Методы и советы для внутривенного введения аденоассоциированный вирус для крыс и оценки трансдукции центральной нервной системы

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Рассматриваются методы для доставки генов широкомасштабной центральной нервной системы, крыса. В этом примере предназначен для имитации заболевание, которое влияет на весь спинной. Широко трансдукции может использоваться для доставки терапевтических белков ЦНС от одноразовых, периферических администрации.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются ключевым реагента в нейробиологии кластерного регулярно interspaced короткие палиндром повторяется (ТРИФОСФАТЫ), Оптогенетика, КРР lox ориентации и т.д. Цель этой рукописи заключается в помощи следователь, попытки переноса генов экспансивного центральной нервной системы (ЦНС) крыс через хвост инъекции Вену AAV. Масштабное выражение имеет важное значение для условий с широко распространенной патологией, а крысы модель является значительным из-за его большего размера и физиологического сходства для людей, по сравнению с мышей. В этом примере приложения широкомасштабные нейрональных трансдукции используется для имитировать нейродегенеративные болезни, которая затрагивает весь спинного мозга, боковой амиотрофический склероз (ALS). Эффективное широкомасштабное ЦНС трансдукции также может использоваться для доставки терапевтических белков факторов в доклинических исследований. После интервала впрыска выражение несколько недель оцениваются последствия трансдукции. Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) управления вектора количество GFP в мозжечке оценивается быстро и надежно базовой программы обработки изображений. Для мотор болезни фенотипов, которые индуцированных ALS связанных с белком transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43), дефицит забил побег рефлекс и rotarod. Помимо моделирования заболевания и генной терапии есть различных потенциальных приложений для ориентации масштабе гена, описанных здесь. Расширенное использование этого метода будет помощь в ускорении гипотез в нейробиологии и нейрогенетики.

Introduction

Рекомбинантных аденоассоциированный вирус (AAV) векторы являются незаменимыми инструментами для исследования ЦНС, потому что они настолько эффективны для преобразователя нейронов в естественных условиях. Векторы AAV очень универсальны для изучения различных трансгенов и изоформ белка, различных тканей, различными видами и различные маршруты администрации. Например Аав может управляться мышей периферических, относительно неинвазивный, внутривенные инъекции передавать нейронов в ЦНС, впервые описаны в Фоаст et al. и Дуке и др. (см. JOVE документ, Gombash и др. (2014)). 1 , 2 , 3 этот ген доставки подход используется в крыс эффективно выражать либо Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) или ALS связанные белком, transactive ответ ДНК связывающих белков 43 кДа (TDP-43) в ЦНС. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 работа крыс важна потому, что крыса физиологических и метаболических параметров ближе к людям по сравнению с мышей и есть поведенческих и токсикологические анализы, разработанный специально для крыс. Кроме того, более трансгенных крыс линии становятся доступными, могут быть использованы в AAV гена передачи исследований.

Методы подробно для экспансивного переноса генов ЦНС в крыса и быстрой, надежной количественной оценки результатов. Широкомасштабные ЦНС трансдукции используется для имитации симптоматика ALS крыс, выразив TDP-43 во всем спинного. Этот метод является инъекции Вену хвост TDP-43 вектора для молодых взрослых крыс используется в Джексон и др. 6 , 8 , 9 после нескольких недель, TDP-43-индуцированной моторного дефицита забил двумя методами: побег рефлекс и rotarod, используемый в Дейтоне et al. и Джексон и др. 5 , 6 , 7 , 9 для управления GFP вектор, в посмертный анализ, флуоресцентный области мозжечка рассчитывается как индекс электромеханической эффективности, используемые в Джексон и др. 6 , 8 анализ мозжечка оказался быстрый и надежный индекс степени трансдукции ЦНС после родов периферийных гена и должен быть применим к целый ряд подходов, попытки переноса генов периферической и Центральной.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

все процедуры, соответствующие руководящие принципы НИЗ. Все процедуры за животных протоколы, которые были утверждены животное уход и использование Комитетом на LSU медицинских наук центр в Шревепорте. Sprague-Dawley, самок в возрасте 6 недель были использованы для выполнения этой процедуры.

