Métodos y consejos para la administración intravenosa del Virus Adeno-asociado a las ratas y la evaluación de la transducción de señales del sistema nervioso Central

Neuroscience

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Summary

Se cubren métodos para una entrega de genes de gran escala del sistema nervioso central en la rata. En este ejemplo, el propósito es imitar una enfermedad que afecta a la médula espinal entera. La transducción generalizada se puede utilizar para proporcionar una proteína terapéutica al SNC de una administración periférica, una sola vez.

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Grames, M. S., Jackson, K. L., Dayton, R. D., Stanford, J. A., Klein, R. L. Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction. J. Vis. Exp. (126), e55994, doi:10.3791/55994 (2017).

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Abstract

Vectores de virus adeno-asociado (AAV) son un reactivo dominante en las neurociencias agrupadas regularmente otro corto repite palindrómico (CRISPR) optogenetics, cre-lox targeting, etcetera. El objetivo de este manuscrito es ayudar al investigador tratar de transferencia de genes de la expansiva del sistema nervioso central (SNC) en la rata mediante inyección en la vena cola de AAV. Expresión de gran escala es relevante para las condiciones con patología extensa, y un modelo de rata es significativo debido a su mayor tamaño y las semejanzas fisiológicas a los seres humanos en comparación con ratones. En esta aplicación de ejemplo, una transducción neuronal de gran escala se utiliza para imitar una enfermedad neurodegenerativa que afecta a la médula espinal entera, esclerosis lateral amiotrófica (ELA). La transducción eficiente de CNS de gran escala también puede utilizarse para proporcionar factores de proteína terapéutica en estudios pre-clínicos. Después de un intervalo de expresión después de la inyección de varias semanas, se evaluaron los efectos de la transducción. Para una proteína fluorescente verde (GFP) control de vectores, la cantidad de GFP en el cerebelo calcula rápidamente y confiablemente por un programa básico de la proyección de imagen. Para fenotipos de enfermedad motor que son inducidos por la ALS respuesta transactive proteína DNA-proteína de 43 kDa (TDP-43), los déficits son anotados por rotarod y el reflejo del escape. Más allá de modelos de enfermedad y la terapia génica, existen diversas aplicaciones potenciales para el gene de gran escala dirigidas a descrito aquí. El uso expandido de este método ayudará a acelerar la prueba de las neurociencias y la Neurogenética de hipótesis.

Introduction

Vectores de virus recombinante adeno-asociado (AAV) son herramientas imprescindibles para la investigación del CNS porque son tan eficaces transducción in vivo de neuronas. Los vectores AAV son muy versátiles para estudiar diferentes transgenes e isoformas de la proteína, diferentes tejidos, diferentes especie y diferentes vías de administración. Por ejemplo, AAV puede ser administrado a ratones por un periférico, relativamente no-invasivo, inyección intravenosa para transducir las neuronas en el SNC como primero descrito en Foust et al. y Duque et al. (véase papel de JOVE por Gombash et al. (2014)). 1 , 2 , 3 se utiliza este enfoque de entrega de genes en ratas expresar eficientemente cualquier proteína fluorescente verde (GFP) o la ALS proteínas, respuesta transactive ADN-proteína de 43 kDa (TDP-43) en el SNC. 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 trabajo en ratas es significativo porque los parámetros fisiológicos y metabólicos de la rata están más cercanos de los seres humanos en comparación con ratones y hay ensayos conductuales y toxicológicos diseñados específicamente para las ratas. Además, más líneas de ratas transgénicas están volviendo disponibles que puede ser utilizado en estudios de transferencia de genes AAV.

