Avanzadas técnicas de Microscopía Confocal para estudiar las interacciones proteína-proteína y cinética en las lesiones del ADN

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Biology

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Summary

Microirradiation láser es una herramienta útil para estudios de reparación del ADN en las células vivas. Se muestra un enfoque metodológico para el uso de láseres de rayos UVA para inducir varias lesiones del ADN. Hemos optimizado un método para microirradiation local que mantiene el ciclo normal de la célula; así, las células irradiadas proceden a través de mitosis.

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Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

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Abstract

Microirradiation local con láser representa una herramienta útil para estudios de procesos relacionados con la reparación de DNA en células vivas. Aquí, describimos un enfoque metodológico para el análisis de la cinética de la proteína en las lesiones del ADN sobre interacciones proteína-proteína o tiempo en localmente microirradiated cromatina. También nos enseña a reconocer las fases individuales del ciclo celular utilizando el sistema celular Fucci para estudiar la cinética de la proteína dependiente de ciclo celular en las lesiones del ADN. Una descripción metodológica de la utilización de dos láseres UV (355 nanómetro y 405 nm) inducir diferentes tipos de daño de la DNA también se presenta. Sólo el microirradiated de las células por el láser de 405 nm diodo procedió normalmente a través de la mitosis y se desprovisto de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). También mostramos cómo las células de microirradiated pueden ser fijo en un momento dado para llevar a cabo la inmunodetección de proteínas endógenas de interés. Para los estudios de reparación de ADN, además se describe el uso de métodos biofísicos como FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo) FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) en las células con que se producen espontáneamente focos de daño de ADN. También se muestra una aplicación de FLIM-FRET (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia) en los estudios experimentales de las interacciones proteína-proteína.

Introduction

Daños en el ADN conduce a la aparición de las lesiones del ADN de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine y sola o doble cadena rompe1,2. Los rayos γ son la forma de radiaciones ionizantes con la más alta energía y alta penetrancia, así esta fuente de radiación es ampliamente utilizada en radioterapia3. Por otro lado, experimentalmente inducida por daño en el ADN causada por lásers imitadores naturales la exposición Ultravioleta a los rayos UV. Microirradiation UVA, como un método microscópico, representa una herramienta experimental para el estudio de daño de la DNA en células vivas individuales. Microirradiation fue utilizado por primera vez hace 40 años para revelar la organización del cromosoma regiones4,5. Esta técnica es altamente dependiente de cualquiera de las propiedades funcionales de microscopios confocales o los límites técnicos de nanoscopía moderno. Para inducir las lesiones del ADN, las células pueden ser presensitized por 5' bromodeoxiuridina (BrdU) o Hoechst 33342 antes de la irradiación UV. Bártová et al. 6 había descrito anteriormente el paso presensitization, y recientemente hemos optimizado esta técnica de microirradiation para evitar la muerte celular o apoptosis. Por ejemplo, el uso de un láser UV de 405 nm (sin presensitization de Hoechst 33342) conduce a la inducción de roturas de doble cadena 53BP1 positivo (distritales) a expensas de dímeros de pirimidina ciclobutano (CPDs). Por otro lado, pasos presensitization combinados con microirradiation UV inducen niveles muy altos de CPDs y distritales simultáneamente7,8. Esta metodología es difícil de aplicar al estudio de una sola vía de reparación de ADN.

Con microirradiation, es posible analizar el reclutamiento de proteínas, cinética y la interacción en las lesiones del ADN en las células vivas. Un ejemplo de este método fue publicado por Luijsterburg et al. 9 1β de proteína de la heterocromatina, y recientemente se demostró para la primera vez que los factores de pluripotencia Oct4 y una proteína vinculada con los cuerpos de Cajal, coilina, son reclutados al ADN inducido por UV lesiones6,10. Cinética de la proteína en estas lesiones de ADN también pueden ser estudiadas usando el FRAP (recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo)11,12,13 o traste técnicas (energía de resonancia de la fluorescencia transferencia)14 ,15. Estos métodos tienen el potencial para revelar la simple difusión de proteínas en las lesiones del ADN o las interacciones proteína-proteína. Una herramienta útil para la caracterización adicional de las proteínas es FLIM (vida proyección de imagen de microscopía de fluorescencia) o su combinación con FRET tecnología (FLIM-FRET)16. Estos métodos permiten el estudio de los procesos en la vida las células que son estable o transitorio expresando la proteína de interés con la etiqueta por una molécula fluorescente17. Aquí, se muestra un ejemplo de decaimiento exponencial de tiempo (τ) para proteína p53 tagged GFP y su socio de la interacción, etiquetado mCherry 53BP1, desempeñando un papel importante en el daño de ADN respuesta18,19 . El parámetro τ, la vida útil del fluorocromo proporcionado por cálculos del FLIM, es específico para un colorante de fluorescencia dado, sus capacidades de Unión y su entorno celular. Por lo tanto, este método puede nos muestran diferencias entre subpoblaciones de la proteína, sus habilidades de enlace y sus propiedades funcionales después de, por ejemplo, daños en el ADN.

Aquí, un resumen de los enfoques metodológicos de las técnicas de microscopía avanzada que se utiliza en nuestro laboratorio para estudiar el reclutamiento de proteínas específicos, cinética, difusión y las interacciones de la proteína-proteína en el sitio de la cromatina microirradiated se presenta. La metodología paso a paso para la inducción de lesiones locales del ADN en las células vivas y una descripción de las metodologías útiles para estudios de eventos relacionados con el daño de DNA en lesiones de ADN localmente inducidas causadas por láseres UV son proporcionados.

