Murine Mandibular Condyle के लिए एक Morphometric और सेलुलर विश्लेषण विधि

Biology

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Summary

यह पांडुलिपि कुतर के mandibular condyle के भीतर morphometric और सेलुलर परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए विधियाँ प्रस्तुत करती है ।

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Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

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Abstract

temporomandibular संयुक्त (TMJ) क्षमता बाहरी उत्तेजनाओं के लिए अनुकूल है, और परिवर्तन लोड हो रहा है condyles की स्थिति को प्रभावित कर सकते हैं, साथ ही साथ संरचनात्मक और सेलुलर घटकों के mandibular condylar उपास्थि (एमसीसी). इस पांडुलिपि इन परिवर्तनों का विश्लेषण और चूहों में TMJ की लोडिंग बदलने के लिए एक विधि के लिए तरीकों का वर्णन (यानी, संपीड़न स्थिर TMJ लोड हो रहा है) । संरचनात्मक मूल्यांकन यहां सचित्र एक सरल morphometric दृष्टिकोण है कि Digimizer सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है और छोटी हड्डियों के रेडियोग्राफ में किया जाता है । इसके अलावा, सेलुलर परिवर्तन के विश्लेषण कोलेजन अभिव्यक्ति, अस्थि remodeling, सेल विभाजन, और एमसीसी में proteoglycan वितरण में परिवर्तन करने के लिए अग्रणी वर्णन किया गया है । ऊतकीय वर्गों में इन परिवर्तनों का ठहराव-छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर सकारात्मक फ्लोरोसेंट पिक्सल गिनती और दूरी मानचित्रण और Digimizer के साथ दाग क्षेत्र को मापने के द्वारा भी प्रदर्शन किया है । यहां दिखाए गए तरीकों murine TMJ तक ही सीमित नहीं हैं, लेकिन छोटे प्रयोगात्मक पशुओं के अतिरिक्त हड्डियों पर और endochondral हड्डी के अंय क्षेत्रों में इस्तेमाल किया जा सकता है ।

Introduction

TMJ एक अनूठा लोड असर craniofacial क्षेत्र में स्थित संयुक्त है और fibrocartilage का गठन किया है । TMJ के एमसीसी संयुक्त समारोह के लिए आवश्यक है, जबकि बोल और masticating बाधा जबड़े आंदोलन सहित, लेकिन यह आमतौर पर अपक्षयी रोगों,1सहित पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस से प्रभावित है । TMJ बाहरी उत्तेजनाओं और लोड हो रहा है परिवर्तन करने के लिए अनुकूल करने की क्षमता है, एमसीसी के घटकों के लिए संरचनात्मक और सेलुलर परिवर्तन करने के लिए अग्रणी2,3,4,5। लोड-एमसीसी के गुण असर अपने घटकों के बीच बातचीत द्वारा समझाया जा सकता है, पानी सहित, कोलेजन नेटवर्क, और घनी proteoglycans पैक । एमसीसी चार अलग सेलुलर क्षेत्रों है कि व्यक्त कोलेजन और गैर कोलेजन प्रोटीन के विभिंन प्रकार: 1) सतही या जोड़दार क्षेत्र; 2) प्रफलन क्षेत्र, विभेदित mesenchymal कोशिकाओं से बना है और है कि लोडिंग मांगों का जवाब; 3) prehypertrophic क्षेत्र, परिपक्व chondrocytes व्यक्त कोलेजन प्रकार 2 से बना; और 4) hypertrophic जोन, क्षेत्र जहां hypertrophic chondrocytes व्यक्त कोलेजन प्रकार 10 मरो और कड़ा से गुजरना । गैर खनिज क्षेत्र proteoglycans में समृद्ध है जो संपीड़न बल6के लिए प्रतिरोध प्रदान करते हैं ।

वहां एमसीसी के hypertrophic क्षेत्र में निरंतर खनिज है, जहां chondrogenesis से आस्टियोजेनेसिस को संक्रमण होता है, subchondral mandibular के condyle हड्डी के मजबूत खनिज संरचना की गारंटी7। खनिज और खनिज क्षेत्र में सेलुलर परिवर्तन अंततः रूपात्मक और mandibular condyle और mandible में संरचनात्मक परिवर्तन के लिए नेतृत्व । एमसीसी के सभी सेलुलर क्षेत्रों और subchondral भाग के खनिज के homeostasis के रखरखाव के स्वास्थ्य के लिए आवश्यक हैं, भार असर क्षमता, और TMJ की अखंडता ।

एकाधिक कोलेजन ट्रांसजेनिक माउस मॉडल (के रूप में Utreja एट अल द्वारा वर्णित है.) 8 एक महान उपकरण के लिए कोलेजन अभिव्यक्ति में परिवर्तन समझ का उपयोग करें, क्योंकि सभी transgenes एमसीसी में व्यक्त कर रहे हैं । एक में गहराई ऊतकीय मूल्यांकन के लिए, ऊतकीय दाग मैट्रिक्स जमाव, खनिज, सेल प्रसार, और apoptosis, साथ ही साथ एमसीसी के विभिंन सेल परतों पर प्रोटीन अभिव्यक्ति अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है ।