Se detallan métodos expansivos CNS transferencia de genes en la rata y cuantificación rápida y confiable de los resultados. Transducción de CNS de gran escala se utiliza para imitar la sintomatología de la ELA en ratas expresando TDP-43 a lo largo de la médula espinal. El método es inyecciones de vena de cola del vector TDP-43 a ratas adultas jóvenes según lo utilizado en Jackson et al. 6 , 8 , 9 después de varias semanas, déficits motor TDP-43-inducida son marcados por dos métodos: escapar de reflejo y rotarod en Dayton et al. y Jackson et al. 5 , 6 , 7 , 9 para el vector de control GFP, en análisis post-mortem, la zona fluorescente del cerebelo se calcula como un índice de eficiencia de la transducción de señales en Jackson et al. 6 , 8 el análisis del cerebelo ha demostrado para ser un índice rápido y confiable del grado de transducción CNS después de la entrega del gene periférico y debe ser aplicable a una variedad de métodos de transferencia génica de periférica a central.

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Protocol

todos los procedimientos siguieron las pautas apropiadas de NIH. Todos los procedimientos siguieron protocolos animales que fueron aprobados por el cuidado Animal y uso en LSU Health Sciences Center en Shreveport. Para este procedimiento se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley a las 6 semanas de edad.

1. determinar los dosis/volúmenes de vector necesitada

  1. pesan las ratas al ser inyectado y determinar la cantidad de vector viral necesaria para cada animal basadas en el título (concentración) de la preparación del vector. Usan dosis de vectores que han tenido éxito para la expresión eficiente de la rata del CNS previamente (ver Jackson et al. 6).
    Nota: para el AAV9 TDP-43 o AAV9 GFP, una dosis típica es entre 3 x 10 13 - 1 x 10 14 vector genomas/kg. Las ratas adultas jóvenes a las 6 semanas de edad pesan unos 150 g.
  2. Hacer dosis equivalentes por kg en todos los animales para comparaciones sistemáticas. Asegúrese de que el volumen supere los volúmenes estándar inyección aconsejada (250-500 μl de una rata de 250 g). Un volumen de inyección típica es 200 μl a una rata adulta joven.

2. Preparar la estación de trabajo

  1. reunir materiales necesarios: una película de parafina cuadrado (aproximadamente 5 x 5 cm) por animal, cojín de preparación de un alcohol por gasas animales, (2-3 por animal), puntas de pipeta y una micropipeta.
  2. Preparación de la superficie de trabajo de limpieza de la superficie con etanol al 70%. Coloque una almohadilla de calefacción hacia abajo con la temperatura regulada a la baja (~ 37 ° C). Coloque una almohadilla de banco encima de la almohada eléctrica.
  3. Preparar la anestesia de gas (isoflurano). Asegurar suficiente oxígeno y gas anestesia para el procedimiento. Limpiar la mascarilla de anestesia y cámara de inducción con etanol al 70% y coloque la máscara de la anestesia sobre la almohadilla del Banco.

3. Preparar el vector

  1. descongelar el vector a temperatura ambiente y un tubo de microcentrífuga estéril para cada animal de la etiqueta.
  2. Pipeta el volumen de AAV determinado en paso 1.1 en el tubo correspondiente y llevar el volumen hasta el volumen de inyección deseado (aquí, 200 μl) con Ringer entibiada ' s solución o solución salina.
  3. Vortex la muestra para 1-2 s y y la entonces pulsación centrifugue durante 5 s para traer la muestra a la parte inferior del tubo de.
  4. Pipeta el volumen total de inyección para la rata por el tubo y en la Plaza de la película de parafina.
  5. Colocar una aguja de 30 calibre en una jeringa de 1 mL.
  6. Coloque la aguja con el bisel mirando hacia abajo en el vector en la película de parafina. Tire el émbolo de la jeringa hasta que el virus está en la aguja y la jeringa. Tenga cuidado para evitar burbujas de aire en la aguja, que se hace más fácil con la práctica.

