Methoden en Tips voor intraveneuze toediening van Adeno-associated Virus voor ratten en evaluatie van het centrale zenuwstelsel transductie

Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Methoden voor een grootschalige centrale zenuwstelsel gene levering in de rat vallen. In dit voorbeeld is het doel om na te bootsen van een ziekte die het hele ruggenmerg aantast. De wijdverbreide transductie kan worden gebruikt voor een therapeutische eiwitten naar het CNS van een eenmalige, perifere administratie.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn een belangrijk reagens in de neurowetenschappen voor geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR), optogenetics, cre-lox doelgerichtheid, enz. Het doel van dit manuscript is om te helpen de onderzoeker probeert genenoverdracht expansieve centrale zenuwstelsel (CNS) in de rat via staart veneuze injectie van AAV. Schaal expressie is relevant voor voorwaarden met wijdverspreide pathologie, en het model van een rat is belangrijk vanwege de grotere omvang en fysiologische overeenkomsten voor de mens ten opzichte van muizen. In dit voorbeeld toepassing, wordt een grootschalige neuronale transductie gebruikt om na te bootsen van een neurodegeneratieve ziekte die het hele ruggenmerg, Amyotrofische laterale sclerose (ALS treft). De efficiënte grootschalige CNS transductie kan ook worden gebruikt voor therapeutische eiwitten factoren in pre-klinische studies. Na een interval na injectie expressie van enkele weken, worden de effecten van de transductie geëvalueerd. Voor een groen fluorescente proteïne (GFP) controle vector, is de hoeveelheid GFP in het cerebellum snel en betrouwbaar geschat door een basic imaging-programma. Voor motor ziekte fenotypen die worden veroorzaakt door het ALS gerelateerde eiwit transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43), worden de tekorten gescoord door ontsnappen reflex en rotarod. Naast ziekte modellering en gentherapie zijn er diverse potentiële toepassingen voor de grootschalige gentargeting hier beschreven. Het uitgebreide gebruik van deze methode zal de steun in de hypothese testen in de neurowetenschappen en neurogenetica bespoedigen.

Introduction

Recombinante adeno-associated virus (AAV) vectoren zijn onmisbare tools voor CNS onderzoek omdat ze zo efficiënt voor het transducing van neuronen in vivo. AAV vectoren zijn zeer veelzijdig voor het bestuderen van verschillende transgenen en eiwit isoforms, verschillende weefsels, andere host-soorten en andere wijzen van toediening. Bijvoorbeeld, kan AAV worden toegediend aan muizen door een randapparaat, relatief niet-invasieve, intraveneuze injectie transduce neuronen in het centraal zenuwstelsel als eerste beschreven in Foust et al. en Duque et al. (Zie JOVE papieren door Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 deze gen levering benadering wordt gebruikt bij ratten efficiënt uitspreken ofwel groen fluorescente proteïne (GFP) of de ALS gerelateerde eiwitten, transactive reactie DNA-bindende eiwit van 43 kDa (TDP-43) in het VNV. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 werkt bij ratten is belangrijk omdat de rat fysiologische en metabolische parameters dichter bij de mensen in vergelijking met muizen zijn en er gedrags- en toxicologische testen zijn speciaal ontworpen voor ratten zijn. Bovendien, steeds meer transgene rat lijnen beschikbaar dat kan worden gebruikt in de AAV gene transfer studies.

Methoden zijn gedetailleerd op expansieve CNS genoverdracht in de rat, en snelle, betrouwbare kwantificering van de resultaten. Grootschalige CNS transductie wordt gebruikt om na te bootsen de symptomatology van ALS bij ratten met het uitspreken van TDP-43 in het ruggenmerg. De methode is staart ader injecties van de TDP-43 vector naar jonge volwassen ratten zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 , 9 na enkele weken, TDP-43-geïnduceerde motor tekorten worden gescoord op twee manieren: reflex en rotarod zoals gebruikt in Dayton et al. en Jackson et al. ontsnappen 5 , 6 , 7 , 9 voor het besturingselement GFP vector, in post-mortem analyse, fluorescerende inzake het cerebellum wordt berekend als een index van de transductie efficiëntie zoals gebruikt in Jackson et al. 6 , 8 de analyse van cerebellum heeft bewezen een snelle en betrouwbare index de mate van CNS transductie na levering van de perifere gen en dient te gelden tot een verscheidenheid van benaderingen probeert randapparaat-naar-centrale genenoverdracht.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

alle procedures gevolgd de passende NIH-richtsnoeren. Alle procedures gevolgd de dierlijke protocollen die werden goedgekeurd door het Animal Care en gebruik Comité bij LSU Health Sciences Center in Shreveport. Vrouwelijke Sprague-Dawley ratten op 6 weken leeftijd werden gebruikt voor deze procedure.