इस पांडुलिपि में ऊतकीय और morphometric विश्लेषणों में चूहों के mandibular condyle के एमसीसी और subchondral की हड्डी में सेलुलर और संरचनात्मक परिवर्तन का मूल्यांकन किया जाता है. इसके अलावा, एक सेल ठहराव विधि, फ्लोरोसेंट ऊतकीय छवियों का विश्लेषण करने के लिए और प्रकाश माइक्रोस्कोप स्लाइड मानचित्रण के लिए, वर्णित है । संपीड़न स्थिर TMJ लोडिंग विधि है, जो एमसीसी और subchondral बोन9में सेलुलर और रूपात्मक परिवर्तन का कारण बनता है, यह भी हमारे तरीकों को मांय सचित्र है ।

यहां वर्णित विधियों का उपयोग mandibular condyle और mandible में morphometric और ऊतकीय परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है या endochondral हड्डी के अंय क्षेत्रों का विश्लेषण करने के लिए और अतिरिक्त खनिज ऊतकों की आकृति विज्ञान ।

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Protocol

विश्वविद्यालय कनेक्टिकट स्वास्थ्य केंद्र के संस्थागत पशु देखभाल समिति ने सभी पशु प्रक्रियाओं को मंजूरी दे दी ।

1. संपीड़न स्थिर TMJ लोड हो रहा है: मुंह खोलने के लिए मजबूर

नोट: चार सप्ताह पुरानी ट्रांसजेनिक कोलेजन (Col2a1XCol10a1) के लिए फ्लोरोसेंट पत्रकारों हार्बर, कृपया Dr. डेविड रोवे (कनेक्टिकट विश्वविद्यालय) द्वारा प्रदान की, इस पांडुलिपि में वर्णित प्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया गया (n = 8; 4 पुरुषों और 4 महिलाओं) । Col2a1 सियान (नीला) transgene एमसीसी के prehypertrophic जोन में कोशिकाओं में व्यक्त किया जाता है, जबकि Col10a1 चेरी (लाल) कोशिकाओं hypertrophic क्षेत्र में मौजूद हैं8 (चित्रा 1). चूहों को समान रूप से दो समूहों में विभाजित किया गया: 1) लोड समूह, जहां चूहों संपीड़न स्थिर TMJ लोड करने के लिए अधीन थे (2 चरण में वर्णित) और 2) नियंत्रण समूह, जहां चूहों कोई हस्तक्षेप प्राप्त किया.

Figure 1
चित्र 1एक डबल कोलेजन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस (Col2a1XCol10a1) के condyle के प्रतिनिधि sagittal । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. किर स्प्रिंग्स usingbeta टाइटेनियम मिश्र धातु archwires (०.०१७ x ०.०२५ में) (चित्रा 2) ।
  2. ketamine (९० मिलीग्राम/kg bodyweight) और xylazine (13 mg/bodyweight) के मिश्रण का एक intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा प्रयोगात्मक पशुओं को Anesthetize ।
  3. धीरे चूहों के मुंह खोलने के लिए और स्प्रिंग्स डालने, दाढ़ की हड्डी और mandibular कृन्तक में छोरों आकर्षक (चित्रा 2बी और सी).
  4. 1 एच के लिए anesthetized चूहों के कृन्तक में स्प्रिंग्स रखने के द्वारा संपीड़न स्थिर TMJ लोडिंग प्रेरित 5 दिनों के लिए इस प्रक्रिया को दोहराएँ.
  5. 5-एथनाइल-2'-deoxyuridine (EdU; 30 मिलीग्राम/किलो bodyweight) intraperitoneally सेल प्रसार विश्लेषण के लिए 2 दिन और इच्छामृत्यु से पहले 1 दिन के साथ चूहों सुई ।

Figure 2
चित्र 2संपीड़न स्थैतिक TMJ लोड हो रहा है: मुंह खुले मॉडल मजबूर । (A) ०.०१७ x ०.०२५ बीटा टाइटेनियम मिश्र धातु archwire के स्प्रिंग गढ़े । (ख) वसंत के साथ लोड माउस । (ग) mandible की स्थिति में मतभेद दिखा लोड और नियंत्रण चूहों की रेडियोग्राफ़. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

2. Mandible विच्छेदन और निर्धारण

  1. मजबूर-खुले मुंह प्रक्रियाओं के समापन बिंदु पर, एक अनुमोदित विधि द्वारा प्रयोगात्मक पशुओं euthanize ।
  2. टुकड़े की उपास्थि को स्क्रैप किए बिना मांसपेशियों के लगाव को काट कर mandibles को condyle.
  3. निर्धारण के लिए 24 ज के लिए 10% formalin में जरुर mandibles रखें ।
    सावधानी: Formalin एक अड़चन है; उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरण पहनें ।

