساس سقوط 40 s، توفر الفئران محاولات التدريب 3-5 قبل بدء التسجيل روتارود-
  5. لبدء اختبار روتارود، وضع الفئران في روتارود والبدء في التعجيل روتارود. ملاحظة الوقت الذي يسقط الفئران من روتارود؛ هذا هو زمن الوصول في الانخفاض. إذا كان لا يزال الفئران في روتارود بعد 120 s، كاب الدورة في هذه المرحلة وإزالة الفئران من روتارود وسجل زمن سقوط 120 س.
  6. تكرار الاختبار أكثر مرتين لما مجموعة ثلاث محاكمات. لتقليل تأثير التعب، الفضاء المحاكمات على الأقل 5 دقيقة عن بعضها البعض. متوسط عشرات المحاكمات الثلاث. هو جرذ الكبار فوائضه عادة لديها زمن الوصول متوسط سقوط > 40 س.
  7. مكان الفئران مرة أخرى في القفص، وتنظيف روتارود والمناطق المحيطة بها مع الإيثانول 70%-

9. التحديد الكمي لتعبير بروتينات فلورية خضراء في المخيخ

  1. تخدير الفئران ونتخلل مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ومن ثم بارافورمالدهيد 4%. تشريح المخ والحبل الشوكي وامتصاص الأنسجة في مثبت بين عشية وضحاها وثم نقلها إلى حل سكروز 30%. وبعد الموازنة، خفض 50 ميكرومتر المقاطع الاكليلية في مبضع انزلاق مع تجميد المرحلة 4 ، ، من 5 6-
  2. اختر
  3. 3-6 أقسام المخيخ التي متباعدة بشكل متساو في ودودة، الفص الوسطى من المخيخ. فلوريسسينتلي التسمية التجارة والنقل إلى أقصى حد الإشارة. استخدام جسم الأولية للتجارة والنقل في 1: 500 واستخدام جسم الثانوي مترافق أليكسا-488 في إضعاف رافعة 4 ، ، من 5 6-
    ملاحظة: انظر مراجع 4 ، ، من 5 6 للمزيد من التفاصيل عن أخذ العينات، تمزيقها، وتلطيخ الإجراءات.
  4. فوتوميكروجراف كل مقطع في منطقة محددة من الاهتمام مع عدسة تكبير منخفض باستخدام مجهر. استخدام هدفا X 2.5 (N.A. 0.12) وعامل تصفية مجموعة 10، 450-490/515-565 الإثارة/الانبعاثات). الاحتفاظ بإعدادات الكاميرا (التعرض مرات، مثلاً، 2 s) نفسه عبر عينات تحليلها. حفظ ك. ملف TIF.
  5. افتح
  6. في الصورة المجهرية في البرنامج صورة سليل متاحة على نطاق واسع؛ وسيتم فتح نافذتين. إغلاق الإطار المبين ك " "الألوان الجدولية" ".
  7. اختيار " خيارات "، ثم " SliceŔ الكثافة يتم الإشارة إلى طائفة من ظلال اللون الأحمر على نافذة البحث الجدول (طرفية). في الإطار، استخدم المؤشر لتعبئة في محدد بروتينات فلورية خضراء وسم فقط وتتوقف عندما تبدأ الخلفية غير محددة ليتم انتقاؤها في الصورة-
    ملاحظة: هذا سوف تبرز منطقة الفلورسنت في الصورة المجهرية كمياً. ينبغي أن يكون الأمثل الإعدادات لالتقاط كافة الخلايا الفلورسنت واضح على وجه التحديد. مع الممارسة، هذا الأسلوب يمكن تمييز التحديد fluorescence محددة.
  8. قبل قياس المجال الفلورسنت، أولاً التأكد من وجود القياسات التي أجريت في الوحدات الصحيحة (بكسل). للقيام بهذا، انقر فوق " تحليل "، ثم " ScaleŔ تعيين السطر الرابع ينبغي أن أقول " الوحدات ". من القائمة المنسدلة، اختر بكسل لقياس بكسل، ثم انقر فوق " موافق ". تبديل خيارات التحليل إلى " "الثقوب الداخلية تشمل" " لضمان إدراج خلايا الجسم بأكمله في التحليل-
  9. انقر فوق
  10. لقياس المنطقة الفلورسنت، " تحليل " ومن ثم انقر فوق " تدبير ". لمشاهدة هذه القيمة، انقر فوق " تحليل " ثم انقر فوق " ResultsŔ إظهار سوف تظهر نافذة نتائج. قياس المساحة الفلورسنت ستكون تحت عنوان المسمى " منطقة "-
  11. لضمان توحيد جميع القياسات، لا تقم بتغيير قيم مميزة في نافذة طرفية.
  12. مرة واحدة وقد سجلت جميع القياسات، متوسط القيم لكل الحيوانات (من 3-6 أقسام للحيوان الواحد). استخدام اختبار إحصائية مناسبة لمقارنة المناطق ترانسدوسيد بين المجموعات. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ينبغي أن تنشأ العاهات، ماساتشوستس-43 موتور المستحثة خلال 2-6 أسابيع حسب جرعة ماساتشوستس إف-43 المستخدمة (الشكل 1). سيؤدي إلى حقن الوريد الذيل غير ناجحة في جزئية أو لا العاهات؛ إف يجب أن تصل إلى مجرى الدم تنتج الأثر. سيؤدي إلى حقنه ناجح للتجارة والنقل إف في التعبير التجارة والنقل في جميع أنحاء المخ والحبل الشوكي بطريقة تعتمد جرعة متجه. عند استخدام المروج المؤتلف قوية للتعبير بالسيارة، الفيروس المضخم للخلايا الدجاج بيتا أكتين الهجين المروج، المعروف أيضا بالمروج المساعدة النقدية، وهناك التعبير الفعال في الجهاز العصبي المركزي فضلا عن عدة أنسجة أخرى مثل الكبد والقلب. 4 , 5 , 10 داخل الفئران الجهاز العصبي المركزي، عند استخدام AAV9 أو بي إف. ب ناقلات، النمط هو توصيل أساسا من الخلايا العصبية وتوصيل الدبقية متفرق، متفرقة فقط. 4 , 8 حيث لا يوجد فرق بين الجنسين في كفاءة توصيل لوحظ في الفئران باستخدام الأسلوب على نطاق واسع، تستخدم الإناث عادة لنقل الجينات عن طريق الحقن الوريدي سبب أوزانها أقل. 6