1. определить дозы/томов вектора необходимо

  1. взвешивание крыс вводиться и определить количество вирусных вектора, необходимые для каждого животного, основанный на титр (концентрация) вектор подготовки. Использование векторных доз, которые ранее были успешными для эффективного выражения в крыса ЦНС (см. Джексон и др. 6).
    Примечание: для AAV9 TDP-43 или AAV9 GFP, Типичная доза составляет 3 x 10 13 - 1 x 10 14 вектор геномов/кг. Молодых взрослых крыс в возрасте 6 недель весят около 150 г.
  2. Сделать эквивалентных доз / кг у всех животных для систематического сопоставления. Убедитесь, что громкость не превышает стандартный рекомендуется инъекции томов (250-500 мкл для крысы 250 g). Типичная инъекции объем-200 мкл для молодых взрослых крыс.

2. Подготовка рабочей станции

  1. собрать все необходимые принадлежности: один фильм парафин площадь (около 5 х 5 см) на животное, один алкоголя подготовка площадки за животных, марлевые подушечки (2-3 на животных), накапайте советы и микропипеткой.
  2. Подготовка рабочей поверхности путем очистки поверхности с 70% этиловом спирте. Место грелку вниз с температурой, значение низкий (~ 37 ° C). Место скамейке площадку на вершине электрогрелки.
  3. Подготовки газа анестезии (изофлюрановая). Обеспечение достаточного количества кислорода и газа анестезии для процедуры. Очистить индукции камеры и анестезии маска с 70% этиловом спирте и место анестезии маску на скамейке pad.

3. Подготовьте вектор

  1. оттепель вектор при комнатной температуре и пометьте один стерильные microcentrifuge пробирку для каждого животного.
  2. Объем AAV установлено в Пипетка шаг 1.1 в соответствующую трубку и доводят объем до желаемого инъекции объем (здесь, 200 мкл) с лактат Рингера ' s решения или физиологическим.
  3. Пульс вихря образца для 1-2 секунд и затем пульс центрифуги для 5 s принести образец в нижней части трубки.
  4. Пипетки объем всего инъекции для крыс из трубки и на площади парафина фильма.
  5. Место 30 иглы на 1 мл шприц.
  6. Место иглы с наклона вниз в вектор на пленке парафина. Тяните обратно на поршень шприца, до тех пор, пока вирус находится в игл и шприцев. Будьте осторожны, чтобы избежать появления пузырьков воздуха в иглу, которая становится легче с практикой.

4. Подготовьте крыса

  1. поверните кислорода до 1 Л/мин и установите изофлюрановая анестезии до 5%. Убедитесь, что анестезии газ течет к палате индукции путем проверки всех соединительных шлангов и ориентации запорный.
  2. Место крыса в газовой камере индукции анестезии около 3 минут, пока крыса безответный.
  3. Обеспечить адекватной глубины анестезии, защемления ног. Движение в ногу или ноги не должно быть после мыс щипок.
  4. Сократить изофлюрановая анестезии до 2% для поддержания анестезии и настроить краном, так, что течет анестезия анестезии маске.
  5. Место крыса ' s нос в маске анестезии и отрегулировать крыса, таким образом, чтобы она лежала на своей стороне.
  6. Определить боковые хвост вен.
    Примечание: Боковые хвост вен лежат на примерно 10 и 2 o ' часы с спинной верхней части хвоста 12 o ' часы. С крысы, лежа на боку, боковые хвост вен должны быть обращены вверх
  7. Инъекция протрите спиртом салфеткой подготовки. Место инъекции составляет две трети по длине хвоста.