3. एक्स-रे इमेजिंग और Morphometric माप

  1. एक फ्लैट कंटेनर में mandibles प्लेस (जैसे, एक ५५ mm x 16 mm पेट्री डिश) और 5 एस के लिए एक 26 केवी में एक कैबिनेट एक्स-रे प्रणाली का उपयोग कर नमूनों की रेडियोग्राफ ले ।
    नोट: छवियों को सहेजने से पहले एक स्केल बार रखें ।
  2. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर mandibles के morphometric माप प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें).
    नोट: कोई भी माप करने से पहले, इकाई निर्धारित करने के लिए रेडियोग्राफ़ पर स्केल बार का उपयोग करें । यह कदम ठीक से संरचनात्मक संरचनाओं को मापने के लिए महत्वपूर्ण है । "इकाई" बटन (चित्रा 3) पर क्लिक करें ।
  3. इमेजिंग सॉफ़्टवेयर (चित्र 3B) में "मार्कर शैली 2" का उपयोग करके संरचनात्मक बिंदुओं का चयन करें । इस पेपर में वर्णित विधि का पालन करने के लिए, निंन बिंदुओं का चयन करें (चित्र 3B):
    1. condylion का चयन करें (बिंदु 1), mandibular condyle के सबसे पीछे बिंदु;
    2. incisor प्रक्रिया (बिंदु 2) का चयन करें;
    3. अवग्रह पायदान (प्वाइंट 3) पर गहरे बिंदु का चयन करें;
    4. mandibular रेमस की गुहा में गहरे बिंदु का चयन करें (बिंदु 4);
    5. condylar जोड़दार सतह के सबसे पूर्वकाल बिंदु का चयन करें (बिंदु 5); और
    6. condylar जोड़दार सतह (प्वाइंट 6) के सबसे पीछे बिंदु का चयन करें ।
  4. संरचनात्मक अंक का चयन करने के बाद, "लंबाई" उपकरण का उपयोग कर morphometric माप प्रदर्शन, लेकिन condyle सिर लंबाई के लिए, अंक (3) और (4) (चित्रा 3सी) से "सीधा लाइन" उपकरण का उपयोग करें ।
    1. mandibular लंबाई, condylion (1) से incisor प्रक्रिया (2) के लिए उपाय ।
    2. condyle सिर की लंबाई को मापने-condylion से सीधा दूरी (1) एक लाइन के लिए अवग्रह पायदान (3) में गहरी बात से पता लगाया mandibular रेमस (4) की गुहा में गहरी बात है ।
    3. condyle सिर चौड़ाई उपाय-condylar जोड़दार सतह के सबसे पीछे बिंदु करने के लिए सबसे पूर्वकाल से दूरी (5-6) ।
    4. स्क्रीन के दाईं ओर "माप सूची" से माप की प्रतिलिपि बनाएँ (चित्र 3C).

Figure 3
चित्र 3 . mandible के morphometric मापन का निरूपण । (A) इकाई (लाल, स्केल बार: 10 मिमी) में परिवृत्त निर्धारित करने के लिए रेडियोग्राफ़ के स्केल बार का उपयोग करें । (B) "मार्कर शैली 2" (लाल रंग में घेरे) का उपयोग करके संरचनात्मक बिंदुओं का चयन करें । 1) Condylion; 2) Incisor प्रक्रिया; 3) अवग्रह पायदान पर गहरी बात; 4) mandibular रेमस की गुहा में गहरी बात; 5) condylar जोड़दार सतह के सबसे पूर्वकाल बिंदु; 6) condylar जोड़दार सतह के सबसे पीछे बिंदु । स्केल बार: 10 मिमी.(ग) "लंबाई" और "सीधा" उपकरण (लाल रंग में घेरे) के साथ माप प्रदर्शन. बिंदु से माप 1 से 2: mandibular लंबाई; बिंदु से 5 से 6: condylar चौड़ाई; सीधा बिंदु 1 से 4-3: condylar सिर लंबाई । माप को "माप सूची" से सहेजें स्केल बार = 10 मिमी. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

4. Condyle एंबेडिंग

नोट: रेडियोग्राफिक छवियां लेने के बाद, mandibles को एंबेड किया जा सकता है और ऊतकीय विश्लेषण के लिए खोदी जा सकती है ।

  1. प्लेस undecalcified mandibles (है कि कदम २.३ में तय किया गया है) में 30% सुक्रोज में रात भर के लिए पंजाब में एंबेडिंग से पहले ।
  2. टुकड़े किसी भी अतिरिक्त नरम ऊतक और ध्यान से mandibular condyle में कटौती ।
  3. कुछ embedding राल डालो (पर्याप्त नमूना कवर करने के लिए) डिस्पोजेबल प्लास्टिक के नए सांचे में और मोल्ड के आधार के खिलाफ condyle की औसत दर्जे की सतह जगह, मोल्ड के नीचे करने के लिए नमूना समानांतर स्थिति ।
  4. सूखी बर्फ का एक टुकड़ा के साथ सही जगह में नमूना ठीक करें ।
  5. एंबेडिंग राल के साथ मोल्ड भरें और ठंड 2-मिथाइल-ब्यूटेन, जो पूर्व में ठंडा किया जा सकता है में निश्चित नमूना के साथ मोल्ड जगह-20 ° c या-८० ° c फ्रीजर या सूखी बर्फ में ।
  6. नमूनों की दुकान पर-20 डिग्री सेल्सियस या पर-८० डिग्री सेल्सियस तक खोदी ।

5. Condyle Sagittal सेक्शनिंग और स्लाइड तैयार करना

  1. condyles (5-7 µm) के जमे हुए sagittalअनुभागोंबनाएँ, और टेप स्थानांतरणविधि10, 11 का उपयोग कर स्लाइड के लिए नमूने स्थानांतरित करें ।
  2. ऊतकीय यूवी-इलाज विधि10का उपयोग कर टेप करने के लिए हस्तांतरित वर्गों का पालन करें ।

6. ऊतकीय धुंधला और माइक्रोस्कोपी इमेजिंग

नोट: ऊतकीय धुंधला के अधिकांश के रूप में Dyment एट अल10द्वारा कागज के ऊतकीय अनुभाग में वर्णित किया जाता है ।