أسلوب التصوير شبه كمي ووصف سريعة وموثوق بها لأن هناك نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة. عينة غير ترانسدوسيد مقارنة بعينه ترانسدوسيد في الشكل 2 مع عينات كلا ملطخة بجسم التجارة والنقل. القيم التي تم جمعها من هذه العينات تشير إلى الضوضاء 0.3% (من القيم المسرودة في الشكل 2ود) في العينة غير ترانسدوسيد، التي يمكن أن تعتبر ضئيلة. ونظرا لأن نسبة الإشارة إلى الضوضاء ممتازة، هذا الأسلوب صالحة لإجراء مقارنات سريعة للظروف التجريبية مثل أنواع ناقلات والجرعة ناقلات، الجنس، والعمر، إلخ.

Figure 1
رقم 1. على نطاق واسع AAV9، ماساتشوستس-43 نقل الجينات للفئران يسبب إعاقة حركية التدريجي. أداء روتارود في 1-3 أسابيع بعد الجينات نقل عنصر تحكم التجارة والنقل أو الجينات ذات الصلة بالمرض، ماساتشوستس-43. المواضيع التي تم اختبارها قبل نقل الجينات، وأعرب عن القياسات اللاحقة كنسبة إلى النقطة الزمنية خط الأساس. وسيبقي الفئران غير معالجة عادية في روتارود من 60-90 ثانية في ظل هذه الظروف. وقد تم تعديل هذا الرقم من6.