1. bepalen van de doses/volumes van vector nodig

  1. wegen de ratten worden geïnjecteerd en het bepalen van de hoeveelheid virale vector nodig voor elk dier op basis van de titer (concentratie) van het vector-preparaat. Vector doses die succesvol voor efficiënte expressie in de rat CNS eerder geweest gebruiken (Zie Jackson et al.. 6).
    Opmerking: voor AAV9 TDP-43 of AAV9 GFP, een typische dosering ligt tussen de 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomen/kg. De jonge volwassen ratten op 6 weken leeftijd wegen ongeveer 150 g.
  2. Equivalente doses per kg bij alle dieren voor systematische vergelijkingen maken Zorg ervoor dat het volume niet hoger is dan standaard geadviseerd injectie volumes (250-500 µL voor een rat 250 g). Een typische geïnjecteerde volume is 200 µl aan een jonge volwassen rat.

2. Voorbereiden werkstation

  1. verzamelen alle vereiste benodigdheden: één paraffine film square (ongeveer 5 x 5 cm) per dier, een alcohol voorbereiding pad per dier, gaas pads (2-3 per dier), Pipetteer tips en een micropipet.
  2. Prepareer het werkoppervlak door het reinigen van het oppervlak met 70% ethanol. Leg een verwarming pad naar beneden met de temperatuur ingesteld op laag (~ 37 ° C). Plaats een bankje pad op de top van de verwarming pad.
  3. Bereiden de gas-anesthesie (Isofluraan). Zorg voor voldoende zuurstof en gas-anesthesie voor de procedure. Schoon het inductie kamer en anesthesie masker met 70% ethanol en het masker van de verdoving plaats op de Bank pad.

3. Voorbereiden van de vector

  1. de vector op kamertemperatuur ontdooien en een steriele microcentrifuge buis voor elk dier een label.
  2. Pipetteer het volume van AAV bepaald in stap 1.1 in de passende buis en breng het volume tot het gewenste geïnjecteerde volume (hier, 200 µl) met lactated Ringer ' s oplossing of zoutoplossing.
  3. Pulse vortex het monster voor 1-2 s en vervolgens pulse centrifuge voor 5 s om het monster naar de onderkant van de buis.
  4. Pipetteer het totale geïnjecteerde volume voor de rat uit de buis en op het plein van paraffine film.
  5. Plaats een naald 30 meter op een spuit van 1 mL.
  6. Plaats de naald met de schuine kant naar beneden in de vector op de paraffine-film. Terugtrekken op de plunjer van de injectiespuit totdat alle het virus in de naald en spuit is. Wees voorzichtig om te voorkomen dat tekenen van luchtbellen in de naald, die makkelijker met de praktijk.

4. Voorbereiden van de rat

  1. zet de zuurstof tot 1 L/min en de narcose Isofluraan ingesteld op 5%. Zorgen dat de narcose gas naar de vergaderzaal inductie stroomt door het controleren van alle aansluitende slangen en afsluiter oriëntaties.
  2. Plaats van de rat in de anesthesie inductie gaskamer ongeveer 3 minuten, totdat de rat niet reageert.
  3. Zorgen voor voldoende diepte van verdoving door het knijpen van de teen. Moet er geen beweging in de voet of been na de teen snuifje.
  4. De narcose Isofluraan verlagen tot 2% voor onderhoud van anesthesie en de afsluiter zodanig aanpassen dat de narcose loopt er door de verdoving masker.
  5. Plaats van de rat ' s neus in het masker van de anesthesie en de rat zodanig aanpassen dat het is liggend op zijn kant.
  6. Identificeren de laterale staart ader.
    Opmerking: De laterale staart aders liggen op ongeveer 10 en 2 o ' klok met de dorsale bovenkant van de staart als 12 o ' klok. Met de rat liggend op zijn kant, de laterale staart ader moet worden geconfronteerd met omhoog
  7. Veeg het gebied van de injectie met de alcohol voorbereiding zeem. De injectieplaats is tweederde van de lengte van de staart.

