डीएनए घावों पर प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और कैनेटीक्स का अध्ययन करने के लिए उन्नत फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक

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Biology

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Summary

लेजर microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है । विभिन्न डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए UVA पराबैंगनीकिरण के उपयोग के लिए एक methodological दृष्टिकोण दिखाया गया है । हम स्थानीय microirradiation है कि सामांय कोशिका चक्र का कहना है के लिए एक विधि अनुकूलित है; इस प्रकार विकिरणित कोशिकाएँ बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ती हैं.

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Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

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Abstract

पराबैंगनीकिरण के साथ स्थानीय microirradiation जीवित कोशिकाओं में डीएनए की मरंमत से संबंधित प्रक्रियाओं के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । यहाँ, हम समय पर डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स का विश्लेषण करने के लिए एक methodological दृष्टिकोण का वर्णन या स्थानीय रूप से microirradiated क्रोमेटिन पर प्रोटीन प्रोटीन बातचीत. हम यह भी बताते है कि कोशिका चक्र के व्यक्तिगत चरणों को पहचानने के लिए Fucci सेलुलर प्रणाली का उपयोग कर कोशिका चक्र पर निर्भर प्रोटीन कैनेटीक्स डीएनए घावों पर अध्ययन करने के लिए । डीएनए क्षति के विभिंन प्रकारों को प्रेरित करने के लिए दो यूवी पराबैंगनीकिरण (३५५ एनएम और ४०५ एनएम) के उपयोग का एक methodological वर्णन भी प्रस्तुत किया है । केवल ४०५-एनएम डायोड लेजर द्वारा microirradiated कोशिकाओं का बँटवारा सामान्य रूप से आगे बढ़ गया और cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) से रहित थे. हम यह भी बताएंगे कि कैसे microirradiated कोशिकाओं ब्याज की अंतर्जात प्रोटीन के immunodetection प्रदर्शन करने के लिए एक निश्चित समय बिंदु पर तय किया जा सकता है । डीएनए की मरंमत के अध्ययन के लिए, हम इसके अतिरिक्त FRAP (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली) और FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) के साथ कोशिकाओं में सहज होने वाली डीएनए क्षति घावों सहित भौतिक तरीकों के उपयोग का वर्णन । हम प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन के प्रायोगिक अध्ययनों में FLIM-झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण) का एक आवेदन भी दिखाते हैं.

Introduction

डीएनए क्षति डीएनए cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs), 8-oxo-7, 8-dihydro-2'-deoxyguanosine, और एकल-किनारा या डबल-कतरा टूटता है1,2से मिलकर घावों की उपस्थिति की ओर जाता है । γ-किरणों उच्चतम ऊर्जा और उच्च penetrance के साथ विकिरण का रूप है, इस प्रकार विकिरण के इस स्रोत व्यापक रूप से रेडियोथेरेपी3में प्रयोग किया जाता है । दूसरी ओर, प्रयोग प्रेरित डीएनए यूवी लेजर की वजह से नुकसान यूवी प्रकाश के लिए प्राकृतिक जोखिम की नकल । UVA microirradiation, एक सूक्ष्म विधि के रूप में, व्यक्तिगत जीवन की कोशिकाओं में डीएनए क्षति का अध्ययन करने के लिए एक प्रयोगात्मक उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है । Microirradiation पहली बार के लिए इस्तेमाल किया गया था ४० साल पहले के लिए गुणसूत्र क्षेत्रों4,5के संगठन प्रकट करने के लिए । यह तकनीक या तो फोकल सूक्ष्मदर्शी के कार्यात्मक गुणों या आधुनिक nanoscopy की तकनीकी सीमाओं पर अत्यधिक निर्भर है । डीएनए घावों को प्रेरित करने के लिए, कोशिकाओं 5 ' bromodeoxyuridine (BrdU) या Hoechst ३३३४२ से पहले यूवी विकिरण के लिए संवेदनशील हो सकता है । Bártová एट अल. 6 पहले से संवेदनशीलता कदम वर्णित है, और हाल ही में हम इस microirradiation तकनीक अनुकूलित क्रम में कोशिका मृत्यु, या apoptosis से बचने के लिए । उदाहरण के लिए, एक ४०५-एनएम यूवी लेजर के उपयोग (Hoechst ३३३४२ अधिकता के बिना) 53BP1 की प्रेरण-सकारात्मक डबल-किनारा टूटता है (DSBs) cyclobutane न्यूक्लियोटाइड dimers (CPDs) की कीमत पर होता है । दूसरी ओर, संवेदनशील यूवी microirradiation के साथ संयुक्त कदम CPDs और DSBs एक साथ7,8के बहुत उच्च स्तर प्रेरित । यह पद्धति एक भी डीएनए की मरंमत मार्ग के अध्ययन के लिए लागू करने के लिए मुश्किल है ।

microirradiation के साथ, यह प्रोटीन भर्ती का विश्लेषण करने के लिए संभव है, कैनेटीक्स, और जीवित कोशिकाओं में डीएनए घावों पर बातचीत. इस विधि का एक उदाहरण Luijsterburg एट अल द्वारा प्रकाशित किया गया था । 9 heterochromatin प्रोटीन 1β के लिए, और हम हाल ही में पहली बार के लिए पता चला है कि pluripotency कारक Oct4 और एक प्रोटीन Cajal निकायों के साथ जुड़े, coilin, यूवी प्रेरित डीएनए घावों के लिए भर्ती कर रहे हैं6,10. इन डीएनए घावों पर प्रोटीन कैनेटीक्स भी FRAP का उपयोग कर अध्ययन किया जा सकता है (Photobleaching के बाद प्रतिदीप्ति वसूली)11,12,13 या झल्लाहट (प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण) तकनीक14 ,15. इन तरीकों को डीएनए घावों या प्रोटीन प्रोटीन बातचीत में प्रोटीन का सरल प्रसार प्रकट करने की क्षमता है । प्रोटीन के अतिरिक्त लक्षण वर्णन के लिए एक उपयोगी उपकरण FLIM (प्रतिदीप्ति लाइफटाइम इमेजिंग माइक्रोस्कोपी) या झल्लाहट प्रौद्योगिकी के साथ इसके संयोजन (झल्लाहट-FLIM)16है । इन तरीकों कि छुरा या क्षणिक एक फ्लोरोसेंट अणु17द्वारा टैग ब्याज की प्रोटीन व्यक्त कर रहे है जीवित कोशिकाओं में प्रक्रियाओं के अध्ययन में सक्षम । यहां, GFP के लिए घातीय क्षय समय (τ) का एक उदाहरण-टैग p53 प्रोटीन और उसके संपर्क साथी, mCherry-टैग 53BP1, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा रहा है18,19 दिखाया गया है । पैरामीटर τ, FLIM गणना द्वारा प्रदान की fluorochrome के जीवनकाल, एक दिया प्रतिदीप्ति डाई के लिए विशिष्ट है, अपनी बाध्यकारी क्षमताओं, और अपने सेलुलर वातावरण. इसलिए, इस विधि हमें प्रोटीन उपआबादी के बीच भेद दिखा सकते हैं, उनकी बाध्यकारी क्षमता, और उनके कार्यात्मक गुण के बाद, उदाहरण के लिए, डीएनए क्षति ।

यहां, उंनत माइक्रोस्कोपी तकनीक है कि हमारी प्रयोगशाला में प्रयोग किया जाता है के methodological दृष्टिकोण की एक रूपरेखा समय विशिष्ट प्रोटीन भर्ती, कैनेटीक्स, प्रसार, और microirradiated क्रोमेटिन के स्थल पर प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए प्रस्तुत है । जीवित कोशिकाओं में स्थानीय डीएनए घावों की प्रेरण के लिए कदम दर कदम पद्धति है, और डीएनए के अध्ययन के लिए उपयोगी तरीके का वर्णन-नुकसान-स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए यूवी पराबैंगनीकिरण की वजह से घावों पर घटनाओं से संबंधित प्रदान की जाती हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. सेल लाइंस की खेती