  1. आधारभूत स्कैनिंग के लिए, पहला कदम Col2a1 और Col10a1 transgenes के लिए छवि के लिए है, के रूप में Dyment एट अल10 द्वारा वर्णित है ।
    1. 30% ग्लिसरॉल और पंजाबियों में स्लाइड के शीर्ष पर प्लेस coverslips । आधारभूत इमेजिंग ofthesectionswitha फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप और उपयुक्त फिल्टर प्रदर्शन करते हैं ।
  2. फ्लोरोसेंट tartrate प्रतिरोधी एसिड फॉस्फेट (ट्रैप) धुंधला प्रदर्शन ।
    नोट: ट्रैप टेम कोशिकाओं, हड्डी resorbing कोशिकाओं, osteoclasts12सहित द्वारा व्यक्त की है । इस दाग का उद्देश्य एमसीसी और subchondral हड्डी remodeling का विश्लेषण है ।
    1. उन्हें पंजाबियों में भिगोकर स्लाइडों का coverslip निकालें. 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पंजाब में स्लाइड धो लो ।
    2. आसुत जल के 1 L में सोडियम एसीटेट निर्जल (९.२ g) और सोडियम L-tartrate dibasic डाईहाइड्रेट (११.४ ग्राम) को भंग करके ट्रैप बफर 1 तैयार करें । एसिटिक एसिड के साथ ४.२ के लिए पीएच समायोजित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर जाल बफर 1 की दुकान ।
    3. आसुत जल के 1 मिलीलीटर में हौसले से भंग सोडियम नाइट्राइट (४० मिलीग्राम) द्वारा जाल बफर 2 तैयार करते हैं ।
    4. जाल सब्सट्रेट बफर तैयार (बस धुंधला होने से पहले) बफर के ७.५ मिलीलीटर 1 और १५० बफर 2 के µ एल मिश्रण से । इस समाधान (२०० µ l) को प्रत्येक स्लाइड पर 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लागू करें ।
    5. सब्सट्रेट बफर के १.८४० मिलीलीटर और फ्लोरोसेंट सब्सट्रेट के 23 µ l को मिलाकर ट्रैप रिएक्शन बफर तैयार करें ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
      नोट: जाल गतिविधि के लिए फ्लोरोसेंट substrategeneratesayellowfluorescentsignal ।
    6. निकालें अतिरिक्त जाल सब्सट्रेट बफर द्वारा धीरे समाधान pipetting.
    7. एक यूवी स्रोत बल्ब ब्लैक लाइट के तहत 5 मिनट के लिए ट्रैप प्रतिक्रिया बफर के २०० µ एल के साथ स्लाइड ।
    8. 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पंजाब में स्लाइड धो लो ।
    9. coverslips में 30% ग्लिसरॉल में स्लाइड पर प्लेस करें और सूक्ष्म इमेजिंग10प्रदर्शन ।
  3. सेल प्रसार धुंधला प्रदर्शन करते हैं ।
    नोट: इस परख में, संशोधित thymidine एनालॉग 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU) नव संश्लेषित डीएनए में शामिल किया गया है: विभाजित कोशिकाओं एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल कर रहे हैं ।
    1. जाल के लिए इमेजिंग के बाद, coverslips निकालें और पंजाब में स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धो लो । ऊतकीय वर्गों दाग करने के लिए 5-ethynyl-2'-deoxyuridine सेल प्रसार किट से चरणों का पालन करें ।
    2. 1x प्रतिक्रिया बफर के ४३० µ l को जोड़कर एक प्रतिक्रिया कॉकटेल तैयार करें, CuSO4, फ्लोरोसेंट डाई के १.२ µ एल के 20 µ l, और ५० µ एल 1x बफर additive (५०० µ एल की कुल मात्रा एक स्लाइड के लिए पर्याप्त है) ।
      नोट: निर्माता की सिफारिश की सामग्री जोड़ने के क्रम में यहां वर्णित है ।
    3. कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए तैयार कॉकटेल के साथ स्लाइड की मशीन, प्रकाश से सुरक्षित ।
    4. 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार पंजाब में स्लाइड धो लो ।
    5. coverslips को 1:1000 DAPI के साथ पंजाब में 30% ग्लिसरॉल में स्लाइड के शीर्ष पर रखें ।
      नोट: DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) एक नीली फ्लोरोसेंट परमाणु दाग है कि डीएनए में अमीर क्षेत्रों में बांधता है ।
  4. प्रदर्शन Toluidine ब्लू (टीबी) धुंधला ।
    नोट: टीबी धुंधला एमसीसी पर proteoglycan वितरण से पता चलता है ।
    1. coverslips को निकालने के लिए स्लाइड indistilledwater कुल्ला करें ।
    2. coverslips को हटाने के बाद, आसुत पानी में स्लाइड धो 5 मिनट के लिए तीन बार एक पूरी तरह से पंजाबियों से नमक हटा दें ।
    3. समाधान एक (आसुत जल के 1 l में सोडियम फॉस्फेट dibasic के २८.४ जी भंग) और समाधान बी (आसुत जल के 1 एल में सोडियम फॉस्फेट monobasic के २७.६ जी भंग) बनाकर टीबी काम बफर तैयार करें । घोल के ९४.७ मिलीलीटर मिश्रण के साथ एक समाधान की ५.३ मिलीलीटर बी पतला इस समाधान 1:1 आसुत जल में ०.१ मीटर काम बफर के २०० मिलीलीटर बनाने के लिए । पीएच ठीक है जब तक सोडियम हीड्राकसीड जोड़कर पीएच ८.० को सही करें ।
    4. 1% शेयर टीबी तैयार: आसुत जल के १०० मिलीलीटर में टीबी के 1 ग्राम मिश्रण ।
    5. 1% स्टॉक टीबी के 3 मिलीलीटर में ०.१ मीटर काम बफर के ४० मिलीलीटर मिश्रण से टीबी काम समाधान तैयार करें ।
    6. 14-17 एस के लिए टीबी काम समाधान में स्लाइड की मशीन ।
      नोट: यह दाग बहुत संवेदनशील समय है; गर्मी समय को रोकने के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है ।
    7. आसुत जल में स्लाइड 5 मिनट प्रत्येक के लिए तीन बार धो लो ।
    8. coverslips को स्लाइड् स के ऊपर रखें, आसुत जल में 30% ग्लिसरॉल में । प्रकाश माइक्रोस्कोप इमेजिंग10प्रदर्शन ।
      नोट: ग्लिसरॉल + पंजाब में टीबी के लिए दाग की स्लाइड्स coverslip न करें । पंजाबियों को इस प्रकार के दाग धुल जाते हैं ।