5. Придать вектор

  1. твердо держать хвост слегка выше области инъекции с одним пальцем прямо над боковой хвост вен; это будет расширяются вены.
  2. С наклонной вверх, выровнять иглой с видимой хвост вен в том же направлении.
  3. Проколоть кожу над хвост вен во время принимая большую осторожность, чтобы избежать с другой стороны, держа хвост и нажав на хвост вен.
  4. Давление из Вены хвост для нормального кровотока.
  5. Перемещения иглы в Вену. Чтобы убедиться, что игла прокола Вены хвост, потяните слегка на поршень. Если игла находится в том ключе, в иглу прольется кровь.
    1. Репозиция иглы при необходимости. Затем, для стабилизации иглы, переместить руку выше место инъекции для ниже укола и прижмите хвост конце шприца.
  6. Медленно вдохнуть вектор в хвост (примерно 20 мкл/s).
    Примечание: Вен может потерять цвет вектора потоков через него. Признаки того, что решение было впрыснуто вне Вены включают блеббинг, побледнение кожи, или сопротивление при внутривенном введении вектор. С практикой, могут быть минимизированы экстра сосудистой экспозиции.
  7. После того, как под вектор удалите иглу из крыса и нажмите марлевой против укола, чтобы помочь остановить кровотечение для 30-60 s.

6. Очистка

  1. выключить изофлюрановая анестезии и кислорода. Контролировать крыс до тех пор, пока он приходит в сознание и затем вернуть его к своей клетке.
  2. Тщательно место все иглы в Шарпс контейнер. Утилизация всех других одноразовых материалов, которые являются потенциально загрязненных AAV в контейнер соответствующей биологической. Очистите рабочие станции с 70% этанол.

7. Оценивать задних конечностей побег рефлекс

Примечание: задних конечностей дефициты обычно возникают 2-6 недель после переноса генов TDP-43, в зависимости от дозы вектора.

  1. На плоской поверхности очищают от мусора, с двумя пальцами захватить крыса ' s хвост примерно 2 см от тела. Поднимите крысы аккуратно Передние конечности висят во время просмотра вентральной нижней крысы.
    1. Выполнять процедуру раз в неделю на протяжении экспериментальной время-после переноса генов (например, до 12 недель после переноса генов).
      Примечание: Также оценка дефицита передних конечностей таким образом, но дефицит задних конечностей чаще встречаются в этой модели, в зависимости от дозы вектора используется.
  2. Наблюдать гомотерия за 10 с. Примечание, если один или оба гомотерия сжимал к срединной линии в течение 10 s.
  3. S
  4. повторите этот тест для в общей сложности три раза с 30 между испытаниями. Если один или оба гомотерия сжал для каждого из трех процессов, крыса показывает моторные дисфункции. Запись данных (вручную в примечаниях) как либо нынешнего дефицита односторонние или двусторонние задних конечностей, если есть последовательно сжимая через все три судебных процесса.

8. Оценивать моторную функцию на rotarod

  1. для настройки rotarod, разместите площадку скамейке под rotarod и установите ускорение в 4-40 оборотов в минуту (об/мин) в течение 2 мин (ставка увеличивается на ~0.3 об/мин/s). Для 12-недельный курс, запустить субъектов в 2, 4, 8 и 12 недель после гена передачи.
  2. Позволяют крысы акклиматизироваться к тестирования номер на 20 мин
  3. Обучить крыса использовать rotarod для в первый раз, сначала запустите rotarod на скорости 4 об/мин, а затем место крысы на rotarod. Крыса ходить за один полный оборот на 4 об/мин, а затем начать ускорение и выполнение крыса ходить на rotarod, до тех пор, пока он падает. Продолжить обучение, пока крыса может последовательно ходить по меньшей мере 40 s. Здоровые, молодых взрослых крыс будет легко подготовленных таким образом.
    1. В случае крыса заметно страдает двигательными нарушениями, которые могут помешать крыса достижения базового задержка падать 40 s, предоставляют крысы 3-5 попытки подготовки перед началом забил rotarod.
  4. Начать rotarod проверки, место крысы на rotarod и начать ускорение rotarod. Обратите внимание на время, в котором крысы падает с rotarod; Это задержка падать. Если крыса остается на rotarod после 120 s, крышка на этом этапе сессии, удалить крысы из rotarod и запись падения задержки 120 s.
  5. Повторить тестирование еще два раза в общей сложности три судебных процесса. Чтобы свести к минимуму эффект усталости, космические испытания по крайней мере 5 минут друг от друга. Средние результаты трех испытаний. Ненарушенный взрослых крыс, как правило, имеет среднюю задержку для падения > 40 s.
  6. Крыса обратно в клетке и чистой rotarod и прилегающих районах с 70% этанол.