  1. हेला-व्युत्पन्न सेल लाइंस
    नोट: हेला ग्रीवा कार्सिनोमा कोशिकाओं का उपयोग करें: या तो हेला कोशिकाओं छुरा citrullinated H2B के साथ टैग की गईं GFP या हेला-Fucci एक्सप्रेस आरएफपी-Cdt1 कोशिकाओं को व्यक्त G1 और जल्दी s चरणों में और s/G2-M चरणों में GFP-geminin (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ). सभी हेला-व्युत्पन्न कोशिका रेखाओं की खेती के लिए
    1. , उपयोग Dulbecco & #39; s संशोधित ईगल & #39; एस मध्यम (DMEM) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और उपयुक्त एंटीबायोटिक्स के साथ पूरक ३७ & #176; ग एक humidified वातावरण में 5% सह 2 युक्त. प्रति सप्ताह मध्यम 2-3 बार बदलें ।
    2. संस्कृति मध्यम निकालें, और trypsin अवरोधक शामिल है कि सीरम के सभी निशान को खत्म करने के लिए 1x & #160;P बी एस का उपयोग कर कोशिकाओं कुल्ला. कमरे के तापमान पर एक खतरा डाकू में इस कदम प्रदर्शन ।
    3. सेल परत को कवर करने के लिए गरम Trypsin-EDTA समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और कक्ष परत (आमतौर पर 3-5 मिनट) फैलाया है जब तक कोशिकाओं ३७ & #176; C. Trypsinize कोशिकाओं पर रखें ।
    4. Trypsin-EDTA को निष्क्रिय करने के लिए गरम पूर्ण विकास माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें, और कई बार धीरे pipetting द्वारा मध्यम फैलाने ।
      नोट: संदूषणों से ऑपरेटर की रक्षा के लिए और इष्टतम सेल खेती की स्थिति बनाए रखने के लिए यह प्रक्रिया एक बहुत ही खतरा डाकू में किया जाना चाहिए ।
    5. किसी स्वचालित कक्ष काउंटर या B & #252; rker कक्ष का उपयोग करके
    6. गणना कक्ष । सेल सस्पेंशन को 1 & #215 पतला करना; 10 5 कोशिकाओं/एमएल और प्लास्टिक 5 एमएल एक नई डिश में । ३७ पर गर्मी कोशिकाओं & #176; ग र 5% सह 2 .
  2. की खेती माउस भ्रूण स्टेम सेल (mESCs), D3 सेल लाइन
    1. संस्कृति mESCs पर सेल संस्कृति बर्तन ०.२% जिलेटिन और mESC रखरखाव माध्यम के साथ लेपित । ३७ पर गर्मी कोशिकाओं & #176; ग र 5% सह 2 .
      नोट: ५० मिलीलीटर aliquots में mESCs खेती/रखरखाव माध्यम तैयार करना और इसे 2-8 & #176 पर संग्रहित करना; C 2 सप्ताह तक के लिए अनुशंसित है । mESC मीडियम में ७५ एमएल ES सेल FBS, 5 एमएल पेनिसिलिन माम और Streptomycin, 5 मिलीलीटर गैर-आवश्यक अमीनो एसिड (10 मिमी) (अंतिम एकाग्रता ०.१ मिमी), ५० & #181; एल माउस ल्यूकेमिया अवरोध करनेवाला कारक (एमएलआईएफ; १०० & #181; G/ml) (अंतिम एकाग्रता 10 एनजी/एमएल), ४३० & #181; L MTG (1- Thioglycerol; 1:100 DMEM में कमजोर पड़ने) (अंतिम एकाग्रता १०० & #181; M) और उच्च ग्लूकोज DMEM मध्यम से ५०० मिलीलीटर.
    2. महाप्राण ने कल्चरल डिश से mESC खेती मीडियम की और कुल्ला करते हुए कोशिकाओं को एक बार 1x & #160;P बी. एस.
    3. जोड़ें ०.५ एमएल Trypsin-EDTA और मशीन पर ३७ & #176; सी बस जब तक कोशिकाओं को पकवान से अलग शुरू करते हैं । उसके बाद, mESC खेती मध्यम 15% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक के 2 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धोने से Trypsin को निष्क्रिय.
    4. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए संस्कृति पकवान से शेष कोशिकाओं को उखाड़ देना ।
      नोट: यह एकल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है, क्योंकि सेल के झुरमुट कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने के ।
    5. mESC रखरखाव माध्यम के साथ जिलेटिन पर बर्तन विभाजित कोशिकाओं 1:10 ।
      नोट: यदि mESC कोशिकाओं का घनत्व बहुत कम है, वे अच्छी तरह से विकसित नहीं है; यदि घनत्व बहुत अधिक है, भेदभाव पदोंनत किया है ।
    6. सुनिश्चित करें कि mESCs चार नए पकवानों में एक पेट्री डिश से विभाजन के द्वारा हर दूसरे दिन mESC मार्ग प्रदर्शन द्वारा एक विभेदित राज्य में बनाए रखा जाता है । 100X के तहत एक औंधा माइक्रोस्कोप के साथ mESC कालोनियों का निरीक्षण & #160; या 200X & #160; आवर्धन, और, यदि सहज & #160 का प्रमाण है; एमईएस सेल विभेद, Oct4 प्रोटीन की कमी का आकलन करने के लिए पश्चिमी दाग प्रदर्शन करते हैं ।
      नोट: इष्टतम कोशिका passaging के साथ, mESCs के सहज विभेदक इन विट्रो कम किया जा सकता है.
< p class = "jove_title" > 2. सेल अभिकर्मक

  1. बीज कोशिकाओं ४८ ज gridded माइक्रोस्कोपी व्यंजन (व्यास ३५ मिमी) पर प्रयोगों से पहले के क्रम में microirradiated डिश पर उनके निर्देशांक के अनुसार पेट्री कोशिकाओं को खोजने के लिए.
    नोट: यह एक उदाहरण है जिसमें microirradiation पहला प्रायोगिक चरण है और immunostaining दूसरा है (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ). बोने के लिए
    1. , 5 & #215 की एकाग्रता का प्रयोग करें; 10 4 कक्ष लाइनों के लिए हेला-व्युत्पन्न सेल लाइंस (या 1 & #215; 10 4 कक्ष/ डिश प्रति 2 मिलीलीटर पूरा माध्यम तक प्रयोग करें । खेती और microirradiation के दौरान, ३७ पर एक थर्मोस्टेट या खेती चैंबर में कोशिकाओं को बनाए रखने & #176; ग और 5% कं 2 .
    2. स्वचालित कक्ष काउंटर का उपयोग करके कक्षों की गणना