7. फ्लोरोसेंट ऊतकीय ठहराव

  1. एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ्लोरोसेंट छवियों के ऊतकीय ठहराव प्रदर्शन ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
    नोट: इस विधि में ऊतकीय ठहराव के बुनियादी सिद्धांत ब्याज के क्षेत्र के पिक्सल की कुल संख्या से ब्याज की फ्लोरोसेंट पिक्सल की संख्या में विभाजित है और १०० द्वारा प्राप्त संख्या गुणा, सकारात्मक पिक्सल का एक प्रतिशत में जिसके परिणामस्वरूप उस क्षेत्र के भीतर ।
  2. condyles के sagittal वर्गों के एमसीसी में Col10a1 अभिव्यक्ति की ठहराव प्रदर्शन करते हैं.
    1. जब इस विधि का उपयोग कर कोशिकाओं और दाग के सभी प्रकार के बढ़ाता है, मात्रा होने के लिए क्षेत्र का चयन करें । एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में ऊतकीय छवियों को खोलने और "कमंद उपकरण (एल)" (चित्रा 4) का उपयोग करके क्षेत्र का चयन करें । विश्लेषण के लिए यहां वर्णित है, केवल एमसीसी क्षेत्र का चयन करें; क्षेत्र का चयन करने के बाद, पिक्सेल की कुल संख्या सॉफ्टवेयर (चित्रा 4) के स्क्रीन पर "हिस्टोग्राम" बॉक्स में दिखाया जाएगा । रुचि के क्षेत्र में पिक्सेल की संख्या सहेजें ।
    2. नमूना उपकरण का उपयोग करके Col10a1 लाल पिक्सेल का चयन करें । शीर्ष पैनल पर "चुनें" पर क्लिक करें और फिर "रंग रेंज." "eyedropper टूल" पर क्लिक करें, छवि में रुचि के पिक्सेल के लिए नमूना रंग चुनें, और "ठीक" क्लिक करें । चुने गए पिक्सेल रंग के लिए सकारात्मक सभी क्षेत्रों का चयन किया जाएगा (चित्रा 4बी) । फ्लोरोसेंट पिक्सल की संख्या की प्रतिलिपि (स्क्रीन के "हिस्टोग्राम" बॉक्स में दिखाया गया है) और उंहें एक स्प्रेडशीट या विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में चिपकाएं ।
    3. ब्याज के क्षेत्र के पिक्सल की संख्या पर फ्लोरोसेंट पिक्सल की संख्या फूट डालो और १०० द्वारा इस संख्या गुणा: ब्याज के क्षेत्र में फ्लोरोसेंट पिक्सल/पिक्सल * १०० ।
      नोट: अंय प्रकार की कक्ष, जैसे नीला Col2a1, इस विधि के साथ मात्रा किया जा सकता है, लेकिन Col10a1 लाल पिक्सेल के बजाय नीले पिक्सेल का चयन किया जाना चाहिए ।

Figure 4
चित्र 4 . transgene Col10a1 ठहराव का निरूपण । (क) "कमंद टूल" (L) के साथ रुचि के क्षेत्र का चयन करें. Col10a1-सकारात्मक कोशिकाओं के लिए, पूरे mandibular उपास्थि का चयन करें. "हिस्टोग्राम" बॉक्स से पिक्सेल की संख्या सहेजें । (ख) ब्याज की पिक्सेल का चयन करें, इस मामले में, लाल फ्लोरोसेंट Col10a1 पिक्सल । ध्यान दें कि केवल ब्याज के क्षेत्र के भीतर लाल पिक्सल का चयन किया जाएगा । "हिस्टोग्राम" बॉक्स से लाल पिक्सेल की संख्या सहेजें । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. एमसीसी और subchondral हड्डी में ट्रैप गतिविधि के ठहराव प्रदर्शन करते हैं ।
    1. चरण ८.२ में वर्णित प्रक्रिया का पालन करें, लेकिन बजाय केवल एमसीसी क्षेत्र का चयन, उपास्थि और subchondral अस्थि क्षेत्रों का चयन करें (चित्रा 5).
    2. ट्रैप गतिविधि विश्लेषण के लिए, चरण 8.2.2 (चित्रा 5बी) में वर्णित के रूप में, ELF97 सब्सट्रेट द्वारा उत्पन्न पीले पिक्सल का चयन करें; धनात्मक पिक्सेल की संख्या की प्रतिलिपि बनाएं; और उंहें एक स्प्रेडशीट या विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में चिपकाएं ।
    3. subchondral हड्डी क्षेत्र में पिक्सल की कुल संख्या के द्वारा पीले पिक्सल की संख्या विभाजित और १०० से गुणा करके ट्रैप-सकारात्मक पिक्सेल का प्रतिशत प्राप्त करें ।