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Protocol

1. cultivo de líneas celulares

  1. líneas de células HeLa
    Nota: las células del carcinoma cervical HeLa uso: ya sea células HeLa expresando estable histona H2B etiquetadas con GFP o Fucci HeLa células expresando RFP Cdt1 en el G1 y fases iniciales de S y GFP-geminin en las fases S/G2-M ( figura 1).
    1. Para el cultivo de todas las líneas de células HeLa, utilizar Dulbecco ' s modificado Eagle ' medio de s (DMEM) suplementado con 10% suero fetal bovino y antibióticos apropiados a 37 ° C en una atmósfera humidificada con 5% CO 2. Reemplazar el medio 2 - 3 veces por semana.
    2. Quitar el medio de cultivo y enjuague las células usando 1 x PBS para eliminar todos los restos de suero que contiene el inhibidor de tripsina. Realizar este paso en una campana de biológicos a temperatura ambiente.
    3. Agregar 1 mL de solución de tripsina-EDTA precalentada para cubrir la capa de la célula y mantener las células en las células Trypsinize de 37 ° C. hasta que capa de la célula se dispersa (generalmente 3-5 min).
    4. Añadir 3 mL de medio de cultivo completo precalentado para inactivar tripsina-EDTA y el medio de la dispersión mediante pipeteo suavemente varias veces.
      Nota: Este procedimiento debe realizarse en una campana de biohazard para proteger al operador contra contaminantes y mantener las condiciones de cultivo celular óptimo.
    5. Cuenta las células usando un contador celular automático o una cámara de Bürker. Diluir la suspensión de 1 × 10 5 células/mL y una pipeta, 5 mL en un plato nuevo. Incube las células a 37 ° C y 5% CO 2.
  2. Cultivo de ratón embrionario las células madre (troncales), línea celular de D3
    1. troncales cultura de célula cultura platos cubiertos con medio de mantenimiento de gelatina y mESC de 0.2%. Incube las células a 37 ° C y 5% CO 2.
      Nota: Se recomiendan preparar el medio de cultivo y mantenimiento de troncales en alícuotas de 50 mL y almacenar a 2-8 ° C hasta por 2 semanas. El medio de la mESC contiene 75 mL ES célula FBS, 5 mL de penicilina G y estreptomicina, 5 mL aminoácidos no esenciales (10 mM) (concentración final 0,1 mM), 50 μl del ratón Factor inhibidor de leucemia (mLIF; 100 μg/mL) (concentración final 10 ng/mL), 430 μl MTG (1- Thioglycerol; dilución 1: 100 en DMEM) (concentración final 100 μm) y el medio DMEM de glucosa alta hasta 500 mL.
    2. Aspirar el medio de cultivo mESC de la placa de cultivo y enjuague las celdas una vez con PBS 1 x.
    3. Añadir 0,5 mL de tripsina-EDTA e incubar a 37 ° C hasta que las células comienzan a separar de la fuente. A continuación, desactivar la tripsina por lavar las células con 2 mL de mESC cultivo suplementado con suero bovino fetal 15%.
    4. Utilizar una pipeta para desalojar las células restantes de la fuente de cultura.
      Nota: Es importante obtener las células, porque grupos de células promueven la diferenciación de las células.
    5. Células del
    6. Split 1:10 en platos gelatinizadas con medio de mantenimiento mESC.
      Nota: Si la densidad de las células de la mESC es demasiado baja, no crecen bien; Si la densidad es demasiado alta, se promueve diferenciación.
    7. Asegurar que troncales se mantienen en un estado indiferenciado realizando mESC paso cada segundo día dividiendo las células de una placa de Petri en cuatro nuevos platos. Inspeccione las colonias mESC con un microscopio invertido debajo de 100 X o 200 aumentos y si hay evidencia de mES espontánea de diferenciación celular, realizar manchas blancas /negras occidentales para evaluar el agotamiento de la proteína Oct4.
      Nota: Con pases de óptima de la célula, diferenciación espontánea de troncales en vitro puede reducirse.