9. Количественная оценка экспрессия гена GFP в мозжечке

  1. анестезировать крыс и perfuse-фосфатный буфер (PBS), а затем параформальдегида 4%. Вскрыть головного и спинного мозга и замочить тканей в фиксатор на ночь, а затем переместите их на 30% раствор сахарозы. После уравновешивания, вырезать 50 мкм корональных секций на раздвижные микротом с замораживанием этап 4 , 5 , 6.
  2. Выбор разделов 3-6 мозжечка, которые равномерно распределены в червя, Центральный мочку мозжечка. Дневно обозначить GFP для максимального сигнала. Использовать основное антитело для GFP в 1: 500 и использовать Alexa-488 конъюгированных вторичное антитело в разведении 1: 300 4 , 5 , 6.
    Примечание: См. ссылается на 4 , 5 , 6 для более подробная информация о взятии проб, секционирование и пятнать процедур.
  3. Photomicrograph каждый раздел в регионе определенный интерес с низким увеличением объектива, с помощью микроскопа. Использование 2,5 X цель (н.а. 0.12) и фильтр установить 10, 450-490/515-565 возбуждения/выбросов). Сохранить настройки камеры (воздействия раз, например, 2 s) то же самое через образцы для анализа. Сохранить как. TIF файлов.
  4. Открыть Микрофотография в программе широко доступны изображения Scion; два windows откроет. Закройте окна указывается как " индексированных цветов ".
  5. Выбрать " варианты ", затем " плотность SliceŔ спектр оттенков будет указываться красным цветом в окне просмотровые таблицы (LUT). В окне, используйте курсор для заполнения конкретных GFP маркировки только и остановить когда неспецифической фон начинает быть взял на изображении.
    Примечание: Это будет выделить области флуоресцентные Микрофотография чтобы быть количественно. Параметры должны быть оптимизированы специально захватить все заметно люминесцентные клеток. С практикой, этот метод можно точно выделить конкретные флуоресцирования.
  6. Перед началом измерения флуоресцентные области, сначала обеспечить измерения, произведенные в правильной единицах (пикселях). Чтобы сделать это, нажмите кнопку " анализ ", то " набор ScaleŔ четвертая строка должна сказать " единиц ". Выберите из раскрывающегося списка, точках измерения в точках, а затем нажмите " ОК ". Переключать опции анализа на " включают интерьер отверстия " для обеспечения включения всего тела клетки в анализе.
  7. Нажмите
  8. для измерения области флуоресцентные, " анализ " и затем нажмите кнопку " мера ". Чтобы увидеть это значение, нажмите " анализ " нажмите " Показать ResultsŔ появится окно результаты. Флуоресцентный области измерения будет под заголовком помечены " область ".
  9. Для обеспечения стандартизации через измерения, не изменяйте значения выделенной в окне LUT.
  10. После того, как были зарегистрированы все измерения, средние значения для каждого животного (от 3-6 секций на животное). Для сравнения transduced области между группами, используйте соответствующий статистический тест. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Индуцированная мотор нарушениями TDP-43 должно возникать в течение 2-6 недель в зависимости от дозы AAV TDP-43 используется (рис. 1). Инъекции Вену неудачной хвост приведет к частичной или не недостатками; AAV должны достичь кровоток, чтобы произвести эффект. Успешного введения AAV GFP приведет к экспрессия гена GFP в мозг и спинной вектор доза зависимым образом. При использовании сильного рекомбинантных промоутер диск выражение, цитомегаловирус курица бета актина гибрид промоутер, также известный как промоутер CAG, существует эффективное выражение в ЦНС, а также несколько других тканей, таких как печень и сердце. 4 , 5 , 10 в рамках крыса ЦНС, при использовании AAV9 или AAV PHP. B векторов, шаблон является преимущественно нейрональных трансдукция и только редкие, спорадические глиальных трансдукции. 4 , 8 поскольку не гендерные различия в эффективности трансдукции наблюдался у крыс с помощью метода масштабе, женщины обычно используются для внутривенного введения гена передачи из-за их нижняя весов. 6