Figure 5
चित्र 5 . फ्लोरोसेंट जाल ठहराव का प्रतिनिधित्व । (क) (mandibular उपास्थि और subchondral हड्डी) ब्याज के क्षेत्र का चयन करें और इस क्षेत्र के पिक्सल की संख्या को बचाने के । (ख) पीले फ्लोरोसेंट पिक्सल का चयन करें, जाल गतिविधि का प्रतिनिधित्व । ध्यान दें कि केवल ट्रैप-पॉजिटिव पिक्सेल का चयन किया जाएगा । चयनित पिक्सेल्स की संख्या सहेजें । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

  1. EdU-धनात्मक कक्षों की ठहराव निष्पादित करें ।
    1. edu-सना स्लाइड DAPI के साथ counterstained होती हैं, इसलिए रुचि के क्षेत्र में पिक्सेल की कुल संख्या की गणना करने के बजाय, edu-धनात्मक पिक्सेल के प्रतिशत का परिकलन करने के लिए DAPI-धनात्मक पिक्सेल का चयन करें । चरण ८.२ में बताए गए अनुसार रुचि के क्षेत्र का चयन करें, लेकिन पिक्सेल की कुल संख्या नहीं सहेजें । नमूना रंग के रूप में DAPI ब्लू पिक्सेल का चयन करें, चरण 8.2.2 में वर्णित के रूप में; DAPI-धनात्मक पिक्सेल (आरेख 6A) की संख्या की प्रतिलिपि बनाएं; और उंहें एक स्प्रेडशीट या विश्लेषण के लिए सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर में चिपकाएं ।
    2. इसके बाद, EdU-धनात्मक पिक्सेल (पीली फ्लोरोसेंट पिक्सेल) का चयन करें और "हिस्टोग्राम" बॉक्स (चित्र 6B) में पिक्सेल की संख्या सहेजें ।
    3. DAPI-धनात्मक पिक्सेल की संख्या और १०० द्वारा प्राप्त की गई संख्या को गुणा करके edu-धनात्मक पिक्सेल की संख् या को विभाजित करके edu पिक्सेल का प्रतिशत परिकलित करें ।

Figure 6
चित्र 6 . EdU ठहराव का निरूपण । (क) एमसीसी के प्रफलन क्षेत्र का चयन (उपास्थि की बाहरी परत). DAPI-धनात्मक पिक्सेल का चयन करें और पिक्सेल की संख्या सहेजें । (B) EdU-धनात्मक पिक्सेल (पीली फ्लोरोसेंट) का चयन करें और पिक्सेल की संख्या सहेजें । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

8. उपास्थि मोटाई और Proteoglycan वितरण का ठहराव

  1. Digimizer छवि सॉफ्टवेयर का उपयोग कर उपास्थि मोटाई (दूरी मानचित्रण) और toluidine नीले दाग क्षेत्र का विश्लेषण ।
    नोट: इकाई (चित्र 7) निर्धारित करने के लिए ऊतकीय छवि में स्केल बार का उपयोग करें ।
  2. दूरी मैपिंग माप निष्पादित करें ।
    नोट: दूरी मानचित्रण माप mandibular condyle पर उपास्थि की मोटाई प्रदान करेगा । विधि में यहां वर्णित है, एमसीसी के पांच क्षेत्रों का चयन कर रहे हैं, एमसीसी की कुल मोटाई के एक औसत दे रही है । शोधकर्ता एमसीसी के बीच में तीन विभिंन क्षेत्रों, या यहां तक कि एक ही क्षेत्र को मापने के लिए चुन सकते हैं ।
    1. "लंबाई" उपकरण का प्रयोग, बाहरी सतह से उपास्थि की लंबाई को मापने toluidine नीले दाग क्षेत्र के अंत (चित्रा 7बी) पांच क्षेत्रों में, या पसंदीदा के रूप में कई स्थानों के रूप में.
    2. "माप सूची" से लंबाई माप की प्रतिलिपि बनाएँ
      नोट: सॉफ्टवेयर भी माप का एक औसत प्रदान करता है (चित्रा 7बी).
  3. toluidine नीले दाग क्षेत्र को मापने ।
    नोट: toluidine नीले दाग क्षेत्र की माप में, एमसीसी में proteoglycan क्षेत्र प्राप्त किया जाएगा ।
    1. "क्षेत्र" उपकरण का चयन करें और toluidine नीले दाग क्षेत्र समोच्च (चित्रा 7सी) ।
    2. "माप सूची" से क्षेत्र मापन की प्रतिलिपि बनाएं

Figure 7
चित्र 7 : proteoglycan वितरण ठहराव का निरूपण । (क) ऊतकीय छवि के पैमाने पर पट्टी का प्रयोग करें "इकाई" बटन पर क्लिक करके इकाई निर्धारित करने के लिए (लाल रंग में वृत्त, इकाई चयनित: ५०० µm) । (ख) "लंबाई" उपकरण (लाल रंग में घेरे) का उपयोग करके विभिन्न स्थानों में उपास्थि की मोटाई को मापने. ऊपरी दाएँ फलक में "माप सूची" से माप सहेजें. सॉफ्टवेयर भी निचले सही पैनल में "आंकड़े" प्रदान करता है, तो मतलब है और माप के एसडी सीधे प्राप्त किया जा सकता है । (ग) "क्षेत्र" उपकरण (लाल रंग में घेरे) का उपयोग करके toluidine नीले दाग क्षेत्र को मापने । रुचि के क्षेत्र को वृत्त करें और माप को "माप सूची" से सहेजें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Representative Results

वर्णनात्मक सांख्यिकी morphometric माप (mandibular लंबाई, condylar लंबाई, condylar चौड़ाई) और ऊतकीय विश्लेषण के वितरण की जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया । परिणाम लोड समूह के बीच तुलना की गई (यानी, चूहों बीटा टाइटेनियम वसंत के साथ compression लदान के अधीन) और नियंत्रण समूह (यानी, नियंत्रण चूहों कि किसी भी प्रक्रिया प्राप्त नहीं किया मेल खाता है). साधनों के बीच सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतरों को ख़राब t-परीक्षण द्वारा निर्धारित किया गया था, और < 0.05 के p मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण समझा गया था.

चरण 4 और आरेख 3में बताए गए अनुसार Morphometric माप, लोड किए गए और नियंत्रण समूहों के mandibles में किया गया था । लोड काफी बढ़ी हुई mandible लंबाई के साथ प्रस्तुत समूह (लोड: १६.६२ ± ०.२३ mm बनाम नियंत्रण: १६.२१ ± ०.२ mm; p < ०.०५) और condyle सिर लंबाई (लोड: ४.६ मिमी, एसडी ०.०८ मिमी बनाम नियंत्रण: ४.४ मिमी; एसडी ०.०६; नियंत्रण समूह की तुलना में p < ०.०५) । फिर भी, समूहों के बीच condyle चौड़ाई में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था (लोड: ३.०६ ± ०.१२ mm बनाम नियंत्रण: २.९ ± ०.११; p = ०.०९) ।

कोलेजन वितरण के ठहराव चरण 8 में वर्णित विधि का उपयोग कर नियंत्रण की तुलना में लोड समूह के condyles के एमसीसी में काफी वृद्धि हुई Col10a1 अभिव्यक्ति का पता चला (लोड: 21% ± ४.४६% बनाम नियंत्रण: ७.५०% ± २.०३%; p < ०.००५; चित्र 8 A और D) । दूसरी ओर, लोड और नियंत्रण समूहों के बीच Col2a1 अभिव्यक्ति में कोई सांख्यिकीय अंतर नहीं था (लोड: ४.८५% ± १.९५% बनाम नियंत्रण: २.९२% ± १.८९%; p = ०.१३; चित्र 8 B और E) । इसके अलावा, ट्रैप गतिविधि के विश्लेषण से पता चला जाल-सकारात्मक क्षेत्रों लोड चूहों के condyles के subchondral क्षेत्र में (लोड: ५.२८% ± १.४५% नियंत्रण बनाम: २.४१% ± १.३९%; p < ०.०५; चित्र 8 C और F). इसी प्रकार, हमने सेल प्रसार में वृद्धि देखी है, क्योंकि चूहों को नियंत्रित करने की तुलना में लोड समूह के एमसीसी में बढ़ी हुई EdU-सकारात्मक कोशिकाओं द्वारा दर्शाया गया है (लोड: ६.२३% ± १.८९% बनाम नियंत्रण: १.९०% ± १.०३%; p < ०.०५; चित्र 9 A और C) ।

लोड और नियंत्रण चूहों के एमसीसी में Proteoglycan वितरण toluidine नीले दाग क्षेत्र और दूरी के नक्शे का मूल्यांकन करके मात्रा था, के रूप में चरण 9 और चित्रा 7में वर्णित है । हम नियंत्रण की तुलना में लोड समूह के condyles के एमसीसी में काफी वृद्धि हुई दूरी मानचित्रण पाया (लोड: २१०.२२ µm ± ४.११ µm बनाम नियंत्रण: १८७.३६ µm ± ८.६४ µm; p < ०.००५; चित्र 9 B और D) । हालांकि, proteoglycan-सना हुआ क्षेत्र सांख्यिकीय लोड और नियंत्रण समूहों के बीच अलग नहीं था (लोड: २०३,८९७.९३ µm2 ± १०,१७१.०० µm2 बनाम नियंत्रण: २०२,८७५.०९ µm2 ± ३३,४१९.०९ µm2; p = ०.९४; चित्र 9 B और E)

Figure 8
चित्र 8 : प्रतिनिधि परिणाम: (क) Col10a1-नियंत्रण और लोड चूहों से condyles के एमसीसी के sagittal वर्गों में सकारात्मक कोशिकाओं । लोड किए गए समूह में बढ़ी हुई संख्याएं Col10a1-धनात्मक कक्ष (D)हैं । (ख) Col2a1-नियंत्रण और लोड चूहों में सकारात्मक कोशिकाओं । समूहों (E)के बीच Col2a1-धनात्मक कक्षों में कोई अंतर नहीं है । (ग) नियंत्रण और लोड चूहों के condyles में जाल दाग । नियंत्रण की तुलना में लोड किए गए समूह में ट्रैप गतिविधि बढ़ाएं (F)। हिस्टोग्राम (D-F) का अर्थ है ± एसडी के लिए एन = 4 प्रति समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । * * नियंत्रण और लोड समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (p < ०.००५) । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 9
चित्र 9:प्रतिनिधि परिणाम: (क) EdU नियंत्रण और भरी हुई चूहों के condyles में धुंधला । बढ़ती हुई EdU-धनात्मक कोशिकाओं (C)द्वारा दर्शाए अनुसार, लोड किए गए समूह में कक्ष प्रसार बढ़ाएं । (ख) नियंत्रण और भरी हुई चूहों के condyles में Toluidine नीला दाग । भरा हुआ चूहों में उपास्थि मोटाई में वृद्धि हुई, के रूप में प्रयोगात्मक समूह में वृद्धि की दूरी मानचित्रण द्वारा दिखाया गया (D). नियंत्रण और लोड किए गए समूहों के बीच proteoglycan-सना क्षेत्र में कोई अंतर नहीं (E)। हिस्टोग्राम (सी-ई) का मतलब है ± एसडी के लिए एन = 4 प्रति समूह का प्रतिनिधित्व करते हैं । * * नियंत्रण और लोड समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर (p < ०.००५) । स्केल बार = २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि murine mandibular condyles और mandibles के morphometric माप और सेलुलर विश्लेषण के लिए तरीकों का वर्णन किया । रेडियोग्राफिक morphometric मापन के लिए छोटे प्रायोगिक पशुओं से अन्य हड्डियों का विश्लेषण भी किया जा सकता है. इसके अलावा, सेलुलर विश्लेषण (सेल ठहराव और उपास्थि दूरी मानचित्रण) को कुतर mandibular condyle तक सीमित नहीं हैं, लेकिन कई ऊतकों के ऊतकीय वर्गों को यों तो इस्तेमाल किया जा सकता है ।

ट्रांसजेनिक माउस मॉडल फ्लोरोसेंट पत्रकारों को व्यक्त उत्कृष्ट उपकरण नेत्रहीन जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन समझ रहे हैं । डबल कोलेजन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर माउस मॉडल (Col2a1XCol10a1) इस रिपोर्ट में इस्तेमाल किया एमसीसी के अध्ययन के लिए विशेष रूप से उपयुक्त था, के बाद से transgenes prehypertrophic और एमसीसी के hypertrophic क्षेत्र में व्यक्त कर रहे है ताकि कोलेजन वितरण मूल्यांकित किया जा सका । यदि शोधकर्ता एक ट्रांसजेनिक माउस फ्लोरोसेंट पत्रकारों, ऊतकीय प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के अंय तरीकों, ऐसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस के रूप में व्यक्त मॉडल का उपयोग नहीं है, इस्तेमाल किया जा सकता है ।

morphometric मापन के लिए, कैबिनेट रेडियोग्राफ़ छवियों को लेने से पहले महत्वपूर्ण कदम के लिए mandible या हड्डियों के सभी कोमल ऊतकों को दूर करने के लिए विश्लेषण किया जा रहा है । अत्यधिक मांसपेशी या कोमल हड्डियों से जुड़ी ऊतक संरचनाओं के वास्तविक माप मुखौटा सकता है । इसके लिए जरूरी है कि कैबिनेट रेडियोग्राफ़ सिस्टम की सीमाओं से वाकिफ हो । हर एक्स-रे की तरह, यह एक 3 आयामी संरचना के एक 2 आयामी प्रतिनिधित्व है, और संरचनाओं और कलाकृतियों के ओवरलैप ध्यान से व्याख्या की जानी चाहिए । इसके अलावा, रेडियोग्राफिक मंत्रिमंडल में हड्डियों की स्थिति के अनुरूप होना चाहिए ।

सकारात्मक पिक्सल की संख्या की गिनती के माध्यम से सेलुलर ठहराव एक सेल में ऊतकीय ठहराव के लिए एक कुशल तरीका है, ऐसे एमसीसी के रूप में संपंन क्षेत्र है, लेकिन इस दृष्टिकोण की सीमा है कि यह कोशिकाओं की सटीक संख्या प्रदान नहीं करता है । इसके अलावा, के बाद से यह केवल चयनित पिक्सल quantifies, यह एक ही "नमूना" पिक्सेल का उपयोग विभिंन तीव्रता के पिक्सल के ठहराव से बचने के लिए जब विभिंन छवियों का विश्लेषण करने के लिए ब्याज की सभी छवियों को मात्रा देने की सिफारिश की है ।

सलाह का एक सामान्य टुकड़ा जब ऊतकीय वर्गों को बढ़ाता है प्रत्येक नमूने के कई धारावाहिक वर्गों का विश्लेषण करने के लिए है (इस पांडुलिपि में, तीन धारावाहिक वर्गों प्रत्येक condyle के लिए विश्लेषण किया गया था), के बाद से प्रत्येक नमूने के भीतर रूपांतरों आमतौर पर मनाया जाता है.

हमारे प्रयोगों में उल्लेख किया पद्धति सरल, प्रयोग करने में आसान है, और किसी भी खनिज ऊतक अध्ययन में रिपोर्टर चूहों इस्तेमाल किया जा रहा है में इस्तेमाल किया जा सकता है. मौजूदा पद्धति के साथ, यह संभव है कि कोशिकाओं के सह-स्थानीयकरण visualizing द्वारा जाल (Col2a1 या Col10a1) या EdU (Col1a1 या Col2a1) के लिए दाग रहे हैं कक्षों की कल्पना करने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों की कोई होड़ वित्तीय हितों की नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक कृपया ऊतकीय सहायता के लिए ट्रांसजेनिक चूहों और ली चेन प्रदान करने के लिए डॉ डेविड रोवे शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

इस प्रकाशन में दी गई रिसर्च को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ डेंटल एंड Craniofacial रिसर्च ऑफ हेल्थ के राष्ट्रीय संस्थान अवार्ड नंबर K08DE025914 के तहत और अमेरिकन एसोसिएशन ऑफ Orthodontic फाउंडेशन द्वारा सुमित यादव को सपोर्ट किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

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References

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