2. Transfección de la célula

  1. semilla células 48 h antes de experimentos en platos de microscopia cuadriculada (diámetro 35 mm) con el fin de encontrar las células de microirradiated según sus coordenadas en la caja Petri.
    Nota: Este es un ejemplo en que microirradiation es el primer paso experimental e inmunotinción es el segundo ( figura 2A).
    1. Para la siembra, utilizar una concentración de 5 x 10 4 células/mL de líneas de células HeLa (o 1 × 10 4 células/mL para D3 mES las células). Uso hasta medio completo 2 mL por caja. Durante el cultivo y microirradiation, a mantener las células en una cámara termostato o cultivo a 37 ° C y 5% CO 2.
    2. Cuenta las células usando un contador celular automático.
      Nota: No use una concentración más alta de las células. Especialmente en el caso de colonias densamente de troncales de D3, alta densidad celular impide una identificación de células de microirradiated localmente después de immunostaining.
  2. Preparar reactivo de ADN y transfección de plásmidos de elección como sigue. Preparar Solución A 2-3 μg de ADN del plásmido seleccionado (véase la Tabla de materiales para los detalles) y 150 μL 1 x PBS. Preparar la Solución B con 3.5 μl de reactivo de transfección en 150 μL 1 x PBS. Asegúrese de que cada solución está bien mezclado mediante pipeteo cuidadoso.
    Nota: La relación óptima de ADN y transfección reactivo debe determinarse empíricamente para cada línea celular y plásmido individual.
  3. En 24 h antes de la observación experimental de vida transitorio transfected las células, se combinan solución A y solución B sin Vortex. Incubar las soluciones combinadas a temperatura ambiente durante 15-20 minutos. En una forma gota a gota, homogéneamente dispersos esta completa mezcla de transfección (300 μL, como se describe en el punto 2.2) en la capa de células que crecen en el plato de la microscopia.
  4. Incubar las células a 37 ° C y 5% CO 2 4-6 h, vuelva la mezcla de transfección con medio fresco. Cultivar células bajo condiciones estándar de.
    Nota: Cuando se utiliza un láser de 405 nm, no presensitize las células con cualquier reactivo, pero cuando se utiliza un láser de 355 nm, realizar presensitization de celular con 10 μm 5-bromo-2 ' - deoxy - uridina (BrdU) 7 , 8 . Tiempo presensitization depende del tipo celular y la duración del ciclo celular. Para las células HeLa, añada BrdU 16 a 20 h antes de microirradiation local. En el caso de troncales, añada BrdU 6 a 8 h antes de microirradiation.

3. Inducción de lesiones locales de ADN y Microscopía Confocal

  1. Coloque el plato sobre la platina del microscopio y registrar la posición de las celdas seleccionadas en el plato, las coordenadas de la celda se necesitarán para su posterior análisis ( figura 2A - c).
  2. Encontrar celdas transfected en un cuadrado con un número o una letra ( figura 2A d-f, flechas en Mostrar anuncio la ubicación de la célula se multiplica en paneles Ae y Af). Obtener una imagen de las celdas mediante microscopía de campo brillante y adquirir una imagen de fluorescencia para identificar la posición de las celdas y la Plaza marcada ( figura 2A).
  3. Para adquisición de imágenes antes de la irradiación, utilizar un láser de luz blanca (WLL) (470-670 nm en incrementos de 1 nm) conectado con el microscopio confocal (u otro láser disponible conectado a la confmicroscopio OCAL).
  4. Utilice la siguiente configuración: 512 × 512 píxeles de resolución, píxeles tamaño 64 nm, 400 Hz, modo bidireccional (análisis en dos direcciones), línea media establecido en 8, zoom 8 x a 12 x.
    Nota: Promedio de la línea representa un número determinado de exploraciones; la misma línea se escanea varias veces antes de continuar a la siguiente línea. Repetidos análisis de todas las líneas de producción el encuadre final de la imagen.
  5. Para observación de imagen y adquisición, utilice un objetivo de aceite de 63 × con una apertura numérica de 1.4 y secuencialmente adquirir imágenes de fluorescencia. Eliminar la interferencia entre los dos fluorocromos usando el modo de escaneo secuencial del software apropiado.
    Nota: Todo el software de microscopio permite a la configuración de un supuesto modo de exploración secuencial. El operador puede optar por adquirir los fluorocromos ' información simultáneamente (por ejemplo, en fluorescencia roja, verde y azul) o, como se ha mencionado aquí, individualmente (secuencialmente), fluorocromo de fluorocromo. Tener en cuenta la información general que la máxima excitación/emisión de GFP es 395/509 nm y la máxima excitación/emisión de mCherry es 587/610 nm (véase fluorocromos utilizados aquí en la figura 2B). Basado en esta información, seleccione la excitación adecuada y filtros de emisión de los fluorocromos deseadas. Selección de filtro y análisis de procedimientos deben ser optimizados para cada microscopio confocal.
  6. Para la inducción de lesiones del ADN, uso 64 línea escaneo modo, apagar el WLL (en ' adquisición ' modo), encienda la fuente de UV (en " láser UV " botón), la región de interés (ROI) (en ' adquisición ' modo) y 355-nm laser al 100% de potencia o, alternativamente, utilizar una fuente láser de 405 nm.
    Nota: Generalmente, energía del laser se ajusta mediante el botón de ajuste de láser adecuada en modo de adquisición de imagen.
  7. Para microirradiation local, usar láseres que emiten en el espectro cercano de UVA. Para microirradiation de ROI en el núcleo y para captura de imagen, establecer el fondo a cero en el modo de adquisición de imagen para regular intensidad de láser fuera el retorno de la inversión; Si la célula se irradia correctamente la señal de GFP-histona H2B desaparecerá y, por ejemplo, etiquetado mCherry la proteína PCNA se reclutarán a las lesiones del ADN inmediatamente después de la irradiación ( figura 2B y Video 1 ).
    Nota: Una lesión en el ADN inducidos en el ROI de una sección confocal también aparece en proyección tridimensional (3D) (ver rotación 3D y x-y, x-z, proyecciones y-z en la figura 2 y Video 2). Para las descripciones de los parámetros técnicos completos de 355 nm y 405 nm láser, ver Stixová et al. 7
  8. después del retorno de la inversión ha sido irradiado, apague la fuente de UV, apague el ROI, encienda el WLL, cambiar la línea a 8 y encuentra otra célula de irradiación. Para la selección de ROI, use el botón aplicable en el software ' el modo de adquisición de imagen de s.
    Nota: mCherry PCNA tiene un pico de máxima acumulación en las lesiones del ADN entre 2 y 20 min ( figura 2B). Para verificar el resultado de los niveles de proteínas exógenas, continuar con la inmunofluorescencia que manchaba inmediatamente después de la microirradiation local. Seleccione el intervalo de tiempo de irradiación según interés.
  9. Comprobar que una acumulación de proteínas exógenas puede detectarse en la mayoría de las células microirradiated. Para esta verificación, utilice los criterios en los siguientes pasos.
    1. Check que no hay sobreexpresión de la proteína exógena en las células transfected transitorio. Como una posible solución, elegir las células con sólo una débil expresión de la proteína fluorescente (p. ej., mCherry PCNA o 53BP1 mCherry).
    2. Evaluar la fototoxicidad de la exposición WLL para la adquisición de la imagen.
      Nota: Para la prueba de la fototoxicidad, exponer células transfected a láser prolongada microirradiation y comprobar que las células proceden a mitosis, como se muestra en la Figura 3A -B. Como una posible solución, reducir el análisis tiempo y número de rebanadas confocales por celular, optimizar la digitalización en 3D por la selección del óptimo paso axial (0,3 μm se recomienda) y configurar el láser ' s potencia en el mínimo. Alternativamente, fototoxicidad puede ser eliminada utilizando el Trolox (ácido 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic, un análogo hidrosoluble de la vitamina E) disuelto en el medio de cultivo. Para los experimentos relacionados con el daño del ADN, no se recomienda uso de Trolox debido a su efecto protector contra la radiación UV.
    3. En caso de irradiación con laser de 355 nm, verificar suficiente incorporación de BrdU usando un anticuerpo de detección de BrdU apropiado de la incorporación de BrdU kit (véase Tabla de materiales). Puesto que la BrdU es incorporado al ADN durante la fase S del ciclo celular, la mayoría de las células debe proceder a través de la fase S durante presensitization. Como una posible solución, tener en cuenta la duración del ciclo celular, que es el tipo de célula específico.
    4. Analizar si la reparación de la DNA proteínas de interés tiene una capacidad para reconocer las lesiones del ADN en específico de ciclo celular fases. Una posible solución: Para comprobar que el reclutamiento de las proteínas a las lesiones del ADN está restringida a fases del ciclo celular específica (S/G1/G2), utilice las células HeLa-Fucci. Estas células expresan RFP Cdt1 en las tempranas fases de S y G1 y etiquetada GFP geminin en S/G2-M ciclo celular fases 22 ( figura 1).
    5. Para evitar la apoptosis, muerte celular, seleccione una fuente de láser adecuado y láser encendido ajuste 23. Tenga en cuenta que irradiado células debe proceder a la mitosis ( Figura 3A -B, Video 3).
      Nota: Apoptosis indeseado puede detectarse positividad de anexina V, caspasa 3 o escote B lamin. En el nivel morfológico, la separación de la célula y formación de cuerpos apoptóticos se verán.