5. Injecteer de vector

  1. stevig vasthouden de staart licht boven de injectie gebied met één vinger direct boven de laterale staart ader; dit zal de ader te verwijden.
  2. Met de schuine kant naar boven, het uitlijnen van de naald met de zichtbare staart ader in dezelfde richting.
  3. Doorboren de huid over de staart ader terwijl het grote verzorgen om te voorkomen dat de andere kant de staart en op te drukken op de staart ader.
  4. Release druk van de ader van de staart te voorzien in normale bloedstroom.
  5. Verplaatsen de naald in de ader. Om ervoor te zorgen dat de naald de staart ader heeft doorboord, trek terug iets op de plunjer. Als de naald in de ader is, zal er bloed vloeien in de naald.
    1. Verplaatsen de naald zo nodig. Vervolgens om te stabiliseren de naald, plaatst u de hand boven de injectieplaats te onder de injectieplaats en houd het uiteinde van de spuit tegen de staart.
  6. De vector langzaam injecteren in de staart (ongeveer 20 µL/s).
    Opmerking: De ader kan verliezen kleur als de vector-flows erdoorheen. Tekenen dat de oplossing werd geïnjecteerd buiten de ader omvatten blebbing, blancheren of de huid weerstand bij het injecteren van de vector. Met praktijk kan de extra vasculaire blootstelling worden geminimaliseerd.
  7. Nadat de vector is toegediend, verwijdert u de naald uit de rat en drukt u op een pad van gaas tegen de injectieplaats te stammen het bloeden voor 30-60 s.

6. Sanering

  1. uitschakelen de Isofluraan narcose en zuurstof. De rat volgen totdat het herwint bewustzijn, en vervolgens terug te sturen naar zijn kooi.
  2. Plaatst zorgvuldig alle naalden in de container slijpsel. Beschikken over alle andere disposable materialen die mogelijk zijn verontreinigd met AAV in een passende biohazard container. Reinig de stations werken met 70% ethanol.

7. Evalueren van stuk ontsnappen reflex

Opmerking: stuk tekorten ontstaat doorgaans 2-6 weken na de TDP-43 genenoverdracht, afhankelijk van de dosis vector.

  1. Op een vlakke ondergrond duidelijke van puin, met twee vingers grijpen de rat ' s staart ongeveer 2 cm van het lichaam. Til de rat voorzichtig totdat de voorpoten hangen tijdens het bekijken van de ventrale onderzijde van de rat.
    1. Uitvoeren de procedure wekelijks in de experimentele tijd-loop na genenoverdracht (bijvoorbeeld tot 12 weken na genenoverdracht).
      Opmerking: Ook scoren voorpoot tekorten op deze manier, maar stuk tekorten hebben meer kans op het optreden in dit model, afhankelijk van de dosis van de vector gebruikt.
  2. Observeren van de hindlimbs voor 10 s. notitie als één of beide hindlimbs richting de middellijn tijdens de 10 balde s.
  3. Herhaal deze test voor een totaal van drie keer met 30 s tussen proeven. Als één of beide hindlimbs zijn gebalde voor elk van de drie proeven, vertoont de rat motor dysfunctie. Opnemen van de gegevens (handmatig in notities) als beide unilaterale of bilaterale stuk tekort aanwezig als er overeenstemming over alle drie proeven balde.