Figure 2
رقم 2. الكمي السريع لمنطقة الفلورسنت الحاملات للتجارة والنقل في المخيخ بعد الإدارة إف الوريدية إلى الفئران. ، ب) عدم ترانسدوسيد عينة التي كانت ملطخة بجسم التجارة والنقل. ج، د) عينة من الفئران تلقي AAV9 التجارة والنقل. ب، د) يستخدم الخيار "كثافة شريحة" على "الصورة سليل" لإبراز منطقة نيون باللون الأحمر بشكل انتقائي، وثم بكسل الأحمر يتم حسابها عن طريق البرنامج. الخيار "شريحة الكثافة" ينبغي تسليط الضوء على كافة الخلايا الفلورسنت مرئية كما رأينا في C. منطقة حمراء المعرب عنها في كسل مربعة محسوبة بالبرنامج هو مبين في باء ودال الوقت وأشير إلى 4 أسابيع بعد حقن الوريد ذيل للتجارة والنقل AAV9 للفئران البالغين شباب بجرعة متجه 1 × 1014 ناقل جينومات/كغ. هو مقياس بار في أ مكم 536؛ التكبير نفسه في ألف-دال. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تم اختبار مجموعة متنوعة من طرق التسليم لناقلات إف: داخل متني، داخل-سيريبروفينتريكولار، داخل thecal، عن طريق الحقن الوريدي، داخل الآنف، وداخل العضلات، إلخ. قد يكون كل مسار مزايا محددة، فضلا عن العيوب. إدارة السياق ذيل إف للفئران الكبار وسيلة يمكن الاعتماد عليها لتحقيق توصيل متسقة من الجهاز العصبي المركزي. أسلوب الحقن الطرفية يتجنب إدخال قنية الحقن في أنسجة الجهاز العصبي المركزي وبالتالي كسبها. كفاءة الجهاز العصبي المركزي التعبير الذي يمكن أن يتحقق بهذه الطريقة هو أكبر ميزة لهذه التقنية. المزايا العملية الأخرى أن أسلوب الحقن جداً سريعة (حوالي 10 دقيقة لكل الحيوانات من البداية إلى النهاية)، وأن حقن الوريد الذيل ليست على درجة عالية من التقنية ويمكن يتقن ذلك بسرعة. ومن المؤكد أن عيب رئيسي ضرورة الكثير من عيار ارتفاع ناقلات الأمراض، التي ستكون قضية جدوى إذا محضرات إف أقل من 1 × 1013 ناقلات جينومات مليلتر. مع مزيد من الصقل لناقلات استهداف قدرات، يمكن أن يكون هذا النهج مفيداً للعلاج الجيني السريرية في المستقبل، نظراً لأن إيصال الجينات طريق طرفية وهكذا نسبيا غير الغازية. من ناحية أخرى، أكثر مباشرة داخل أو حقن السوائل يمكن أن تكون مفيدة في النهج السريرية والاكلينيكية لسببين: أكثر محدودية انتشار الموجه واستخدام جرعات أقل من ناقلات الأمراض.

في الفئران مع قتامة تصبغ، على المنوال الذيل قد يكون أكثر صعوبة لتحديد. لذلك، يمكن استخدام طرق بديلة للإدارة مثل حقن الرجعية-المداري أو حقن الوريد الوريد الصافن. حقن الرجعية-المداري استهداف سرير الشعرية كثيفة وهي بالتالي شبيه حقن الوريدي. للفئران، وربما للفئران أيضا، الأسلوب الرجعية-المداري قد يكون أسهل من حقن الوريد الذيل، ولكن أظهرت ثلاث دراسات تناسق كبير لحقن الوريد ذيل الفئران الكبار. 6 , 8 , 9 يستخدم معظم هذا العمل مروج المؤتلف قوية لمحرك التعبير التحوير، المروج المختلطة أكتين بيتا الدجاج الفيروس المضخم للخلايا. 10 إذا كان المجرب يرغب في تعيين حدود التعبير إلى الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي، مروج نوع معين خلية يمكن محاولة، على سبيل المثال المروج سينابسين. 8 , 11

وفيما يتعلق بطريقة التصوير، أنها طريقة سريعة وشبه كمي لتقدير كفاءة توصيل. إذا أجريت بشكل صحيح، ثم المقايسة تعطي تقديرات موثوقة لمنطقة ترانسدوسيد. يتم استدعاء الأسلوب المعيار الذهبي لعد الكائنات في أنسجة الجهاز العصبي المركزي ستيريولوجي. ويستغرق حوالي 75 دقيقة لكل الحيوانات لإجراء تحقيق ستيريولوجيكال في منطقة ذات الفائدة في الدماغ بينما أسرع في 20 دقيقة للحيوان الواحد أو حتى أقل عند الارتقاء بالأسلوب المبين. إذا كان يتم الاحتفاظ بجميع شروط متساوية وهو صحيح عينات من نفس المنطقة، النهج اتساق البيانات تناسق كبير من ستيريولوجي، ومجموعات كبيرة من عينات يمكن بسرعة تحليل جماعي.