4. Tinción de inmunofluorescencia

  1. enjuague brevemente la capa de células (crecimiento en platos de microscopio) con 1 x PBS y después de enjuagar, fijar las células con formaldehído al 4% durante 10 minutos (para las líneas de células HeLa) o 20 minutos (para D3 ES cells) a temperatura ambiente. Enjuagar el plato con 1 x PBS.
    PRECAUCIÓN: Formaldehído causa daño grave en los ojos, puede provocar reacciones alérgicas de la piel y también es un carcinógeno potencial; por lo tanto, se deben realizar todos los pasos experimentales con formaldehído en una campana extractora.
    Nota: Para evitar blanqueo innecesaria de señales de fluorescencia, guardar el plato en una cámara oscura durante el tiempo de incubación necesario para la tinción de inmunofluorescencia.
  2. Permeabilizar células con 0,1% Tritón X-100 disuelto en H 2 O 8 min y luego incubar las células durante 12 minutos con PBS de × 1 que contienen saponina 0.1% y 0,1% Tritón X-100. Después de la incubación, lavar las celdas de 1 x PBS dos veces por 15 minutos
  3. Incubar las células con 1% de BSA en PBS durante 60 min para bloquear la Unión inespecífica de anticuerpos seleccionados de 1 x. Celdas de 1 x PBS para 15 minutos de lavado después de la incubación.
  4. Anticuerpo primario
  5. diluido en una proporción de 1: 100 (o 1: 200) (este paso debe ser optimized para anticuerpos individuales) en el 1% de BSA en 1 x PBS, utilizando 25 μl de esta solución por plato y cubrir las células con un cubreobjetos. Incubar las células con la solución que contiene el anticuerpo primario en una cámara humidificada durante la noche a 4 ° C.
  6. Al día siguiente, lave las células 1 x PBS dos veces por 5 min
  7. Diluir el anticuerpo secundario en una proporción de 1: 100 (o bien 1: 200) en 1% de BSA en 1 x PBS, con 100 μl de esta solución por plato y cubre las células con un cubreobjetos. Incubar las células con la solución que contiene el anticuerpo secundario de 60 minutos. Después de la incubación, lavar las celdas de 1 x PBS tres veces durante 5 minutos
  8. Montar el cubreobjetos con una gota de medio de montaje y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas o pegamento para prevenir el secado y movimiento durante la observación microscópica. Guardar el plato en la oscuridad a 4 ° C.

5. Microscopía de fluorescencia de imagen de toda la vida (FLIM)

software
  1. comienzo el FLIM. Abierta la " Suite de aplicaciones " del software y cambiar a la " FLIM " modo. Asegúrese de que el WLL funciona en modo pulsado.
    Nota: El operador debe cambiar un botón de hardware para ir al modo de pulso.
  2. Colocar el plato que contiene las células manchadas (teñidas en la sección 4) en la platina del microscopio en la misma orientación que durante microirradiation local y encontrar las células irradiadas según las rejillas en la caja Petri. Realizar la adquisición de imágenes por microscopio confocal.
    Nota: Utilice la siguiente configuración: modo de 1024 × 1024 Pixeles, 400 Hz, bidireccional, 16 líneas, zoom 8 x a 12 x.
  3. Antes de comenzar la medición del FLIM, realice una prueba preliminar para mostrar un registro en tiempo real de decaimiento exponencial, haciendo clic en " FLIM de configuración " y " adquisición " y presionando " prueba de FLIM de ejecutar ". Optimizar los parámetros FLIM de la muestra mediante la evaluación de los dos parámetros principales como sigue.
    1. Optimizar la tasa de repetición de WLL con la longitud de onda de excitación ajustada a la duración de la muestra (ver nota más abajo). En el software del microscopio confocal, ajustar la intensidad del láser con el boton que se llama generalmente " ajuste del laser " en la ' adquisición de la imagen ' menú. A continuación, calcular una curva de decaimiento (o histograma que muestra todas las cuentas del fotón) utilizando el software FLIM (ver Figura 4A -B).
      Nota: Use el WLL en modo del pulso de excitación. El software debe estar equipado con un selector de pulso para WLL, que permite la selección de la tasa de repetición (80, 40, 20 o 10 MHz). La longitud de onda de excitación en el caso de la donante la fluorescencia de GFP, es de 488 nm. La curva de decaimiento se registra utilizando el espacio de trabajo de software FLIM. El parámetro (τ D, τ DA) muestra tiempos de decaimiento exponencial (e.g., vida útil del fluorocromo); parámetro (A) representa la amplitud del decaimiento del fluorocromo (ver ejemplos de datos FLIM para p53 tagged GFP y 53BP1 mCherry marcados en la Figura 4A -B).
    2. Comprobar las tasas de repetición de cuenta utilizando la herramienta de adquisición de software (modo de tasa de repetición select). Seleccionar los píxeles más brillantes de la muestra; la curva para el píxel más brillante debe ser inferior al 10% de la intensidad de fluorescencia general.
  4. Clic en " medida " y pulse " ejecutar FLIM ".

6. donante toda la vida usando un Script del FLIM y eficiencia de cálculo de traste

  1. inicie el software de FRET-FLIM y abrir el ' donante ' área de trabajo.
  2. Seleccione el " Análisis " / " imagen " ficha en el menú y comenzar la secuencia de comandos FLIM haciendo clic en " empezar ". Para ajustes óptimos de FRET-FLIM, utilice conocidos socios de proteína interacción.
    Nota: La eficacia de FRET-FLIM para interactuar bien conocidos socios GFP-p53 y 53BP1 mCherry fue (34,1 ± 2.3) % ( figura 4).
  3. Utilice sólo el canal de emisión del donante (canal 1 o 2) y presiona " calcular rápidamente el FLIM ".
    Nota: La imagen y la gráfica dos se actualizará.
  4. Software en el traste-FLIM, establecer la escala de intensidad (0 - 4000 cuentas) y la escala de toda la vida (0 - 5 ns) manualmente en el software. Con este enfoque, visualizar la celda de interés y establecer la medida de FRET-FLIM.
    Nota: Esta opción elimina las diferencias en la intensidad de fluorescencia entre las células individuales en la población celular.
  5. En la forma de decaimiento, elegir el modelo de grifería.
    Nota: Se recomiendan reconvolution n exponencial y selección de parámetro de modelo " n ". Un ajuste óptimo tiene los siguientes criterios: la cabida sobrepone la curva la curva de decaimiento bien y la χ 2 - valor es igual a 1 ( Figura 4B).
  6. Seleccione el " umbral " / " uso umbral " y ajuste el umbral a 75. Iniciar " inicial de ajuste ".
    Nota: El software de SPT64 calcula la duración promedio del donante en la ausencia de trastes (" vida promedio ponderada de amplitud ", τ Av.Amp)

7. Eficiencia de traste usando el Script de FLIM-FRET

  1. Seleccione el espacio de trabajo del aceptador de la donante y a continuación, abra " Análisis " | " imagen " | " vida FRET imagen ".
  2. Seleccione a sólo el donante como el canal activo y ajuste píxel Binning dependiendo el número de fotones/pixel. A continuación, ejecute el modo de software llamado " FastFLIM calcular ". Si el número de fotones/píxel de la imagen es bajo, aumentar el Pixel Binning a 4 puntos.
  3. Ajustar la intensidad a 0 - 200 cuentas y toda la vida a 0 - 5 ns.
  4. Active " umbral de uso " e introduzca un límite de 75.
  5. Establece el modelo de montaje en " donantes Multi-exp ", introduzca el parámetro de modelo " n ", entrar τ Av.Amp (paso de 6.6) como un τ D y activar " ajuste inicial ".
  6. Configurar los parámetros de Bkgr dic, cambio IRF y Bkgr IRF a valores constantes por quitar la marca de.
    Nota: Ajustar la mayoría de parámetros se mantienen constantes tanto como sea posible. Este enfoque reduce las fluctuaciones estadísticas. En este caso, no pulse " inicial ajuste " otra vez. Siguen las descripciones de los parámetros mencionados: IRF = función de la respuesta del instrumento, BkgrDec = fondo del ajuste exponencial, ShiftIRF = IRF cambio de reconvolution exponencial en forma, BkgrIRF = fondo IRF de exponencial reconvolution ajuste. Los tres parámetros se calculan y se puede fijar usando el software para su posterior análisis.
  7. Prensa " FRETŔ calcular una FRET imagen (trazado en el área de imagen FLIM) traste histograma de eficiencia se calcula y se grafica un histograma de la distancia de trastes ( figura 4). Cuando termine el análisis de imagen, oprima " guardar resultado ".
    Nota: Durante los experimentos de traste, es necesario considerar que las proteínas fluorescentes presentan transiciones reversibles entre Estados no fluorescente (oscuro) y fluorescentes (brillante). Esta característica se llama " intermitente ", y traste eficiencia se ve afectada por este fenómeno (una explicación de este efecto fue proporcionada por Vogerl et al. 24).

8. Análisis FRAP

  1. lugar el dish sobre la platina del microscopio, encuentra el transfected las células expresando la proteína fluorescente etiquetada de interés y realizar la adquisición de imágenes con microscopía de campo brillante de la lámpara del microscopio estándar (ver figura 2Aa-b) y modos de la microscopia de fluorescencia.
    1. Para la adquisición de la imagen, utilice el láser de luz blanca (WLL) conectado con el microscopio confocal (o un láser de elección según el fluorocromo seleccionado). Utilice la siguiente configuración: 512 × 512 pixeles, 1000 Hz, bidireccional modo medio de la línea 1, zoom 8 x a 12 x.
    2. Adquisición de por lo menos 15 imágenes prebleaching (en la energía de laser del ~ 10%) y definir la región de interés (ROI) en el menú de adquisición de imagen.
  2. Photobleaching experimentos, utilizar un láser de argón (488 nm). Aplicar los siguientes ajustes: marco resolución de 512 × 512 pixels, 1000 Hz, modo bidireccional, zoom 8 x a 10 x.
    Nota: Fluorocromos como GFP, mCherry, RFP pueden ser excitados por un láser de argón en 488 nm o 514 nm.
  3. Utilizar el modo de software FRAP del microscopio de la opción. Durante el fotoblanqueo, ajustar el láser de argón ' s potencia máxima usando el botón de ajuste de láser. Realizar la adquisición de imágenes a intervalos 0,256 s a la energía del laser de 10%.
    Nota: Para postbleaching pasos, utilice el modo de adquisición de la imagen estándar del microscopio confocal de elección.
    1. Fluorescencia de monitor el tiempo de recuperación después de photobleaching (hasta 45-50 s después del procedimiento de blanqueamiento).
      Nota: Como se muestra en la figura 4, el tiempo de recuperación después de photobleaching para etiquetado mCherry 53BP1 es distinto en las lesiones espontáneas del DNA y los focos inducida por irradiación de rayos UVA. mCherry 53BP1 en lesiones UVA recuperadas rápidamente en comparación con acumulaciones mCherry 53BP1 en espontáneamente produciendo focos; de reparación del ADN Ver figura 4 y Foltankova et al. 25
  4. exportar los datos desde el software del microscopio (o el software de elección) a una hoja de cálculo y realizar análisis estadístico.

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Representative Results

Utilizando microscopía confocal avanzada, se observó una acumulación de proteínas 53BP1 y PCNA mCherry mCherry etiquetadas en las lesiones del ADN. Se realizaron análisis por microirradiation local de las células vivas. Para reconocer los patrones de distribución nuclear de proteínas relacionadas con la reparación de ADN en cada ciclo celular fases, hemos utilizado el sistema celular Fucci, por la que es posible determinar la G1, S temprano, y las fases G2 de la célula (figura 1). La aplicación biológica del modelo celular Fucci que publicamos en Suchankova et al. 26 muestra que 53BP1 fue reclutado a las lesiones del ADN localmente inducidas en las fases G1, S y G2 del ciclo celular, que se asoció con la función de esta proteína durante no homóloga se terminan uniendo (NHEJ), uno de los principales mecanismos que conducen a reparación de rotura de doble cadena. Por otro lado, este sistema experimental nos mostró el nivel celular individual que la proteína PCNA, que está vinculada a la vía de reparación de recombinación homóloga (HRR), reconoce distritales en las últimas fases S y G2 del ciclo celular 27. Para estudios sobre la maquinaria de reparación del ADN, también se optimizan las condiciones de irradiación para garantizar que los cultivos celulares continúan experimentan mitosis después de la exposición a láseres UV (figura 3). Microirradiated las células que experimentan mitosis demuestran que, en estas condiciones experimentales, ADN reparación procede de una manera relativamente fisiológica y las células no ha sido heridos por los rayos láser, que a intensidades más altas inducen la apoptosis. Aquí, mostramos cómo aplicar análisis de FRET-FLIM a la caracterización de proteínas de reparación del ADN. Esta avanzada tecnología nos permite estudiar las interacciones de la proteína-proteína locales en el núcleo de la célula o, alternativamente, las interacciones de proteínas en regiones nucleolares como nucléolo, lámina nuclear o los racimos de la heterocromatina. Para los principiantes en esta tecnología, nos gustaría recomendar la optimización de esta técnica de FRET-FLIM mediante socios de proteína interacción conocida como p53 y 53BP1 (Figura 4A-C). En general, un conocimiento de la interacción de proteínas conduce a comprender cómo complejos proteicos regulan procesos como la replicación, activación de gen, silenciamiento o la reparación del ADN. Además, una herramienta muy útil para estudios de cinética de la proteína es el método FRAP, que muestra las características de difusión local de la proteína y la movilidad (figura 4). Tomados en conjunto, aquí ofrecemos las instrucciones metodológicas para la aplicación de técnicas avanzadas de microscopía confocal en el ADN reparación estudios.

Figure 1
Figura 1: se puede estudiar la formación de focos de reparación del ADN en células de HeLa-Fucci expresando RFP-cdt1 (rojo) en las fases G1 y S principios y GFP-geminin (verde) en las fases S/G2 del ciclo celular. Espontáneamente que ocurren las lesiones de ADN positivas para la proteína 53BP1 (azul; La coloración Alexa 405), fueron estudiados en el G1 (rojo), S temprano (naranja; expresión de geminin GFP y RFP cdt1) y G2 (verde) las fases del ciclo celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: contratación de PCNA mCherry etiquetadas en las lesiones del ADN con el tiempo. (A) las células que expresan mCherry-PCNA (rojo), se encontraban en un plato de microscopio cuadriculada en regiones seleccionadas (gris). Después de la fijación y el immunostaining, las células irradiadas (flechas amarillas) fueron situadas según coordenadas registrados (véase la carta gris K por ejemplo) (Aa-c). El marco amarillo y flechas (Ad) muestran la celda que fue ampliada en paneles Ae-f y microirradiated. (B) acumulación de mCherry-PCNA (rojo) fue estudiada en células de HeLa estable expresando GFP-tagged histona H2B (verde). Las células fueron supervisadas inmediatamente después de la microirradiation local para hasta 35 min (ver Video 1). (C) Microirradiated células se analizaron por microscopia confocal 3D, y acumulación de la proteína en las lesiones del DNA (p. ej., mCherry 53BP1) fue encontrada en las tres dimensiones (x-y, x-z y y z) aunque sólo la parte media del núcleo de la célula fue microirradiated (véase la rotación celular 3D en Video 2 proyecciones en 3D en la figura 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: células microirradiated por un diodo láser de 405 nm proceder normalmente a través del ciclo celular. (A) después de la irradiación con un láser de diodo de 405 nm, las células HeLa (estable expresando GFP-histona H2B; verde) sufren mitosis (ver también Video 2). Marcos y flechas amarillas indican ROI irradiada en las celdas seleccionadas. Marcos blanco ver mitosis. (B) en las mismas condiciones experimentales, mitosis en las células irradiadas también fue observado por microscopia de lapso de tiempo en las células HeLa estable expresando GFP-H2B (verde) y transitorio expresando mCherry-PCNA (rojo). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: análisis FLIM y traste-FLIM de GFP-p53 y 53BP1 mCherry. La fluorescencia resonancia energía transferencia (traste) detectado por FLIM y la aplicación de recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo(FRAP) en varias lesiones del ADN. ( A-C) Promedio (n = 10) cursos de la vida de p53 de GFP-etiquetados en la ausencia y presencia del aceptador (mCherry-53BP1), medido en todo nonreplicating núcleos de células HeLa. Curvas de decaimiento (A) representante de la fluorescencia y residuos estudiaron en células de HeLa transitoriamente expresando GFP-p53 (sólo para donantes, τD) o GFP-p53 y 53BP1 mCherry (donador – aceptor, τDA). (B) media vida (τ - τ1 3) y amplitudes (A1 -3) de (un) mCherry-53BP1 GFP-p53 y (b) medición en los núcleos de toda célula HeLa. Se presentan y también se calcularon los valores χ2 . (C) Resumen de la eficacia de traste la conocida interacción GFP-p53 y 53BP1 mCherry. Barras de escala = 4-5 μm. traste-FLIM resultado mostrando ~ 35% traste eficiencia para interactuar bien conocidos socios p53 GFP-etiquetado y etiquetado mCherry 53BP1. (D) Cinética de recuperación de mCherry 53BP1 estudió en lesiones de DNA que ocurre espontáneamente (curva verde) y lesiones del ADN inducidas por la UVA (curva azul). mCherry en las lesiones del ADN fue blanqueado al nivel de fondo (forma dispersa de la proteína de la proteína 53BP1 mCherry), y la fluorescencia del fondo fue restada de cada valor. DATA, se muestra como la intensidad de fluorescencia relativa de mCherry 53BP1, se presentan como el medio ± error estándar. Prueba t de Student reveló una diferencia estadísticamente significativa entre los dos tipos de lesiones del DNA (* muestra p ≤0. 05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Video 1
Video 1: reclutamiento de la proteína PCNA mCherry etiquetadas (fluorescencia roja) a las lesiones del ADN inducidas por microirradiation local en HeLa células estable expresando GFP-etiquetadas las histonas H2B (fluorescencia verde). Haga clic aquí para descargar este video.

Video 2
Video 2: acumulación de proteína 53BP1 mCherry etiquetadas (fluorescencia roja) en las lesiones del ADN inducidas por microirradiation local en células HeLa. El núcleo de la célula se muestra en el espacio 3D utilizando el modo de software que permite la visualización de la rotación de la célula en el espacio. Haga clic aquí para descargar este video.

Video 3
Video 3: Microirradiated HeLa células estable expresando GFP-tagged histona H2B (fluorescencia verde) proceder a través de mitosis. La región irradiada se caracteriza por el agotamiento de GFP-H2B (regiones negro son irradiadas tiras dentro de los núcleos celulares). Haga clic aquí para descargar este video.

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Discussion

Técnicas de microscopía representan herramientas básicas en laboratorios de investigación. Aquí, una breve descripción de los métodos utilizados para el estudio de reclutamiento de la proteína y se presenta la cinética en las lesiones del ADN. Destaca especialmente la experiencia experimental en el campo de la microirradiation local de las células vivas, y discutimos el estudio de la cinética de la proteína por interacción proteína-proteína y FRAP en las lesiones del ADN por blanqueo de aceptador traste28 y su avanzada modificación traste-FLIM (Figura 4A-D). Los métodos que se muestran aquí son herramientas fundamentales para un verdadero entendimiento de los procesos de reparación del ADN, especialmente proteína cinética en sistemas celulares de la vida, como inspeccionados por microscopios confocal avanzada6,7,8, 28. Estos métodos son de inmensa utilidad para la medicina futura en el tratamiento de los efectos de la radioterapia sobre los tejidos o la caracterización de la morfología de la célula del tumor. Para optimizar este método, nos gustaría recomendar a partir de conocidos socios de proteína interactúan, como se muestra en la figura 4.

Es bien sabido que el reclutamiento de proteínas a las lesiones del ADN es altamente dinámica y dependiente del tiempo; así, la aplicación de la microscopia confocal de lapso de tiempo después de la irradiación de la célula es necesaria no sólo en el campo de la ciencia básica sino también en clínicas26. Lesiones de ADN local inducidas por láser microirradiation9,28,29 representan regiones genómicas donde es posible estudiar proteínas reclutamiento, proteínas o ADN de la proteína de Unión y interacción. El punto de partida de estos métodos es que el reclutamiento de proteínas exógenos debe ser verificado por los anticuerpos correspondientes en el nivel endógeno. A continuación, el paso crítico de dichos experimentos es que sobre-transfected las células pueden proporcionar resultados falsos positivos; por lo tanto, la mejor decisión es establecer líneas celulares estable expresando las fluorescencia etiquetas proteínas de interés. Por otra parte, debido a los efectos fototóxicos de los láseres utilizados para la adquisición de la imagen, deben optimizarse las condiciones para la exploración o Trolox compuesto debe ser disuelto en el medio de cultivo celular. Además la eliminación del paso presensitization antes de la irradiación se recomienda. Después de microirradiation local, debe proceder la reparación del ADN que las células sufren mitosis ()Figura 3A-B y Video 3). Inducción de apoptosis después de la irradiación del laser es un proceso menos valioso de la vista del ADN óptima reparación23. También es evidente que algunas proteínas de reparación del ADN reconozcan daños en el ADN sólo en fases de ciclo celular específica (p. ej., Bártová et al. 30). por lo tanto, el uso del sistema celular HeLa-Fucci, mostrando las células en las fases individuales de interfase, es una herramienta útil para estudios de ADN dañan respuesta. Además, las fases del ciclo celular pueden ser reconocidas según el patrón de distribución nuclear de la proteína PCNA del31.

Es bien sabido que los métodos de FRAP y trastes representan herramientas muy útiles para la investigación de las características de las proteínas que son reclutadas a ADN lesiones7,8,32. Por otra parte, el FLIM técnica32 puede revelar información sobre los dinámicos cambios conformacionales de las proteínas que se acumulan en las lesiones del ADN. El uso de este método es importante porque FLIM mide procesos celulares dinámicos directamente; así, la intensidad de fluorescencia de estado estacionario se mide con el tiempo. FLIM enfoques aumente el contraste de imagen mediante la eliminación de la fluorescencia de fondo. Esto es una ventaja de la medición de FRET-FLIM en comparación con el convencional FRET aceptor de blanqueo. La vida de la fluorescencia medida por FLIM proporcionan información sobre las fracciones de proteínas fluorescencia etiquetas y mostrar cómo heterogéneas sondas son debido a las condiciones ambientales. FLIM es también el mejor y más confiable enfoque biofísico a realizar traste para la interacción de proteínas en la vida de las células32,33.

Tomados en conjunto, todos los métodos descritos tienen el potencial para revelar nuevos mecanismos de la respuesta de daño de DNA en células humanas, que es importante especialmente para los enfoques radioterapéuticos conformados resultan. Por ejemplo, se ha aplicado para obtener imágenes de alta resolución en la medicina, donde se le llama tomografía multifotón34FLIM multifotón. Este método altamente sofisticado microscópica pueda ser aplicado en clínicas para el diagnóstico de cáncer mediante histoquímicas muestras y analizaron con alta resolución. Métodos FLIM además pueden proporcionar un análisis preciso de las superficies de células de tumor según la autofluorescencia. Una desventaja del método FLIM-FRET es su fondo de software altamente sofisticado, que debe ser entendida completamente por el operador del microscopio. Más importancia biológica de los datos de FLIM, en general y en procesos de reparación del ADN, sin duda se revelará en un futuro cercano.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay ningún conflicto de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue financiado por la Agencia de donación de la República Checa, proyecto P302-12-G157. Los experimentos también fueron apoyados por la CZ09 de programa de investigación Checa-Noruega, que es supervisado por los fondos noruegos y por el Ministerio de educación, juventud y deporte de la República Checa (número: 7F14369).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

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References

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