4. Preparar la rata

  1. gire el oxígeno hasta 1 L/min y la anestesia isoflurano en 5%. Asegúrese de que la anestesia de gas fluye a la cámara de inducción revisando todas las mangueras de conexión y llave de paso orientaciones.
  2. Colocar la rata en la cámara de inducción de anestesia de gas alrededor de 3 minutos, hasta que la rata es insensible.
  3. Garantizar la adecuada profundidad de la anestesia pellizcando el dedo del pie. No debe haber ningún movimiento en el pie o la pierna después del pellizco del dedo del pie.
  4. Reducir la anestesia isoflurano al 2% para el mantenimiento de la anestesia y ajuste la llave de paso para que la anestesia está fluyendo a la máscara de la anestesia.
  5. Colocar la rata ' s de la nariz en la máscara de la anestesia y ajustar la rata que está mintiendo en su lado.
  6. Identificar la vena lateral de la cola.
    Nota: Las venas laterales de la cola se encuentran en aproximadamente 10 a 2 o ' reloj con la parte superior dorsal de la cola como 12 o ' reloj. Con la rata acostado a su lado, la vena lateral de la cola debe estar hacia arriba
  7. Limpiar la zona de inyección con el cojín de la preparación de alcohol. El sitio de inyección es dos tercios la longitud de la cola.

5. Inyectar el vector

  1. Sujete la cola ligeramente por encima de la zona de inyección con un dedo directamente sobre la vena lateral de la cola; esto dilatar la vena.
  2. Con el bisel hacia arriba, alinee la aguja con la vena de la cola visible en la misma dirección.
  3. Perforar la piel sobre la vena de la cola mientras se toma gran cuidado para evitar que la otra mano sosteniendo la cola y presión sobre la vena de la cola.
  4. Libere la presión de la vena de la cola para permitir el flujo normal de sangre.
  5. Mover la aguja en la vena. Para asegurar que la aguja ha perforado la vena de la cola, tire levemente del émbolo. Si la aguja está en la vena, la sangre fluirá dentro de la aguja.
    1. Reposicionar la aguja según sea necesario. A continuación, para estabilizar la aguja, mover la mano sobre el sitio de la inyección a debajo del sitio de la inyección y mantenga el extremo de la jeringa contra la cola.
  6. Lentamente inyectar el vector en la cola (aproximadamente 20 μl/s).
    Nota: La vena puede perder el color como el vector atraviesa. Los signos que se inyectó la solución fuera de la vena incluyen blebbing, palidez de la piel, o resistencia al inyectar el vector. Con la práctica, puede minimizarse la exposición extra vascular.
  7. Después de que el vector ha sido administrado, retire la aguja de la rata y coloque una almohadilla de Gasa contra el sitio de la inyección para ayudar a frenar la sangría de 30-60 s.

6. Limpieza

  1. apagar el isoflurano anestesia y oxígeno. Supervisar la rata hasta que recupere conciencia y luego devolverlo a su jaula.
  2. Cuidadosamente coloque las agujas en el contenedor de objetos punzantes. Disponer de otros materiales desechables que están potencialmente contaminadas con AAV en un recipiente de riesgo biológico apropiado. Limpiar las estaciones de trabajo con etanol al 70%.

7. Evaluar reflejo de escape trasera

Nota: miembro posterior déficit generalmente se presenta 2 a 6 semanas después de la transferencia de genes de la TDP-43, dependiendo de la dosis de vector.

  1. En una superficie plana clara de escombros, con dos dedos coge la rata ' s cola de aproximadamente 2 cm del cuerpo. Levante suavemente la rata hasta que las extremidades anteriores están colgando mientras se observa la parte inferior ventral de la rata.
    1. Realizar el procedimiento cada semana durante el curso del tiempo experimental después de la transferencia de genes (por ejemplo, hasta 12 semanas después de la transferencia de genes).
      Nota: Anotar también déficits de miembro anterior de esta manera, pero déficits trasera son más probables que ocurra en este modelo, dependiendo de la dosis de vector utilizada.
  2. Observar los miembros posteriores de 10 s. Nota Si uno o ambos miembros posteriores aprietan hacia la línea media durante los 10 s.
  3. Repetir esta prueba para un total de tres veces con 30 s entre los ensayos. Si uno o ambos miembros posteriores son cerrados para cada uno de los tres ensayos, la rata muestra disfunción del motor. Registrar los datos (manualmente en notas) como cualquier déficit de miembro posterior unilateral o bilateral actual si hay constante apretamiento en los tres ensayos.