8. Evalueren van motor functie op de rotarod

  1. op te zetten van de rotarod, plaatst u het pad van een bankje onder de rotarod en versnelling ingesteld op 4-40 omwentelingen per minuut (rpm) meer dan 2 min (het tarief stijgt met ~0.3 rpm/s). Voor een cursus-12 weken tijd, draaien de onderwerpen op 2, 4, 8 en 12 weken na gene transfer.
  2. Toestaan de rat om te acclimatiseren in de test kamer voor 20 min.
  3. Te trainen de rat te gebruiken de rotarod voor de eerste keer, eerst beginnen met de rotarod op een ingestelde snelheid van 4 rpm, dan plaatst u de rat op de rotarod. Toestaan dat de rat te lopen voor een volledige omwenteling van 4 toeren per minuut, dan start de versnelling en laat de rat te lopen op de rotarod tot het eraf valt. Opleiding totdat de rat wandelt consequent voor ten minste 40 s. Een gezonde, jonge volwassen ratten zullen op deze manier gemakkelijk worden getraind.
    1. In het geval van een rat met een merkbaar motor bijzondere waardevermindering, die kan voorkomen dat de rat bereiken een basislijn latency te vallen van 40 s, bieden de rat 3-5 opleiding pogingen voordat u begint met het scoren van rotarod.
  4. Om te beginnen met het testen van de rotarod, de rat plaats op de rotarod en start de versnelling van de rotarod. Opmerking de tijd waartegen de rat van de rotarod valt; Dit is de latentie te vallen. Als de rat op de rotarod na 120 blijft s, cap de sessie op dit punt, de rat uit de rotarod verwijderen en het opnemen van een daling van de latentie van 120 s.
  5. Herhalen de test twee keer voor een totaal van drie proeven. Ruimte om te minimaliseren van het effect van vermoeidheid, de proeven ten minste 5 min uit elkaar. Het gemiddelde van de scores van de drie proeven. Een onberispelijke volwassen ratten heeft meestal een gemiddelde latentie te vallen van > 40 s.
  6. De rat plaats terug in de kooi en reinig de rotarod en de omliggende gebieden met 70% ethanol.

9. Kwantificering van GFP expressie in het cerebellum

  1. Anesthetize van de ratten en perfuse met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en dan 4% paraformaldehyde. Ontleden van de hersenen en het ruggenmerg en geniet van de weefsels in het fixeer 's nachts en verplaats deze naar een 30% sacharoseoplossing. Na evenwichtsinstelling, gesneden 50 μm coronale secties op een glijdende microtoom met het bevriezen van fase 4 , 5 , 6.
  2. Kies 3-6 gedeelten van het cerebellum die gelijkmatig zijn verdeeld in de vermis, de centrale kwab van het cerebellum. Fluorescently label het GFP te maximaliseren van het signaal. Gebruik van het primaire antilichaam voor GFP op 1:500 en gebruiken de Alexa-488 geconjugeerd secundair antilichaam bij een verdunning 1:300 4 , 5 , 6.
    Opmerking: Zie referenties 4 , 5 , 6 voor meer informatie over de bemonstering, segmenteren, en procedures kleuring.
  3. Photomicrograph elke sectie in de gedefinieerde regio van belang met een lage vergroting lens met behulp van een microscoop. Gebruik een 2,5 X doelstelling (N.A. 0.12) en filter ingesteld 10, 450-490/515-565 excitatie/emissie). Houden van de camera-instellingen (blootstelling tijden, bijvoorbeeld 2 s) hetzelfde in verschillende steekproeven te analyseren. Opslaan als een. TIF-bestand.
  4. Openen de gekleurd in de algemeen beschikbare programma van het beeld van de Scion; twee vensters zal openen. Sluit het venster aangegeven als " geïndexeerde kleur ".
  5. Kiezen " opties ", dan " dichtheid SliceŔ een waaier van tinten wordt aangegeven in het rood in het venster Look-Up Table (LUT). In het venster, gebruik de cursor om het invullen de specifieke GFP etikettering alleen en stoppen wanneer de niet-specifieke achtergrond begint in de afbeelding worden opgepikt.
    Opmerking: Dit zal benadrukken de fluorescerende gebied op de gekleurd worden gekwantificeerd. De instellingen moeten worden geoptimaliseerd voor het specifiek vangen alle zichtbaar fluorescerende cellen. Praktijk, deze methode kan juist wijzen op de specifieke fluorescentie.
  6. Voor fluorescerende oppervlakte te meten, eerst zorgen dat de metingen, verricht in de juiste eenheden (pixels). Om dit te doen, klikt u op " analyseren ", dan " instellen ScaleŔ de vierde regel moet zeggen " eenheden ". De drop-down lijst, kies pixels om te meten in pixels, klik op " OK ". De analyse opties om te schakelen " omvatten interieur gaten " om de opname van het gehele lichaam van de cel in de analyse.
  7. Voor het meten van het fluorescerende gebied, klik op " analyseren " en klik vervolgens op " maatregel ". Deze waarde, klik op " analyseren " klik vervolgens op " Toon ResultsŔ Er verschijnt een resultatenvenster. De fluorescerende gebied meting zal worden onder de kop met het label " gebied ".
  8. Om te zorgen voor standaardisatie in de metingen, Wijzig niet de gemarkeerde waarden in het venster LUT.
  9. Zodra alle metingen zijn opgenomen, de gemiddelden voor elk dier (van 3-6 afdelingen per dier). Gebruik een geschikte statistische proef om te vergelijken van de getransduceerde gebieden tussen de groepen. 6

