そのセンターの蛍光質量イメージングによるゴルジ体タンパク質の量的なローカリゼーション

Biology

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Summary

ゴルジの住民の正確な局在はゴルジ体の細胞の機能を理解するために不可欠です。しかし、従来の光学顕微鏡ではサブ ゴルジ構造を解決できません。ここで定量的蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在を決定する従来の顕微鏡による超解像法のプロトコルについて述べる。

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Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

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Abstract

ゴルジ複合体から成っているcisを含むサブ ゴルジ領域にさらに分類できる直列積層膜 cisternae-ゴルジ、内側-ゴルジ体トランス-ゴルジとトランス-ゴルジ ネットワーク。細胞ゴルジ装置の機能は、その居住者のタンパク質の分布特性によって決定されます。従来の光学顕微鏡の空間分解能が小さすぎるため、サブ ゴルジ構造または cisternae 解決。したがって、免疫金電子顕微鏡はサブ ゴルジ体レベルでタンパク質をローカライズする選択の方法です。しかし、技術と楽器はほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えるです。ここで質量の中心 (かすかな光) 体系的かつ定量的ローカライズ ゴルジ体のタンパク質のイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションと呼ばれる最近開発された超解像手法について述べる。かすかな光は、共焦点顕微鏡や従来の広視野標準蛍光ラベリング プロトコルに基づいています。それは顕微鏡システム、画像の取得と取得後解析波長シフト収差の校正を含みます。テスト蛋白質のサブ ゴルジ装置の局在は定量的局在商として表されます。かすかな光の 4 つの主な利点があります。それは急速に従来の方法とツールに基づいて、ローカライズ結果は定量的、それを与える 〜 ゴルジ体軸に沿って 30 nm 実用的な解像度。ここでテストのゴルジ体のタンパク質をローカライズするかすかな光の詳しいプロトコルについて述べる。

Introduction

ゴルジ複合体は、哺乳類細胞1,2,3でタンパク質や脂質 (以下貨物) の分泌/エンドサイトーシス人身売買に必須の役割を果たしています。ゴルジ体、貨物だけでなく様々 な細胞内コンパートメントにソートしますが、グリコシル化反応の様々 な種類によっても変更します。哺乳類のゴルジ複合体は、通常から成っている 4-11 しっかりと隣接してフラット膜嚢 cisternae と呼ばれる多数の横に接続されているゴルジ スタックを構成されています。順次積み上げゴルジさらとして分類される、他の一方の端からcis内側、トランス-cisternae。トランスで-側ゴルジ スタック、トランス-トランスと呼ばれる管状、胞体膜ネットワークに発展するほとんどの膜嚢-ゴルジ ネットワーク (TGN)4。分泌経路の小胞体 (ER) から派生した貨物は、そのcisでゴルジ スタックを入力-側し、順次内側とトランスを通過-cisternae。貨物が最終的にトランスでゴルジを終了-ゴルジ体や TGN 膜、エンドソームまたは分泌顆粒に運命にあります。

貨物がゴルジ スタックを通過する方法とゴルジ装置がその大槽内の組織を維持する方法の分子・細胞メカニズムは謎のままし、激論1の下でまだ現在が。このフィールドの難しさの 1 つはゴルジのみ解決できることを電子顕微鏡検査 (EM) の下で光学顕微鏡の解像度から (~ 200 nm) 個々 のゴルジ (< 100 nm 両方の大槽内厚を解決するのに十分ではないです。距離)。したがって、居住者のタンパク質とトランジット貨物のサブ ゴルジ装置の局在は、従来免疫金 EM によって決まります。しかし、免疫金 EM は技術的に非常に難しく、それはほとんどの細胞生物学の実験室の能力を超えています。EM の解像度は、サブナノメータをすることができます、免疫金 EM によって与えられる解像度が大きく複雑な抗体 (一次および二次抗体) のサイズと金粒子によって妨げられて、それは 20 よりも悪化することができますが nm。さらに、EM 画像は相対的な位置と 2D 断面図5の向きによって誤った結論につながるゴルジ装置の 3 D 地球ビューではなく 2D 薄いセクションから取得されます。たとえば、EM の単一セクションの勉強は両方は同一ラウンド膜プロファイルを表示することができますので、確実に、尿細管の直交ビューから、小胞を区別することがないです。排出量の枯渇 (STED)、センサー ローカリゼーション顕微鏡 (パーム) と確率光再建顕微鏡 (刺激して 3 D 構造照明顕微鏡を用いて (3 D SIM) などの超解像顕微鏡技術の最近の出現嵐)、光顕微鏡6下サブ ゴルジ構造を解決することが可能になります。ただし、ゴルジ体の細胞生物学的研究の使用を大幅に制限することができます、少なくとも 4 つの欠点があります。1) 現在の超解像技術では、高価で特別なハードウェアの構成ほとんどの細胞生物学の実験室を超えている必要があります。2) 特別な蛍光ラベリング プロトコルは、いくつかの超解像技術に必要です。3) が、最高の条件の下でこれらの技術は 20 110 nm の空間分解能を主張、実際サンプルで得られた実用的な解像度が悪化することができます。4) 従来の顕微鏡で比較してこれらの超解像技術まだまたは問題がある実施で多色、3 D ライブ細胞イメージング、単独または組み合わせで。おそらく最も重要なは、免疫金 EM と超解像顕微鏡技術収量定性的定量的なローカリゼーション データの代わりに。