8. Evaluar la función motora en el rotarod

  1. para configurar el rotarod, coloque una almohadilla de banco bajo el rotarod y aceleración en 4-40 revoluciones por minuto (rpm) durante 2 min (la velocidad aumenta por ~0.3 rpm/s). Para un curso de tiempo de 12 semanas, corren los temas 2, 4, 8 y 12 semanas después gene transfer.
  2. Permite la rata se adapte a la sala de pruebas durante 20 min
  3. Formar la rata con el rotarod por primera vez, primero iniciar el rotarod a una velocidad de 4 rpm, luego colocar la rata en el rotarod. Permiten la rata a caminar una vuelta completa a 4 rpm, a continuación, iniciar la aceleración y permiten la rata a caminar en el rotarod hasta que se desprenda. Continuar entrenamiento hasta que la rata puede caminar constantemente por lo menos 40 s. Una rata adulta sana, los jóvenes será capacitada fácilmente de esta manera.
    1. En el caso de una rata con un notable deterioro motor, que puede impedir que la rata logro una latencia inicial para bajar de 40 s, proporcionar la rata 3-5 intentos de formación antes de comenzar anotando rotarod.
  4. Para comenzar la prueba del rotarod, colocar la rata en el rotarod y empezar a aceleración del rotarod. Nota el tiempo en que la rata cae desde el rotarod; se trata de la latencia a caer. Si la rata se mantiene en el rotarod después 120 s, tapa de la sesión en este momento, quite la rata el rotarod y grabar un estado latente de la caída de 120 s.
  5. Repetir la prueba dos veces más para un total de tres ensayos. Para minimizar el efecto de la fatiga, espacio de los ensayos por lo menos 5 minutos aparte. Promedio de las puntuaciones de los tres ensayos. Una rata adulta intacta por lo general tiene una latencia promedio de caída de > 40 s.
  6. Volver a colocar la rata en la jaula y limpiar el rotarod y alrededores con etanol al 70%.

9. Cuantificación de la expresión de GFP en el cerebelo

  1. anestesiar las ratas y perfusión con tampón fosfato salino (PBS) y luego con paraformaldehído al 4%. Diseccionar el cerebro y la médula espinal y remojando la noche anterior los tejidos en el fijador y luego moverlos a una solución de sacarosa al 30%. Después de equilibrar, cortar secciones coronales de 50 μm en un micrótomo de deslizamiento con congelación etapa 4 , 5 , 6.
  2. Elegir las secciones 3-6 del cerebelo que se espacian uniformemente en los vermis, el lóbulo central del cerebelo. Etiqueta fluorescente GFP para maximizar la señal. Utilizar el anticuerpo primario para GFP en 1: 500 y utilizar el Alexa 488 anticuerpo secundario conjugado a la dilución de 1:300 4 , 5 , 6.
    Nota: Véase referencia 4 , 5 , 6 para más detalles sobre el muestreo, seccionamiento y procedimientos de tinción.
  3. Microfotografía cada sección en la región definida de interés con una lente de baja magnificación usando un microscopio. Uso un objetivo X 2.5 (N.A. 0.12) y filtro Coloque 10, 450-490/515-565 excitación/emisión). Mantener la configuración de la cámara (tiempo de exposición, por ejemplo, 2 s) el mismo a través de las muestras a analizar. Guarde como un. Archivo TIF.
  4. Abrir la microfotografía en el programa de imagen Scion ampliamente disponible, se abrirán dos ventanas. Cierre la ventana indicada como " Color indexado ".
  5. Elegir " opciones de ", entonces " densidad de SliceŔ una gama de tonos se indicará en rojo en la ventana de tabla de búsqueda (LUT). En la ventana, usa los cursores para llenar en la GFP etiquetado específico sólo y cuando el fondo no específico comienza a ser recogido en la imagen.
    Nota: Esto resaltará la zona fluorescente en la microfotografía a cuantificarse. La configuración debe optimizarse para capturar específicamente todas las células visiblemente fluorescentes. Con la práctica, este método puede destacar precisamente la fluorescencia específica.
  6. Antes de medir área fluorescente, primero asegurar que las mediciones efectuadas en las unidades correctas (píxeles). Para ello, haga clic en " Análisis ", luego " Set ScaleŔ la cuarta línea debe decir " unidades ". En la lista desplegable, seleccione píxeles para medir en píxeles y luego haga clic en " OK ". Cambiar las opciones de análisis para " incluyen Interior agujeros " para asegurar la inclusión de todo el cuerpo de la célula en el análisis.
  7. Haga clic en
  8. para medir la zona fluorescente, " analizar " y haga clic en " medida ". Para ver este valor, haga clic en " analizar " haga clic en " Mostrar ResultsŔ aparecerá una ventana de resultados. La medida del área fluorescente será bajo el título con la etiqueta " área ".
  9. Para asegurar la estandarización en las medidas, no cambie los valores de resaltado en la ventana LUT.
  10. Una vez que todas las mediciones se han registrado, un promedio de los valores para cada animal (de 3 a 6 secciones por animal). Utilizar una prueba estadística adecuada para comparar las áreas transduced entre los grupos. 6

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Representative Results

TDP-43 deficiencias motoras inducidas deben presentarse dentro de 2 a 6 semanas dependiendo de la dosis de la AAV TDP-43 usado (figura 1). Inyecciones de vena de cola dará como resultado parcial o sin impedimentos; el AAV debe alcanzar el torrente sanguíneo para producir el efecto. Una inyección exitosa de AAV GFP resultará en la expresión de GFP en el cerebro y la médula espinal de una manera dependiente de dosis de vector. Cuando se utiliza el promotor recombinante fuerte expresión de unidad, citomegalovirus pollo beta actina híbrido promotor, también conocido como el promotor CAG, hay expresión eficiente en el SNC, así como varios otros tejidos tales como hígado y corazón. 4 , 5 , 10 dentro de la rata del CNS, al usar AAV9 o AAV PHP. Vectores de B, el patrón es transducción neuronal predominante y transducción glial solamente escaso, esporádico. 4 , 8 ya que diferencia de género en la eficiencia de la transducción no fue observada en ratas con el método de gran escala, las hembras se utilizan típicamente para transferencia de genes vía intravenosa debido a su menor peso. 6

El método de proyección de imagen semi-cuantitativo descrito es rápido y confiable porque hay una excelente relación señal a ruido. Una muestra no-transduced se compara con una muestra transduced en la figura 2 con ambas muestras teñidas con el anticuerpo de la GFP. Valores de estas muestras indican ruido de 0.3% (de los valores indicados en la figura 2B, D) en la muestra no-transduced, que puede considerarse insignificante. Dada la excelente relación señal a ruido, este método es válido para una comparación rápida de condiciones experimentales tales como tipos de vectores, vector dosis, género, edad, etcetera.

Figure 1
Figura 1. Transferencia de genes de AAV9 TDP-43 de gran escala a las ratas causa debilitación progresiva del motor. Rotarod rendimiento en 1-3 semanas después gene transferencia de control GFP o relacionadas con ALS gen TDP-43. Los sujetos fueron probados antes de la transferencia de genes y las medidas se expresan como una relación al momento basal. Una rata normal no tratada permanece en el rotarod de 60-90 s bajo estas condiciones. Esta figura ha sido modificada desde6.

Figure 2
Figura 2. Cuantificación rápida de la zona fluorescente GFP-positivas en el cerebelo tras la administración intravenosa de AAV a la rata. A, B) no-transduced muestra estaba manchada con el anticuerpo de la GFP. C, D) muestra de una rata recibiendo AAV9 GFP. B, D) la densidad rebanada opción en imagen Scion se utiliza para destacar selectivamente la zona fluorescente en color rojo, y luego los píxeles rojos son contados por el programa. La opción de densidad rebanada debe destacar todas las células fluorescentes visibles en C. El área roja, expresado en píxeles cuadrados calculados por el programa se muestra en B, D. El momento era 4 semanas después de una inyección en la vena cola de AAV9 GFP a una rata adulta joven a una dosis de vector de 1 x 1014 vector genomas/kg. Barra de escala en el A es 536 μm; mismo aumento en un D. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Una variedad de rutas de entrega han sido probados para vectores AAV: intraparenquimal, intra-cerebroventricular, intra-tecal, intravenosa, intranasal, intramuscular, etcetera. Cada ruta puede tener ventajas como inconvenientes. Administración de cola vena de AAV a ratas adultas es un método confiable para lograr la constante de transducción del CNS. El método de inyección periférica evita la introducción de una cánula de inyección en los tejidos de la CNS y por lo tanto es mínimamente invasivo. La expresión eficiente de CNS que puede lograrse mediante este método es la mayor ventaja de la técnica. Otras ventajas prácticas son que el método de inyección es muy rápida (unos 10 minutos por animal de principio a fin) y que las inyecciones de vena de la cola no son muy técnicas y por lo tanto pueden ser dominadas rápidamente. Sin duda, un gran inconveniente es que se necesita un montón de vector de alto título, que será un tema viabilidad si la prepara AAV es inferiores a 1 x 1013 vector genomas/ml. Con más refinamiento de vectores dirigidos a las capacidades, este enfoque podría ser ventajoso para la terapia de gen clínica en el futuro, dado que la entrega del gene es una vía periférica y así relativamente no-invasivo. Por otro lado, más directa que las inyecciones de líquido cerebroespinales dentro podrían ser ventajosas en enfoques clínicos y preclínicos por dos razones: una más limitada propagación del vector y el uso de dosis más bajas de vector.

En ratas con pigmentación más oscura, la vena de la cola puede ser más difícil de identificar. Por lo tanto, se pueden utilizar rutas alternativas de administración como inyecciones retro-orbital o inyecciones intravenosas a la vena safena. Las inyecciones de retro-orbital blanco un denso lecho capilar y están así similares a una inyección intravenosa. Para los ratones y tal vez para las ratas, el método de retro-orbital puede ser más fácil que las inyecciones de vena de la cola, pero tres estudios han demostrado la consistencia de las inyecciones de vena de la cola en ratas adultas. 6 , 8 , 9 la mayor parte de este trabajo utiliza una fuerte promotora recombinante para la expresión de transgenes en coche, el promotor de citomegalovirus pollo beta actina híbrido. 10 si el experimentador desea delimitar la expresión a las neuronas en el SNC, un promotor de tipo-específicas de la célula puede ser intentado, por ejemplo el sinapsina promotor. 8 , 11

En relación con el método de proyección de imagen, es un método rápido y semicuantitativo para estimar la eficiencia de la transducción de señales. Si se realiza correctamente, el análisis produce una estimación confiable de la zona de transduced. El método estándar de oro para contar objetos en el tejido del CNS se llama estereología. Se tarda unos 75 minutos por animal para llevar a cabo un sondeo estereológicos en una región de interés en el cerebro mientras que el método descrito es más rápido en 20 minutos por animal o incluso menos cuando se escala. Si todas las condiciones se mantienen iguales y la misma región se muestrea correctamente, la consistencia de los datos acerca de la gran consistencia de estereología, y grandes grupos de muestras pueden analizarse rápidamente en masa.

Hay una serie de notas técnicas adicionales que requieren más discusión. Sección 1 con respecto a la dosis de vector, las dosis de vectores necesarios para la expresión del transgen eficiente en ratas fueron determinados por ensayo y error y la dosis-respuesta de Wang et al., Dayton et al.y Jackson et al., así como dosis anteriores usadas en ratones (Foust et al. y Duque et al.). 1 , 2 , 4 , 5 , 6 ciertamente un paso crítico y potencialmente tarifa-limitador está produciendo alto-título AAV prepara para alcanzar las dosis eficaces.

Para la sección 3 sobre cargar el vector en la aguja, burbujas de aire en la solución de la inyección debe evitarse lo mejor posible. Una pequeña cantidad de aire no debe ser problemática ya que esto puede ser filtrado por los pulmones, pero excesivos volúmenes de aire que se inyecta en la vena pueden provocar una embolia gaseosa venosa potencialmente dando por resultado muerte. 12 si hay burbujas en la jeringa, el virus debe ser expulsado de la jeringa, y se debe cargar una jeringa nueva. Para evitar la creación de burbujas, asegúrese de colocar la aguja cerca de la caída del vector en el parafilm con el bisel hacia abajo. Cuando la mayoría del vector ha tomado dentro de la aguja, elaborar muy lentamente la solución restante. Se forma una pequeña bolsa de aire en la parte trasera de la jeringa. Este es el espacio muerto y no se inyectará. Para asegurar que se mantiene hacia la parte trasera de la jeringa, mantenga la jeringa horizontal o puntiagudo hacia abajo y no mueva la jeringa.

Para sección 5 con respecto a las inyecciones, para asegurar que la inyección va en la vena y no el tejido que rodea la vena, una vez que se ha insertado la aguja, tire levemente del émbolo para crear presión negativa en la punta de la aguja. Como se mencionó, si la aguja está en la vena, la sangre debe fluir hacia la aguja y será visible en la base de la aguja. Al inyectar en la vena, debe sentirse poca resistencia cuando la aguja está colocada adecuadamente. Si se encuentra resistencia significativa, entonces es probable que la inyección va en el tejido de la cola como se describió anteriormente. También es posible pinchar a través de la vena, causando una "vena quemada", cuando el ángulo que se inserta la aguja es demasiado empinado, cuando el calibre de la aguja es demasiado grande para la vena, o cuando la velocidad de inyección es demasiado rápida ejerciendo demasiada presión sobre la vena. Una vena quemada puede ocurrir durante la primera punción de la vena o durante la inyección. Para evitar pinchar la vena durante la inyección o que la aguja se descolocado de la vena, la jeringa debe ser estabilizada sujetando el extremo de la jeringa contra la cola como se ha mencionado. Si la aguja se desaloja o se necesita una segunda inyección por otra razón, puede hacerse la segunda inyección a la vena lateral de la cola en el lado opuesto o hasta más cerca al cuerpo en el mismo lado.

Para la sección 8, el ensayo rotarod se ejecuta en intervalos de 4 semanas durante el experimento. Normal, las ratas no tratadas tienen mejores resultados cuando son más jóvenes (4-6 semanas de edad) que en edades mayores. Los déficits en el reflejo del escape se trazan como supervivencia de la función del miembro con el tiempo. Las curvas de supervivencia son analizadas por una prueba de log-rank en software de prisma.

Para la sección 9 sobre el análisis de la transducción de señales, con la práctica, el procedimiento se convierte relativamente rápido, toma unos 20 minutos o menos por animal. Este ensayo también es muy fiable porque los tejidos no-transduced que son procesados con la GFP procedimiento de tinción una lectura básicamente insignificante (Figura 2B), y porque hay una amplia gama dinámica para la lectura. La mayoría de la fluorescencia de GFP deriva de células de Purkinje transduced, y así sus grandes números proveen un amplio rango dinámico. Hasta ahora, el gene transferencia su eficiencia no ha causado las lecturas saturar a través de todo el campo (es decir, 100% transduction de las células de Purkinje), por lo menos cuando la transferencia del gene se administra a ratas adultas. Si saturación de todo el campo era un problema, entonces la señal podría reducirse mediante la aplicación de una dosis más baja del vector en diferentes animales o midiendo sólo el más débil, nativo GFP fluorescencia, renunciando el procedimiento de tinción. Sin duda la transducción de otros tipos de células en el cerebelo también podría contribuir a la señal, pero la mayoría de lo que es fácilmente visible y por el programa es claramente los cuerpos celulares en las capas de células de Purkinje y sus árboles dendríticos en el molecular capas a lo largo de cerebelo, basado en su morfología y posición conocida. Un reto importante para el método es que las burbujas de aire o desechos fluorescente podían contar, así que contaminará las lecturas. Secciones y campos con este ruido no se utilizan; deben limpiarlos muestras libres de ruido no específicos. GFP es una proteína extraña, hay no hay ruido de fondo dentro del tejido, la fluorescencia específica puede ser precisamente capturada y estimada. En estos estudios, las GFP fotomicrografías fueron capturadas en color y luego se convierte en escala de grises utilizando un programa de imagen que no sea imagen de Scion. Sin embargo, sería más sencillo captar la GFP en blanco y negro en primer lugar para el posterior análisis en imagen Scion. Estudios previos analizaron la transducción de la médula espinal las neuronas motoras inferiores base en un porcentaje, es decir, el porcentaje de motoneurons expresando GFP. 4 , 6 sin embargo, el análisis del cerebelo es más rápido, requiriendo menos secciones y también parece ser más consistente y confiable también (por ejemplo, a través de observadores individuales haciendo las evaluaciones). El método imagenológico cerebeloso rápido así es un buen índice rápido del éxito de la transferencia de genes de periférica a central. Análisis de la transducción de la médula espinal y ejemplos de la transducción de otros sitios en el sistema nervioso de rata se han divulgado en Wang et al., Dayton et al.y Jackson et al. 4 , 5 , 6

En Resumen, la ruta intravenosa de administración es mínimamente invasiva; el SNC puede ser objetivo de una administración periférica sin colocar una aguja en el cerebro o la médula espinal. Junto con el refinamiento adicional de focalización, terapias genéticas preclínicos y clínicos relevantes continuará utilizando entrega intravenosa, mientras que muchos tipos futuros miles de estudios funcionales básicos en ratas pueden beneficiarse de la transducción expansiva en búsqueda de agilizar la comprobación de la hipótesis de la función del gene in vivo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por la Asociación de ALS, Karyopharm Therapeutics, Inc., Meira GTx y una donación benéfica para la investigación de ALS de Thomas Lawson, para lo cual estamos agradecidos. Agradecemos a Elysse huerta y Donna Burney para asesoría y capacitación. JAS fue apoyado por la Fundación mintió e institutos nacionales de salud otorgar GM103418.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Scale Pelouze SP5
Nalgene bucket Thermo Scientific 12014000 4000 mL
Microcentrifuge tube USA Scientific 1615-5500
Lactated Ringer's Solution Baxter Healthcare 0338-0114-04
Mini vortexer Fisher Scientific 128101
Centrifuge Eppendorf 22624415
Laboratory film Bemis PM996
1-mL syringe BD 309626 Comes with a 25g needle attached.
Replace with 27-30g needle for injection
30g needle BD 305106
Isoflurane Piramal Healthcare 66794-013-25 Isoflurane USP 250 mL
Anesthesia mask Kopf Instruments 906
Gauze Henry Schein 100-2524 2" x 2" (5cm x 5cm)
Pipet tips USA Scientific 1111-0816
Micropipet Gilson 4642080
Gas anesthesia vaporizer SurgiVet 4214322 Classic T3
Gas anesthesia scavenger SurgiVet 32373B10 Enviro-PURE
Heating pad Sears 17280
Bench pad VWR 56617-006
Rotarod Panlab/Harvard Apparatus 76-0772 4 rats/ 4 mice
70% Ethanol Decon Laboratories, Inc. 2401 140 proof
70% Isopropanol VWR 89108-160
Scion Image Scion Corporation
GFP Tag Polyclonal Antibody Invitrogen A11122 Primary Antibody - 1:500 dilution
AlexaFluor 488 Invitrogen A11070 Secondary Antibody - 1:300 dilution
Axioskop 40 microscope Zeiss

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Foust, K., Nurre, E., Montgomery, C., Hernandez, A., Chan, C., Kaspar, B. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes. Nat. Biotechnol. 27, (1), 59-65 (2009).
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