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

TDP-43 geïnduceerde motor waardeverminderingen moeten ontstaan binnen 2-6 weken afhankelijk van de dosis van de AAV TDP-43 gebruikt (Figuur 1). Mislukte staart ader injecties zal leiden tot gedeeltelijke of geen waardeverminderingen; de AAV moet bereiken de bloedbaan te produceren het effect. Een succesvolle injectie van AAV GFP zal resulteren in GFP expressie in de hersenen en het ruggenmerg in een vector-dosis-afhankelijke wijze. Bij het gebruik van de sterke recombinante promotor op station expressie, het cytomegalovirus kip bèta actine hybride promotor, ook bekend als de CAG-promotor, is er efficiënte uitdrukking in het centraal zenuwstelsel, evenals verschillende andere weefsels zoals lever en hart. 4 , 5 , 10 binnen de rat CNS, bij het gebruik van AAV9 of AAV PHP. B vectoren, het patroon is overwegend neuronale transductie en slechts schaars, sporadisch gliale transductie. 4 , 8 aangezien geen geslacht verschil in signaaltransductie efficiëntie werd waargenomen bij ratten met de grootschalige methode, vrouwtjes worden doorgaans gebruikt voor intraveneuze genenoverdracht vanwege hun lagere gewichten. 6

De semi-kwantitatieve beeldvorming methode beschreven is snel en betrouwbaar omdat er een uitstekende signaal-ruisverhouding. Een niet-getransduceerde monster wordt vergeleken met een getransduceerde monster in Figuur 2 met beide monsters gekleurd met het GFP-antilichaam. Waarden van deze monsters verzameld duiden op 0,3% ruis (van de waarden in de lijst in figuur 2B, D) in het niet-getransduceerde monster, die kan worden beschouwd als te verwaarlozen. Gezien de uitstekende signal-to-noise verhouding, is deze methode geldig voor snelle vergelijkingen van experimentele omstandigheden zoals het typen van de vector, vector dosis, geslacht, leeftijd, enz.

Figure 1
Figuur 1. Grootschalige AAV9 TDP-43 genoverdracht op ratten veroorzaakt progressieve motor waardevermindering. Rotarod prestaties op 1-3 weken na gene transfer van het besturingselement GFP of het gen ALS bedrijfsgerelateerde TDP-43. De onderwerpen voor genenoverdracht werden getest en de latere metingen werden uitgedrukt in verhouding tot het tijdstip van de basislijn. Een normale onbehandelde rat zal blijven op de rotarod van 60-90 s onder deze omstandigheden. Dit cijfer is gewijzigd van6.