部分的に上記の問題を解決しようとして、我々 は最近 (かすかな光)、体系的にかつ定量的にゴルジをローカライズする質量の中心をイメージングによるゴルジ体蛋白質のローカリゼーションの名前は基づく従来の光学顕微鏡法を開発しました。免疫金 EM7と同等の解像度でタンパク質。この方法では培養された哺乳類細胞におけるゴルジ分散ゴルジ ミニ スタックとしてノコダゾール、微小管重合薬物の治療。広範な研究は、組織で細胞機能8,9,10、ネイティブのゴルジ スタックが近いノコダゾール誘起ゴルジ ミニ スタック (以下ゴルジ ミニ ・ スタック) を示しています。 11。テスト蛋白質のローカリゼーション商 (LQ) は、かすかな光を介して取得することができます、それは量的なサブ-ゴルジ装置の局在を表します。LQs の数値の値を比較することができます、以上 25 のゴルジ体マーカーの LQ データベースが利用されています。

かすかな光、ゴルジ ミニ スタックは、内因性あるいは外因表現商品番号:gm130、ゴールト mCherry テスト蛋白質 (x)、トリプル ラベルします。商品番号:gm130 と GalT-mCherry、 cis- および-ゴルジ マーカーそれぞれ1213,,の参照ポイントを提供します。トリプル蛍光、赤 (R)、緑 (G) と遠 (B) 人工的にそれぞれ赤、緑、青、として表示されます。蛍光質量 (以下、センター) の中心は、サブピクセルの解像度を達成するために採用しています。ゴルジ体の軸は、商品番号:gm130 のセンターからゴルト mCherry へのベクトルとして定義されます。ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸周り無限の回転対称性を有する円筒構造としてモデル化されます。したがって、ゴルジ ミニ スタックは、ゴルジ体軸に沿って一次元構造としてさらにモデル化します。LQ テスト蛋白質の x はx/d1、d1は商品番号:gm130 の距離ゴルト mCherry センターからのxは、商品番号:gm130 の x の中心からの距離として定義されています。X の中心は軸を計算のための投影軸距離が使用されます。かすかな光のゴルジ体軸、軸角度、x、d1角度 α、角度 β を含む変数は、図 1に示す図式。LQ は、ゴルジ ミニ スタックのセルにランダムに向きがゴルジ体軸角の独立しています。

ゴルジ ミニ スタック表示画像で不均一です。かすかな光の解析可能なゴルジ ミニ スタックを選択するための 3 つの条件を開発しました。1) 信号対雑音比の基準、ゴルジ ミニ スタック バック グラウンドの標準偏差 (SD) の合計強度の比率は各チャンネルの ≥ 30。この条件は、ゴルジ ミニ スタックの信号対雑音比に依存する重心の位置決め精度を確保するためです。D1≥ 70 が必要です 2) 軸の角度または距離基準 nm。d1ゴルジ体軸角の増加と共に減少します。軸角が 90 ° に近づいているまたは垂直、ミニのスタックになります d1として解決可能な場合は、0 に近づいています。d1≥ 70 nm を垂直ゴルジ ミニ スタック近く効果的に除外できます。3) 直線性基準、いずれかに | α を日焼け |または | β を日焼け |≤ 0.3 です。この基準により、ミニ スタックの 3 つのセンターが十分に co ゴルジ ミニ スタックの 1 次元モデルの線形。すべて光顕微鏡は赤、緑および遠赤色蛍光中心の相対的な位置を歪めることができる真剣に色収差に苦しみます。顕微鏡システムの色収差を 110 nm のビーズがあり、赤、緑、遠赤色蛍光によるトリプル ラベルであるイメージングによる校正実験します。各ビーズ イメージの一次多項式関数によって緑と遠中心の波長シフトが施され、赤のセンターはビードの真の位置として定義されています。ゴルジ ミニ スタックの中心は、緑と遠のチャンネルの波長シフトを修正する多項式関数にさらされます。

かすかな光の解像度を実現することができます 〜 30 nm ゴルジ体軸の標準的な条件の下で。重要なは、定量的、ゴルジ体のタンパク質をマップする体系的な方法を提供します。かすかな光は、全体のフィールドなど、従来の顕微鏡や共焦点顕微鏡、蛍光ラベリングの共通のプロトコルを使用して実行できます。画像とデータ処理は、最短時間で取ることができます。かすかな光を直接を実証した分泌貨物の進歩的な移行からシス-トランス-ゴルジ7の側。

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Protocol

注: 以下はかすかな光のステップバイ ステップ プロトコル EGFP LQ タグ チロシン硫酸化酵素 1 (TPST1)、HeLa 細胞におけるゴルジ常駐酵素を決定するためです。

1. 蛍光標識ゴルジ ミニ スタックの準備

  1. ガラス coverslips を準備します。
    1. 分注 0.3 mL 滅菌ダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) ティッシュ文化フードの 24 ウェル プレートのウェルに。
    2. Φ 12 mm No.1.5 ガラス基板ガラス カバーガラスの表面上の破片を削除する 70% エタノールで濃く柔らかいティッシュ ペーパーを使用しての部分を拭いてください。鋭いピンセットのペアを使用して、簡潔に、coverslip を 70% エタノールに浸漬 24 ウェル プレートに転送、よく含む滅菌 DMEM の底に沈みます。
      注: ガラス coverslips は従来を燃やすことによって滅菌されています。しかし、このような治療下 coverslips は簡単にその後の処理中に割れ目。70% エタノールに浸漬は、それらを傷つけることがなくガラス coverslips を殺菌に効果的です。
    3. カバー蓋、37 ° c CO 24 ウェル プレート使用まで2インキュベーターを残します。
  2. 種細胞
    1. 10 %dmem で T-25 フラスコ培養 HeLa 細胞 (以下細胞) 胎仔ウシ血清 (FBS) (以下完全培地) 37 ° C CO2インキュベーターで 5% CO2に付属しています。抗生物質を使用する必要はありません。
    2. 電池が達するとき ~ 80% の confluency 培養培地を吸引します。0.25% の 1 つの mL を追加トリプシン-EDTA フラスコに軽くピペッティングしてフラスコの壁に細胞をフラッシュし、フラスコに 2 分追加 1 mL の完全培地を 37 ° C CO2インキュベーター内のセルを孵化させなさい。
    3. 滅菌遠心分離の管および細胞ペレットに 2 分間、500 x g でスピンに剥離細胞を転送します。上清を吸引し、1 mL の完全培地で細胞ペレットを中断します。
    4. 滅菌ガラス基板と種子を含む 24 ウェル プレートのウェル中の吸引 ~ 井戸の 1 x 10 の5セル。0.5 ml の完全培地と同様のボリュームをトップします。5% CO2に付属している 37 ° C の CO2インキュベーターで孵化させなさい。細胞の培養 〜 80% の confluency。
  3. 細胞を transfect します。
    注: 十分に普及セル、分散したゴルジ ミニ スタックをイメージングのために有利。
    1. Transfect ~ 80 %80 ng ゴルト mCherry7と合流するセルと 320 ng TPST1 EGFP (材料の表を参照) DNA プラスミドの製造元によって提供されるプロトコルによるとトランスフェクション試薬を用いたします。37 ° C CO2インキュベーターで孵化させなさい。4-6 時間培養後、培地を変更します。セル準備が整いました 〜 12 時間後で。
  4. ゴルジ ミニ履歴を生成するノコダゾール治療
    1. ジメチルスルホキシド 1 mL 中 10 mg ノコダゾール粉末を溶解することによりノコダゾール原液 (33 mM) を準備します。原液の約数と長期保管の-20 ° C でストア。
    2. 1 mL 37 ° C 完全培地 (最終濃度 33 μ M) でノコダゾール原液 (33 mM) の 1 μ L を希釈します。粒子状物質を削除するは全速力で遠心分離機します。
    3. 井戸の中を吸引し、0.5 mL の完全培地を含む 33 μ M ノコダゾールを追加します。蛍光ラベリング (セクション 1.5) に 3 h 続行のための 37 ° C CO2インキュベーター内のセルを孵化させなさい。
  5. 蛍光ラベリング
    注: は、GalT mCherry、TPST1 EGFP の変質を避けるために暗闇の中で細胞を保ちます。
    1. 蛍光ラベリング試薬します。
      1. 4% パラホルムアルデヒド溶液を準備するには、ホット 1 リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) X 4% (w/v) パラホルムアルデヒド粉末を溶解し、0.45 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルター処理します。ソリューションは、-20 ° C で保存できます。
        注意: パラホルムアルデヒドは有毒で発がん性、皮膚の炎症を引き起こすことができます。適切な個人用保護具 (PPE) を着用します。
      2. 蛍光希釈バッファー (FDB) を準備するには、5% (v/v)、FBS と 1x PBS で 2% (w/v) ウシ血清アルブミン (BSA) を混ぜます。0.45 μ m のフィルターを通してソリューションをフィルター処理し、-20 ° C でソリューションを格納
      3. 5.35 g NH4Cl 100 mM NH4Cl を準備し、室温でソリューションを格納する 1 リットルの水に粉末を溶解します。
      4. 10% (w/v) サポニン粉 10% サポニン、分注を準備し、-20 ° C でソリューションを格納するために水に溶解します。
    2. 固定
      1. X PBS 液 0.5 ml 1 何度も井戸を洗浄し、0.5 mL 4% パラホルムアルデヒド溶液を追加します。室温で 20 分間インキュベートします。リンス 0.5 mL の 1x PBS で 2 回と 2 回 0.5 mL 100 mM NH4Cl. リンスもまあ 0.5 mL の 1x PBS で 2 回。セルは、暗闇の中で一晩 4 ° C で 1 × PBS で保つことができます。
    3. 蛍光標識
      1. 1 μ L マウス 500 μ L FDB 含む 0.1% サポニンの抗商品番号:gm130 一次抗体を希釈します。逆に 24 ウェル プレートの蓋と蓋に 10 μ L 一次抗体の混合物を適用します。
      2. 鋭いピンセットのペアを使用して抽出し、細胞側の混合物と接触している抗体の混合物を確保するドロップの上にガラス基板を転送します。1 時間室温で一次抗体の混合物で細胞を孵化させなさい。
        注: coverslip の蓋は、暗闇の中で加湿ビニール袋に配置できます。
      3. 鋭いピンセットのペアを使用して抽出しをセル側ともに、coverslip を転送し、≥ 3 回、0.5 mL の 1x PBS でそれを洗う 30 分振動は必要ではありません。
      4. 1 μ L 遠赤色蛍光体共役ヤギ抗マウス igg 抗体 (二次抗体) 500 μ L FDB 含む 0.1% サポニンを希釈します。
      5. 洗って、24 ウェル プレートの蓋の裏面をきれい。蓋に 10 μ L 遠二次抗体の混合物を適用します。1.5.3.2 - 1.5.3.3 の手順を繰り返します。
    4. 取付
      1. 2.2 g poly(vinyl alcohol)、グリセリン 1 g を混合することによってメディアをマウントを準備 (MW 〜 31,000 ダ)、1.2 mL 1 M トリス (pH 8) と 8.8 mL H2o ・ ディゾルブ ボルテッと 60 ° C の水浴の混合物。-20 ° C でソリューションを格納します。
      2. メディアをマウントを解除し、スライド ガラスに 10 μ L を転送します。メディアをマウントのドロップに coverslip (セル側を下) をオーバーレイします。ガラス スライド 37 ° C、30 分またはメディアをマウントを強化する 1 時間室温で孵化させなさい。無色透明マニキュアで coverslip を封印し、-20 ° C でガラス スライドを保存

2. 蛍光ビーズの波長シフト補正のための準備

  1. Coverslip クリーニング
    1. 慎重にプラスチック製のラックに 25 mm No.1.5 ガラス カバーガラスの作品を配置します。
    2. 400 mL のビーカーに転送、coverslip のラックは 300 mL で 1 M NaOH をいっぱいしのバス 15 分簡単に 300 mL の脱イオン水でリンス 400 mL ビーカーにラックがいっぱいに (35 ワット) を超音波発生装置の超音波。300 mL 99% エタノール 400 mL のビーカーにラックを転送し、15 分簡単にリンス 400 mL ビーカーにラックが 300 mL の脱イオン水で満たされた風呂超音波発生装置の超音波。
    3. 2.1.2 ステップ 2 回を繰り返します。
    4. リンス 300 mL の脱イオン水で coverslip のラックで 10 分間繰り返し 400 mL ビーカーにステップ 2 回以上。60 ° C のオーブン ラックを転送し、1 h. ストア ダストフリー ペトリ皿で乾燥された coverslip の coverslip の乾燥します。
  2. ガラス基板上の蛍光ビーズの固定化
    1. 110 nm マルチカラー蛍光ビーズ 80-fold で 1 × PBS 含んでいる 0.1 μ g/μ L BSA を希釈します。簡単に渦管ビーズ凝集体を分散します。洗浄 Φ 25 mm No.1.5 ガラス基板 (セクション 2.1 を参照) に 60 μ L 希釈ビーズを広めるピペット チップを使用しています。暗闇の中で真空ポンプに接続されたデシケータで coverslip の乾燥し、メディアを 50 μ L マウントにスライド ガラスに coverslip のマウント (1.5.4.2 の手順を参照してください)。

3. 画像の取得

注: かすかな光で高精度の重心計算の高い信号対雑音比 (sn 比) の画像が必要です。回転のディスク共焦点または広視野顕微鏡、共焦点走査型レーザーなど従来の顕微鏡では、イメージを取得できます。計画アポクロマート対物レンズと電荷結合素子 (CCD)、科学的な相補型金属酸化膜半導体 (sCMOS) などの低ノイズ イメージ センサーを搭載した広視野顕微鏡を使用ことができます。イメージ センサーのためのパラメーターは、低読み取りノイズ、高ダイナミック レンジを確保するために調整されます。顕微鏡は、グリーン、mCherry、遠赤色蛍光体の蛍光フィルターの最適な構成を装備する必要があります、ごくわずかな蛍光クロストークが必要があります。理想的には、x, ナイキストのサンプリング レートを実現するイメージングのシステム x、y および z サイズ 100 よりも小さいにボクセルを通常必要とする y および z 軸 100 および 200 nm それぞれ。X と y、ボクセルの大きさが常に等しいと pixel_size と呼ばれます。Pixel_size は、カメラのセンサー サイズをシステム倍率で割ることによって計算できます。

  1. イメージ カラー ビーズ
    1. 緑、赤、赤外チャンネル開始時、各撮像セッションの終わりでイメージ マルチカラー ビーズ。
      注: ここでは、画像は、100 × NA 1.4 計画アポクロマート目的、電動ステージ、200 w メタルハライド光源および 16 ビット sCMOS カメラ搭載 (反転) 従来の広視野エピ蛍光顕微鏡で買収されました。励起フィルター (帯域通過)、ダイクロイック ミラー (長いパス) および緑のチャネル フィルター キューブの排出フィルター (帯域通過) の波長が 465-495、505 と 515-555 nm;赤のチャネル フィルター キューブのあれらは 565 と 578-633 nm; 528-553遠チャネル フィルター キューブのためのそれら、590 650、660 と 663 738 nm です。取得、x、ボクセルの大きさの中に y と z 軸はそれぞれ 64、64、200 nm です。
    2. 良いビーズの密度を持つビューのフィールドを検索します。
    3. 緑、赤、赤外チャンネル (チャンネルGチャネルRチャンネルB、それぞれ) の 3 D 画像のスタックを取得します。上と下の最高の焦点面 (スタックごと 7 セクション) の 3 つのセクションを取る。3 つのスタックは、3 つの TIFF ファイルとして保存します。
      注: 各チャンネルの露出時間は経験的にダイナミック レンジを最大化するため、ピクセルの彩度を避けるため、退色を最小限に決まります。フィルターと x、y および z、ボクセル サイズなどの他のパラメーターは、前述のように選択されます。
  2. 画像のゴルジ ミニ ・ スタック
    1. 使用 TPST1 EGFP とゴールト mCherry トランスフェクションし、その特急 TPST1 EGFP とゴールト mCherry の低または中程度のレベルのセルを検索する (セクション 1.5) スライドを蛍光標識します。3.1.3 の手順で説明したように 3 D 画像のスタックを取得します。

4. 画像解析

  1. 蛍光ビーズの中心を取得します。
    1. ImageJ の 3 つの TIFF ファイルから成るビーズ画像のセットを開く (ファイル > 画像 > を開く)。
    2. 焦点を当てたチャンネルR画像によるセクションの周り 3 つの連続したセクションの平均 > スタック > Z プロジェクト。「開始スライス」と「ストップ スライス」のセクション番号を入力し、「投影型」のオプションの「平均強度」を選択します。
    3. 「多角形選択」を使用してイメージ ビーズが含まれていない (ROIs) の関心の領域を描画します。"分析 > 測定"、「平均グレー値」と「標準偏差」だけをチェック。実行して「分析 > メジャー「平均と SD の投資収益率を取得しますします。
    4. . 「意味 + 6 × SD」バック グラウンド強度を計算します。によって対応するバック グラウンド強度値を持つイメージを引く"プロセス > 数学 > 減算"、このチャネルに対応する背景の輝度値を入力します。
    5. スライスと同じ背景の投資収益率を停止、同じスタートを使用してチャネルGBチャンネル画像のスタックの 4.1.2 に 4.1.4 手順を繰り返します。投資収益率は、4.1.3 手順メモ チャネルGBチャンネルの画像.にコピーできます。
    6. バック グラウンド減算の 3 つの画像をマージ (画像 > 色 > チャンネルを統合) 赤チャネルRを選択して、緑Gをチャネルし、チャネルB青として。3 つのチャネルから成る単一コンポジット画像が得られます。
    7. ROI マネージャーを起動 (分析 > ツール > ROI マネージャー)。各 ROI 内で 1 つだけのビーズは、単一のビーズの周りの正方形 ROI を描画します。キーボードの"t"を押すことによって、投資収益率を ROI マネージャーに追加します。このプロセスを繰り返し、できるだけ多くの Roi を追加します。
    8. "分析 > 測定」、「センターのミサ」だけをチェック。
    9. チャンネルR、ROI マネージャーでを選択し、センターを取得する「測定」をクリックしてください2 つの列が対応する x と y ・ ロワの中心の座標を「結果」ウィンドウに表示されます。コピーして 2 つの列をスプレッドシートに貼り付けます。
    10. チャンネルGBのステップ 4.1.9 を繰り返します。
    11. 次の順序で単一のスプレッドシートの中心の座標を手配:RGxRy、x のBGy、yBx。"Beads.csv"として、「.csv」形式でスプレッドシートを保存します。ファイル名にスペースを残さない。
  2. 選択し、ゴルジ ミニ スタックを測定
    1. ImageJ、「マクロ ゴルジ投資収益率検査」と「マクロ出力 3 チャンネル データ」プラグインによって (補足資料の添付) 2 つのマクロをインストール > インストール"。明確な ROI マネージャーと結果表示ウィンドウ。
    2. 3 つの TIFF ファイルから成るゴルジ ミニ スタック画像のセットを開く (ファイル > 画像 > オープン)。
    3. 4.1.5 4.1.2 - の手順を繰り返し、後で使用できる 3 つのバック グラウンド減算画像を保存します。レコード チャンネルRGチャンネルと SDR, SDG SD のBとチャンネルBの背景 SDs, 後で使用します。
    4. 4.2.3 (Ctrl + Shift + D) のステップから生成された 3 つのバック グラウンド減算のイメージを複製します。
    5. "プロセス > イメージ電卓」、最初にGRチャンネルの画像にチャネル背景減算を追加。結果の画像をバック グラウンド減算チャンネルBイメージに追加します。出来上がりの画像ので「イメージ > 調整 > しきい値"、「最低しきい値レベル」として「1」を入力する「設定」を選択。「適用」を押すと、黒と白のバイナリ イメージの結果です。
    6. "分析 > 粒子の分析"のサイズの範囲を入力"サイズ (ピクセル ^2)」。「50-無限」を入力します。「エッジの除外」のチェックおよび「マネージャーに追加」.ゴルジ ミニ スタックを含む Roi ROI マネージャーに追加されます。
      注: サイズの範囲が経験的には一般的に小さな音を除外する決まる必要があります。
    7. バック グラウンド減算の 3 つの画像をマージ (画像 > 色 > チャンネルを統合) ステップ 4.2.3 赤チャネルRを選択することによって、緑Gをチャネルし、チャネルB青として。3 つのチャネルから成る単一コンポジット画像が生成されます。
    8. 選択して「マクロ ゴルジ投資収益率検査」マクロを実行"プラグイン > マクロ ゴルジ投資収益率検査」.対話型ダイアログ ボックスの維持か、拒否する各 ROI を目視で確認します。3 つのすべてのチャネルで単一のオブジェクトが含まれている Roi を選択します。
      注: このツールを実行した後、拒否・ ロワは、ROI マネージャーから削除されます。
    9. 「エリア」「平均グレー値」、「重心」をチェックイン」分析 > 測定」。マクロ ツール「マクロ出力 3 チャンネル データ」を起動することによりデータを取得 (プラグイン > マクロ出力 3 チャンネル データ)。
      注: 領域の平均強度とセンター (x と y) ・ ロワのチャネルRGチャンネルとチャンネルBの「結果」ウィンドウに表示されます。
    10. コピー x と y の座標センターをスプレッドシートに、次の順序でそれらを整理:RGxRy、x のBGy、yBx。「.Csv」ファイル (ministacks.csv) としてスプレッドシートを保存します。ファイル名にスペースを残さない。センター (セクション 4.3) の波長シフト補正と LQ 計算 (セクション 4.4) に進みます。
  3. センターの色収差シフト補正
    1. Matlab のコンパイラのランタイム (MCR) をインストールします。
    2. 専用の作業フォルダーに次のファイルをインストール: my_train.exe と my_test.exe。"Beads.csv"のコピペと同じフォルダーに「ministacks.csv」ファイル。
    3. Windows の「コマンド プロンプト」を起動し次コマンドを入力すると、作業フォルダーに移動" cd path_of_working_folder」
    4. ビーズの中心を用いた波長シフト校正ファイルを生成します。「My_train.exe ビーズ.csv校正.mat 1」の次のコマンドを入力します。「校正.mat"をという名前のファイル作業フォルダーに作成されます。生成されるその他のファイルを無視します。
    5. ゴルジ ミニ スタックの中心の波長シフトを修正するには、「my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv校正.mat 1」の次のコマンドを入力します。
      注:「corrected_ministacks.csv」という名前のファイルが作業フォルダーに作成されます。GB yBx yG、x の順に並べ、センターの波長シフト補正座標が含まれています。作成される他のファイルを無視します。赤のチャネルとして定義されている注意の色収差したがって x の無料Rと yRが生データと同じ。
  4. LQs の計算
    1. 起動とデータ解析ソフトウェア コピペ、以下のシーケンス、平均グレー値、エリア、背景の 4.2.3 のステップから得られる SDs (1 行の配置) と波長シフト補正 x と y ゴルジ ミニ-スタックにチャネルRの座標、列 A から E とワークシート同様に、それぞれ J、O、K、列 F チャンネルGBの対応するデータを転送します。
    2. W、「チャンネル R の統合された強度」、「チャンネル G の統合された強度」、"チャンネル B の強度」、d1、dx、ABS(tan a)、ABS (日焼け b) と LQ に P 8 つの新しい列を追加します。
      1. それぞれの列の一番上を右クリックし、各列の値を計算する「列値の設定」を選択します。列 P、入力"Col(A)Col(B)";列の Q、入力"Col(F)Col(G)";列の R、入力"Col(K)Col(L)";S の列に対して入力"pixel_size*Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O))""pixel_size"が nm; ピクセルのサイズT の列に対して入力"pixel_size*((Distance(Col(I)、Col(J)、Col(N)、Col(O))^2+Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O))^2-Distance(Col(D)、Col(E)、Col(I)、Col(J))^2)/(2Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O)))」。U の列に対して入力"Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I)、Col(J)、Col(N)、Col(O))^2+Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O))^2-Distance(Col(D)、Col(E)、Col(I)、Col(J))^2)/(2 Distance(Col(I)、Col(J)、Col(N)、Col(O))Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O)))";列 V、入力"Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D)、Col(E)、Col(I)、Col(J))^2+Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O))^2-Distance(Col(I)、Col(J)、Col(N)、Col(O))^2)/(2 Distance(Col(D)、Col(E)、Col(I)、Col(J))Distance(Col(D)、Col(E)、Col(N)、Col(O)))";W の列に対して入力"コル (T)/Col (S)」。
    3. ゴルジ ミニ スタックを導入で説明されている 3 つの条件でフィルターします。
      1. データ分析ソフトウェアに行く"ワークシート > ワークシート クエリ""If"テストの列変数を選択して。次の別名 I1、I2、I3 を割り当てる d1、A と B の列「チャンネル R の統合の強さ」、「G チャンネルの統合された強度」、「チャンネル B の統合された強度」、d1、ABS(tan a) と ABS (日焼け b)、それぞれ。"場合条件"] ボックスに、入力"I1 > =30*cell(1,3) と I2 > =30*cell(1,8) と I3 > =30*cell(1,13) と d1 > = 70 と (A < = 0.3 または B < = 0.3)」。
      2. 「新しいワークシートに抽出」、「適用」をクリックします。解析可能なゴルジ ミニ スタックの列 A W は、新しいワークシートに抽出されます。
    4. 新しいワークシートで W、選択列の最上部を右クリックして「列に関する統計情報 > [開く] ダイアログ".チェック「N 合計」、「平均」、"平均の SE"、「ヒストグラム」。LQs の統計的分析が表示されます。

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Representative Results

私たちの研究室で使用されるなど、計画のアポクロマート レンズを搭載した現代の研究グレード光顕微鏡は、最小限の色収差 (図 2A) を示しています。ただし、マルチカラー蛍光ビーズ画像の精査は、同じビーズ (図 2B) の異なるカラー画像のシフトを明らかにできます。我々 は、赤のチャネルが色収差の無料したがって赤い蛍光性の中心は、ビーズの本当の位置を定義します。緑と遠赤色蛍光の相対的な波長シフトは、赤い蛍光性 (図 2C) の中心から発信された緑および青のベクトルで表現できます。画像平面内で波長シフト経験的各ビーズ (図 2D) に緑および青のベクトルによって示されています。我々 の顕微鏡の波長シフトは、大きさと x によるとシフト変更の方向は統一でされていないおよび y 位置。波長シフトがかすかな光の精度に影響する大幅遠中心のシフトはできる限り 50 nm。したがって波長シフトを修正する必要があります。ビーズのセンターが取得されると、我々 は一次多項式フィッティングを調整し、その後センターの波長シフトを修正を採用しています。このアプローチ (図 2 D G) して波長シフト収差を大幅に向上します。

哺乳類細胞におけるゴルジ複合体が通常従来の光学顕微鏡 (図 3A) で解決できない核領域に集計されます。3 時間ノコダゾール治療後ゴルジ複合体の核が消え、ゴルジ ミニ スタックの数十を細胞質 (図 3B) 小胞体出口各地で組み立てます。ゴルジ膜と集約されたゴルジ ミニ スタックの大きな塊が存在し、彼らが分析のために選択されていません。図 3Cにゴルジ ミニ スタックの選択を示す例を示します。図 3Dミニ スタックのとおり 40 選択したゴルジ「マクロ ゴルジ投資収益率検査」ツールを使用してください。3 つの条件を適用すると、21 ゴルジ ミニ スタックが分析できると計算 TPST1 EGFP の LQs の選ばれた (図 3D;"L"としてラベル付け)、図 3Eに示すように、統計情報付き。12 セルから選ばれた合計 111 解析可能なゴルジ ミニ スタックと TPST1 EGFP LQ 0.76 0.04 と測定 (平均 ± SEM; n = 111) (図 3F)。TPST1 EGFP LQ giantin 間配置 (LQ = 0.59) と EGFP Rab6 (LQ = 1.04)7。それは GS15 近く (LQ = 0.83) と ST6GalT1 AcGFP1 (LQ = 0.82)。文学から質的なローカライズ データを考慮した LQs によるとサブ ゴルジ領域を定義した: ERES/ERGIC <-0.25;cis、0.00 ± 0.25;内側、0.50 ± 0.25;トランス-ゴルジ、1.00 ± 0.25、TGN、1.25 2.00。したがってを示すそのトランスに TPST1 EGFP LQ-ゴルジ装置の局在は、前研究14と一致しています。