وهناك عدد من الملاحظات التقنية الإضافية التي تتطلب مزيدا من النقاش. للقسم 1 فيما يتعلق بجرعات متجه، حددت جرعات ناقلات اللازمة للتعبير التحوير كفاءة في الفئران بالتجربة والخطأ، والاستجابة للجرعة في وانغ et al., دايتون et al.، وجاكسون وآخرون، فضلا السابقة الجرعات المستخدمة في الفئران (فوست et al. ودوكي وآخرون). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 التأكيد خطوة هامة، ويحتمل أن يحد من معدل هو إنتاج عالية-عيار إف محضرات لتحقيق جرعة فعالة.

3 القسم فيما يتعلق تحميل الموجه إلى الإبرة، فقاعات الهواء في الحل الحقن ينبغي تجنبها على أفضل وجه ممكن. يجب أن لا إشكالية كمية صغيرة من الهواء كهذا يمكن أن تخرج بالرئتين، ولكن يمكن أن يسبب كميات مفرطة من الهواء حقن الوريد انسداد وريدي هواء يحتمل أن يؤدي إلى الوفاة. 12 إذا كانت الفقاعات موجودة في المحاقن، يجب طرد الفيروس من المحاقن، وحقنه جديدة يجب أن يتم تحميل. لتجنب نشوء فقاعات، تأكد من موقف الإبرة قريبة من قطره من ناقلات الأمراض على بارافيلم مع المجسم مشطوف الحواف إلى الأسفل. عندما أخذت غالبية الناقل في الإبرة، ورسم ببطء شديد حتى حل المتبقية. وسوف تشكل جيب الجوي صغير في الجزء الخلفي من المحاقن. هذا هو الفضاء الميت، وسوف لا يكون حقن. لضمان أن يبقى نحو الجزء الخلفي المحاقن، تبقى المحاقن الأفقي أو أشار إلى الأسفل ولا نفض الغبار المحاقن.

للمادة 5 فيما يتعلق بالحقن، لضمان أن يدخل الحقن الوريد والأنسجة المحيطة الوريد، عندما تم إدراج الإبرة لا، سحب قليلاً على المكبس لخلق ضغط سالب في طرف الإبرة. كما ذكر، إذا كانت الإبرة في هذا السياق، ينبغي أن التدفق إلى الإبرة الدم وستكون مرئية في قاعدة الإبرة. بينما عن طريق الحقن الوريد، ينبغي أن يرى مقاومة تذكر عندما يتم وضع الإبرة على نحو ملائم. إذا تم مصادفة مقاومة كبيرة، فمن المحتمل أن يحدث الحقن الأنسجة الذيل كما هو موضح أعلاه. من الممكن أيضا للثقب عن طريق الوريد، تسبب "الوريد مهب"، عند زاوية أن يتم إدخال الإبرة حاد جداً، عند قياس الإبرة كبير جداً لهذا السياق، أو عندما تكون سرعة حقن سريعة جداً وضع الكثير من الضغط في هذا السياق. يمكن أن يحدث المنطلق مهب أثناء ثقب الأولية الوريد أو الحقن. لتجنب ثقب الوريد أثناء الحقن أو وجود الإبرة تصبح فكها من هذا السياق، ينبغي أن استقرت المحاقن بعقد نهاية المحاقن ضد الذيل كما ذكر. إذا يصبح فكها الإبرة أو حقنه ثانية مطلوب لسبب آخر، يمكن إجراء حقن الثانية أما بالوريد الذيل الأفقي على الجانب الآخر أو حتى أقرب إلى الجسم على نفس الجانب.

الباب 8، يتم تشغيل الإنزيم روتارود على فترات مدتها 4 أسابيع خلال التجربة. عادي، الفئران غير المعالجة قد عشرات أفضل عندما تكون أصغر سنا (4-6 أسابيع من العمر) من كبار السن. يتم رسم أوجه العجز في المعاكسة الهروب كالبقاء على قيد الحياة من أطرافهم الدالة على مر الزمن. ويتم تحليل منحنيات البقاء على قيد الحياة باختبار رتبة سجل في البرنامج المنشور.