Figure 2
Figuur 2. Snelle kwantificering van het GFP-positieve fluorescerende gebied in het cerebellum na intraveneuze toediening van AAV aan de rat. A, B) niet-getransduceerde monster dat is gekleurd met het GFP-antilichaam. C, D) monster uit een rat AAV9 GFP ontvangen. B, D) de dichtheid segment optie op Scion afbeelding wordt gebruikt om selectief markeren de fluorescerende gebied in het rood, en vervolgens de rode pixels worden geteld door het programma. De optie dichtheid delige moet alles van de zichtbare fluorescerende cellen markeren, zoals te zien in C. Het rode gebied uitgedrukt in vierkante pixels zoals berekend door het programma wordt weergegeven in B, D. Het tijdstip was 4 weken na een staart veneuze injectie van AAV9 GFP aan een jonge volwassen rat op een vector dosis van 1 x 1014 vector genomen/kg. Schaal bar in A is 536 µm; dezelfde vergroting in A-D. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Een verscheidenheid van levering routes zijn getest voor AAV vectoren: intra-parenchymal, intra-cerebroventricular, intra-thecal, intraveneuze intranasale, intra musculaire, enz. Elke route wellicht specifieke voordelen evenals nadelen. Staart ader toediening AAV aan volwassen ratten is een betrouwbare methode voor het bereiken van overeenstemming transductie van het centraal zenuwstelsel. De perifere injectie methode vermijdt de invoering van een canule injectie in de CNS weefsels en kan daarom minimaal invasieve. De efficiënte CNS-expressie die kan worden bereikt door deze methode is het grootste voordeel van de techniek. Andere praktische voordelen zijn dat de injectie-methode zeer is snel (ongeveer 10 min per dier van start tot finish) en dat de staart ader injecties niet zeer technisch zijn en kunnen daarom snel worden beheerst. Zeker, een groot nadeel is dat er een heleboel hoge titer vector nodig is, die zal een kwestie van de haalbaarheid zijn als de AAV preps lager dan 1 x 1013 vector genomen/ml zijn. Met een verdere verfijning van vector gericht op mogelijkheden, zou deze aanpak voordelige voor klinische gentherapie in de toekomst, gezien dat de levering van het gen door een perifere route is en dus relatief niet-invasieve. Aan de andere kant, meer directe intra hersen vloeistof injecties kunnen nuttig zijn, in preklinische en klinische benaderingen om twee redenen: meer beperkte verspreiding van de vector en het gebruik van lagere doses van de vector.

Bij ratten met donkere pigmentatie, kan de staart ader worden moeilijker te identificeren. Alternatieve wijzen van toediening zoals retro-orbitaal injecties of intraveneuze injecties op de saphenous ader kunnen dus worden gebruikt. De retro-orbitaal injecties richten een dichte capillaire bed en zijn dus vergelijkbaar met een intraveneuze injectie. Voor muizen, en misschien wel voor ratten, de retro-orbitaal-methode kan ook gemakkelijker dan staart ader injecties, maar drie studies hebben aangetoond grote consistentie van de staart ader injecties bij volwassen ratten. 6 , 8 , 9 allermeest dit werk gebruikt een sterke recombinante promotor op station transgenic expressie, het cytomegalovirus kip bèta actine hybride promotor. 10 als de experimentator wenst af te bakenen uitdrukking aan de neuronen in het VNV, een promotor van de type-specifieke cel kan worden geprobeerd, bijvoorbeeld de synapsin promotor. 8 , 11

Met betrekking tot de beeldvorming methode is het een snelle, semi-kwantitatieve methode voor het schatten van de transductie efficiëntie. Indien goed uitgevoerd, dan is de bepaling levert een betrouwbare schatting van het getransduceerde gebied. De methode van de gouden standaard voor tellen objecten in CNS weefsel heet stereology. Het duurt ongeveer 75 minuten per dier uit te voeren van een stereological-sonde in een gebied van belang in de hersenen, overwegende dat de beschreven methode sneller op 20 min per dier of zelfs minder is als opgeschaald. Als alle voorwaarden zijn gelijk gehouden, maar dezelfde regio goed wordt bemonsterd, de consistentie van de gegevens benadert de grote consistentie van stereology, en grote groepen monsters kunnen snel massaal worden geanalyseerd.

Er zijn een aantal aanvullende technische opmerkingen die verdere discussie rechtvaardigen. Voor deel 1 met betrekking tot de vector doses, de vector doses vereist voor efficiënte transgenic expressie bij ratten werden bepaald door trial-and-error en dosis-respons in Wang et al., Dayton et al.en Jackson et al., alsmede vorige doses bij muizen (Foust et al. en Duque et al.) worden gebruikt. 1 , 2 , 4 , 5 , 6 zeker een kritische, en potentieel-snelheidsbeperking stap is de productie hoog-titer AAV preps om de effectieve doses.

Voor punt 3 moet met betrekking tot het laden van de vector in de naald, luchtbellen in de oplossing van de injectie vermeden worden zo goed mogelijk. Een kleine hoeveelheid lucht moet niet problematisch als dit kan worden gefilterd door de longen, maar de buitensporige hoeveelheid lucht in de ader ingespoten kunnen leiden tot een embolie van de veneuze lucht mogelijk resulteert in de dood. 12 bubbels in de spuit aanwezig zijn, het virus moet worden uitgezet in de spuit als een nieuwe spuit moet worden geladen. Om te voorkomen dat het creëren van bubbels, zorg ervoor dat de naald dicht bij de daling van de vector op de parafilm plaatsen met de schuine kant naar beneden. Wanneer de meerderheid van de vector is overgenomen in de naald, heel langzaam de resterende oplossing in te stellen. Een kleine zak van de lucht zal vormen aan de achterkant van de spuit. Dit is dode ruimte en zullen niet worden ingespoten. Om ervoor te zorgen dat het blijft naar de achterkant van de spuit, houd de injectiespuit horizontale of puntige naar beneden en doen niet flick de spuit.