Полуколичественного изображений методом, описанным быстрое и надежное, потому что есть отличное соотношение сигнал шум. Образец не преобразованы сравнивается с transduced пример на рисунке 2 с обоих образцов, окрашенных с GFP антитела. Собранные из этих образцов указывают шума 0,3% (из значений, перечисленных в Рисунок 2B, D) в образце не преобразованы, который можно считать незначительным. Учитывая превосходное соотношение сигнал шум, этот метод является допустимым для быстрого сравнения экспериментальных условий, таких как векторные типы, вектор дозы, пол, возраст, и т.д.

Figure 1
Рисунок 1. Перенос генов AAV9 TDP-43-масштабе крысам вызывает прогрессивные двигательными нарушениями. Rotarod производительности на 1-3 недели после гена передача КГВ управления или связанные с ALS гена TDP-43. Темы были протестированы до переноса генов и последующего измерения были высказаны как отношение к базовой точки время. Нормальных неочищенных крыса будет оставаться на rotarod от 60-90 s в этих условиях. Эта цифра была изменена с6.

Figure 2
Рисунок 2. Быстрое количественная оценка области флуоресцентные GFP-положительным в мозжечке после внутривенного введения AAV для крысы. Образец, B) преобразованы не был запятнан GFP антитела. C, D) образца от получения AAV9 GFP крыс. B, D) параметр плотность срез на Scion изображения используется выборочно выделить области флуоресцентные в красном, и затем красные пиксели, учитываются в программе. Параметр плотность ломтик следует выделить все видимые ячейки флуоресцентные, как видно из C. Красная площадь в квадратных пикселах рассчитывается в программе отображается в B, D. Момент времени было 4 недели после инъекции Вену хвост AAV9 GFP для молодых взрослых крыс вектор дозе 1 x 1014 вектор геномов/кг. Линейки в A — 536 мкм; же увеличения в A-D. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Целый ряд маршрутов доставки были протестированы на векторы AAV: интра Паренхиматозный, интра которых, интра гнойный, внутривенно, интраназально, межмышечная, и т.д. Каждый маршрут может иметь определенные преимущества, а также недостатки. Хвост вен отправления AAV для взрослых крыс является надежным методом для достижения последовательного трансдукции ЦНС. Периферических инъекционный метод избегает введение инъекций канюли в тканях ЦНС и поэтому является минимально инвазивные. Эффективное выражение ЦНС, которое может быть достигнуто этим методом является самым большим преимуществом методики. Другие практические преимущества, что метод впрыска является очень быстро (около 10 минут на животное от начала до конца), и что инъекции Вену хвост не сугубо технический и поэтому могут быть освоены быстро. Конечно основным недостатком является, что необходимо много высокий титр вектора, который будет вопросом осуществимости, если готовые AAV менее 1 x 10-13 вектор геномов/мл. С дальнейшее совершенствование вектора таргетинга этот подход может быть выгоден клинических генной терапии в будущем, учитывая что ген Доставка осуществляется по маршруту, периферийных устройств и таким образом относительно неинвазивные. С другой стороны, более прямой, внутри цереброспинальный жидкости инъекции может быть выгодным в доклинической и клинической подходов по двум причинам: более ограниченное распространение вектора и использование более низких доз вектор.