    3. नोट: कोशिकाओं के उच्च एकाग्रता का उपयोग न करें । विशेष रूप से D3 mESCs की घनी पैक कालोनियों के मामले में, उच्च कोशिका घनत्व immunostaining के बाद स्थानीय रूप से microirradiated कोशिकाओं की एक पहचान रोकता है ।
  2. इस प्रकार के रूप में पसंद के प्लाज्मिड डीएनए और अभिकर्मक एजेंट तैयार करते हैं । तैयार समाधान A का उपयोग कर 2-3 & #181; चयनित प्लाज्मिड डीएनए के g लए ( तालिका के सामग्री विवरण के लिए देखें) और १५० & #181; L 1x & #160;P बी. एस. तैयार हल ख का उपयोग ३.५ & #181; l अभिकर्मक reagent in १५० & #181; l 1 & #215; पंजाब. सुनिश्चित करें कि प्रत्येक समाधान अच्छी तरह से सावधान pipetting.
    द्वारा मिश्रित है नोट: डीएनए और अभिकर्मक रिएजेंट के इष्टतम अनुपात प्रत्येक सेल लाइन और व्यक्तिगत प्लाज्मिड.
  3. के लिए निर्धारित empirically होना चाहिए क्षणिक transfected रहने वाले कोशिकाओं के प्रायोगिक निरीक्षण से पहले 24 एच में
  4. , समाधान एक और भंवर के बिना समाधान ख गठबंधन । 15-20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर संयुक्त समाधान मशीन । एक dropwise तरीके में, homogeneously इस पूरा अभिकर्मक मिश्रण फैलाने (३०० & #181; एल, के रूप में बिंदु २.२ में वर्णित) कोशिका परत पर माइक्रोस्कोपी डिश में बढ़ रही है.
  5. में ३७ & #176; C और 5% कं 2 4-6 h के लिए, फिर अभिकर्मक मिश्रण को ताजे मध् यम से बदलें । मानक शर्तों के तहत कोशिकाओं की खेती ।
    नोट: जब एक ४०५-एनएम लेजर का उपयोग कर, किसी भी एजेंट के साथ कोशिकाओं को संवेदनशील नहीं है, लेकिन जब एक ३५५-एनएम लेजर का उपयोग कर, 10 & #181 के साथ सेल के संवेदीकरण करते हैं; M 5-ब्रोमो-2 & #39;-deoxy-uridine (BrdU) < सुप class = "xref" > 7 , < सुप class = "xref" > 8 . संवेदीकरण समय कक्ष प्रकार और कक्ष चक्र की लंबाई पर निर्भर करता है । हेला कक्षों के लिए, स्थानीय microirradiation से पहले BrdU 16 से 20 h जोड़ें । mESCs के मामले में, microirradiation से पहले BrdU 6 से 8 ज जोड़ें ।
< p class = "jove_title" > 3. स्थानीय डीएनए घावों की प्रेरण और फोकल माइक्रोस्कोपी

  1. माइक्रोस्कोप मंच पर पकवान जगह और पकवान पर चयनित कोशिकाओं की स्थिति रिकॉर्ड; सेल निर्देशांकों की जरूरत होगी आगे के विश्लेषण के लिए (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a a-c ).
  2. किसी संख्या या अक्षर (< सबल वर्ग = "xfig" > आरेख 2a d-f के साथ लेबल किए गए किसी वर्ग में transfected cell (s)
  3. ढूंढें, विज्ञापन में तीरों को पैनल एई और वायुसेना में बढ़ाया सेल का स्थान दिखाते हैं) । उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर सेल (ओं) की एक छवि प्राप्त करने और दोनों सेल (ओं) और लेबल वर्ग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2a ) की स्थिति की पहचान करने के क्रम में एक प्रतिदीप्ति छवि प्राप्त.
  4. छवि अधिग्रहण के लिए
  5. विकिरण से पहले, एक सफेद प्रकाश लेजर (डब्ल्यूएलएल) का उपयोग करें (1 एनएम वेतन वृद्धि में 470-670 एनएम) फोकल माइक्रोस्कोप से जुड़ा (या किसी अंय उपलब्ध लेजर conf से जुड़ेocal माइक्रोस्कोपी).
  6. निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: ५१२ & #215; ५१२-पिक्सेल संकल्प, पिक्सेल आकार ६४ एनएम, ४०० हर्ट्ज, द्वि-दिशा मोड (दो दिशाओं में स्कैनिंग), पंक्ति औसत सेट करने के लिए 8, ज़ूम 12x.
    नोट: पंक्ति औसत स्कैन की एक दी गई संख्या का प्रतिनिधित्व करता है; अगली पंक्ति के लिए जारी रखने से पहले एक ही पंक्ति एकाधिक बार स्कैन की गई है । सभी लाइनों की दोहराया स्कैन छवि के अंतिम फ्रेम का उत्पादन ।
  7. छवि अवलोकन और अधिग्रहण के लिए
  8. , एक ६३ & #215 का उपयोग करें; १.४ के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ तेल उद्देश्य और क्रमिक रूप से प्रतिदीप्ति छवियों का अधिग्रहण । दो fluorochromes के बीच पार बात उपयुक्त सॉफ्टवेयर के अनुक्रमिक स्कैनिंग मोड का उपयोग करके समाप्त करें ।
    नोट: सभी माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर एक तथाकथित अनुक्रमिक स्कैनिंग मोड की स्थापना में सक्षम बनाता है. ऑपरेटर यह चयन कर सकता है कि fluorochromes & #39 प्राप्त करना है; सूचना एक साथ ( जैसे , लाल-हरा-नीला प्रतिदीप्ति में) या, जैसा कि यहां उल्लेख किया गया है, व्यक्तिगत रूप से (क्रमिक रूप से), fluorochrome fluorochrome द्वारा । सामांय जानकारी है कि GFP के लिए अधिकतम उत्तेजना/उत्सर्जन 395/509 एनएम है और mCherry के लिए अधिकतम उत्तेजना/उत्सर्जन 587/610 एनएम है (यहां < मजबूत वर्ग में इस्तेमाल किया fluorochromes देखें = "xfig" > चित्रा बी ) खाते में ले लो । इस जानकारी के आधार पर, वांछित fluorochromes के लिए उपयुक्त उत्तेजना और उत्सर्जन फिल्टर का चयन करें । फ़िल्टर चयन और स्कैनिंग प्रक्रियाओं प्रत्येक फोकल माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए ।
  9. डीएनए घावों की प्रेरण के लिए
  10. , ६४ लाइन स्कैनिंग मोड का उपयोग करें, स्विच ऑफ डब्ल्यूएलएल (& #39 में; अर्जन & #39; मोड), बाहरी यूवी स्रोत पर स्विच करें (ऑन & #34; यूवी लेजर & #34; बटन), ब्याज का क्षेत्र निर्धारित करें (ROI) (& #39; अर्जन & #39; मोड), और ३५५-एनएम सेट करें १००% बिजली के लिए लेजर या, वैकल्पिक रूप से, एक ४०५ एनएम लेजर स्रोत का उपयोग करें ।
    नोट: आम तौर पर, लेजर शक्ति छवि अधिग्रहण मोड में उपयुक्त लेजर समायोजन बटन द्वारा समायोजित किया जाता है ।
  11. स्थानीय microirradiation के लिए
  12. , निकट UVA स्पेक्ट्रम में उत्सर्जन करने वाले पराबैंगनीकिरण का उपयोग करें । नाभिक में रॉय के microirradiation के लिए और छवि पर कब्जा करने के लिए, छवि अधिग्रहण मोड में शूंय के लिए पृष्ठभूमि सेट करने के लिए रॉय के बाहर लेजर तीव्रता को विनियमित; यदि कोशिका ठीक से विकिरणित है, तो GFP-citrullinated H2B का सिग्नल गायब हो जाएगा, और, उदाहरण के लिए, mCherry-tagged PCNA प्रोटीन विकिरण के तुरंत बाद डीएनए घावों के लिए भर्ती किया जाएगा (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 बी और वीडियो 1 ).
    नोट: एक डीएनए चोट एक फोकल खंड के रॉय में प्रेरित भी तीन आयामी (3 डी) प्रक्षेपण में प्रकट होता है (3 डी रोटेशन और एक्स-वाई देखें, < सुदृढ वर्ग में x-z, y-z अनुमानों = "xfig" > चित्रा 2c और वीडियो 2 ). ३५५-एनएम और ४०५-एनएम पराबैंगनीकिरण के लिए पूर्ण तकनीकी मापदंडों के विवरण के लिए, देखें Stixov & #225; एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > ७
  13. रॉय विकिरणित किया गया है के बाद, बाहरी यूवी स्रोत बंद स्विच, रॉय बंद स्विच, डब्ल्यूएलएल पर स्विच, 8 करने के लिए स्कैनिंग लाइन बदलने के लिए, और विकिरण के लिए एक और सेल पाते हैं । ROI चयन के लिए, सॉफ़्टवेयर & #39; s छवि प्राप्ति मोड में लागू बटन का उपयोग करें.
    नोट: mCherry-PCNA 2 और 20 मिनट के बीच डीएनए घावों पर एक अधिकतम संचय चोटी है (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2 बी ). exogenous प्रोटीन के स्तर पर परिणाम को सत्यापित करने के लिए, स्थानीय microirradiation के तुरंत बाद इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग के साथ आगे बढ़ें । का चयन करें विकिरण ब्याज के अनुसार समय अंतराल ।
  14. सत्यापित करें कि exogenous प्रोटीन का संचय microirradiated कोशिकाओं के बहुमत में पता लगाया जा सकता है । इस सत्यापन के लिए, निंन चरणों में मापदंड का उपयोग करें ।
    1. की जाँच करें कि क्षणिक transfected कोशिकाओं में exogenous प्रोटीन का कोई इजहार नहीं है. एक संभव समाधान के रूप में, केवल फ्लोरोसेंट प्रोटीन की एक कमजोर अभिव्यक्ति के साथ कोशिकाओं का चयन ( जैसे , mCherry-PCNA या mCherry-53BP1).
    2. छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल किया डब्ल्यूएलएल जोखिम के phototoxicity का आकलन.
      नोट: phototoxicity परीक्षण के लिए, लंबे समय तक लेज़र microirradiation करने के लिए transfected कक्षों का पर्दाफाश और सत्यापित करें कि कक्ष में दिखाए गए के रूप में बँटवारा करने के लिए आगे बढ़ना < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ए -बी . एक संभव समाधान के रूप में, सेल प्रति फोकल स्लाइस की स्कैनिंग समय और संख्या को कम करने, इष्टतम अक्षीय चरण (०.३ & #181; m की सिफारिश की है) के चयन के द्वारा 3 डी स्कैनिंग का अनुकूलन और लेजर & #39; s शक्ति अपने न्यूनतम पर सेट. वैकल्पिक रूप से, phototoxicity Trolox (6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchroman-2-carboxylic एसिड, विटामिन ई के एक पानी में घुलनशील अनुरूप) की खेती के माध्यम में भंग का उपयोग कर समाप्त किया जा सकता है । डीएनए-क्षति से संबंधित प्रयोगों के लिए, यह यूवी विकिरण के खिलाफ अपने सुरक्षात्मक प्रभाव के कारण Trolox का उपयोग करने के लिए अनुशंसित नहीं है ।
    3. एक ३५५-एनएम लेजर के साथ विकिरण के मामले में
    4. , BrdU निगमन किट से एक उचित BrdU का पता लगाने एंटीबॉडी का उपयोग कर BrdU के पर्याप्त निगमन सत्यापित ( सामग्री की मेज देखें) । के बाद से BrdU डीएनए में सेल चक्र के एस चरण के दौरान शामिल किया है, कोशिकाओं के बहुमत एस चरण के माध्यम से आगे बढ़ना चाहिए । संभव समाधान के रूप में, कक्ष चक्र की लंबाई पर विचार करें, जो कि विशिष्ट कक्ष-प्रकार है.
    5. विश्लेषण कि क्या डीएनए की मरंमत के हित के प्रोटीन विशिष्ट कोशिका चक्र चरण (ओं) में डीएनए घावों को पहचानने की क्षमता है । एक संभव समाधान: डीएनए घावों के लिए चयनित प्रोटीन की भर्ती विशिष्ट कोशिका चक्र चरणों (G1/S/G2), हेला-Fucci कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित है कि पुष्टि करने के लिए । इन कोशिकाओं G1 और जल्दी एस चरणों में आरएफपी-Cdt1 व्यक्त और s/G2-M सेल चक्र चरणों में GFP-टैग geminin < सुप वर्ग = "xref" > २२ (< सुदृढ वर्ग = "xfig" > चित्रा १ ).
    6. से बचने के लिए apoptosis, कोशिका मृत्यु, एक उपयुक्त लेज़र स्रोत और लेज़र पावर सेटिंग का चयन करें < सुप क्लास = "xref" > २३ . ध्यान रखें कि विकिरणित कोशिकाओं का बँटवारा करने के लिए आगे बढ़ना चाहिए (< मजबूत वर्ग = "xfig" > फिगर 3 ए -बी, वीडियो 3 ).
      नोट: अवांछित apoptosis Annexin वी धनात्मकता, caspase 3, या लामिन बी दरार द्वारा पता लगाया जा सकता है । रूपात्मक स्तर पर, कोशिका टुकड़ी और अपोप्तोटिक निकायों के गठन दिखाई देगा ।
< p class = "jove_title" > 4. इम्यूनोफ्लोरेसेंस दाग

  1. कुल्ला सेल परत (सूक्ष्मदर्शी व्यंजन में बढ़ रही है) 1 & #215 के साथ संक्षेप में; पंजाबियों और धोने के बाद, 10 मिनट के लिए 4% formaldehyde का उपयोग कर कोशिकाओं को ठीक (हेला के लिए-व्युत्पन्न सेल लाइनों) या कमरे के तापमान पर 20 मिनट (D3 ES कोशिकाओं के लिए). 1 & #215 के साथ पकवान कुल्ला; पंजाबियों.
    सावधानी: Formaldehyde गंभीर आंख नुकसान का कारण बनता है, एक एलर्जी त्वचा प्रतिक्रिया का कारण हो सकता है, और यह भी एक संभावित कैंसर है; इस प्रकार, formaldehyde के साथ सभी प्रयोगात्मक कदम एक चिमटा हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
    नोट: प्रतिदीप्ति संकेतों के अनावश्यक ब्लीचिंग से बचने के लिए, इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला के लिए आवश्यक समय के दौरान एक अंधेरे कक्ष में पकवान की दुकान ।
  2. Permeabilize कोशिकाओं के साथ ०.१% ट्राइटन x-१०० में भंग ज 2 8 मिनट के लिए, और फिर 12 मिनट के लिए कोशिकाओं के साथ मशीन 1 & #215; पंजाबन जिसमें ०.१% saponin और ०.१% ट्राइटन x-१००. मशीन के बाद, 1 & #215 में कोशिकाओं को धो; पंजाबियों 15 मिनट के लिए दो बार
  3. 1% BSA में 1 & #215 के साथ कोशिकाओं की मशीन; ६० ंयूनतम के लिए पंजाबियों चयनित एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन ब्लॉक करने के लिए । 1 & #215 में कोशिकाओं को धो लें; पंजाब के लिए 15 मिनट के बाद मशीन.
  4. 1:100 (या 1:200) के अनुपात में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला (यह कदम हे होना चाहिएव्यक्तिगत एंटीबॉडी के लिए ptimized) 1 में 1% BSA में & #215; पंजाबियों, 25 & #181 का उपयोग कर रहा है; प्रति डिश इस समाधान के एल, और एक coverslip के साथ कोशिकाओं को कवर किया । 4 & #176 पर रातोंरात एक humidified चैंबर में प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के साथ कोशिकाओं की मशीन; C.
  5. अगले दिन
  6. , 1 & #215 में कोशिकाओं को धोने; पंजाबियों 5 मिनट के लिए दो बार
  7. 1:100 के अनुपात में माध्यमिक एंटीबॉडी (या वैकल्पिक रूप से 1:200) 1% BSA में 1 & #215; पंजाबियों, का उपयोग १०० & #181; एल प्रति डिश इस समाधान के, और एक coverslip के साथ कोशिकाओं को कवर पतला । ६० मिनट के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान के साथ कोशिकाओं की मशीन । मशीन के बाद, 1 & #215 में कोशिकाओं को धो; पंजाबियों 5 min.
  8. के लिए तीन बार
  9. बढ़ते माध्यम की एक बूंद के साथ coverslip माउंट, और नेल पॉलिश या गोंद के साथ coverslip सील को सुखाने और सूक्ष्म अवलोकन के दौरान आंदोलन को रोकने के । डिश को अंधेरे में स्टोर करे 4 & #176; ग.
< p class = "jove_title" > 5. प्रतिदीप्ति सेक्युरिटी इमेज (FLIM) माइक्रोस्कोपी

  1. सुरु FLIM लागेको हो । खुल कर & #34; Application suite & #34; के सॉ और स्विच ऑफ & #34; FLIM & #34; मोड. सुनिश्चित करें कि डब्ल्यूएलएल स्पंदित मोड में काम कर रहा है ।
    नोट: ऑपरेटर पल्स मोड तक पहुँचने के लिए एक हार्डवेयर बटन स्विच करना होगा.
  2. जगह के रूप में स्थानीय microirradiation के दौरान एक ही उंमुखीकरण में माइक्रोस्कोप मंच पर दाग कोशिकाओं (धारा 4 में दाग) युक्त पकवान, और पेट्री पकवान पर ग्रिड के अनुसार विकिरणित कोशिकाओं को लगता है । फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा छवि अधिग्रहण प्रदर्शन.
    नोट: निम्न सेटिंग्स का उपयोग करें: १०२४ & #215; १०२४ पिक्सल, ४०० हर्ट्ज, द्वि-दिशा मोड, 16 लाइनों, ज़ूम 12x.
  3. FLIM मापन आरंभ करने से पहले
  4. , घातांक क्षय का रीयल-टाइम रिकॉर्ड दिखाने के लिए प्रारंभिक परीक्षण करें, & #34 पर क्लिक करके, सेटअप FLIM & #34; और & #34; अर्जन & #34; र दबाने & #34; रन FLIM test & #34;. दो मुख्य पैरामीटर निम्नानुसार का आकलन करके नमूने के लिए FLIM पैरामीटर्स ऑप्टिमाइज़ करें ।
    1. नमूना के जीवनकाल के लिए देखते उत्तेजना तरंग दैर्ध्य के साथ डब्ल्यूएलएल की पुनरावृत्ति दर का अनुकूलन (नीचे नोट देखें). फोकल माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में, उपयुक्त बटन के साथ लेजर तीव्रता समायोजित, जो आम तौर पर कहा जाता है & #34; लेजर समायोजन सेटिंग & #34; में & #39; इमेज अर्जन & #39; मेन्यू. फिर, एक क्षय वक्र गणना (या हिस्टोग्राम सभी फोटॉन गिनती दिखा रहा है) FLIM सॉफ्टवेयर का उपयोग (देखें < मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4a -बी ).
      नोट: उत्तेजना के लिए पल्स मोड में डब्ल्यूएलएल का उपयोग करें । सॉफ्टवेयर डब्ल्यूएलएल, जो पुनरावृत्ति दर (८०, ४०, 20, या 10 मेगाहर्ट्ज) के चयन की अनुमति देता है के लिए एक पल्स बीनने के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए । प्रतिदीप्ति दाता, GFP, के मामले में उत्तेजना तरंग दैर्ध्य ४८८ एनएम है । क्षय वक्र FLIM सॉफ्टवेयर कार्यक्षेत्र का उपयोग कर दर्ज की गई है । पैरामीटर (& #964; D , & #964; DA ) घातांक क्षय समय ( उदा. , fluorochrome जीवनभर) दिखाता है; पैरामीटर (A) fluorochrome क्षय के आयाम का प्रतिनिधित्व करता है (GFP के लिए FLIM डेटा के उदाहरण देखें-tagged p53 and mCherry-tagged 53BP1 in < सुदृढ वर्ग = "xfig" > फिगर 4a -बी ).
    2. सॉफ्टवेयर अधिग्रहण उपकरण का उपयोग कर गिनती दोहराव दर की जाँच करें (दोहराव दर मोड का चयन करें). नमूना में प्रतिभाशाली पिक्सेल का चयन करें; चमकीले पिक्सेल के लिए वक्र समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता के 10% से नीचे होना चाहिए ।
  5. पर क्लिक करें & #34; माप & #34; र प्रेस & #34; रन FLIM & #34;.
< p class = "jove_title" > 6. दाता लाइफटाइम एक FLIM स्क्रिप्ट और झल्लाहट दक्षता की गणना का उपयोग कर

  1. प्रारंभ करें झल्लाहट-FLIM सॉफ्टवेयर और ओपन द & #39;D onor & #39; कार्यक्षेत्र.
  2. selection & #34; Analysis & #34;/& #34; इमेजिंग & #34; मेन्यू में टैब और FLIM स्क्रिप्ट को क्लिक कर स्टार्ट कर & #34; स्टार्ट & #34;. इष्टतम झल्लाहट-FLIM सेटिंग्स के लिए, अच्छी तरह से ज्ञात का उपयोग प्रोटीन भागीदारों बातचीत ।
    नोट: अच्छी तरह से ज्ञात सहभागिता भागीदारों के लिए झल्लाहट-FLIM दक्षता GFP-p53 और mCherry-53BP1 (३४.१ & #177; २.३)% (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4c ).
  3. उपयोग केवल दाता उत्सर्जन चैनल (चैनल 1 या 2) और प्रेस & #34; गणना तेज FLIM & #34;.
    नोट: छवि और ग्राफ दोनों अद्यतन किया जाएगा.
  4. झल्लाहट में
  5. -FLIM सॉफ्टवेयर, तीव्रता स्केल (0-4000 मायने रखता है) और लाइफटाइम स्केल (0-5 एन एस) सॉफ्टवेयर में मैंयुअल रूप से सेट । इस दृष्टिकोण के साथ, ब्याज की कोशिका कल्पना और झल्लाहट-FLIM माप निर्धारित किया है ।
    नोट: यह सेटिंग कक्ष जनसंख्या में व्यक्तिगत कक्षों के बीच प्रतिदीप्ति तीव्रता में अंतर समाप्त करता है ।
  6. क्षय रूप में
  7. , फिटिंग मॉडल चुनें.
    नोट: हम अनुशंसा करते है n-घातांक reconvolution और मॉडल पैरामीटर का चयन & #34; n & #34; । एक इष्टतम फिट निम्नलिखित मानदंड है: फिट वक्र के साथ क्षय वक्र ओवरले और & #967; 2 -मान 1 के बराबर है (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 4B ).
  8. Select & #34; थ्रेसहोल्ड & #34;/& #34; उपयोग थ्रेशोल्ड & #34; और ७५ करने के लिए थ्रेशोल्ड सेट करें । सुरु & #34; पहायला फिट & #34;.
    नोट: SPT64 सॉफ्टवेयर झल्लाहट के अभाव में औसत दाता जीवनकाल की गणना करता है (& #34; आयाम भारित औसत जीवनकाल & #34;, & #964; Av. Amp )
< p class = "jove_title" > 7. झल्लाहट FLIM-झल्लाहट स्क्रिप्ट का उपयोग कर कार्यक्षमता

  1. का चयन करें दाता/स्वीकार्य कार्यस्थान और फिर खोलें & #34; Analysis & #34;| & #34; इमेजिंग & #34;| & #34; लाइफटाइम झल्लाहट इमेज & #34;.
  2. सक्रिय चैनल के रूप में केवल दाता का चयन करें और पिक्सेल फोटॉन संख्या/पिक्सेल पर निर्भर करता है । फिर, सॉफ़्टवेयर मोड नामक चलाएं & #34; गणना FastFLIM & #34;. अगर इमेज में फोटॉन number/पिक्सेल कम है तो पिक्सल बिन्नी को 4 पॉइंट्स तक बढ़ाएं ।
  3. 0-200 गिनती करने के लिए तीव्रता सेट और 0-5 ns.
  4. करने के लिए जीवनकाल
  5. कध & #34; उपयोग थ्रेशोल्ड & #34; और ७५ की थ्रेशोल्ड दर्ज करें.
  6. सेट करने के लिए फिटिंग मॉडल & #34; बहु-Exp. दाता & #34;, मॉडल पैरामीटर & #34; n & #34;, लिहा & #964; Av. Amp (चरण ६.६) as a & #964; D , व कध & #34; पहायला फिट & #34;.
  7. पैरामीटर सेट करें Bkgr Dec , Shift IRF , और Bkgr IRF को लगातार मानों के निशान से निकाल कर.
    नोट: संभव के रूप में ज्यादा के रूप में स्थिर रहने के लिए मानकों के बहुमत सेट. यह तरीका सांख्यिकीय उतार-चढ़ाव को कम करता है. इस मामले में, & #34 न दबाएँ; आरंभिक फ़िट & #34; नु. उल्लेख किया मापदंडों का वर्णन का पालन करें: IRF = साधन प्रतिक्रिया समारोह, BkgrDec = घातीय फिट से पृष्ठभूमि, ShiftIRF = घातीय reconvolution फिट से IRF शिफ्ट, BkgrIRF = IRF से घातीय reconvolution फिट । सभी तीन मापदंडों की गणना कर रहे हैं और आगे विश्लेषण के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर तय किया जा सकता है.
  8. प्रेस & #34; गणना झल्लाहट & #34;; एक झल्लाहट छवि (FLIM छवि क्षेत्र में प्लॉट) और झल्लाहट क्षमता हिस्टोग्राम की गणना कर रहे हैं, और एक झल्लाहट दूरी हिस्टोग्राम (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 4c ) की साजिश रची है. छवि विश्लेषण समाप्त होने पर, दबाएं & #34; सेव रिजल्ट & #34;.
    नोट: झल्लाहट प्रयोगों के दौरान, यह है कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्लोरोसेंट (उज्ज्वल) और गैर फ्लोरोसेंट (डार्क) राज्यों के बीच प्रतिवर्ती संक्रमण का प्रदर्शन पर विचार करने के लिए आवश्यक है । इस विशेषता को & #34 कहा जाता है; निमिष & #34;, और झल्लाहट दक्षता इस घटना से प्रभावित है (इस आशय का एक स्पष्टीकरण Vogerl एट अल. द्वारा प्रदान किया गया था < सुप वर्ग = "xref" > २४ ).
< p class = "jove_title" > 8. FRAP विश्लेषण

  1. जगह जिलेमाइक्रोस्कोप मंच पर एच, transfected ब्याज की फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं को खोजने के लिए, और छवि अधिग्रहण प्रदर्शन मानक माइक्रोस्कोप लैंप के साथ उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 2Aa -बी देख) और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी मोड. छवि अधिग्रहण के लिए
    1. , चयनित fluorochrome के अनुसार, फोकल माइक्रोस्कोप (या पसंद की एक लेजर) से जुड़े सफेद प्रकाश लेजर (डब्ल्यूएलएल) का उपयोग करें । निंन सेटिंग्स का उपयोग करें: ५१२ & #215; ५१२ पिक्सल, १००० हर्ट्ज, द्वि-दिशा मोड, लाइन औसत 1, ज़ूम 12x.
    2. (पर ~ 10% लेजर शक्ति) और ब्याज के क्षेत्र को परिभाषित (रॉय) छवि अधिग्रहण मेनू में 15 से अधिक ब्लीचिंग छवियों का अधिग्रहण ।
  2. photobleaching प्रयोगों के लिए, एक आर्गन लेजर (४८८ एनएम) का उपयोग करें । निम्न सेटिंग्स लागू करें: फ़्रेम संकल्प ५१२ & #215; ५१२ पिक्सल, १००० हर्ट्ज, द्वि-दिशा मोड, ज़ूम x + 10x करने के लिए.
    नोट: GFP, mCherry, और आरएफपी सहित Fluorochromes ४८८ एनएम या ५१४ एनएम पर काम कर रहे एक आर्गन लेजर द्वारा उत्साहित किया जा सकता है ।
  3. पसंद के माइक्रोस्कोप के FRAP सॉफ्टवेयर मोड का उपयोग करें । photobleaching के दौरान, लेजर समायोजन बटन का उपयोग कर अधिकतम करने के लिए आर्गन लेजर & #39; एस पावर सेट करें । ०.२५६ s & #160 पर छवि अधिग्रहण प्रदर्शन; अंतराल, पर 10% लेजर शक्ति.
    नोट: postbleaching चरणों के लिए, पसंद के फोकल माइक्रोस्कोप के मानक छवि अधिग्रहण मोड का उपयोग करें ।
    1. मॉनिटर प्रतिदीप्ति रिकवरी समय के बाद photobleaching (अप करने के लिए ब्लीचिंग प्रक्रिया के बाद 45-50 s).
      नोट: जैसा कि < सबल वर्ग में दिखाया गया है = "xfig" > चित्रा 4d , mCherry के लिए photobleaching के बाद वसूली समय-टैग 53BP1 सहज डीएनए घावों और UVA-विकिरण प्रेरित घावों पर अलग है । UVA घावों पर mCherry-53BP1 की तुलना में तेजी से mCherry-53BP1 गर्द में अनायास डीएनए की मरंमत घावों पर बरामद; see < सुदृढ वर्ग = "xfig" > फिगर 4d आणि Foltankova एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > २५
  4. एक स्प्रेडशीट के लिए माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर (या पसंद के सॉफ्टवेयर) से डेटा निर्यात और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं ।

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Representative Results

उन्नत फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करना, हम डीएनए घावों पर mCherry-tagged 53BP1 और mCherry-PCNA प्रोटीन का एक संचय मनाया । सजीव कोशिकाओं के स्थानीय microirradiation द्वारा विश्लेषण किया गया । व्यक्तिगत कोशिका चक्र चरणों में डीएनए की मरंमत से संबंधित प्रोटीन के परमाणु वितरण पैटर्न को पहचानने के लिए, हम Fucci सेलुलर प्रणाली है, जिसके द्वारा यह G1, जल्दी एस निर्धारित करने के लिए संभव है, और सेल चक्र के G2 चरणों का इस्तेमाल किया (चित्रा 1) । Fucci सेलुलर मॉडल है कि हम Suchankova एट अल में प्रकाशित की जैविक आवेदन । 26 से पता चलता है कि 53BP1 G1, एस में स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए घावों के लिए भर्ती किया गया था, और सेल चक्र के G2 चरणों, जो गैर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के दौरान इस प्रोटीन के समारोह के साथ जुड़े थे (NHEJ), मुख्य तंत्र में से एक के लिए अग्रणी डबल-किनारा तोड़ मरंमत । दूसरी ओर, इस प्रायोगिक प्रणाली हमें व्यक्तिगत सेलुलर स्तर पता चला है कि PCNA प्रोटीन, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन मरंमत मार्ग (HRR) से जुड़ा हुआ है, देर एस और सेल चक्र 27के G2 चरणों में DSBs पहचानता है । डीएनए मरंमत मशीनरी पर अध्ययन के लिए, हम भी विकिरण शर्तों को अनुकूलित करने के लिए सुनिश्चित करें कि सेल संस्कृतियों के लिए यूवी पराबैंगनीकिरण (चित्रा 3) के जोखिम के बाद बँटवारा से गुजरना जारी रखा । Microirradiated कोशिकाओं का बँटवारा के दौर से गुजर साबित होता है कि, इन प्रयोगात्मक स्थितियों में, डीएनए की मरंमत एक अपेक्षाकृत शारीरिक तरीके से आय और कोशिकाओं पराबैंगनीकिरण है, जो उच्च तीव्रता पर apoptosis प्रेरित द्वारा घायल नहीं किया गया है । यहां, हम यह भी दिखा कैसे झल्लाहट-FLIM विश्लेषण डीएनए की मरंमत प्रोटीन के लक्षण वर्णन लागू करने के लिए । इस उंनत प्रौद्योगिकी हमें सेल नाभिक में स्थानीय प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत का अध्ययन करने के लिए सक्षम बनाता है या, वैकल्पिक रूप से, इस तरह के nucleolus, परमाणु लेमिना, या heterochromatin के समूहों के रूप में nucleolar क्षेत्रों में प्रोटीन बातचीत । इस तकनीक में शुरुआती के लिए, हम अच्छी तरह से उपयोग करके इस झल्लाहट-FLIM तकनीक को अनुकूलित करने की सिफारिश करना चाहते है जैसे p53 और 53BP1 (चित्रा 4a-सी) के रूप में प्रोटीन भागीदारों के साथ बातचीत । सामांय में, प्रोटीन की एक ज्ञान प्रोटीन संपर्क समझ कैसे प्रोटीन परिसरों प्रतिकृति, जीन सक्रियण, मुंह, या डीएनए की मरंमत की तरह प्रक्रियाओं को विनियमित करने की ओर जाता है । इसके अलावा, प्रोटीन कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए एक बहुत ही उपयोगी उपकरण FRAP विधि है, जो स्थानीय प्रोटीन प्रसार और गतिशीलता (चित्रा 4d) की विशेषताओं को दर्शाता है । एक साथ ले लिया, यहां हम डीएनए की मरंमत अध्ययन में उंनत फोकल माइक्रोस्कोपी तकनीक लागू करने के लिए methodological निर्देश प्रदान करते हैं ।

Figure 1
चित्र 1: डीएनए मरंमत घावों के गठन हेला-Fucci G1 में आरएफपी-cdt1 (लाल) व्यक्त की कोशिकाओं में अध्ययन किया जा सकता/अर्ली s चरणों और GFP-geminin (हरा) s/G2 चरणों में सेल चक्र. 53BP1 प्रोटीन के लिए सकारात्मक होने वाले डीएनए घावों को सहज (नीला; Alexa ४०५ धुंधला), G1 में अध्ययन किया गया (लाल), जल्दी एस (नारंगी, दोनों आरएफपी-cdt1 और GFP-geminin की अभिव्यक्ति), और G2 (हरी) कोशिका चक्र के चरणों । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: समय के साथ डीएनए घावों पर mCherry-टैग PCNA की भर्ती. (क) mCherry-PCNA (लाल) व्यक्त करने वाली कोशिकाएँ चुनिंदा क्षेत्रों में एक gridded माइक्रोस्कोप डिश (ग्रे) पर स्थित थीं. निर्धारण और immunostaining के बाद, विकिरणित कोशिकाओं (पीले तीर) पंजीकृत निर्देशांक के अनुसार स्थित थे (एक उदाहरण के रूप में ग्रे अक्षर कश्मीर देखें) (ए. ए.-सी). पीले फ्रेम और तीर (विज्ञापन) सेल कि microirradiated था और पैनल एई-एफ में बढ़ाया दिखा । (ख) mCherry-PCNA (लाल) का संचय हेला कक्षों में छुरा GFP-tagged citrullinated H2B (हरा) का अध्ययन किया गया. ३५ मिनट तक के लिए स्थानीय microirradiation के तुरंत बाद कक्ष मॉनिटर किए गए थे ( वीडियो 1देखें) । (ग) Microirradiated कोशिकाओं 3d फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण किया गया, और डीएनए घावों पर प्रोटीन संचय (जैसे, mCherry-53BP1) सभी तीन आयामों में पाया गया (x-y, x-z, और y-z) हालांकि केवल सेल नाभिक की midsection का microirradiated था (देखें 3d-सेल रोटेशन में वीडियो 2 3d अनुमानों में चित्रा 2c) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3: एक ४०५-एनएम लेजर डायोड द्वारा microirradiated कोशिकाओं सेल चक्र के माध्यम से आम तौर पर आगे बढ़ना । (क) विकिरण के बाद एक ४०५-एनएम डायोड लेजर का उपयोग, हेला कोशिकाओं (छुरा GFP-citrullinated H2B व्यक्त; ग्रीन) बँटवारा से गुजरना ( वीडियो 2भी देखें). पीले तीर और फ्रेम चयनित कोशिकाओं में विकिरणित रॉय से संकेत मिलता है । सफेद फ्रेम का बँटवारा दिखा. (ख) एक ही प्रायोगिक शर्तों के तहत, विकिरणित कोशिकाओं में बँटवारा भी हेला कोशिकाओं में समय चूक माइक्रोस्कोपी द्वारा छुरा व्यक्त GFP-H2B (हरा) और क्षणिक mCherry व्यक्त-PCNA (लाल) द्वारा मनाया गया. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: FLIM और झल्लाहट-FLIM का विश्लेषण GFP-p53 और mCherry-53BP1. विभिन्न डीएनए घावों पर Photobleaching (FRAP) के बाद FLIM और प्रतिदीप्ति रिकवरी के आवेदन द्वारा प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा अंतरण (झल्लाहट) का पता चला । ( A-C) औसत (n = 10) GFP के जंमों-टैग किए गए p53 अनुपस्थिति और स्वीकारकर्ता (mCherry-53BP1) की उपस्थिति में, पूरे गैर-पुनरावृत्ति हेला कक्ष नाभिक में मापा जाता है । () प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति क्षय वक्रता और अवशिष्टों हेला कोशिकाओं में अध्ययन क्षणिक GFP व्यक्त-p53 (दाता-केवल, τडी) या GFP-p53 और mCherry-53BP1 (दाता-स्वीकारकर्ता, τदा). () औसत जीवनकालों (τ1 3) और आयाम (एक1 -एक3) के (एक) GFP-p53 और () mCherry-53BP1 में मापा पूरे हेला सेल नाभिक । χ2 मान भी परिकलित किए गए थे और दिखाए जाते हैं । () अच्छी तरह से ज्ञात बातचीत भागीदारों GFP-p53 और mCherry-53BP1 के लिए झल्लाहट दक्षता का सारांश । स्केल पट्टियां = 4-5 µm. झल्लाहट-FLIM परिणाम दिखा ~ ३५% अच्छी तरह से जाना जाता है सहभागिता भागीदारों GFP-टैग p53 और mCherry-टैग 53BP1 के लिए झल्लाहट क्षमता । (D) mCherry-53BP1 की वसूली कैनेटीक्स अनायास डीएनए घावों (हरी वक्र) और UVA-प्रेरित डीएनए घावों (नीला वक्र) में अध्ययन किया । डीएनए घावों पर mCherry (mCherry-53BP1 प्रोटीन के प्रोटीन का फैला हुआ रूप) पृष्ठभूमि के स्तर पर ब्लीच किया गया था, और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रत्येक मान से घटाया गया था । डीata, mCherry के सापेक्ष प्रतिदीप्ति तीव्रता के रूप में दिखाया-53BP1, मतलब ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । है छात्र टी परीक्षण डीएनए घावों के दो प्रकार के बीच एक सांख्यिकीय महत्वपूर्ण अंतर पता चला (* दिखाता है p ≤ ०.०५) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Video 1
वीडियो 1: mCherry की भर्ती-टैग PCNA प्रोटीन (लाल प्रतिदीप्ति) डीएनए हेला कोशिकाओं में स्थानीय microirradiation द्वारा प्रेरित घावों को छुरा GFP citrullinated (ग्रीन H2B) टैग व्यक्त । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Video 2
2 वीडियो: हेला कोशिकाओं में स्थानीय microirradiation द्वारा प्रेरित डीएनए घावों पर mCherry-tagged 53BP1 प्रोटीन (red प्रतिदीप्ति) का संचय. सेल नाभिक एक सॉफ्टवेयर मोड है कि अंतरिक्ष में सेल रोटेशन के दृश्य को सक्षम बनाता है का उपयोग कर 3 डी अंतरिक्ष में दिखाया गया है । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Video 3
Video 3: Microirradiated हेला कोशिकाओं को छुरा GFP-tagged citrullinated H2B (green प्रतिदीप्ति) बँटवारा के माध्यम से आगे बढ़ना. विकिरणित क्षेत्र GFP-H2B के घट की विशेषता है (काले क्षेत्रों सेल नाभिक के अंदर विकिरणित स्ट्रिप्स रहे हैं) । इस वीडियो को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

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Discussion

सूक्ष्म तकनीक अनुसंधान प्रयोगशालाओं में बुनियादी उपकरणों का प्रतिनिधित्व करते हैं । यहां डीएनए घावों पर प्रोटीन भर्ती और कैनेटीक्स के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले तरीकों का संक्षिप्त विवरण प्रस्तुत किया गया है । हम विशेष रूप से जीवित कोशिकाओं के स्थानीय microirradiation के क्षेत्र में हमारे प्रयोगात्मक अनुभव का उल्लेख किया है, और हम स्वीकारकर्ता द्वारा डीएनए घावों पर FRAP और प्रोटीन-प्रोटीन बातचीत द्वारा प्रोटीन कैनेटीक्स के अध्ययन पर चर्चा-ब्लीचिंग झल्लाहट28 और उसके उंनत संशोधन झल्लाहट-FLIM (चित्रा 4a-डी). यहां दिखाया तरीकों डीएनए की मरंमत की प्रक्रिया के एक सच्चे समझ के लिए आवश्यक उपकरण हैं, विशेष रूप से सेलुलर सिस्टम में रहने वाले प्रोटीन कैनेटीक्स, के रूप में उंनत फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा निरीक्षण किया6,7,8, 28. इन तरीकों के ऊतकों या निस्र्पक ट्यूमर सेल आकृति विज्ञान पर रेडियोथेरेपी के प्रभाव से निपटने में भविष्य दवा के लिए अपार उपयोगिता के हैं । इस विधि का अनुकूलन करने के लिए, हम अच्छी तरह से ज्ञात बातचीत प्रोटीन भागीदारों के साथ शुरू करने की सिफारिश करना चाहते हैं, जैसा कि चित्र 4cमें दिखाया गया है ।

यह सर्वविदित है कि डीएनए घावों को प्रोटीन भर्ती अत्यधिक गतिशील और समय पर निर्भर है; इस प्रकार, सेल विकिरण के बाद समय चूक फोकल माइक्रोस्कोपी के आवेदन न केवल बुनियादी विज्ञान के क्षेत्र में, लेकिन यह भी क्लीनिक में26की आवश्यकता है । लेजर के कारण स्थानीय रूप से प्रेरित डीएनए घावों microirradiation9,28,29 जीनोमिक क्षेत्रों जहां यह प्रोटीन भर्ती, प्रोटीन प्रोटीन, या प्रोटीन-डीएनए बाध्यकारी अध्ययन करने के लिए संभव है प्रतिनिधित्व करते हैं और बातचीत. इन पद्धतियों की प्रारंभिक बात यह है कि exogenous प्रोटीन की भर्ती अंतर्जात स्तर पर उपयुक्त एंटीबॉडी द्वारा सत्यापित की जानी चाहिए. अगले, इस तरह के प्रयोगों के महत्वपूर्ण कदम यह है कि ओवर-transfected कोशिकाओं को झूठे-सकारात्मक परिणाम प्रदान कर सकते हैं; इस प्रकार, सबसे अच्छा निर्णय के लिए सेल लाइनों की स्थापना के लिए छुरा फ्लोरोसेंट ब्याज की टैग प्रोटीन व्यक्त । इसके अलावा, छवि अधिग्रहण के लिए इस्तेमाल पराबैंगनीकिरण के phototoxic प्रभाव के कारण, या तो स्कैनिंग के लिए शर्तों अनुकूलित किया जाना चाहिए या Trolox यौगिक सेल खेती माध्यम में भंग किया जाना चाहिए । इसके अलावा विकिरण की सिफारिश की है पहले पूर्व संवेदनशील कदम के उंमूलन । स्थानीय microirradiation के बाद, डीएनए मरंमत ऐसी है कि कोशिकाओं का बँटवारा (चित्रा3ए-बी और वीडियो ३)से गुजरना चाहिए आगे बढ़ना चाहिए । लेजर विकिरण के बाद apoptosis की प्रेरण इष्टतम डीएनए की मरंमत23के दृष्टिकोण से एक कम मूल्यवान प्रक्रिया है । यह भी स्पष्ट है कि कुछ डीएनए मरंमत प्रोटीन केवल विशिष्ट कोशिका चक्र चरणों में डीएनए क्षति को पहचान (उदा, Bártová एट अल । 30). इस प्रकार, हेला-Fucci सेलुलर प्रणाली का उपयोग, चरण के व्यक्तिगत चरणों में कोशिकाओं को दिखा, डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए एक उपयोगी उपकरण है. इसके अलावा, सेल चक्र चरणों PCNA प्रोटीन के परमाणु वितरण पैटर्न के अनुसार31मांयता प्राप्त किया जा सकता है ।

यह सर्वविदित है कि FRAP और झल्लाहट तरीकों प्रोटीन है कि डीएनए घावों7,8,३२के लिए भर्ती कर रहे है की विशेषताओं की जांच के लिए बहुत उपयोगी उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं । इसके अलावा, FLIM तकनीक३२ प्रोटीन है कि डीएनए घावों पर संचित के गतिशील गठन परिवर्तन के बारे में जानकारी प्रकट कर सकते हैं । इस विधि का उपयोग महत्वपूर्ण है क्योंकि FLIM उपाय गतिशील सेलुलर प्रक्रियाओं सीधे; इस प्रकार, स्थिर राज्य प्रतिदीप्ति तीव्रता समय के साथ मापा जाता है । FLIM दृष्टिकोण पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति को नष्ट करने के द्वारा छवि कंट्रास्ट बढ़ाएँ । यह पारंपरिक स्वीकारकर्ता-ब्लीचिंग झल्लाहट की तुलना में झल्लाहट-FLIM माप का एक लाभ है. FLIM द्वारा मापा प्रतिदीप्ति जीवनकालों फ्लोरोसेंट टैग प्रोटीन के अंशों के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं और शो कैसे heterogenic जांच पर्यावरणीय स्थितियों के कारण कर रहे हैं । FLIM भी सबसे अच्छा और सबसे विश्वसनीय भौतिक दृष्टिकोण के लिए३२,३३जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन संपर्क के लिए झल्लाहट प्रदर्शन करने के लिए है ।

एक साथ ले लिया, वर्णित विधियों के सभी संभावित मानव कोशिकाओं है, जो विशेष रूप से radiotherapeutic दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण है में डीएनए क्षति प्रतिक्रिया के नए तंत्र प्रकट करने के लिए है । उदाहरण के लिए, multiphoton FLIM चिकित्सा, जहां यह multiphoton टोमोग्राफी३४कहा जाता है में उच्च संकल्प छवियों को प्राप्त करने के लिए लागू किया गया है । यह अत्यधिक परिष्कृत सूक्ष्म विधि histochemical नमूनों का उपयोग कर कैंसर निदान के लिए क्लीनिक में लागू किया जा सकता है और उच्च संकल्प के साथ विश्लेषण । FLIM तरीके इसके अतिरिक्त ट्यूमर सेल का एक सटीक विश्लेषण उनके autofluorescence के अनुसार प्रदान कर सकते हैं । FLIM-झल्लाहट विधि का एक नुकसान अपनी अत्यधिक परिष्कृत सॉफ्टवेयर पृष्ठभूमि है, जो पूरी तरह से माइक्रोस्कोप ऑपरेटर द्वारा समझा जाना चाहिए है । FLIM डेटा की आगे की जैविक प्रासंगिकता, सामान्य रूप में और डीएनए मरम्मत प्रक्रियाओं में, निश्चित रूप से निकट भविष्य में पता चल जाएगा.

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Disclosures

लेखक घोषणा करते हैं कि हितों का कोई टकराव नहीं हैं.

Acknowledgments

इस काम को चेक गणराज्य की ग्रांट एजेंसी, प्रोजेक्ट P302-12-G157 ने सपोर्ट किया था । प्रयोग भी चेक-नार्वे अनुसंधान कार्यक्रम CZ09, जो नार्वे कोष द्वारा निगरानी की है द्वारा समर्थित थे, और शिक्षा, युवा और चेक गणराज्य के खेल के मंत्रालय द्वारा (अनुदान संख्या: 7F14369) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

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References

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