Voor hoofdstuk 5 met betrekking tot de injecties, om ervoor te zorgen dat de injectie in de ader en niet het weefsel rondom de ader gaat, zodra de naald is ingevoegd, trek terug iets op de plunjer negatieve druk maken op het puntje van de naald. Zoals gezegd, als de naald in de ader, bloed moet vloeien terug in de naald en zal worden zichtbaar op de basis van de naald. Terwijl het injecteren in de ader, moet weinig weerstand worden gevoeld wanneer de naald op de juiste wijze is geplaatst. Als grote weerstand wordt aangetroffen, dan is het waarschijnlijk dat de injectie in het weefsel van de staart gaat zoals hierboven beschreven. Het is ook mogelijk om via de ader, waardoor een "geblazen ader", als de hoek dat de naald is geplaatst is te steil, als de maat van de naald is te groot voor de ader, of wanneer de snelheid van de injectie te snel te veel onder druk te zetten door de ader doorprikken. Een geblazen ader kan optreden tijdens de eerste aanprikken van de ader of tijdens de injectie. Om te voorkomen dat de ader prikken tijdens de injectie of met de naald worden verdreven uit de ader, moet de spuit worden gestabiliseerd door het einde van de injectiespuit te houden tegen de staart genoemd. Als de naald wordt verdreven of een tweede injectie nodig is om een andere reden, kan de tweede injectie worden gemaakt aan de laterale staart ader aan de overkant of dichter bij het lichaam aan dezelfde kant.

Voor sectie 8, is de bepaling van de rotarod op 4 weken durende intervallen uitgevoerd tijdens het experiment. Normaal, onbehandelde ratten hebben betere scores wanneer zij jongere (4-6 weken oud) dan op oudere leeftijd zijn. De tekorten in de escape reflex zijn uitgezet als voortbestaan van ledematen functie na verloop van tijd. De overleving curven worden geanalyseerd door een log-rank test op Prism software.

Voor hoofdstuk 9 met betrekking tot de analyse van de transductie, met de praktijk, wordt de procedure relatief snel, nemen ongeveer 20 min per dier of minder. Deze bepaling is ook uiterst betrouwbaar, omdat niet-getransduceerde weefsels die zijn verwerkt met de GFP kleuring procedure een (in principe verwaarloosbaar lezingFiguur 2B), en omdat er een enorme dynamisch bereik aan de uitlezing. Allermeest naar de GFP-fluorescentie is afgeleid van getransduceerde Purkinje cellen, en dus hun grote aantallen bieden een groot dynamisch bereik. Tot nu toe het spuitrendement van gene bereikt niet heeft veroorzaakt de lezingen te verzadigen over het gehele veld (dat wil zeggen, 100% transductie van Purkinje cellen), ten minste wanneer de genenoverdracht wordt toegediend aan volwassen ratten. Verzadiging van het gehele veld mochten een probleem, kan dan het signaal worden verlaagd door een lagere dosis van het vector in afzonderlijke dieren toe te passen of door het meten van alleen de zwakkere, inheemse GFP fluorescentie, af te zien van de kleuring procedure. Zeker kan de transductie van andere celtypes in het cerebellum ook bijdragen aan het signaal, maar de meeste van wat is waarneembaar en geteld door de programma is duidelijk de cel organen in het Purkinje cel lagen en hun dendritische bomen in de moleculaire lagen in het cerebellum, gebaseerd op hun bekende positie en morfologie. Een belangrijke uitdaging voor de methode is dat luchtbellen of fluorescerende puin kan worden geteld, die zal dus besmetten de lezingen. Secties en velden met deze ruis worden niet gebruikt; schone gratis aspecifieke lawaai monsters zijn nodig. Aangezien GFP een buitenlandse eiwit is, is er geen achtergrondgeluid binnen het weefsel, zodat de specifieke fluorescentie precies kan worden gevangen en naar schatting. In deze studies, werden de photomicrographs van GFP gevangen genomen in kleur en vervolgens omgezet in grijswaarden met behulp van een beeldbewerkingsprogramma dan Scion afbeelding. Het zou echter eenvoudiger te vangen de GFP in zwart-wit in de eerste plaats voor latere analyse in Scion afbeelding. Eerdere studies geanalyseerd de transductie van ruggenmerg lagere motorische neuronen op een percentage basis, dat wil zeggen, het percentage van motoneurons GFP uitdrukken. 4 , 6 de analyse van cerebellum is echter een snellere, vereisen minder secties en ook lijkt te zijn meer consistent en betrouwbaar zijn ook (bijvoorbeeld over afzonderlijke waarnemers de evaluaties). De snelle cerebellaire beeldvorming methode is dus een goede snelle index van het succes van perifere-naar-centrale genenoverdracht. Analyses van de transductie van het ruggenmerg en de voorbeelden van de transductie van andere sites in het zenuwstelsel van de rat zijn gemeld in de Wang et al., Dayton et al.en Jackson et al. 4 , 5 , 6

Kortom is de intraveneuze toedieningsweg minimaal invasieve; de CNS kan het doelwit van een perifere administratie zonder het plaatsen van een naald in de hersenen of het ruggenmerg. Samen met de verdere verfijning van gerichte, zullen relevante preklinische en klinische gentherapieën blijven gebruiken intraveneuze levering, terwijl velen voor talloze toekomstige soorten basic functionele studies bij ratten door de uitgestrekte signaaltransductie in zoektocht naar profiteren kunnen versnellen hypothese testen van genfuncties in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de ALS Association, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx en een charitatieve donatie voor ALS onderzoek van Thomas Lawson, waarvoor wij dankbaar zijn. Wij danken Elysse boomgaard en Donna Burney voor advies en training. JAS werd gesteund door de Stichting gelogen en National Institutes of Health verlenen GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
  2. Duque, S., et al. Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons. Mol. Ther. 17, (7), 1187-1196 (2009).
  3. Gombash Lampe, S., Kaspar, B., Foust, K. Intravenous injections in neonatal mice. J. Vis. Exp. (93), e52037 (2014).
  4. Wang, D., et al. Expansive gene transfer in the rat CNS rapidly produces amyotrophic lateral sclerosis relevant sequelae when TDP-43 is overexpressed. Mol. Ther. 18, (12), 2064-2074 (2010).
  5. Dayton, R., et al. Selective forelimb impairment in rats expressing a pathological TDP-43 25 kDa C-terminal fragment to mimic amyotrophic lateral sclerosis. Mol. Ther. 21, (7), 1324-1334 (2013).
  6. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. AAV9 supports wide-scale transduction of the CNS and TDP-43 disease modeling in adult rats. Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 2, 15036 (2015).
  7. Jackson, K., et al. Preservation of forelimb function by UPF1 gene therapy in a rat model of TDP-43-induced paralysis. Gene Therapy. 22, (1), 20-28 (2015).
  8. Jackson, K., Dayton, R., Deverman, B., Klein, R. Better targeting, better efficiency for wide-scale neuronal transduction with the synapsin promoter and AAV-PHP.B. Front. Mol. Neurosci. 9, 116 (2016).
  9. Jackson, K., et al. Severe respiratory changes at end stage in a FUS-induced disease state in adult rats. BMC Neuroscience. 17, (1), 69 (2016).
  10. Xu, L., et al. CMV-beta-actin promoter directs higher expression from an adeno-associated viral vector in the liver than the cytomegalovirus or elongation factor 1 alpha promoter and results in therapeutic levels of human factor X in mice. Hum Gene Ther. 12, (5), 563-573 (2001).
  11. Jackson, K., Dayton, R., Klein, R. Gene vector "magic bullet": targeted expression in the central nervous system after peripheral delivery using the synapsin promoter. Expert Opin Ther Targets. 20, (10), 1153-1154 (2016).
  12. van Hulst, R., Klein, J., Lachmann, B. Gas embolism: pathophysiology and treatment. Clin. Physiol. Funct. Imaging. 23, (5), 237-246 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics