Localisation quantitative d’une protéine de Golgi Imaging sa masse Centre de Fluorescence

Biology

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Summary

La localisation précise des résidents de l’appareil de Golgi est essentielle pour comprendre les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi. Toutefois, la microscopie optique conventionnelle est incapable de résoudre la structure sub-Golgi. Nous décrivons ici le protocole pour une méthode de Super-résolution microscopie conventionnelle basée déterminer quantitativement la localisation sup-Golgi d’une protéine.

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Tie, H. C., Chen, B., Sun, X., Cheng, L., Lu, L. Quantitative Localization of a Golgi Protein by Imaging Its Center of Fluorescence Mass. J. Vis. Exp. (126), e55996, doi:10.3791/55996 (2017).

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Abstract

L’appareil de Golgi est constitué de saccules membranaires empilées en série qui peuvent être également classés en régions sub-Golgi, y compris le cis-Golgi, medial-Golgi, trans-Golgi et trans-réseau de l’appareil de Golgi. Les fonctions cellulaires de l’appareil de Golgi sont déterminées par la répartition de ses protéines résidentes. La résolution spatiale de microscopie optique conventionnelle est trop faible pour résoudre la structure sub-Golgi ou saccules. Ainsi, la microscopie immuno-or est une méthode de choix pour localiser une protéine au niveau sub-Golgi. Cependant, la technique et l’instrument sont au-delà de la capacité de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Nous décrivons ici notre méthode développée récemment Super-résolution appelée localisation des protéines Golgi par imagerie centres de masse (GLIM) systématiquement et quantitativement localiser une protéine de Golgi. GLIM est basé sur les protocoles d’étiquetage de fluorescence standard et grand champ conventionnel ou microscopes confocaux. Il s’agit de l’étalonnage de l’aberration chromatique-Maj du système microscopique, l’acquisition de l’image et l’analyse postérieure à l’acquisition. La localisation de sub-Golgi d’une protéine test est exprimée quantitativement comme le quotient de localisation. Il existe quatre principaux avantages de GLIM ; C’est rapide, basé sur les outils et les méthodes conventionnelles, le résultat de la localisation est quantitatif, et qu’elle leur offre ~ résolution pratique de 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Nous décrivons ici le protocole détaillé de GLIM pour localiser un test de la protéine de l’appareil de Golgi.

Introduction

Le complexe de Golgi joue un rôle essentiel dans sécrétoire/endocytose traite des protéines et des lipides (ci-après les cargaisons) dans les cellules de mammifères,1,2,3. À l’appareil de Golgi, cargaisons sont non seulement triées dans divers compartiments subcellulaires mais aussi modifiés par divers types de glycosylation. Le complexe de Golgi mammifères se compose de nombreuses cheminées de Golgi latéralement connectées, qui se compose généralement de 4-11 sacs de membrane étroitement adjacentes et plat appelés saccules. Les saccules de Golgi empilées en série sont classés plus loin, d’un bout à l’autre, tout comme médiale, ciset trans-cisternes. À la trans-côté d’une pile de Golgi, le trans-plupart sac de membrane se développe en un réseau de membrane tubulaire et le réticulum, appelé le trans-Golgi network (TGN)4. Dans la voie de sécrétion, cargaisons provenant de réticulum endoplasmique (re) entrer dans une cheminée de Golgi à la cis-côté et puis séquentiellement traversent médiale et trans-cisternes. Cargaisons finit par sortir l’appareil de Golgi à la trans-Golgi ou TGN destinant à la membrane plasmique, les endosomes ou les granules de sécrétion.

Les mécanismes moléculaires et cellulaires du comment des cargaisons de transit une pile de l’appareil de Golgi et comment l’appareil de Golgi maintient son organisation saccules restent mystérieux et sont actuellement encore un débat houleux1. Une des difficultés dans ce domaine est que les saccules de Golgi ne peuvent être résolus en vertu de la microscopie électronique (EM) depuis la résolution du microscope optique (~ 200 nm) est insuffisante pour résoudre différents saccules de Golgi (< 100 nm dans les deux épaisseur de saccules et la distance). Donc, la localisation de sub-Golgi des protéines résidentes et transit des cargaisons sont classiquement déterminés par l’EM immuno-or. Toutefois, l’EM immuno-or est très pointues et il est au-delà des capacités de la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. Bien que la résolution de l’EM peut être Sub nanomètre, la résolution offerte par le EM immuno-or est considérablement entravée par la taille de l’anticorps complexe (principales et l’anticorps secondaire) et les particules d’or, et il peut être pire que 20 nm. En outre, des images de EM sont obtenus à partir 2D minces au lieu d’une 3D vision globale de l’appareil de Golgi, ce qui peut aboutir à des conclusions erronées selon la position relative et l’orientation de la section 2D5. Par exemple, étudier une EM single-section ne peut pas fiable différencier une vésicule de la vue orthogonale d’un tubule puisque les deux peuvent afficher des profils identiques membrane rond. L’avènement récent des techniques de microscopie de Super-résolution, telles que la microscopie éclairage structuré 3D (3D-SIM), stimulée par épuisement des émissions (STED), microscopie de localisation de photoactivation (PALM) et (microscopie) reconstruction optique stochastique STORM), permet de résoudre les structures sub-Golgi sous lumière microscopes6. Cependant, il y a au moins quatre inconvénients qui peuvent considérablement limiter leurs utilisations dans l’étude biologique de la cellule de l’appareil de Golgi. 1) les techniques actuelles de Super-résolution nécessitent une configuration matériel coûteux et spécial qui dépasse la plupart des laboratoires de biologie cellulaire. 2) protocoles d’étiquetage de fluorescence spéciaux sont nécessaires pour certaines techniques de Super-résolution. 3) bien que, dans les meilleures conditions, ces techniques de réclamer 20-110 nm à résolution spatiale, la résolution pratique obtenue dans des échantillons réels peut être bien pire. 4) par rapport à la microscopie conventionnelle, ces techniques de Super-résolution encore ont des difficultés dans la conduite de multicolores, 3D ou vivent d’imagerie cellulaire, seules ou en combinaison. Probablement plus important encore, fois EM immuno-or et les techniques de microscopie de Super-résolution rendement qualitatif plutôt que des données quantitatives de localisation.

Tenter de résoudre partiellement les problèmes mentionnés ci-dessus, nous avons récemment développé une méthode de microscopie conventionnelle basée, qui se nomme la localisation des protéines Golgi Imaging centres de masse (GLIM), systématiquement et quantitativement localiser un appareil de Golgi protéine à une résolution équivalente à celle de l’immuno-or EM7. Dans cette méthode, l’appareil de Golgi dans des cellules de mammifères est dispersée comme mini-piles de l’appareil de Golgi par le traitement de la nocodazole, un médicament dépolymérisation des microtubules. Des études approfondies ont démontré qu’induite par la nocodazole Golgi mini-piles (ci-après Golgi mini-cheminées) sont très proches de natives stacks de Golgi dans les organisations et les fonctions cellulaires8,9,10, 11. Le quotient de la localisation (LQ) d’une protéine de test peut être acquises par le biais de GLIM et il dénote la localisation sup-Golgi quantitative. Les valeurs numériques de LQs peuvent être comparés et une base de données LQ de plus de 25 marqueurs de Golgi est disponible.

GLIM, mini-piles de l’appareil de Golgi sont marqués au triple GM130 endogène ou exogène exprimée, GalT-mCherry et la protéine test (x). GM130 et GalT-mCherry, cis- et trans-Golgi marqueurs respectivement12,13, constituent des points de référence. La fluorescence triple, rouge (R), vert (G) et (B) rouge sombre, artificiellement apparaissent en rouge, vert et bleu, respectivement. Centre de masse de fluorescence (ci-après le centre) est adoptée pour régler les sous-pixels. L’axe de l’appareil de Golgi est défini comme le vecteur de la centre de GM130 à celui de GalT-mCherry. La mini-pile Golgi est modélisée comme une structure cylindrique avec une symétrie rotationnelle infinie autour de l’axe de l’appareil de Golgi. Par conséquent, une mini-pile de Golgi peut être modélisée de davantage comme une structure unidimensionnelle selon l’axe de l’appareil de Golgi. Le LQ de la protéine test dx/d1, dans lequel dx est la distance entre le centre de x à celle de GM130, tandis que d1 correspond à la distance depuis le centre de GalT-mCherry à celle de GM130 correspond à x. Si le centre de x est hors-axe, sa distance axiale de projection est utilisé pour le calcul. Schématiquement, les variables, y compris de Golgi axe, angle axial, dx, d1, angle α et β de l’angle, pour GLIM sont illustrées à la Figure 1. LQ est indépendante de l’angle axial de Golgi mais mini-piles de l’appareil de Golgi orientent aléatoirement dans une cellule.

Mini-piles de l’appareil de Golgi apparaissent non homogènes dans les images. Nous avons développé trois critères pour sélectionner analysables Golgi mini-piles pour GLIM. 1) le critère de rapport signal-sur-bruit, dans lequel le rapport de l’intensité totale d’une pile mini de Golgi à la déviation standard (SD) de l’arrière-plan est ≥ 30 dans chaque canal. Ce critère est d’assurer la précision de positionnement du centre de masse, qui repose sur les rapports signal-bruit de mini-piles de l’appareil de Golgi. 2) le critère angle ou la distance axial, qui exige d1≥ 70 nm. d1 diminue avec l’augmentation de l’angle axial de l’appareil de Golgi. Quand l’angle axial est proche de 90° ou verticale, la minipile devient non-être résolu comme d1 est proche de 0. d1≥ 70 nm peut effectivement exclure près verticale mini piles d’appareil de Golgi. 3) le critère de colinéarité, dans laquelle soit | tan α | ou | tan β | est ≤ 0,3. Ce critère s’assure que les trois centres d’une mini pile sont suffisamment colinéaire pour notre modèle unidimensionnel de la pile mini de l’appareil de Golgi. Tous les microscopes de lumière souffrent de l’aberration chromatique qui peut gravement altérer la position relative des centres de fluorescence rouge, vert et rouge sombre. L’aberration chromatique de systèmes de microscope est calibrée expérimentalement par imagerie 110 perles nm, qui sont marqués par fluorescence rouge, vert et rouge sombre au triple. Pour chaque image de la perle, le Centre rouge est défini comme la véritable position du talon et chromatique-déplacements des centres de verts et de rouge sombre sont équipés de fonctions polynômes de premier ordre. Centres de Golgi mini-cheminées subissent les fonctions polynomiales pour corriger les décalages-chromatique dans les canaux vert et rouge sombre.

Par le biais de GLIM, nous pouvons atteindre une résolution de ~ 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi dans des conditions normales. Ce qui est important, il fournit une méthode systématique pour cartographier quantitativement toute protéine de Golgi. GLIM peut être effectuée par des microscopes classiques, tels que grand champ ou microscopes confocaux, utilisant des protocoles communs étiquetage fluorescence. L’imagerie et traitement des données peuvent prendre aussi courts qu’une heure. Par le biais de GLIM, nous avons démontré directement la transition progressive de la cargaison sécrétrice de la cis- TRANS-latérale de l' appareil de Golgi7.

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Protocol

Remarque : Voici un protocole étape par étape de GLIM pour déterminer la sulfotransférase LQ de EGFP-le tag tyrosylprotéine 1 (TPST1), une enzyme résidente de Golgi, dans les cellules HeLa.

1. préparation des Mini-piles de Golgi marqués par Fluorescence

  1. Préparer des lamelles de verre
    1. Aliquote 0,3 mL stérile Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) à un puits d’une plaque 24 puits dans une hotte de culture de tissus.
    2. Effacer un morceau de Φ 12 mm No.1.5 verre couvre-objet à l’aide de papier de soie doux tamponné avec l’éthanol à 70 % pour enlever les débris à la surface de la lamelle de verre. Utilisez une paire de pinces à épiler pointu pour brièvement tremper le couvre-objet dans l’éthanol à 70 %, transférez-le dans la plaque 24 puits et couler au fond de la DMEM contenant bien stérile.
      NOTE : Lamelles de verre sont classiquement stérilisés par flambage. Cependant, lamelles couvre-objet en vertu de tel traitement fissure facilement au cours de la manipulation par la suite. 70 % éthanol trempage est efficace pour la stérilisation des lamelles de verre sans les abîmer.
    3. Avec le couvercle couvert, laisser la plaque 24 puits dans les 37 ° C CO2 incubateur jusqu'à utilisation.
  2. Cellules de semences
    1. La culture HeLa cellules (ci-après) dans une fiole de T-25 en DMEM supplémenté de 10 % fœtale Bovine sérique (FBS) (milieu ci-après complet) dans un incubateur à 37 ° C CO2 fourni avec 5 % de CO2. Les antibiotiques ne sont pas nécessaires ici.
    2. Quand les cellules atteignent ~ 80 % confluence, aspirer le milieu de culture. Ajouter 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA dans le ballon et incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO2 pour 2 min. Ajouter 1 mL de milieu complet dans le ballon et rincer doucement les cellules sur le mur de la fiole de pipetage.
    3. Transfert des cellules individuelles à un tube de centrifugation stérile et un essorage à 500 g pendant 2 min granuler les cellules. Aspirer le surnageant et le culot de suspendre dans 1 mL de milieu complet.
    4. Aspirez le milieu dans le puits de la plaque 24 puits contenant la lamelle de verre stérilisé et semences ~ 1 x 105 cellules dans le puits. Recharger le volume du puits avec un milieu complet de 0,5 mL. Incuber dans une étuve à 37 ° C CO2 livrée avec 5 % de CO2. La culture de cellules à ~ 80 % confluence.
  3. Transfecter de cellules
    Remarque : Les cellules bien étalées sont avantageux pour imagerie dispersée Golgi mini-piles.
    1. Transfecter ~ confluentes à 80 % avec 80 ng GalT-mCherry7 et 320 ng TPST1-EGFP plasmides d’ADN (voir Table des matières) à l’aide d’un réactif de transfection selon le protocole prévu par le fabricant. Incuber dans un incubateur à 37 ° C CO2 . Changer le support après 4-6 h d’incubation. Les cellules sont prêts ~ 12 h plus tard.
  4. Traitement de la nocodazole pour générer des mini-piles de l’appareil de Golgi
    1. Préparer une solution nocodazole (33 mM) en dissolvant la poudre nocodazole 10 mg dans 1 mL le sulfoxyde diméthylique. Partie aliquote de la solution mère et conserver à-20 ° C pour le stockage à long terme.
    2. Diluer 1 µL de solution mère de la nocodazole (33 mM) dans 1 mL de milieu complet de 37 ° C (concentration finale 33 µM). Centrifuger à vitesse de pointe pour enlever les particules fines.
    3. Aspirer le milieu dans le puits et ajouter 0,5 mL de 33 µM nocodazole contenant du milieu complet. Incuber les cellules dans un incubateur à 37 ° C CO2 pendant 3 h procéder à immunofluorescence labeling (section 1.5).
  5. Immunofluorescence labeling
    Remarque : Conservez les cellules dans le noir pour éviter le photoblanchiment de GalT-mCherry et TPST1-EGFP.
    1. Préparer des réactifs pour immunofluorescence labeling
      1. Pour préparer la solution à 4 % paraformaldéhyde, dissoudre la poudre de 4 % (p/v) paraformaldéhyde à chaud 1 X en solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et filtrer la solution sur un filtre de 0,45 µm. La solution peut être conservée à-20 ° C.
        ATTENTION : Paraformaldéhyde est toxique et cancérogène et peut causer des irritations de la peau. Porter l’équipement de protection individuelle (EPI) approprié.
      2. Pour préparer le tampon de dilution de fluorescence (FDB), mélanger 5 % (v/v) de SVF et 2 % (p/v) sérum d’albumine bovine (BSA) dans du PBS 1 x. Filtrer la solution sur un filtre de 0,45 µm et conserver la solution à-20 ° C.
      3. Dissoudre 5,35 g NH4Cl poudre dans 1 L d’eau pour préparer 100 mM NH4Cl et stocker la solution à température ambiante.
      4. Dissoudre la poudre de saponine de 10 % (p/v) dans l’eau jusqu'à 10 % de saponine, aliquote de préparer et stocker la solution à-20 ° C.
    2. Fixation
      1. Rincer une fois bien avec 0,5 mL 1 x solution de PBS et ajouter 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde à 4 %. Incuber pendant 20 min à température ambiante. Rincez le puits deux fois avec du PBS 1 x 0,5 mL et deux fois avec 0,5 mL 100 mM NH4CL. Rincer le puits deux fois avec du PBS 1 x 0,5 mL. Les cellules peuvent être conservés dans du PBS 1 x à 4 ° C durant la nuit dans l’obscurité.
    3. Marquage par fluorescence
      1. Diluer 1 µL souris anti-GM130 Anticorps primaire en saponine de 500 µL FDB contenant 0,1 %. Inverser le couvercle de la plaque 24 puits et appliquer 10 µL d’anticorps primaire mélange sur le couvercle.
      2. Utiliser une paire de pinces à épiler pointu pour extraire et transférer la lamelle de verre sur la baisse des anticorps mélange assurant que le côté de la cellule est en contact avec le mélange. Incuber les cellules avec le mélange de l’anticorps primaire pendant 1 h à température ambiante.
        Remarque : Le couvercle avec le couvre-objet peut être placé dans un sac plastique humidifié dans l’obscurité.
      3. Utilisez une paire de pinces à épiler pointu pour extraire et transférer la lamelle vers le puits avec le côté de la cellule vers le haut et le rincer dans du PBS 1 x 0,5 mL trois fois par ≥ 30 min. Shaking est inutile.
      4. Diluer 1 µL fluorophore rouge sombre conjugués chèvre anti-souris IgG (anticorps secondaire) en saponine de 500 µL FDB contenant 0,1 %.
      5. Lavez et nettoyez la surface arrière du couvercle de la plaque 24 puits. Appliquer 10 µL anticorps secondaire rouge sombre mélange sur le couvercle. Répétez les étapes 1.5.3.2 - 1.5.3.3.
    4. Montage
      1. Préparer le milieu de montage en mélangeant 1 g de glycérol, 2,2 g poly(vinyl alcohol) (MW ~ 31 000 Da), 1,2 mL 1 M Tris (pH 8) et 8,8 mL H2O. dissoudre le mélange dans un bain d’eau de 60 ° C avec parfois mélangé au vortex. Conserver la solution à-20 ° C.
      2. Décongeler le milieu de montage et transférer 10 µL sur une lame de verre. Superposition de la lamelle couvre-objet (côté cellule vers le bas) sur la goutte de milieu de montage. Incuber la lame de verre à 37 ° C pendant 30 min ou à température ambiante pendant 1 h durcir le milieu de montage. Sceller la lamelle avec vernis incolore et stocker la lame de verre à-20 ° C.

2. préparation des perles fluorescentes pour la Correction chromatique-Maj

  1. Lamelle couvre-objet de nettoyage
    1. Placer soigneusement un morceau de 25 mm No.1.5 lamelle de verre sur un support en plastique.
    2. Transfert le panier avec la lamelle dans un bécher de 400 mL remplie avec 300 mL de 1 NaOH M et soniquer dans un sonicateur de bain (35 Watts) pendant 15 minutes brièvement, rincez le panier dans un bécher de 400 mL rempli de 300 mL d’eau désionisée. Transférer la crémaillère dans un bécher de 400 mL rempli avec 300 mL d’éthanol à 99 % et laisser agir dans le sonicateur bain pendant 15 min. brièvement rincer la crémaillère dans un bécher de 400 mL rempli de 300 mL d’eau désionisée.
    3. Répétez l’étape 2.1.2 deux fois plus.
    4. Rincez le panier avec la lamelle dans 300 mL d’eau désionisée dans un bécher de 400 mL pour 10 min. répéter l’étape deux fois plus. Transférer la grille dans un four à 60 ° C et sécher la lamelle pour 1 h. magasin la lamelle séchée dans une boîte de Pétri et sans poussière.
  2. Immobilisation des perles fluorescentes sur la lamelle de verre
    1. Diluer 110 nm multicolore fluorescent perles 80-fold en 1 x PBS contenant 0,1 µg/µL BSA. Brièvement vortex le tube pour disperser les agrégats de la perle. Propagation de 60 perles µL dilué sur la lamelle de verre No.1.5 Φ nettoyé 25 mm (voir la section 2.1) à l’aide d’un embout de la pipette. Sécher la lamelle dans un dessicateur relié à une pompe à vide dans l’obscurité et monter la lamelle sur une lame de verre dans 50 µL de milieu de montage (voir étape 1.5.4.2).

3. image Acquisition

Remarque : GLIM nécessite des images de haut ratio signal-bruit (SNR) pour calcul de centre de masse de haute précision. L’image peut être acquis par des microscopes classiques tels que le laser à balayage confocal, tourne disque confocale ou grand-angulaire de microscope. Un microscope à champ large équipé de lentilles de l’objectif apochromatique-plan et d’un capteur d’image à faible bruit, comme un dispositif à couplage de charge (CCD) et les scientifique complémentaire métal-oxyde-semiconducteur (sCMOS) peut être utilisé. Paramètres pour le capteur d’image sont ajustées afin d’assurer une faible gamme dynamique lire-bruit et haute. Le microscope doit être équipé de la configuration optimale des filtres de fluorescence verte, mCherry et fluorophore rouge sombre, et il doit avoir interférence négligeable de fluorescence. Idéalement, le système d’imagerie permet d’obtenir une fréquence d’échantillonnage de Nyquist dans le x, axe y et z, ce qui nécessite généralement le x, y et z de taille d’un voxel pour être inférieur à 100, 100 et 200 nm, respectivement. X et y taille du voxel sont toujours égal et sont appelés pixel_size. Le pixel_size peut être calculée en divisant la taille du capteur caméra par le grossissement de système.

  1. Perles multicolores image
    1. Image multicolores perles dans les canaux rouges, verts et rouge sombre au début et à la fin de chaque séance d’imagerie.
      NOTE : Ici, les images ont été acquises au microscope conventionnel épifluorescente grand-angulaire (inversé) équipé 100 X NA 1.4 objectif plan-apochromatique, platine motorisée, source lumineuse de 200 watts métal halide et caméra 16 bits sCMOS. Les longueurs d’onde pour filtre d’excitation (passe-bande), miroir dichroïque (longue passe) et filtre d’émission (passe-bande) du cube canal vert filtre sont 465-495, 505 et 515-555 nm ; Voilà pour le cube du filtre rouge canal 528-553, 565 et 578-633 nm ; et voilà pour le cube du filtre rouge sombre canal 590-650, 660 et 663-738 nm. Lors de l’acquisition, la taille d’un voxel le long du x, y et z est 64, 64 et 200 nm, respectivement.
    2. Trouver un champ de vision avec une densité de bonne perle.
    3. Acquérir les piles de l’image 3D dans les canaux rouges, verts et rouge sombre (canalG, canalR, canalB, respectivement). Prendre 3 sections au-dessus et en dessous le meilleur plan focal (7 sections par pile). Enregistrez les trois piles sous trois fichiers TIFF.
      NOTE : Le temps d’exposition pour chaque canal est empiriquement déterminé pour maximiser la plage dynamique, d’éviter la saturation des pixels et de minimiser photoblanchiment. Autres paramètres, tels que les filtres et le x, y et z la taille de la voxel, sont choisis comme indiqué plus haut.
  2. Image de Golgi mini-piles
    1. Utilisation TPST1-EGFP et GalT-mCherry transfectées et fluorescent étiqueté diapositives (section 1.5) pour rechercher les cellules que TPST1-EGFP express et un niveau faible ou moyen de GalT-mCherry. Acquérir des piles d’image 3D comme indiqué au point 3.1.3.