للمادة 9 فيما يتعلق بتحليل توصيل، مع الممارسة، يصبح هذا الإجراء سريع نسبيا، يستغرق حوالي 20 دقيقة للحيوان الواحد أو أقل. هذا التحليل أيضا درجة عالية من الموثوقية لانسجة غير ترانسدوسيد التي يتم معالجتها مع بروتينات فلورية خضراء تلطيخ الداخلي (قراءة لا تذكر أساساالشكل 2)، ونظرا لوجود مجموعة واسعة ديناميكية لقراءات. معظم الأسفار بروتينات فلورية خضراء مشتقة من خلايا بوركنجي ترانسدوسيد، وبالتالي أعدادهم كبيرة توفر مجموعة كبيرة ودينامية. حتى الآن، لم تسبب كفاءة نقل الجينات يتحقق القراءات تشبع عبر الحقل بأكمله (أي نسبة 100% توصيل خلايا بوركنجي)، على الأقل عندما تتولى نقل الجينات للفئران الكبار. إذا تشبع الحقل بأكمله كانت مشكلة، ثم الإشارة يمكن أن تخفض بتطبيق أقل جرعة ناقلات الأمراض في الحيوانات منفصلة أو بقياس فقط الأضعف، الأصلية بروتينات فلورية خضراء الأسفار، التخلي عن الإجراء المصبوغة. ومن المؤكد أيضا المساهمة توصيل أنواع الخلايا الأخرى في المخيخ للإشارة، ولكن معظم ما هو العيان وحسابها عن طريق البرنامج هو وضوح الهيئات الخلية في طبقات خلايا بوركنجي واشجارهم الجذعية في الجزيئية الطبقات في جميع أنحاء المخيخ، على أساس الموقف المعروف ومورفولوجيا. يشكل تحديا كبيرا للأسلوب هو أن فقاعات الهواء أو الحطام الفلورسنت يمكن الاعتماد عليه، وبالتالي الذي سوف تلوث القراءات. لا تستخدم المقاطع والحقول مع هذا الضجيج؛ عينات نظيفة خالية من الضوضاء غير محددة مطلوبة. حيث التجارة والنقل بروتين أجنبية، هناك لا ضجيج الخلفية داخل الأنسجة، حيث يمكن القبض على الأسفار محددة تحديداً والمقدرة. في هذه الدراسات، واستولت في لون photomicrographs بروتينات فلورية خضراء وثم تحويلها إلى درجات الرمادي باستخدام برنامج تصوير خلاف "الصورة سليل". بيد أنه سيكون أكثر وضوحاً للقبض التجارة والنقل بالأسود والأبيض في المقام الأول للتحليل اللاحق في "صورة سليل". تحليل الدراسات السابقة توصيل الحبل الشوكي الخلايا العصبية الحركية السفلي على أساس النسبة مئوية، أي النسبة المئوية للإعراب عن التجارة والنقل موتونيورونس. 4 , 6 ومع ذلك، تحليل المخيخ هو أكثر سرعة، التي تحتاج إلى عدد أقل من الفروع ويبدو أيضا أن يكون أكثر اتساقا وموثوق به جداً (على سبيل المثال، عبر المراقبين الفردية مما يجعل التقييمات). وبالتالي طريقة تصوير الدماغ السريع سريع مؤشر جيد لنجاح نقل الجين الطرفية للوسطي. وأبلغ تحليلات لتوصيل الحبل الشوكي وأمثلة لتوصيل لمواقع أخرى في الجهاز العصبي الفئران في وانغ et al., et al.، دايتون، وجاكسون et al. 4 , 5 , 6

وباختصار، الطريق الوريدي الإدارة كسبها؛ يمكن استهداف الجهاز العصبي المركزي الإدارة طرفية دون وضع إبرة في الدماغ أو الحبل الشوكي. جنبا إلى جنب مع مزيد من الصقل للاستهداف، العلاج الجيني ما قبل السريرية والسريرية ذات الصلة وستواصل استخدام التسليم عن طريق الحقن الوريدي، بينما العديد من أنواع المستقبل عدد لا يحصى من الدراسات الفنية الأساسية في الفئران يمكن أن تستفيد من توصيل توسعية في السعي إلى التعجيل باختبار الفرضية لوظيفة الجينات المجراة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المرض المداواة كاريوفارم، رابطة، وجهازا ميرا وهبة خيرية لأبحاث المرض من لوسون توماس، ونحن ممتنون. ونحن نشكر بستان اليسي ودونا بورني للمشورة والتدريب. جاس تدعمها "المؤسسة كذب" و "المعاهد الوطنية للصحة" منح GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17, (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18, (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21, (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22, (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17, (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20, (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23, (5), 237-246 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics