Um método de análise celular para o côndilo Mandibular murino e morfométricas

Biology

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Summary

Este manuscrito apresenta métodos para a Análise morfométrica e as mudanças celulares dentro do côndilo mandibular de roedores.

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Dutra, E. H., O'Brien, M. H., Lima, A., Nanda, R., Yadav, S. A Morphometric and Cellular Analysis Method for the Murine Mandibular Condyle. J. Vis. Exp. (131), e55998, doi:10.3791/55998 (2018).

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Abstract

Articulação temporomandibular (ATM) tem a capacidade de adaptação a estímulos externos, e carregar as alterações pode afetar a posição dos côndilos, bem como os componentes estruturais e celulares da cartilagem condilar mandibular (MCC). Este manuscrito descreve métodos para analisar estas mudanças e um método para alterar o carregamento da TMJ em camundongos (i.e., à compressão estática TMJ carregando). A avaliação estrutural ilustrada aqui é uma abordagem simples morfométricos que usa o software Digimizer e é executada em radiografias de ossos pequenos. Além disso, a análise de celulares muda levando a alterações na expressão do colágeno, a remodelação óssea, a divisão celular, e proteoglycan distribuição no MCC é descrita. A quantificação dessas mudanças em cortes histológicos - contando os pixels fluorescentes positivos usando imagem de software e o mapeamento de distância de medição e manchado área com Digimizer - também é demonstrado. Os métodos mostrados aqui não são limitados a TMJ murino, mas podem ser usados em ossos adicionais de pequenos animais experimentais e em outras regiões de ossificação endocondral.

Introduction

A TMJ é uma articulação de carga exclusiva localizada na região craniofacial e é formada de fibrocartilagem. O MCC da TMJ é essencial para a função da articulação, incluindo o movimento da mandíbula sem impedimentos ao falar e mastigar, mas geralmente é afetado por doenças degenerativas, incluindo osteoartrite1. A TMJ tem a capacidade de adaptação a estímulos externos e alterações de carga, levando a alterações estruturais e celulares para os componentes do MCC2,3,4,5. As propriedades de carga do MCC podem ser explicadas pelas interações entre seus componentes, incluindo a água, a rede de colágeno e densamente proteoglicanos. O MCC tem quatro zonas distintas de celulares que expressam diferentes tipos de proteínas de colágeno e não-colágeno: 1) a zona superficial ou articular; 2) a zona proliferativa, composta de células mesenquimais indiferenciadas e que responde ao carregar as demandas; 3) a zona de prehypertrophic, composto de condrócitos maduros expressando colágeno tipo 2; e 4) a hipertrófica de zona, a região onde os condrócitos hipertróficas expressando colágeno tipo 10 morrer e sofrer calcificação. A região não-mineralizado é rica em proteoglicanos que proporcionam resistência a forças compressivas6.

Há contínua mineralização na zona hipertrófica do MCC, onde ocorre a transição da condrogênese a osteogênese, garantindo a robusta estrutura mineral do osso subcondral do côndilo mandibular7. As mudanças celulares em regiões não mineralizadas e mineralizadas, finalmente, levam a alterações morfológicas e estruturais no côndilo mandibular e maxilar inferior. Manutenção da homeostase de todas as regiões celulares do MCC e a mineralização da parte subcondral são essenciais para a saúde, capacidade load-bearing e integridade da TMJ.

O modelo de rato transgénico colágeno múltipla (como descrito por Utreja et al) 8 é uma ótima ferramenta para usar para entender mudanças na expressão do colágeno, porque todos os transgenes são expressas em MCC. Para uma avaliação aprofundada e histológica, manchas histológicas são utilizadas para estudar a deposição de matriz, mineralização, proliferação celular, apoptose, e expressão de proteínas para as camadas de células diferentes do MCC.

Neste manuscrito, histológico e análises morfométricas são usadas para avaliar as alterações estruturais e celulares no MCC e subcondral osso do côndilo mandibular de ratos. Além disso, um método de quantificação de célula, para a análise de imagens histológicas fluorescentes e para mapear as corrediças do microscópio de luz, é descrito. A TMJ estática à compressão carregando o método, que provoca alterações celulares e morfológicas na MCC e subcondral osso9, também é ilustrada para validar nossos métodos.

Os métodos descritos aqui podem ser usados para determinar morfométricos e as alterações histológicas no côndilo mandibular e maxilar inferior de roedores ou para analisar outras regiões de ossificação endocondral e a morfologia dos tecidos mineralizados adicionais.

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Protocol

Comitê institucional cuidados de animais do centro de saúde da Universidade de Connecticut aprovou todos os procedimentos de animais.

1. compressão estática TMJ carregamento: Boca forçada a abrir

Nota: Ratos transgénicos quatro semanas de idade, abrigando fluorescentes repórteres para colágeno (Col2a1XCol10a1), gentilmente cedidos pelo Dr. David Rowe (Universidade de Connecticut), foram utilizados para os experimentos descritos neste manuscrito (n = 8; 4 machos e 4 fêmeas). O transgene de Col2a1 ciano (azul) é expressa em células na zona prehypertrophic do MCC, enquanto o Col10a1 cereja (vermelhas) células estão presentes na região hipertrófica8 (Figura 1). Os ratos foram igualmente divididos em dois grupos: grupo 1) do carregado, onde os ratos foram submetidos a compressiva TMJ estática de carga (descrito no passo 2) e 2) o grupo de controle, onde os ratos não receberam nenhuma intervenção.

Figure 1
Figura 1. Representante sagital do côndilo do mouse duplo-colágeno repórter fluorescentes (Col2a1XCol10a1). Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Fabrica molas usingbeta arcos de liga de titânio (0,017 x 0.025 in)(Figura 2).
  2. Anestesia os animais experimentais por uma injeção intraperitoneal de uma mistura de cetamina (90 mg/kg de peso) e xilazina (13 mg/kg de peso corporal).
  3. Delicadamente, abra a boca dos ratos e inserir as molas, os loops de engajar-se nos incisivos maxilares e mandibulares (Figura 2B e C).
  4. Induzi o carregamento de TMJ estático à compressão, mantendo as molas nos incisivos de ratos anestesiados por 1 h. Repita este procedimento para 5 dias.
  5. Injete os ratos com 5-ethnyl-2'-desoxiuridina (EdU; 30 mg/kg de peso corporal) intraperitonealmente para análise de proliferação celular 2 dias e 1 dia antes da eutanásia.

Figure 2
Figura 2. Compressiva carregamento estático de TMJ: forçada de boca aberto modelo. (A) mola fabricada de 0,017 x 0.025 arco de liga de titânio beta. (B) rato carregado com mola. (C) radiografia do carregado e ratos controle, mostrando diferenças no posicionamento da mandíbula. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. fixação e dissecação de mandíbula

  1. No ponto de extremidade dos procedimentos forçado-abrir boca, eutanásia em animais experimentais por um método aprovado.
  2. Disse as mandíbulas cortando a fixação muscular sem raspagem da cartilagem do côndilo.
  3. Coloque as mandíbulas limpas em formol a 10% por 24 h para fixação.
    Atenção: O formol é um irritante; Use equipamento de protecção adequado.

3. imagem latente e medidas morfométricas de raio-x

  1. Coloque as mandíbulas num recipiente plano (por exemplo, por 55 x 16 mm placa de Petri) e tirar radiografias das amostras usando um sistema de raio-x do armário em um 26 kV para 5 s.
    Nota: Coloque uma barra de escala antes de salvar as imagens.
  2. Executar medidas morfométricas as mandíbulas usando um software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: Antes de realizar qualquer medição, use a barra de escala da radiografia para determinar a unidade. Esta etapa é importante medir adequadamente as estruturas anatômicas. Clique no botão de "Unidade"(Figura 3).
  3. Selecione os pontos anatômicos usando o "estilo de marcador 2" no software da imagem latente (Figura 3B). Para seguir o método descrito neste documento, selecione os seguintes pontos (Figura 3B):
    1. Selecione o condylion (ponto 1), o ponto mais posterior do côndilo mandibular;
    2. Selecione o processo incisivo (ponto 2);
    3. Selecione o ponto mais profundo no entalhe sigmoide (ponto 3);
    4. Selecione o ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular (ponto 4);
    5. Selecione o ponto mais anterior da superfície articular condilar (ponto 5); e
    6. Selecione o ponto mais posterior da superfície articular condilar (ponto 6).
  4. Depois de selecionar os pontos anatômicos, executar medidas morfométricas, usando a ferramenta de "comprimento", mas para o comprimento da cabeça do côndilo, use a ferramenta "linha perpendicular" de pontos (3) e (4) (Figura 3C).
    1. Medir o comprimento mandibular, desde o condylion (1) para o processo de incisivo (2).
    2. Medir o comprimento da cabeça côndilo - a distância perpendicular da condylion (1) a uma linha traçada a partir do ponto mais profundo no entalhe sigmoide (3) para o ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular (4).
    3. Medir a largura da cabeça de côndilo - a distância entre a maioria anterior o ponto mais posterior da superfície articular condilar (5-6).
    4. Copie as medições da lista"medição" do lado direito da tela (Figura 3C).

Figure 3
Figura 3 . Representação de medidas morfométricas da mandíbula. (A) Use a barra de escala da radiografia para determinar a unidade (circulado em vermelho, barra de escala: 10 mm). (B) selecione os pontos anatômicos usando o "estilo de marcador 2" (circulado em vermelho). 1) Condylion; 2) processo incisivo; 3) ponto mais profundo no entalhe sigmoide; 4) ponto mais profundo na concavidade do ramo mandibular; 5) a maioria dos ponto anterior da superfície articular condilar; 6) ponto mais posterior da superfície articular condilar. Barra de escala: 10 mm.(C) realizar medições com o "comprimento" e "perpendiculares" ferramentas (circuladas em vermelho). Medições do ponto 1 e 2: comprimento mandibular; do ponto 5 e 6: largura condilar; perpendicular do ponto 1 ao 4 - 3: comprimento da cabeça condilar. Salvar as medições na "lista de medição". Barra de escala = 10 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

4. côndilo incorporação

Nota: Depois de tomar as imagens radiográficas, as mandíbulas podem ser incorporadas e seccionadas para análise histológica.

  1. Coloque suas mandíbulas undecalcified (que foram corrigidas no passo 2.3) em 30% de sacarose em PBS durante a noite antes da incorporação.
  2. Dissecar qualquer excesso de tecido mole e corte com cuidado o côndilo mandibular.
  3. Despeje a resina encastre (suficiente para cobrir a amostra) em moldes de plástico descartável e coloque a face medial do côndilo contra a base do molde, posicionamento da amostra paralela à parte inferior do molde.
  4. Fixe a amostra no lugar correto com um pedaço de gelo seco.
  5. Encher o molde com incorporação de resina e coloque o molde com amostra fixa no frio 2-metil-butano, que pode ser pre-refrigerados em um congelador-20 ° C ou -80 ° C ou em gelo seco.
  6. Armazene as amostras a-20 º C ou a-80 ° C até seccionamento.

5. côndilo corte sagital e preparação de Slide

  1. Criar seções sagitais congeladas dos côndilos (5-7 µm) e transferir as amostras para o slide usando o método de transferência do fita10,11.
  2. Aderir os transferiu para a fita usando o método UV-curable10cortes histológicos.

6. histológica coloração e imagem microscópica

Nota: A maioria da coloração histológica é executada conforme descrito na seção histológica do papel por Dyment et al.10.

  1. Para a digitalização da linha de base, o primeiro passo é a imagem de Col2a1 e Col10a1 transgenes, conforme descrito por Dyment et al.10 .
    1. Coloque as lamelas em cima dos slides em 30% de glicerol e PBS. Execute o microscópio fluorescente da ofthesectionswitha da linha de base de imagem e filtros adequados.
  2. Execute a coloração da fosfatase ácida tartarato-resistente fluorescente (armadilha).
    Nota: A armadilha é expresso pelas células hematopoiéticas, incluindo o osso resorbing células, osteoclastos12. O propósito desta mancha é analisar o MCC e remodelação de osso subcondral.
    1. Remova a lamela dos slides mergulhando-os em PBS. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
    2. Prepare o buffer de armadilha 1 pela dissolução de acetato de sódio anidro (9,2 g) e sódio L-tartarato dibásico dihidratado (11,4 g) em 1 litro de água destilada. Ajustar o pH a 4.2 com ácido acético e armazenar buffer armadilha 1 a 4 ° C.
    3. Prepare o tampão de armadilha 2 dissolvendo-se recentemente de nitrito de sódio (40mg) em 1 mL de água destilada.
    4. Prepare o tampão de substrato de armadilha (antes de coloração) misturando-se 7,5 mL de tampão 1 e 150 µ l de tampão de 2. Aplica esta solução (200 µ l) de cada slide para 10 min à temperatura ambiente.
    5. Preparar o amortecedor da reação armadilha misturando 1,840 mL de tampão de substrato e 23 µ l de substrato fluorescente (ver a Tabela de materiais).
      Nota: O substrategeneratesayellowfluorescentsignal fluorescente para atividade de armadilha.
    6. Retire o tampão de substrato de armadilha excesso pipetando suavemente a solução.
    7. Incube as lâminas com 200 µ l de tampão de reação armadilha para 5 min sob luz negra UV fonte bulbo.
    8. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
    9. Coloque as lamelas nos slides em 30% de glicerol em PBS e executar imagens microscópicas10.
  3. Execute a coloracao de proliferação celular.
    Nota: Neste ensaio, a timidina modificados analógico 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU) incorporado ao DNA recém sintetizado: Divisão de células são rotuladas com um corante fluorescente.
    1. Depois da imagem latente para a armadilha, remover as lamelas e lavar os slides em PBS, três vezes por 5 min cada. Siga os passos do kit de proliferação celular 5-ethynyl-2'-desoxiuridina manchar os cortes histológicos.
    2. Preparar uma reação cocktail adicionando 430 µ l de 1 X 20 µ l de CuSO4amortecedor da reação, 1,2 μL de tintura fluorescente e 50 µ l de 1 X buffer aditivo (um volume total de 500 µ l é suficientes para um slide).
      Nota: O fabricante recomenda adicionando os ingredientes na ordem descrita aqui.
    3. Incube os slides com os coquetéis preparados por 30 min à temperatura ambiente, protegida da luz.
    4. Lave as lâminas em PBS três vezes por 5 min cada.
    5. Coloque as lamelas em cima dos slides em 30% de glicerol em PBS com 1:1,000 DAPI.
      Nota: DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) é uma mancha nuclear fluorescente azul que vincula a regiões de AT-rico em DNA.
  4. Execute a coloração azul de toluidina (TB).
    Nota: TB coloração revela a distribuição proteoglycan no MCC.
    1. Enxágue o indistilledwater de slides para remover as lamelas.
    2. Depois de retirar as lamelas, lave as lâminas em água destilada três vezes por 5 min cada para remover completamente os sais da PBS.
    3. Preparar o tampão de trabalho TB, tornando a solução (dissolver 28,4 g de fosfato de sódio dibásico em 1 litro de água destilada) e solução B (dissolver 27,6 g de fosfato de sódio monobásico em 1 litro de água destilada). Mix 94,7 mL da solução A com 5,3 mL de solução B. dilua esta solução 1:1 em água destilada para fazer 200 mL de 0,1 M de tampão a trabalhar. Corrigi o pH para 8,0 pela adição de hidróxido de sódio até que o pH é fixo.
    4. Prepare-se 1% das ações TB: misturar 1 g de TB em 100 mL de água destilada.
    5. Prepare a solução de trabalho TB misturando 40 mL de tampão de trabalho 0,1 M em 3 mL de 1% das ações TB.
    6. Incube as lâminas na solução trabalho TB para s 14-17.
      Nota: Esta mancha é tempo muito sensível; o tempo de incubação pode precisar de ser ajustado para evitar a overstaining.
    7. Lave as lâminas em água destilada três vezes por 5 min cada.
    8. Lugar de lamelas em cima dos slides em glicerol 30% em água destilada. Execute o microscópio óptico de imagem10.
      Nota: Fazer não lamela as lâminas coradas por TB em glicerol + PBS. PBS lava para fora este tipo de mancha.

7. fluorescente quantificação histológica

  1. Realizar quantificação histológica de imagens fluorescentes usando um software de análise de imagem (consulte a Tabela de materiais).
    Nota: O princípio básico da quantificação histológica neste método é dividir o número de pixels fluorescentes de interesse pelo número total de pixels da área de interesse e multiplique o número obtido por 100, resultando em um percentual de positivos pixels dentro dessa região.
  2. Realize a quantificação da expressão de Col10a1 o MCC de secções sagitais dos côndilos.
    1. Quando quantificar todos os tipos de células e manchas usando esse método, selecione a área a ser quantificada. Abra as imagens histológicas em um software de análise de imagem e selecione a área usando o "Lasso Tool (L)"(Figura 4). Para a análise descrita aqui, selecione a região do MCC Depois de selecionar a área, o número total de pixels será mostrado na caixa "Histograma" na tela do software(Figura 4). Salve o número de pixels na área de interesse.
    2. Selecione os pixels Col10a1 vermelho usando a ferramenta de amostragem. Clique em "Select" no painel superior e em seguida "Gama de cores". Clique na "ferramenta conta-gotas," Selecione a amostra de cor para o pixel de interesse na imagem e clique em "Okey". Todas as áreas de positivas para a cor do pixel escolhido será selecionado (Figura 4B). Copie o número de pixels fluorescentes (mostrado na caixa "Histograma" da tela) e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
    3. Dividir o número de pixels fluorescentes sobre o número de pixels da área de interesse e multiplique esse número por 100: pixéis fluorescentes / pixels na área de interesse * 100.
      Nota: Outro tipo de células, tais como Col2a1 azul, pode ser quantificado com esse mesmo método, mas os pixels azuis devem ser selecionados em vez dos pixels Col10a1 vermelho.

Figure 4
Figura 4 . Representação do transgene Col10a1 quantificação. (A) selecione a área de interesse com o "Lasso Tool" (L). Para as células Col10a1-positivo, selecione a cartilagem mandibular todo. Salve o número de pixels na caixa "histograma". (B) selecione o pixel de interesse, neste caso, o vermelho fluorescente Col10a1 pixels. Observe que apenas os pixels vermelhos dentro da área de interesse serão selecionados. Salve o número de pixels vermelhos da caixa "histograma". Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Realize a quantificação da atividade de armadilha no MCC e subcondral osso.
    1. Siga o procedimento descrito no passo 8.2, mas em vez de apenas selecionar a área MCC, selecione as regiões de osso de cartilagem e subcondral (Figura 5A).
    2. Para a análise da atividade de armadilha, selecionar os pixels amarelos gerados pelo substrato ELF97, conforme descrito na etapa 8.2.2 (Figura 5B); Copie o número de pixels positivos; e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
    3. Obter a percentagem de pixels armadilha-positivo dividindo o número de pixels amarelos pelo número total de pixels na região do osso subcondral e multiplicando por 100.

Figure 5
Figura 5 . Representação de quantificação de armadilha fluorescente. (A) selecione a área de interesse (osso mandibular de cartilagem e subcondral) e salvar o número de pixels da região. (B) selecione os pixels fluorescentes amarelos, que representa a atividade de armadilha. Observe que somente de armadilha-positivo pixels serão selecionados. Salve o número de pixels selecionados. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Realize a quantificação de células EdU-positivo.
    1. EdU-manchado slides são counterstained com DAPI, então em vez de contar o número total de pixels na região de interesse, selecione pixels DAPI-positivo para calcular a porcentagem de pixels EdU-positivo. Selecione a área de interesse, conforme descrito na etapa 8,2, mas não salva o número total de pixels. Selecione o pixel DAPI azul como a amostra de cor, conforme descrito na etapa 8.2.2; Copie o número de pixels de DAPI-positivo (Figura 6A); e colá-los em uma planilha ou software estatístico para análise.
    2. Em seguida, selecionar os pixels de EdU-positivo (amarelos fluorescentes pixels) e salve o número de pixels na caixa "histograma" (Figura 6B).
    3. Calcule a percentagem de EdU pixels dividindo o número de pixels de EdU-positivo pelo número de pixels de DAPI-positivo e multiplicar o número obtido por 100.

Figure 6
Figura 6 . Representação de quantificação de EdU. (A) selecione a região proliferativa do MCC (a camada externa da cartilagem). Selecionar pixels DAPI-positivo e salvar o número de pixels. (B) selecionar pixels EdU-positivo (amarelo fluorescente) e salvar o número de pixels. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

8. quantificação da espessura da cartilagem e distribuição Proteoglycan

  1. Analise a espessura da cartilagem (mapeamento de distância) e a área manchada de azul de toluidina usando o software de imagem de Digimizer.
    Nota: Utilize a barra de escala da imagem histológica para determinar a unidade (Figura 7A).
  2. Realize uma medição de mapeamento de distância.
    Nota: A medida da distância mapeamento irá fornecer a espessura da cartilagem no côndilo mandibular. O método descrito aqui, são selecionadas cinco regiões do MCC, dando uma média da espessura total do MCC. O pesquisador pode optar por medir três regiões diferentes, ou mesmo uma única região no meio do MCC.
    1. Usando a ferramenta de "comprimento", medir o comprimento da cartilagem da superfície exterior à extremidade da toluidina manchadas de azul área (Figura 7-B) em cinco regiões, ou em locais como muitos como preferencial.
    2. Copie as medições de comprimento na "lista de medição".
      Nota: O software também oferece uma média das medições (Figura 7-B).
  3. Meça a área manchada de azul de toluidina.
    Nota: Na medição da área manchada de azul de toluidina, área proteoglycan no MCC será obtida.
    1. Selecione a ferramenta "área" e contorne a área manchada de azul de toluidina (Figura 7-C).
    2. Copie as medições de área na "lista de medição".

Figure 7
Figura 7 : Representação de quantificação de distribuição proteoglicano. (A) Use a barra de escala da imagem histológica para determinar a unidade clicando no botão "unidade" (circulado em vermelha, unidade selecionada: 500 µm). (B) medir a espessura da cartilagem em locais diferentes, usando a ferramenta de "comprimento" (circulada em vermelho). Salve as medições da lista"medição" no painel superior direito. O software também oferece "Estatísticas", no painel inferior direito, então a média e o SD das medições podem ser obtidos diretamente. (C) medir a área manchada de azul de toluidina, usando a ferramenta de "área" (circulada em vermelho). Círculo da área de interesse e salvar a medição na "lista de medição". Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Estatísticas descritivas foram realizadas para examinar a distribuição de medidas morfométricas (comprimento mandibular, condilar comprimento, largura condilar) e análise histológica. Os resultados foram comparados entre o grupo carregado (ou seja, ratos submetidos a carga compressiva com a mola de titânio beta) e grupo controle (ou seja, ratos de controle que não recebeu qualquer procedimento de correspondência). Diferenças estatisticamente significativas entre médias foram determinadas pelo teste t não pareado e um p-valor de < 0,05 foi considerado como estatisticamente significativo.

Medidas morfométricas, conforme descrito na etapa 4 e Figura 3, foram realizadas nas mandíbulas da carregado e grupos de controle. O grupo carregado apresentado com comprimento mandíbula significativamente aumentada (carregado: 16.62 ± 0,23 mm versus controle: 16.21 ± 0,2 mm; p < 0,05) e o comprimento da cabeça côndilo (carregado: 4,6 mm, SD 0,08 mm versus controle: 4,4 mm; SD 0,06; p < 0,05) em comparação com o grupo de controle. No entanto, não houve diferença significativa na largura do côndilo entre grupos (carregado: 3,06 ± 0,12 mm versus controle: 2,9 ± 0,11; p = 0,09).

Quantificação da distribuição do colágeno, usando o método descrito na etapa 8 revelada significativamente aumentada Col10a1 expressão em MCC dos côndilos do grupo carregado em comparação com o controle (carregado: 21% ± 4,46% vs. controle: 7,50% ± 2,03%; p < 0.005; Figura 8 A e D). Por outro lado, estatisticamente não houve diferença na expressão Col2a1 entre o carregado e grupos de controle (carregado: 4,85% ± 1,95% vs. controle: 2,92% ± 1.89%; p = 0,13; Figura 8 B e E). Além disso, a análise da atividade de armadilha mostrou aumentada regiões armadilha-positivo na região subcondral dos côndilos dos ratos carregados (carregado: 5,28% ± 1,45% vs. controle: 2,41% ± 1.39%; p < 0,05; Figura 8 C e F). Da mesma forma, observamos a proliferação celular aumentada, conforme indicado pelo aumentada células EdU-positivo em MCC do grupo carregado em comparação com os ratos controle (carregado: 6.23% ± 1.89% vs. controle: 1,90% ± 1,03%; p < 0,05; Figura 9 A e C).

Distribuição de proteoglycan no MCC de carregado e ratos controle foi quantificada, avaliando a área manchada de azul de toluidina e o mapa de distância, conforme descrito na etapa 9 e Figura 7. Encontramos o mapeamento de distância significativamente aumentada no MCC de côndilos do grupo carregado em comparação com o controle (carregado: 210.22 µm ± 4,11 µm versus controle: 187.36 µm ± 8,64 µm; p < 0.005; Figura 9 B e D). No entanto, a área manchada de proteoglycan não foi estatisticamente diferente entre o carregado e grupos de controle (carregado: 203,897.93 µm2 ± 10,171.00 µm2 versus controle: 202,875.09 µm2 ± 33,419.09 µm2; p = 0,94; Figura 9 B e E)

Figure 8
Figura 8 : Resultados representativos: (A) células de Col10a1-positivo nas seções sagitais do MCC de côndilos do controle e carregado de ratos. Existem números aumentados de células Col10a1-positivo no grupo carregada (D). (B) células de Col2a1 positivo no controle e carregado de ratos. Não há nenhuma diferença nas células Col2a1 positivo entre os grupos (E). (C) armadilha de coloração nos côndilos do controle e carregado de ratos. Aumento da atividade armadilha no grupo carregado em comparação com o controle (F). Os histogramas (D-F) representam os meios ± SD para n = 4 por grupo. * * Significativa diferença entre os grupos carregados (p < 0.005) e controle. Barra de escala = 200µm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9:resultados representativos: (A) EdU mancha nos côndilos do controle e carregado de ratos. Proliferação celular aumentada no grupo carregado, conforme representado pela EdU-positivo aumento células (C). Toluidina (B) azul de coloração nos côndilos do controle e carregado de ratos. Aumento da espessura da cartilagem nos ratos carregados, conforme mostrado pelo mapeamento de maior distância no grupo experimental (D). Nenhuma diferença na área manchada proteoglycan entre o controle e carregado de grupos (E). Histogramas (C-E) representam os meios ± SD para n = 4 por grupo. * * Significativa diferença entre os grupos carregados (p < 0.005) e controle. Barra de escala = 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Este manuscrito descreve métodos para a medição de morfometria e análise celular dos côndilos mandibulares murino e mandíbulas. As medições radiográficas morfométricas também podem ser usadas para analisar outros ossos de pequenos animais experimentais. Além disso, a análise celular (célula quantificação e mapeamento de distância de cartilagem) não estão limitada a do côndilo mandibular roedor, mas pode ser usado para quantificar a cortes histológicos de tecidos diversos.

Modelos de rato transgênicas expressando fluorescentes repórteres são excelentes ferramentas para entender visualmente mudanças na expressão gênica. O modelo do rato de repórter fluorescente duplo-colágeno (Col2a1XCol10a1) usado neste relatório foi especialmente adequado para o estudo da MCC, desde que os transgenes são expressos na região prehypertrophic e hipertrófica do MCC, então essa distribuição de colágeno poderia ser avaliada. Se o pesquisador não tem acesso a um modelo de mouse transgênicas expressando fluorescentes repórteres, outros métodos de análise de expressão de proteínas histológica, tais como a imunofluorescência, podem ser usados.

Para as medidas morfométricas, o passo fundamental antes de tomar as imagens de radiografia do armário é remover todos os tecidos moles da mandíbula ou dos ossos para ser analisado. Muscular excessiva ou tecidos moles anexado aos ossos podem mascarar as medições reais das estruturas. É importante estar ciente das limitações do sistema de radiografia do armário. Como todos os raios-x, é uma representação 2-dimensional de uma estrutura de 3-dimensional e sobreposição de estruturas e artefatos deve ser interpretada com cuidado. Além disso, o posicionamento dos ossos no armário radiográfico deve ser coerente.

A quantificação celular por meio da contagem do número de pixels positivas é um método eficiente para quantificação histológico em uma região rica em celulares como o MCC, mas a limitação dessa abordagem é que ele não fornece o número exacto de células. Além disso, desde que quantifica apenas os pixels selecionados, recomenda-se quantificar todas as imagens de interesse usando o mesmo pixel "amostrado" para evitar a quantificação de pixels de diferentes intensidades, quando analisando imagens diferentes.

Um general Conselho quando quantificar histológicos é analisar várias seções seriais de cada amostra (Neste manuscrito, três seções seriais foram analisadas para cada côndilo), desde que as variações dentro de cada amostra são geralmente observadas.

A metodologia mencionada em nossos experimentos é simples, fácil de usar e pode ser usada em qualquer estudo de tecido mineralizado na qual repórter ratos estão sendo usados. Com a metodologia existente, é possível visualizar as células que estão manchadas para armadilha (Col2a1 ou Col10a1) ou EdU (Col1a1 ou Col2a1) visualizando a localização co de células.

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Disclosures

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Os autores gostaria de agradecer Dr. David Rowe para gentilmente fornecer os ratos transgénicos e Li Chen pela assistência histológica.

A pesquisa reportada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Dental & pesquisa Craniofacial do institutos nacionais da saúde sob prêmio número K08DE025914 e pela Associação Americana de fundação ortodôntico para Sumit Yadav.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MX20 Radiography System Faxitron X-Ray LLC 
Digimizer Image software  MedCalc Software
Shandon Cryomatrix embedding resin Thermo Scientific 6769006
Manual microscope Axio Imager Z1 Carl Zeiss 208562
yellow fluorescent protein filter  - EYFP Chroma Technology Corp 49003
cyan fluorescent protein filter - ECFP Chroma Technology Corp 49001
red fluoresecent protein filter - Cy5 Chroma Technology Corp 49009
sodium acetate anhydrous Sigma-Aldrich S2889
sodium L-tartrate dibasic dihydrate  Sigma-Aldrich 228729
sodium nitrite  Sigma-Aldrich 237213
ELF97 substrate Thermo Fisher Scientific E6600
ClickiT EdU Alexa Fluor 594 HCS kit Life Technologies C10339  includes EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) 
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Scientific D1306
Sodium phosphate dibasic  Sigma-Aldrich S3264
Sodium phosphate monobasic  Sigma-Aldrich 71505
Toluidine Blue O  Sigma-Aldrich T3260
Adobe Photoshop  Adobe Systems Incorporated
Phosphate buffered saline tablets (PBS) Research Products International P32080-100T
CNA Beta III Nickel-Free Archwire Ortho Organizers, Inc.
GraphPad Prism  GraphPad Software, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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