4. image Analysis

  1. Acquérir des centres de perles fluorescentes
    1. Dans ImageJ, ouvrez un jeu d’images de perle consistant en trois fichiers TIFF (fichier > Image > Ouvrir).
    2. Moyenne 3 sections consécutives autour de la section la mieux ciblée en canalR par Image > cheminées > projet de Z. Entrer le numéro de section de « Tranche de début » et « Arrêt de tranche » et parmi les options de « type de projection », sélectionnez « Moyenne intensité ».
    3. Dessiner des zones d’intérêt (ROIs) qui ne contiennent aucun des perles dans l’image à l’aide de « Sélections polygone ». Dans « Analyze > mesures Set », cochez seulement « Valeur de gris moyen » et « Déviation Standard ». Puis exécutez « Analyze > mesure » pour obtenir la moyenne et l’écart-type de la ROI.
    4. Calculer l’intensité du fond comme « moyenne + 6 × SD ». Soustraire l’image avec les valeurs d’intensité de fond correspondant de « processus > mathématiques > soustraire », la valeur d’intensité de fond correspondant à ce canal d’entrée.
    5. Répétez les étapes 4.1.2 à 4.1.4 pour canalG et piles d’image canalB en utilisant le même début et arrêt de tranche et le fond même ROI. Remarquez que le retour sur investissement dans étape 4.1.3 peut être copiée sur canalG et les images de canalB .
    6. Fusionner les trois images de fond-soustrait (Image > couleur > fusion canaux) en choisissant canalR comme rouge, canalG en vert et canalB en bleu. Vous obtiendrez une image composite unique composé de trois chaînes.
    7. Lancer le gestionnaire de ROI (Analyze > Outils > Gestionnaire de retour sur investissement). Dessiner un ROI carré autour des perles unique assurant qu’il n’y a qu’une seule perle au sein de chaque ROI. Ajouter le ROI au ROI manager en appuyant sur « t » sur le clavier. Répétez cette procédure et ajouter des ROIs autant que possible.
    8. Dans « Analyze > mesures Set », ne vérifier que « centre de masse ».
    9. Sélectionnez canalR, dans le gestionnaire de ROI, cliquez sur « Mesure » pour obtenir des centres ; deux colonnes correspondant à x et y les coordonnées des centres des ROIs seront affichera dans la fenêtre de « Résultat ». Copiez et collez les deux colonnes dans une feuille de calcul.
    10. Répétez l’étape 4.1.9 pour canauxG etB.
    11. Organiser les coordonnées des centres dans une feuille de calcul simple dans l’ordre suivant : xR, y,R, xG, y,G, xBet yB. Enregistrez la feuille de calcul au format « .csv » sous «beads.csv». Ne laisser aucun espace dans le nom du fichier.
  2. Sélectionnez et mesurer des mini-piles de l’appareil de Golgi
    1. Installer deux macros (joint en Matériaux supplémentaires) dans ImageJ, « inspection Macro-Golgi ROI » et « Données de 3 canaux Macro-sortie » par plug-ins > installer ». Gestionnaire de ROI clair et fenêtre de résultats.
    2. Ouvrir un ensemble d’images de minipile de Golgi consistant en trois fichiers TIFF (fichier > Image > Ouvrir).
    3. Répétez les étapes 4.1.2 - 4.1.5 et enregistrer les images de fond-soustrait trois pour une utilisation ultérieure. Enregistrement le fond SDs pour channelR, channelG et canalB Rde la SD, SDG et SDB, respectivement, pour les utiliser ultérieurement.
    4. Dupliquer les trois images de fond-soustrait générés à l’étape 4.2.3 (Ctrl + Maj + D).
    5. Dans « processus > Calculatrice d’Image », ajoutez d’abord le fond-soustrait canalG aux images du canalR . Ajoutez l’image résultante à l’image de fond-soustrait canalB . À l’image qui en résulte, dans « Image > réglage > seuil », sélectionnez « activé » à l’entrée « 1 » comme « Le plus bas seuil ». Après avoir appuyé sur « Appliquer », une noir et blanche image binaire est entraînée.
    6. Dans « Analyze > analyser les particules », entrée de la gamme de taille pour « taille (pixels ^ 2) ». Entrée « 50-infini ». Cochez « Ne comprend pas sur les bords » et « Ajouter à Manager ». ROIs contenant mini-piles de l’appareil de Golgi sont maintenant ajoutés au gestionnaire de ROI.
      NOTE : Le calibre doit être déterminé empiriquement pour exclure les bruits qui sont généralement de petite taille.
    7. Fusionner les trois images de fond-soustrait (Image > couleur > fusion canaux) de l’étape 4.2.3 en sélectionnant le canalR comme rouge, canalG en vert et canalB en bleu. Une seule image composite composé de trois chaînes est générée.
    8. Exécutez la macro « inspection Macro-Golgi ROI » en sélectionnant « Plugins > inspection Macro-Golgi ROI ». Dans la boîte de dialogue interactif, visuellement chaque ROI afin de conserver ou de le rejeter. Sélectionnez les ROIs qui contiennent un seul objet sur les trois canaux.
      Remarque : Après avoir exécuté cet outil, ROIs rejetés sont éliminés par le gestionnaire du ROI.
    9. Cochez seulement « Espace », « Valeur de gris moyen » et « Centre de masse » « Analyze > mesures Set ». Acquisition de données en lançant l’outil macro « Données de 3 canaux de Macro-sortie » (Plugins > Macro-sortie 3 canaux de données).
      Remarque : Centres (x et y) des ROIs au canalR, channelG et canalB , intensités moyennes et les zones sont affichés dans la fenêtre de « Résultat ».
    10. Copie x et y les coordonnées des centres dans un tableur et classez-les dans l’ordre suivant : xR, y,R, xG, y,G, xBet yB. Enregistrer la feuille de calcul dans un fichier « .csv » (ministacks.csv). Ne laisser aucun espace dans le nom du fichier. Procéder à la correction chromatique-Maj des centres (article 4.3) et calcul de LQ (section 4.4).
  3. Correction chromatique-Maj des centres
    1. Installer le Runtime de compilateur Matlab (MCR).
    2. Installer les fichiers suivants dans un dossier de travail dédié : my_train.exe et my_test.exe. Copier et coller «beads.csv» et «ministacks.csv » fichiers dans le même dossier.
    3. Lancez « Command Prompt » de Windows et allez dans le dossier de travail en tapant la commande suivante " cd path_of_working_folder ».
    4. Générer un fichier de calibrage chromatique-Maj à l’aide de centres de perles. Tapez la commande suivante «my_train.exe perles.csv étalonnage.mat 1». Un fichier nommé «étalonnage.mat » est créé dans le dossier de travail. Ignorer les autres fichiers qui sont générés.
    5. Corriger le décalage chromatique vers des centres de Golgi mini-piles en tapant la commande suivante «my_test.exe ministacks.csv corrected_ministacks.csv étalonnage.mat 1».
      Remarque : Un fichier nommé «corrected_ministacks.csv » est créé dans le dossier de travail. Il contient chromatique-Maj coordonnées corrigées des centres, qui sont disposés dans l’ordre de xG, y,G, xB et yB. Ignorer les autres fichiers qui sont créés. Prenez note que le canal rouge est défini comme libre de l’aberration chromatique et, par conséquent, xR et yR sont les mêmes que les données brutes.
  4. Calcul de LQs
    1. Lancer le logiciel d’analyse de données et des copier et les coller, dans le sous séquence, signifie valeurs de gris, les zones, fond SDs obtenu à l’étape 4.2.3 (placez-les à la ligne 1) et corrigé chromatique-shift x et y coordonnées de Golgi mini-cheminées en canalR dans un feuille de calcul comme colonnes A à E. De même, transférer les données correspondantes pour canauxG etB à colonnes F à J et K à O, respectivement.
    2. Ajouter huit nouvelles colonnes P à W, nommé « intensité intégrée du canal R », « l’intensité intégrée de canal G », « intensité intégrée du canal B », d1, dx, ABS(tan a), ABS (tan b) et LQ.
      1. Cliquez avec le bouton droit sur la partie supérieure de la colonne respective et sélectionnez « Définir des valeurs de colonne » pour calculer les valeurs de chaque colonne. Pour la colonne P, l’entrée « Col(A)Col(B) » ; pour la colonne Q, l’entrée « Col(F)Col(G) » ; pour colonne de R, l’entrée « Col(K)Col(L) » ; pour la colonne S, l’entrée « pixel_size*Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O)) » où « pixel_size » est la taille du pixel en nm ; pour les colonnes T, entrée « pixel_size*((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2)/(2Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))) » ; pour la colonne U, entrée "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2) / (2 Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) « ; pour la colonne V, entrée "Abs(Tan(Acos((Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))^2+Distance(Col(D), Col(E), Col(N), Col(O))^2-Distance(Col(I), Col(J), Col(N), Col(O))^2) / (2 Distance(Col(D), Col(E), Col(I), Col(J))Distance(Col(D) , Col(E), Col(N), Col(O))) « ; pour colonne W, entrée « Col (T) / Col (S) ».
    3. Filtrer les Golgi mini-piles par trois critères décrits dans l' Introduction.
      1. Dans le logiciel d’analyse de données, allez dans « feuille de calcul > requête de feuille de calcul » et sélectionnez les variables de la colonne pour test « If ». Assigner les alias suivants I1, I2, I3, d1, A et B pour les colonnes « intensité intégrée du canal R », « intensité intégrée de canal G », « l’intensité intégrée du canal B », d1, ABS(tan a) et ABS (tan b), respectivement. Dans le « si condition » entrée du décodeur, « I1 > =30*cell(1,3) et I2 > =30*cell(1,8) et I3 > =30*cell(1,13) AND d1 > = 70 et (A < = 0,3 ou B < = 0,3) ».
      2. Sélectionnez « Extraire à nouvelle feuille de calcul », cliquez sur « Appliquer ». Les colonnes A à W de Golgi analysables mini-cheminées sont extraits vers une nouvelle feuille de calcul.
    4. Dans la nouvelle feuille de calcul, cliquez sur le bouton droit du haut de la colonne W, sélectionnez « statistiques sur la colonne > dialogue ouvert ». Cocher « Total N », « Moyenne », « SE de la moyenne », « Histogrammes ». L’analyse statistique des LQs s’affiche ensuite.

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Representative Results

Microscope photonique grade recherche moderne équipé d’une lentille apochromatique de plan, comme celui utilisé dans notre laboratoire, montre l’aberration chromatique minimale (Figure 2A). Toutefois, un examen attentif de l’image multicolore perle fluorescente peut révéler le déplacement des images de couleur différente du même talon (Figure 2B). Nous définissons que le canal rouge est libre de l’aberration chromatique et centres de fluorescence rouge sont donc les positions réelles des perles. Les chromatiques-déplacements relatives de la fluorescence verte et rouge sombre peuvent être représentés par des vecteurs verts et bleus, originaires du centre de fluorescence rouge (Figure 2C). Le chromatique-déplacement dans le plan de l’imagerie est empiriquement illustré par le vecteur vert et bleu pour chaque perle (Figure 2D). Pour notre microscope, les chromatiques-déplacements ne sont pas uniformes en tant qu’amplitudes et les directions des changements de quarts de travail selon x et y des positions. Le chromatique-Maj peut considérablement affecter la précision des GLIM comme le déplacement des centres de l’infra-rouge peut être autant que 50 nm. C’est pourquoi chromatique-Maj doit être corrigée. Une fois que les centres de perles sont acquis, nous employons premier ordre polynomial fitting d’étalonner et de corriger par la suite les chromatiques-déplacements des centres. L’aberration chromatique-shift est grandement améliorée par cette approche ( D-Gdela Figure 2 ).

Dans les cellules de mammifères, l’appareil de Golgi est agrégée à l’espace périnucléaire qui n’est généralement pas être résolu sous un microscope optique conventionnel (Figure 3A). Après traitement de la nocodazole pendant 3 heures, l’appareil de Golgi de périnucléaire disparaît, et des dizaines de mini-piles de l’appareil de Golgi assemblent sur les sites de sortie du réticulum endoplasmique dans tout le cytoplasme (Figure 3B). Gros morceaux de membrane de Golgi et mini-piles agrégées de Golgi sont présents et ils ne sont pas sélectionnés pour analyse. Figure 3Cmontre une image d’exemple qui illustre la sélection de mini-piles de l’appareil de Golgi. En utilisant l’outil de « inspection Macro-Golgi ROI », appareil de Golgi sélectionné 40 mini-piles sont répertoriées à la Figure 3D. Après avoir appliqué les trois critères, Golgi 21 mini-piles étaient analysables et choisie pour le calcul de LQs de TPST1-EGFP (Figure 3D; étiqueté comme « L »), avec leurs statistiques, illustré à la Figure 3E. Au total, 111 analysables mini-piles de Golgi ont été sélectionnés parmi 12 cellules et la LQ de TPST1-EGFP a été mesurée à 0,04 0,76 (moyenne ± SEM ; n = 111) (Figure 3-F). La LQ de TPST1-EGFP la positionne entre giantin (LQ = 0,59) et EGFP-Rab6 (LQ = 1,04)7. C’est près de GS15 (LQ = 0,83) et ST6GalT1-AcGFP1 (LQ = 0,82). Nous avons défini les régions sub-Golgi selon LQs en tenant compte des données de localisation qualitative de la littérature : l’ERES/ERGIC, < -0,25 ; cis, 0.00 ± 0,25 ; médiale, 0,50 ± 0,25 ; TRANS-Golgi, 1,00 ± 0,25 et TGN, 1.25-2,00. La LQ de TPST1-EGFP indique donc son trans-localisation de Golgi, qui est en accord avec une précédente étude14.

Figure 1
Figure 1 . Schématiques Illustrations montrant les Variables utilisées dans le calcul du GLIM. Vue xz (A) d’une mini-pile de Golgi qui possède des centres coaxiaux GM130, GalT-mCherry, des protéines x fluorescence montrant Golgi axe et angle axial, dx d1. L’image de la pile mini de l’appareil de Golgi est sa projection sur le plan de l’image. Vue de xy (B) d’une mini-pile de Golgi avec hors axe Centre de protéine x montrant l’angle α, β angle et projection axial distance dx. A et B sont adaptés à partirE de la Figure 1et Figure 1F de notre précédent de publication7, respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 . Correction de la chromatique-Maj. (A) l’image fusionnée trois couleurs de 110 nm multi couleur perles acquis par un microscope à champ large. Chaque perle émet vert, rouge et rouge sombre (artificiellement colorée en bleu) par fluorescence. Balance bar, 10 µm. (B) élargie — vue d’une image simple-perle fusionnée avec un chromatique-changement notable. Balance bar, 200 nm. (C), un diagramme schématique montrant que décalages d’images de la perle verte et rouge sombre peuvent être représentées par des vecteurs du centre de l’image de la perle rouge (0,0) aux centres de vert (vecteur vert) et images de perle rouge sombre (vecteur bleu), respectivement. (D, E) L’effet de la correction chromatique-shift. Dans le même champ d’image, vecteur vert et bleu est tracées avant et après changement de correction. Pour visualiser le changement minuscule, l’ampleur de chaque vecteur est amplifiée 200 fois. (F, G) Des intrigues montrant centres de vert (points verts) et de perles rouge sombre (points bleus) avant et après correction de décalage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 . Un exemple typique de GLIM, acquérir ici la QL de TPST1-EGFP. Une cellule HeLa exprimant TPST1-EGFP (vert) et GalT-mCherry (rouge) ont été colorés pour GM130 endogène (bleu). (A) A cellule typique. (B, C, D, E) Une cellule traitée avec la nocodazole était imagée (B). De l’image, analysables Golgi mini-cheminées ont été choisis comme indiqué dans C. Mini-piles de Golgi sélectionnés sont étiquetés par des numéros d’identification. Images de ces mini-cheminées de Golgi masqués sont affichés ci-dessous en avec leurs numéros d’identification. « L » indique que la pile mini de l’appareil de Golgi est valable pour le calcul de la QL (piles mini à analysables de Golgi). Histogramme de LQs de 21 mini-cheminées de la cellule apparaît en E. Histogramme de LQs (F) de 111 mini-cheminées de 12 cellules. La valeur affichée dans l’histogramme est moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Matériaux supplémentaires : Macro-Golgi ROI inspection.ijm, Macro-sortie 3 canaux data.ijm, codes Matlab, template.opj My_train.exe, My_test.exe et feuille de calcul.

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Discussion

Auparavant, la localisation d’une protéine de Golgi sous le microscope photonique a été principalement quantifiée par le degré de corrélation ou la superposition de l’image de la protéine et l’image d’un marqueur de Golgi de localisation connue15,16, 17. La corrélation obtenue ou coefficient de chevauchement reflète comment fermer la protéine test est le marqueur de Golgi dans l’espace. Il y a au moins trois avertissements relatifs à cette approche. Tout d’abord, la corrélation ou coefficient de chevauchement n’est pas linéaire et il n’indique pas directement la distance spatiale. En second lieu, le degré de corrélation est critique dépend de la résolution du système microscopique. Par conséquent, le coefficient entre deux protéines de Golgi n’est pas une constante indépendante du système. Troisième, deux protéines de Golgi avec la même localisation axiale mais différente distribution latérale le long de saccules peuvent avoir des coefficients distincts. Par conséquent, la corrélation ou coefficient de chevauchement n’indique pas la localisation axiale d’une protéine de Golgi. Dans une autre méthode proposée par Dejgaard et al., cis, trans-marqueurs de Golgi et la protéine d’intérêt sont marqués au triple dans nocodazole traités Golgi mini-piles, semblables à GLIM. Au sein de chaque mini-pile Golgi, positions des trois pixels intensité maximale sont acquis et la position relative de la protéine test correspond à un ratio de distance18. Cependant, leur méthode est incapable d’atteindre la résolution sous-pixel, ce qui limite grandement sa demande. Par rapport aux précédentes méthodes quantitatives, GLIM, qui a été développé indépendamment, mais comporte un concept similaire à celui de Dejgaard et al., est en mesure de quantifier la localisation axiale d’une protéine de Golgi avec une précision inégalée et la cohérence.

Nous avons présenté le protocole de GLIM d’acquérir la QL de protéine de GFP-étiquetée exogène exprimée - TPST1-EGFP. La QL de protéine endogène peut être déterminée si son anticorps est disponible. Selon l’espèce de l’anticorps primaire, souris ou lapin, puis un anticorps anti-GM130 lapin ou souris, respectivement, peut être utilisé dans le protocole de triple-étiquetage. Lapin et la souris des anticorps anti-GM130 pour immunofluorescence labeling sont disponibles dans le commerce. Nous avons démontré précédemment que le lapin et la souris des anticorps anti-GM130 donnent les mêmes résultats en GLIM7. Si la test de protéine est intrinsèquement rouge dans l’émission de fluorescence, telles que la fusion de mCherry, un Golgi GFP-étiquetée protéine marqueur avec LQ connu en combinaison avec GM130 Anticorps étiquetage peut servir à triple-marquer les cellules et déduire indirectement la LQ de la protéine test. En supposant que la protéine marqueur LQ est LQm et la distance entre le centre de la protéine marqueur et celle de GM130 dm, la LQ de la protéine test x peut être calculé comme (dx/dm) × LQm. Un des grands avantages de GLIM par rapport à la microscopie Super-résolution est qu’elle peut facilement être appliquée à l’imagerie de cellules vivantes dans les configurations microscopiques classiques. Nous avons essayé une combinaison de trois protéines de fluorescence, GFP-Golgin84, mCherry-GM130 et GalT-iRFP670, pour la surveillance dynamiquement la LQ de GFP-Golgin84, l’unique appareil de Golgi mini-piles7.

Dans GLIM, la plus longue étape est l’analyse postérieure à l’acquisition, en particulier sur le choix des mini-piles de Golgi analysables. Mini-piles de l’appareil de Golgi sont hétérogènes en taille et en composition moléculaire19, on ne sait pas si la distribution de LQs (Figure 3F) représente l’architecture hétérogène de Golgi mini-cheminées ou l’incertitude de notre calcul de la LQ. Quelles que soient les causes, nous avons constaté qu’il est important d’avoir un grand nombre de Golgi analysables mini-piles (n) pour assurer l’exactitude de la QL, laquelle est compromis lorsque n est petit. Données avec n ≥ 100 de plusieurs cellules entraîne généralement, LQs fiables. Par conséquent, GLIM donne des données de localisation moyenne ensemble, obscurcissant l’individualité des mini-piles de l’appareil de Golgi. Une autre limitation de GLIM est qu’elle suppose que toutes les protéines de Golgi ont une distribution étroite autour d’un centre unique. Certaines protéines de Golgi, tels que COPI sous-unités, ARF1 et soluble sensible N-éthylmaléimide facteur accessoire protéine récepteur (collets)20,21, ont été signalés à distribuer largement de la CEI à la trans- Appareil de Golgi et le RTG. Il ne convient sans doute d’étudier leur localisation de Golgi par la LQ. Comme GLIM consiste actuellement à sélection manuelle des mini-piles de Golgi, ce qui est laborieux et subjective, l’évolution future de GLIM sera de mettre en œuvre un outil logiciel pour sélectionner automatiquement l’appareil de Golgi mini-piles avec une interférence humaine minimale.

Quelle est la résolution spatiale du GLIM ? Puisque la QL est un ratio, qui est sans unité, il n’indique pas une distance spatiale. Ici, nous tentons de donner une estimation très approximative. La résolution spatiale du GLIM peut être définie comme la plus petite distance axiale entre deux protéines de Golgi peut être résolus. Examen LQs de divers Golgi protéines7, nous avons constaté que SEMs de datasets avec gamme 100 n ≥ autour de 0,03. En supposant que les deux protéines de Golgi ont le même n = 100 et SEM = 0,03, l’appareil de Golgi deux protéines ont significative localisation différente de t-test (p < 0,05), c'est-à-dire, être résolu, si la différence entre leurs LQs est ≥ 3 × SEM = 0,09. Partir des données de l’EM, on peut estimer que la longueur axiale de la mini-pile Golgi, qui est aussi la distance entre GM130 et GalT-mCherry en GLIM, est ~ 300 nm8. Par conséquent, la résolution de GLIM est estimée à 0,09 × 300 = 30 nm suivant l’axe de l’appareil de Golgi. Dans GLIM, une plus grande n donne généralement SEM plus petite, ce qui entraîne à son tour une résolution plus élevée.

C’est sans doute inapproprié de comparer directement la résolution de GLIM à celui de l’EM immuno-or, puisque cette dernière technique ne donne pas directement les données quantitatives de localisation. Semblable à GLIM, la résolution de l’EM immuno-or le long de l’axe de l’appareil de Golgi peut être définie comme la plus petite distance entre les deux marqueurs de Golgi peut être résolus. Pour mesurer sa résolution nécessite l’étude de double-immuno-or marquage de deux protéines de Golgi étroitement adjacents les uns aux autres le long de l’axe de l’appareil de Golgi. Telle étude systémique n’est probablement pas disponible selon notre connaissance. Tel que mentionné dans l’introduction, l’un des facteurs limitants dans la résolution spatiale de l’EM immuno-or est la grande taille de l’anticorps complexe, ce qui en fait la résolution d’être pire que ~ 20 nm. Un autre facteur limitant de la résolution de l’image est la densité de marquage de molécules d’antigènes. Selon la théorie d’échantillonnage de Nyquist, il doit y avoir au moins deux particules d’or par unité de résolution. Dans la plupart des études EM immuno-or, les distances entre les particules du voisin or est pas < 15 nm en raison de la très faible marquage efficacité ; Il est donc difficile pour cette technique réaliser des photos d’une résolution inférieure à 30 nm. De ce point de vue, nous estimons que la résolution de GLIM est au moins comparable à celle de l’EM immuno-or.

GLIM est une méthode robuste qui donne des résultats très cohérents. Il est indépendant du type de microscope utilisé. Nous avons testé cette microscopes confocaux disque grand champ et filature a donné les mêmes résultats. LQs des mêmes protéines Golgi acquis à différents lots d’expériences ont été aussi en accord avec l’autre. Une base de données LQ consistant en une protéines résidentes diverse gamme de Golgi a été généré pour la comparaison et l’interprétation. Nous espérons que plus d’utilisation de GLIM dans le milieu de la recherche augmentera considérablement la base de données. Par conséquent, une base de données plus complète décrivant quantitativement la localisation d’un grand nombre de protéines de Golgi va grandement aider à comprendre l’organisation et le fonctionnement de l’appareil de Golgi.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Nous tenons à remercier D. Stephens (Université de Bristol, Bristol, Royaume-Uni) pour le plasmide TPST1-EGFP ADN, ainsi que Lakshmi ngassa Govindarajan pour aider à l’optimisation du logiciel. Ce travail a été soutenu par les subventions accordées par le Conseil National de recherches médicales (NMRC/CBRG/007/2012), le ministère de l’éducation (AcRF Tier1 RG 18/11, RG 48/13 et RG132/15 et AcRF niveau 2 MOE2015-T2-2-073) à L.L.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
fluorescence beads. Commercial name: TetraSpeck beads Invitrogen T7279 As multi-color beads to calibrate chromatic-shift of the microscope
Glass coverslip Φ 12 mm (No. 1.5) Menzel CB00120RAC
Glass coverslip Φ 25 mm (No. 1.5) Menzel
DMEM Capricon DMEM-HPA-P50
Trypsin-EDTA
FBS GE Hyclone SV30160.03
Nocodazole Merck 487928
transfection reagent. Commercial name: Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
transfection medium. Commercial name: OptiMEM Invitrogen 31985070
TPST1-EGFP Addgene 66617 A gift from D. Stephens (University of Bristol, Bristol, United Kingdom)
GalT-mCherry Made in our lab
paraformaldehyde Merck 1.04005.1000
saponin Sigma-Aldrich 47036
poly(vinyl alcohol) (Mw ~31,000). Commercial name: Mowiol-488 CALBIOCHEM 475904
BSA Sigma-Aldrich A9647
Mouse anti-GM130 BD Biosciences 610823 Primary antibody for human GM130
far-red fluorescence conjugated goat anti-mouse IgG. Commercial name: Alexa Fluor 647 conjugated goat anti-mouse IgG Invitrogen A-21235 Far red fluorescence conjugated secondary antibody

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References

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