Figure 1
図 1.かすかな光の計算で使用される変数を示す図。商品番号:gm130、ゴールト mCherry および蛋白質のコーアクシャル センター ゴルジ ミニ スタックの (A) xz ビュー軸、軸角度、x d1ゴルジを示す蛍光 x。ゴルジのミニ スタックのイメージは、画像平面に射影です。(B) xy 表示ゴルジ ミニ スタックの x 軸角度 α、β と投影を示す蛋白質の軸を中心にxの距離。ABはそれぞれ図 1Eと前文書7図 1Fから適応です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2.波長シフトの補正します。(A) 広視野顕微鏡で取得した 110 nm マルチカラー ビーズの 3色マージされた画像。それぞれのビーズを発する緑、赤、および遠 (人工的に着色ブルーとして) 蛍光。スケール バー、10 μ m (B) 拡大表示の顕著な波長シフトと合併シングル ビーズ イメージ。スケール バー、200 nm。(C) A 図、緑と遠ビーズ画像のシフトに表されます。 ベクトルの赤のビーズ画像 (0, 0) の中心から緑 (緑ベクトル) と遠 (青いベクトル) ビーズ画像のセンターにそれぞれ示します。(D, E)波長シフト補正の効果。イメージの同じフィールド内にある緑と青のベクトルはの前にプロットし、後シフト補正。小さな変化を視覚化するには、それぞれのベクトルの大きさは 200-fold で増幅されます。(F, G)散布図のシフト補正の前後に緑 (緑の点) と遠 (青い点) ビーズの中心を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3.TPST1 EGFP の LQ を取得ここで、かすかな光の典型的な例です。TPST1 EGFP (緑) と GalT-mCherry (レッド) を表現する HeLa 細胞染色による内因性商品番号:gm130 (青)。(A) は典型的なセル。(B、C、D、E)ノコダゾールと扱われる細胞をイメージしました (B)。イメージからCに示すように分析可能なゴルジ ミニ スタックが選ばれました。選択したゴルジ ミニ スタックの識別番号でラベルです。これらの仮面ゴルジのミニ スタックのイメージは、その識別番号を持つD下に表示されます。"L"は、ゴルジのミニ スタックが LQ (解析可能なゴルジ ミニ スタック) の計算に有効であるを示します。Eのセルから 21 ミニ スタックの LQs のヒストグラムが表示されます。(F) LQs ヒストグラム 12 セルから 111 ミニ スタックの。ヒストグラムに表示される値は平均 ± SEM.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

補足資料:マクロ ゴルジ投資収益率 inspection.ijm、マクロ出力 3 チャンネル data.ijm、Matlab コード、My_train.exe、My_test.exe、およびスプレッドシートの template.opj。

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Discussion

以前は、光学顕微鏡のゴルジ体蛋白質のローカリゼーション主の相関または蛋白質の画像とローカリゼーションの既知15,16、ゴルジ体マーカーの画像の重なりの度合いによって定量化を行った 17。結果の相関関係または重複度係数は、どれだけ近いテスト タンパク質はゴルジ体のマーカーに空間的反映されます。このアプローチのために少なくとも 3 つの注意事項があります。まず、相関関係や重複度係数は非線形とは直接の空間的距離を示しません。第二に、相関度は顕微鏡の解像度に大きく依存します。したがって、2 つのゴルジ体のタンパク質間の係数は、システムに依存しない定数ではありません。第三に、同じ軸ローカリゼーション cisternae 分布の異なる側面が 2 つのゴルジ体タンパク質が異なる係数を持つことができます。したがって、相関関係や重複度係数軸ゴルジ タンパク質局在は示されません。Dejgaardによって提案された方法で。、 cistrans-ゴルジ マーカーおよび興味の蛋白質はのトリプル ラベル ノコダゾール扱わゴルジ ミニ スタック、かすかな光のよう。各ゴルジ ミニ スタック内の 3 つの最大輝度のピクセル位置を取得し、テスト蛋白質の相対的な位置の距離比18として計算されます。ただし、そのメソッドは大きくそのアプリケーションを制限するサブ ピクセルの解像度を達成することではありません。以前の定量法、かすかな光が独自に開発、Dejgaardと似た概念をクマと比較します。、は前例のない正確さと一貫性とゴルジ体タンパク質の軸のローカリゼーションを定量化することができます。

外に表現された GFP 付けられた蛋白質 - TPST1 EGFP の LQ を取得するかすかな光のプロトコルを提案します。その抗体が利用可能な場合、内因性のタンパク質の LQ を決定ことができます。一次抗体、マウスやウサギ、ウサギまたはマウス抗商品番号:gm130 抗体の種に応じて、それぞれで使えるトリプル分類のプロトコル。蛍光ラベリングのウサギとマウスの両方の対策商品番号:gm130 抗体が市販されています。我々 は以前、ウサギとマウス抗商品番号:gm130 抗体がかすかな光7では同じ結果を与えることを実証しました。場合テスト蛋白質は mCherry 融合、GFP タグのゴルジ商品番号:gm130 抗体の分類との組み合わせで知られている LQ がマーカー蛋白質がトリプル ラベルのセルを使用してテスト蛋白質の LQ を直接推論などの蛍光性の放出で本質的に赤です。マーカー蛋白質の LQ が LQm商品番号:gm130 のマーカー蛋白質の中心からの距離は dm、LQ テスト蛋白質の x (x/dm) × LQmとして計算できます。超解像顕微鏡法と比較してかすかな光の最大の利点の 1 つは、それは簡単に、従来の顕微鏡のセットアップでライブセル イメージングに適用することができますです。我々 は、LQ の GFP-Golgin84 単一ゴルジ ミニ スタック7を動的に監視するため、GFP Golgin84、mCherry 商品番号:gm130、GalT-iRFP670、3 つの蛍光タンパク質の組み合わせを試みた。

かすかな光、最も時間がかかるステップは買収後の分析は、分析可能なゴルジ ミニ スタックの選択に特にです。LQs (図 3 f) の分布はゴルジ ミニ スタックの異種のアーキテクチャまたはの私達の計算の不確かさを表す場合は明らかだゴルジ ミニ スタックのサイズの分子組成19異種とおり、LQ。原因を問わず n が小さい場合に侵害分析可能なゴルジ ミニ ・ スタック (n)、LQ の精度を確保するための多数を持っていることが重要だとわかりました。通常、n ≥ 100 複数のセルからのデータは、信頼性の高い LQs を生みます。したがって、かすかな光は、ゴルジ ミニ スタックの個性を隠すことのアンサンブル平均ローカリゼーション データを与えます。かすかな光のもう一つの制限は、すべてのゴルジ体タンパク質単一の中心のまわりの狭い分布をある前提があります。トランス-シスから広く配布するコピ サブユニット、ARF1 可溶性 N エチルマレイミド感受性因子添付ファイル蛋白質受容体 (スネア)20,21, などのいくつかのゴルジ体タンパク質が報告されています。ゴルジと、TGN。それは LQ で、ゴルジのローカリゼーションを調査するおそらく適していません。かすかな光は、現在は骨の折れる、主観的、ゴルジ ミニ スタックの手動の選択を含むようかすかな光の将来の発展は人間の干渉を抑えたゴルジ ミニ スタックを自動的に選択するソフトウェア ツールを実装すること。

かすかな光の空間分解能とは何ですか。LQ は比、単位であるので、空間距離は示しません。ここでは、非常に大まかな見積もりを与えることを試みた。かすかな光の空間分解能は 2 つの解決可能なゴルジ体タンパク質間最小軸距離として定義できます。N ≥ 100 範囲 0.03 周りでデータセットの SEMs 様々 なゴルジ体タンパク質7の LQs を調べると、分かった。2 ゴルジ体のタンパク質は、同じ n を持っていると仮定すると = 100 と SEM = 0.03、蛋白質によってかなり異なる局在がある 2 つのゴルジt 検定(p < 0.05)、すなわち、解決、LQs の違いが ≥ 3 × SEM = 0.09。商品番号:gm130 からかすかな光でゴルト mCherry までの距離はまた、ゴルジ ミニ スタックの軸の長さである EM データから推定できる ~ 300 nm8。それ故に、かすかな光の解像度は、0.09 × 300 = 30 と推定されるゴルジ体軸に沿って nm。かすかな光、n が大きいほど一般的に小さい SEM の場合より高い解像度で、結果が生成されます。

おそらく後者の手法が定量的なローカリゼーション データを直接生成されませんので直接免疫金 EM のかすかな光の解像度を比較すると不適切なもの。かすかな光と同様に、ゴルジ体軸に沿って免疫金 EM の解像度は、2 つの解決可能なゴルジ マーカー間の最小の距離として定義できます。その解像度を測定するためのデュアル免疫金標識ゴルジ体軸に沿って互いに密接に隣接している 2 つのゴルジ体のタンパク質の研究が必要です。このような全身性の研究は我々 の知識によるとおそらく利用できません。導入部分で説明したように免疫金 EM の空間分解能の制限要因の一つはより悪化する解像度になる抗体の複雑な大きいサイズ ~ 20 nm。画像解像度の別の重要な制限要因は抗原分子のラベリングの密度です。ナイキスト サンプリング理論によると解像度の単位あたりの少なくとも 2 つの金粒子があります。ほとんどの免疫金 EM 研究隣人金粒子間距離、非常に低いためありません < 15 nm の効率をラベリングします。これは難しく 30 未満の画像の解像度を達成するためにこの手法の nm。このような観点から、かすかな光の解像度は、少なくとも免疫金 EM に匹敵する推定します。

かすかな光は、非常に一貫した結果を与える堅牢な方法です。顕微鏡使用の種類に依存しないです。私たちは、同じ結果が得られた、広視野と回転のディスク共焦点顕微鏡をテストしています。実験の別のバッチを取得同じゴルジ体蛋白質の LQs もお互いによく一致しました。比較とその解釈の多様な範囲のゴルジ常駐タンパク質から成る LQ データベースが生成されました。かすかな光の研究コミュニティのより多くの使用がデータベースを大幅拡大することを見込んでいます。その結果、多数のゴルジ体蛋白質のローカリゼーションを定量的記述するより完全なデータベースは、組織とゴルジ複合体の機能の理解に大きく役立ちます。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

我々 はソフトウェアの最適化を助けるため TPST1 EGFP DNA のプラスミッドとしてラクシュミ Narasimhan Govindarajan D. ステファン (ブリストルの大学, ブリストル, イギリス) を感謝したいです。この作業は、l. l. に国立の医療研究評議会 (ナノ材研/CBRG/007/2012 年)、文部省 (AcRF Tier1 RG 18/11、RG 48/13 と RG132/15 AcRF Tier2 MOE2015-T2-2-073) からの助成金によって支えられました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

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References

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