У крыс с темной пигментации хвост вен может быть более трудно определить. Таким образом могут использоваться альтернативные маршруты администрации как ретро орбиталь инъекции или внутривенных инъекций в подкожной вены. Ретро орбиталь инъекции целевой кровать капилляра плотной и таким образом похожи на внутривенные инъекции. Для мышей и, возможно, для крыс тоже, ретро орбиталь метод может быть проще, чем инъекции Вену хвост, но три исследования показали большую согласованность инъекции Вену хвост у взрослых крыс. 6 , 8 , 9 большую часть этой работы используется сильный рекомбинантных промоутер диск трансген выражение, цитомегаловирус курица бета актина гибрид промоутер. 10 если экспериментатор желает ограничить выражение для нейронов в ЦНС, промоутер определенного типа клеток может выполняться, например Синапсин промоутер. 8 , 11

Что касается метода обработки изображений это быстро, полуколичественного метода для оценки эффективности трансдукции. Если проводится правильно, затем assay дает достоверную оценку области transduced. Stereology вызывается метод золотой стандарт для подсчета объектов в тканях ЦНС. На животное для проведения стереологических зонд в регионе интереса в головном мозге, описан метод быстрее, в 20 мин на животное, или даже меньше при масштабировании в то время как около 75 минут. Если все условия хранятся равных и того же региона надлежащего выборку, согласованность данных приближается к большой последовательности stereology, и большие группы образцов могут быть быстро проанализированы en masse.

Существует ряд дополнительных технических записок, которые заслуживают дальнейшего обсуждения. Для секции 1 относительно вектора доз, вектор доз, необходимых для эффективного трансген выражение в крыс были определены путем проб и ошибок и доза ответ в Wang et al., Дейтон et al.и Джексон et al., а также предыдущие дозы, используемые в мышах (Фауст et al. и Дуке и др.). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 конечно критической и потенциально ограничения скорости шаг производит готовые высокого титра AAV для достижения эффективной дозы.

Для раздела 3 относительно загрузки вектора в иглу, пузырьков воздуха в инъекционного раствора следует избегать как можно лучше. Небольшое количество воздуха не следует проблематичным, поскольку это могут быть отфильтрованы легких, но чрезмерное объемы воздуха, вводят в Вену может вызвать венозной эмболии, потенциально приводящих к смерти. 12 если пузыри присутствуют в шприц, вирус должен быть выслан из шприца, и должен быть загружен новый шприц. Чтобы избежать создания пузырьков, убедитесь, что положение иглы недалеко от падения вектора на парафина с наклонной вниз. Когда большинство вектора учтены иглы, очень медленно, составить оставшийся раствор. Небольшой карман воздуха лягут на задней шприца. Это мертвое пространство и не будут вводиться. Чтобы убедиться, что он остается к задней части шприц, Держите шприц горизонтальной или заостренными вниз и не Флик шприца.

Для раздела 5 относительно инъекции чтобы гарантировать, что инъекции переходит в Вену и не тканей, окружающих вену, вставленные иглы, потяните слегка на поршень для создания отрицательного давления в кончик иглы. Как уже упоминалось, если игла находится в ключе, кровь должна поток обратно в иглу и будут видны на базе иглы. При инъекции в Вену, следует считать мало сопротивления, когда игла надлежащим образом размещены. Если ощущается значительное сопротивление, то вполне вероятно, что инъекции происходит в ткани хвост, как описано выше. Это также возможно для прокола через Вену, вызывая «ветром ключе», когда угол, что игла вводится слишком крутой, когда датчик иглы слишком велик для Вены, или когда скорость впрыска слишком быстро, слишком большое давление на Вены. Выдувная вен может произойти во время первоначального пункции Вены или во время инъекции. Чтобы избежать прокола Вены во время инъекции или имеющих стать выбили из Вены иглы, шприц должны быть стабилизированы, удерживая конец шприца против хвост, как упоминалось. Если игла становится выбили или второй инъекции необходима по другой причине, второй инъекции могут вноситься либо к боковой хвост Вены на противоположной стороне или вверх ближе к телу на той же стороне.

Для раздела 8 rotarod assay запускается каждые 4 недели во время эксперимента. Нормальный, необработанной крыс имеют более баллов, когда они моложе (4-6 недель старый) чем в более старшем возрасте. Дефицит в побег рефлекс выводятся как выживание функции конечности с течением времени. Кривых выживания анализируются лог ранг тест на призму программного обеспечения.

Раздел 9 относительно трансдукции анализа, с практикой процедура становится относительно быстро, принимая около 20 мин на животное или меньше. Этот assay также отличается высокой надежностью, потому что не преобразованы тканей, которые обрабатываются с GFP пятная процедуру (в основном незначительным чтенияРисунок 2B), и потому, что существует широкий динамический диапазон для индикации. Большинство GFP флуоресценции вытекает из transduced клеток Пуркинье, и таким образом их большое число обеспечивают большой динамический диапазон. До настоящего времени, эффективность переноса гена достигнуто не вызвало чтений насытить через все поле (т.е., 100% трансдукции клеток Пуркинье), по крайней мере, когда перенос генов осуществляется для взрослых крыс. Если насыщенность всего поля были проблемы, то сигнал может быть снижен путем применения более низкую дозу вектор в отдельных животных или путем измерения только слабее, родной флюоресценция GFP, отказываясь пятная процедуру. Конечно трансдукции другие типы клеток мозжечка может также способствует сигнал, но большая часть что легко видимой и учитывается программой явно в слои клеток Пуркинье клеток органов и их дендритных деревьев в молекулярной слои на протяжении мозжечка, основанный на их известной позиции и морфологии. Серьезным вызовом метода является, что пузырьки воздуха или флуоресцентные мусора могут учитываться, который таким образом будет загрязнять чтениях. Поля с этот шум и разделы не используются; чистые образцы бесплатным неспецифичные шума являются обязательными. Так как GFP иностранных белок, существует не фоновый шум в ткани, поэтому конкретные флуоресцирования можно точно захвачен и оценкам. В этих исследованиях GFP микрофотографиями были захвачены в цвете и затем преобразуется в оттенки серого, с использованием изображений программы помимо Scion изображения. Однако было бы более простым для захвата GFP в черно-белом в первую очередь для последующего анализа в Scion изображения. Предыдущие исследования проанализировали трансдукции нижних двигательных нейронов спинного мозга на процентной основе, т.е. доля мотонейронов, выражая GFP. 4 , 6 однако, анализ мозжечок является более быстрым, требующие меньше секций и также, как представляется, более последовательным и надежным тоже (например, через отдельные наблюдатели, оценок). Метод быстрого мозжечковой изображений является таким образом хороший быстрый Индекс успешности переноса генов периферической и Центральной. Анализ спинного трансдукция и примеры трансдукции других сайтов в нервной системе крысы были зарегистрированы в Wang et al., Дейтон et al.и Джексон и др. 4 , 5 , 6

В целом внутривенного маршрут администрации является минимально инвазивной; центральной нервной системы могут быть направлены на периферийных администрации без размещения иглу в головного или спинного мозга. Наряду с дальнейшего уточнения таргетинга соответствующих доклинических и клинических генной терапии будет по-прежнему использовать внутривенно доставки, в то время как многие виды основных функциональных исследований на крысах множества будущих может принести пользу, экспансивного трансдукции в стремлении ускорить тестирование гипотезы функции гена в естественных условиях.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgements

Эта работа финансировалась ALS ассоциация, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx и благотворительные пожертвования для ALS исследований от Томас Лоусон, для которой мы благодарны. Мы благодарим Elysse Орчард и Донна Burney для консультаций и подготовки кадров. ДЖАС был поддержан фондом лгал и национальных институтов здравоохранения грант GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17, (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18, (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21, (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22, (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17, (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20, (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23, (5), 237-246 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics