Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

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Biology

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Summary

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

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Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

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Abstract

Lokale Microirradiation mit Lasern stellt ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur-bezogenen Prozesse in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir einen methodischen Ansatz zur Analyse von Protein-Kinetik bei DNA-Läsionen über Zeit oder Proteinprotein Interaktionen auf lokal Microirradiated Chromatin. Wir zeigen auch, wie zu erkennen, einzelne Phasen des Zellzyklus mit dem Fucci zellulären System Zelle-Zyklus-abhängige Protein Kinetik bei DNA-Läsionen zu studieren. Eine methodische Beschreibung des Einsatzes von zwei UV-Lasern (355 nm und 405 nm), verschiedene Arten von DNA-Schäden zu induzieren auch vorgestellt. Nur die Zellen Microirradiated von 405 nm Diodenlaser führte normalerweise durch Mitose und waren frei von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Wir zeigen auch, wie Microirradiated Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt auszuführende Immunodetection der körpereigene Proteine des Interesses behoben werden können. Für die DNA-Reparatur-Studien, beschreiben wir zusätzlich die Verwendung von biophysikalischen Methoden einschließlich FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz) und FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) in Zellen mit spontan auftretender DNA Beschädigung Brennpunkte. Wir zeigen auch eine Anwendung der FLIM-FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) in experimentellen Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Introduction

DNA-Schädigung führt zum Auftreten von bestehend aus Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine und Einzel-Strang DNA-Läsionen oder Doppel-Strang bricht1,2. Γ-Strahlen sind die Form von ionisierender Strahlung mit der höchsten Energie und hohe Penetranz, damit diese Quelle der Strahlung ist weit verbreitet in Strahlentherapie3. Auf der anderen Seite induziert experimentell DNA-Schäden durch UV-Laser imitiert natürliche Belichtung mit UV-Licht. UVA-Microirradiation darstellt als eine mikroskopische Methode, ein experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von DNA-Schäden in einzelne lebende Zellen. Microirradiation wurde erstmals vor 40 Jahren verwendet, um die Organisation von Chromosom Regionen4,5zu offenbaren. Diese Technik ist stark abhängig von entweder die funktionellen Eigenschaften der konfokalen Mikroskopen oder die technischen Grenzen des modernen Nanoskopie. DNA-Läsionen zu induzieren, können Zellen durch 5' Bromodeoxyuridine (BrdU) oder Hoechst 33342 vor UV-Bestrahlung presensitized. Bártová Et al. 6 zuvor beschrieben die presensitization Schritt, und vor kurzem haben wir diese Microirradiation-Technik zur Vermeidung von Zelltod oder Apoptose optimiert. Beispielsweise führt der Einsatz von 405nm UV Laser (ohne Hoechst 33342 Presensitization) zur Induktion von 53BP1-positiven Doppel-Strangbrüchen (DSB) auf Kosten von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Auf der anderen Seite presensitization Schritte in Kombination mit UV-Microirradiation verursachen sehr hohe CPDs und DSB gleichzeitig7,8. Diese Methodik ist schwierig, auf die Studie eines einzelnen DNA-Reparatur-Signalwegs anzuwenden.

Mit Microirradiation ist es möglich, Protein-Rekrutierung, Kinetik und Interaktion auf DNA-Läsionen in lebenden Zellen zu analysieren. Ein Beispiel für diese Methode wurde von Luijsterburg Et Al. veröffentlicht. 9 für Heterochromatin Protein 1β, und wir zeigten vor kurzem zum ersten Mal, das der Pluripotenz Faktor Oct4 und ein Protein assoziiert mit Cajal Körpern, coilin, UV-induzierten DNA-Läsionen6,10eingestellt werden. Protein-Kinetik bei dieser DNA-Läsionen können auch untersucht werden, mit Hilfe der FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz)11,12,13 oder FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) Techniken14 ,15. Diese Methoden haben das Potenzial, einfache Diffusion von Proteinen an DNA-Läsionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu offenbaren. Ein nützliches Werkzeug für zusätzliche Charakterisierung von Proteinen ist FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) oder die Kombination mit Bund Technologie (Bund-FLIM)16. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Prozessen in lebenden Zellen, die stabil sind oder vorübergehend mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses von ein fluoreszierendes Molekül17getaggt. Hier ist ein Beispiel für exponentielle Abfallzeit (τ) für GLP-Tags p53 Protein und seine Interaktionspartner, mCherry Verschlagwortet mit 53BP1, spielen eine wichtige Rolle im DNA-Schaden Antwort18,19 . Der Parameter τ ist die Lebensdauer der Fluorochrom von FLIM Berechnungen zur Verfügung gestellt spezifisch für einen bestimmten Fluoreszenz-Farbstoff, seine Bindung-Fähigkeiten und seiner zellulären Umgebung. Daher kann diese Methode uns Unterscheidungen zwischen Protein Subpopulationen, ihre Bindung Fähigkeiten und ihre funktionellen Eigenschaften nach, z. B. DNA-Schäden zeigen.

Hier ein Überblick über die methodischen Ansätze der moderne Mikroskopiertechniken, die in unserem Labor verwendet wird, um Zeit-spezifischen Protein Rekrutierung, Kinetik, Diffusion und Protein-Protein-Interaktionen auf dem Gelände von Microirradiated Chromatin zu studieren wird vorgestellt. Die Schritt für Schritt Methode für die Induktion von lokalen DNA-Läsionen in lebenden Zellen und eine Beschreibung der Methoden, die nützlich für die Studien von DNA-Schäden im Zusammenhang mit Veranstaltungen im lokal induzierte DNA-Läsionen verursacht durch UV-Laser sind vorgegeben.

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Protocol

1. Anbau von Zell-Linien

  1. HeLa-abgeleitete Zellinien
    Hinweis: Verwendung HeLa zervikalen Karzinomzellen: entweder stabil auszudrücken Histon H2B HeLa-Zellen mit dem Stichwort GLP oder HeLa-Fucci Zellen mit dem Ausdruck RFP-Cdt1 in der G1 und frühen S-Phase und GLP-Geminin in den S/G2-M-Phasen ( Abbildung 1).
    1. Für den Anbau alle HeLa-abgeleitete Zellinien verwenden Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und geeigneten Antibiotika bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO 2 ergänzt. Ersetzen Sie das Medium 2 - 3 Mal pro Woche.
    2. Kulturmedium zu entfernen und spülen Sie die Zellen mit 1 X PBS, um alle Spuren des Serums zu beseitigen, die Trypsin-Inhibitor enthält. Führen Sie diesen Schritt in ein Biohazard-Haube bei Raumtemperatur.
    3. Fügen Sie 1 mL vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung für die Zellschicht zu decken, und halten Sie Zellen bei 37 ° c Trypsinize Zellen bis Zellschicht (in der Regel 3-5 min) dispergiert wird.
    4. Fügen Sie 3 mL vorgewärmte komplette Wachstumsmedium, Trypsin-EDTA zu inaktivieren und verteilen das Medium durch mehrere Male sanft pipettieren.
      Hinweis: Dieses Verfahren muss durchgeführt werden in ein Biohazard Haube um den Bediener vor Verunreinigungen zu schützen und weiterhin optimale Zelle Anbaubedingungen.
    5. Graf Zellen unter Verwendung einer automatischen Zelle Zähler oder Bürker Kammer. Zellsuspension 1 × 10 5 Zellen/mL und 5 mL Pipettieren in ein neues Gericht zu verdünnen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO 2.
  2. Anbau von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs), D3-Zell-Linie
    1. Kultur mESCs auf Zelle Kultur Gerichte mit 0,2 % Gelatine und mESC Wartung Medium beschichtet. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO 2.
      Hinweis: Das mESCs Anbau/Wartung Medium in 50 mL Aliquote Zubereitung und Lagerung von es bei 2 bis 8 ° C für bis zu 2 Wochen wird empfohlen. Das mESC Medium enthält 75 mL ES Cell FBS, 5 mL Penicillin G und Streptomycin, 5 mL nicht-essentiellen Aminosäuren (10 mM) (Endkonzentration 0.1 mM), 50 µL Maus Leukämie Inhibitor Faktor (mLIF; 100 µg/mL) (Endkonzentration 10 ng/mL), 430 µL MTG (1) Thioglycerol; 1: 100 Verdünnung in DMEM) (Endkonzentration 100 µM) und hohe Glukose DMEM Medium bis zu 500 mL.
    2. Aspirieren mESC Anbau Medium aus der Kulturschale und spülen Sie die Zellen einmal mit 1 X PBS.
    3. 0,5 mL Trypsin-EDTA und bei 37 ° C inkubieren Sie einfach, bis die Zellen beginnen, aus der Schale lösen. Dann inaktivieren die Trypsin durch Waschen der Zellen mit 2 mL mESC Anbau Medium ergänzt mit 15 % fötalen Rinderserum.
    4. Verwenden eine Pipette, um die restlichen Zellen von der Kulturschale zu verdrängen.
      Hinweis: Es ist wichtig, einzelne Zellen zu erhalten, da Zelle Klumpen Differenzierung der Zellen fördern.
    5. Split Zellen 01:10 auf gelierenden Gerichte mit mESC Wartung Medium.
      Hinweis: Wenn die Dichte der mESC Zellen zu niedrig ist, sie nicht gut wachsen; Wenn die Dichte zu hoch ist, wird die Differenzierung gefördert.
    6. Stellen Sie sicher, dass mESCs in einem undifferenzierten Zustand beibehalten werden, indem Sie ausführen mESC Durchgang jeden zweiten Tag durch die Spaltung von Zellen aus einer Petrischale in vier neue Gerichte. MESC Kolonien mit einem inversen Mikroskop unter X 100 oder 200 X Vergrößerung zu inspizieren, und wenn es Beweise für spontane mES Zelldifferenzierung gibt, führen Western Blots Oct4 Protein Erschöpfung zu bewerten.
      Hinweis: Mit optimalen Zelle Passagierung, spontane Differenzierung des mESCs in Vitro reduziert werden.

2. Handy-Transfektion

  1. Samen Zellen 48 h vor Experimenten auf gerasterten Mikroskopie Gerichte (Durchmesser 35 mm) um Microirradiated Zellen nach ihrer Koordinaten auf der Petrischale finden.
    Hinweis: Dies ist ein Beispiel, in welchem Microirradiation der erste experimentelle Schritt ist, und Immunostaining ist der zweite ( Abbildung 2A).
    1. Für die Aussaat, verwenden eine Konzentration von 5 × 10 4 Zellen/mL für HeLa-abgeleitete Zellinien (oder 1 × 10 4 Zellen/mL für D3 mES Zellen). Anwenden Sie bis zu kompletten Medium 2 mL pro Schale. Bei Anbau und Microirradiation pflegen Zellen in einem Thermostat oder Anbau Kammer bei 37 ° C und 5 % CO 2.
    2. Anzahl Zellen mit einer automatischen Zelle Zähler
    3. .
      Hinweis: Verwenden Sie keine höhere Konzentration von Zellen. Insbesondere in dicht gepackten Kolonien von D3 mESCs, hohe Zelldichte verhindert eine Identifikation der lokal Microirradiated Zellen nach Immunostaining.
  2. Plasmid DNA und Transfektion Reagenz der Wahl wie folgt vorbereiten. Lösung A mit 2 bis 3 µg des ausgewählten Plasmid DNA vorzubereiten (siehe die Tabelle der Materialien für Details) und 150 µL 1 X PBS. Lösung B mit 3,5 µL Transfection Reagens in 150 µL 1 × PBS vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass jede Lösung durch sorgfältige Pipettieren gut vermischt ist.
    Hinweis: Das optimale Verhältnis von DNA und Transfection Reagens muss empirisch bestimmt werden für jede Zelllinie und individuelle Plasmid.
  3. Bei 24 h vor experimentellen Beobachtung vorübergehend transfizierten lebender Zellen verbinden Lösung A und Lösung B ohne aufschütteln. Inkubieren Sie die kombinierte Lösungen bei Raumtemperatur für 15-20 min. In gewissem Sinne tropfenweise, homogen verteilen das komplette Transfektion Mischung (300 µL, wie beschrieben in Punkt 2.2) auf der Zellschicht in der Mikroskopie Petrischale wachsen.
  4. Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5 % CO 2 für 4-6 h, ersetzen Sie die Transfektion Mischung durch frisches Medium. Zellen unter normalen Bedingungen zu kultivieren.
    Hinweis: Bei der Verwendung von 405 nm Laser die Zellen mit einer Reagenz nicht presensitize, aber bei der Verwendung von 355 nm Laser durchzuführen Zelle Presensitization mit 10 µM, 5-Bromo-2 ' - Deoxy - Uridin (BrdU) 7 , 8 . Presensitization Zeit hängt von den Typ und die Länge des Zellzyklus. HeLa-Zellen fügen Sie BrdU 16 bis 20 Uhr vor der lokalen Microirradiation hinzu. Im Falle von mESCs, fügen BrdU 6 bis 8 Stunden vor Microirradiation.

3. Induktion von lokalen DNA-Läsionen und konfokalen Mikroskopie

  1. legen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch und erfassen die Position der markierten Zellen auf dem Teller, die Zellkoordinaten benötigt werden, zur weiteren Analyse ( Abbildung 2A a-c).
  2. Finden transfizierte Zellen in einem Quadrat mit einer Zahl oder einen Buchstaben ( Abbildung 2A d-f, Pfeile in Ad zeigen die Position der Zelle in Platten Ae und Af vergrößert) gekennzeichnet. Erhalten Sie ein Bild von den Zellen mit Hellfeld Mikroskopieren und eine Fluoreszenzbild zu erwerben, um die Position von den Zellen und dem beschrifteten Platz ( Abbildung 2A) zu identifizieren.
  3. Für die Bildaufnahme vor Bestrahlung, verwenden Sie ein Weißlicht-Laser (WLL) (470-670 nm in 1-nm-Schritten) an die confocal Mikroskop angeschlossen (oder ein anderes zur Verfügung Laser verbunden, die ConfÖcal Mikroskop).
  4. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 512 × 512 Pixel Auflösung, Pixel Größe 64 nm, 400 Hz, bidirektionalen Modus (Scannen in zwei Richtungen), Zeile durchschnittlichen Satz 8, 8 X 12 x zoom
    Hinweis: Zeile Durchschnitt repräsentiert eine bestimmte Anzahl von Scans; die gleiche Zeile ist mehrfach gescannt, bevor Sie mit der nächsten Zeile fortfahren. Wiederholte Scans aller Linien produzieren der letzte Frame des Bildes.
  5. Für Bild Beobachtung und Erfassung, verwenden ein 63 × Öl-Ziel mit einer numerischen Apertur von 1,4 und Fluoreszenzbilder sequentiell zu erwerben. Übersprechen zwischen den zwei Fluorochromes mittels des sequentiellen Scan Modus der entsprechenden Software beseitigen.
    Hinweis: Alle Mikroskop-Software ermöglicht die Einstellung eines sogenannten sequentiellen Scan-Modus. Die Betreiber kann auswählen, ob die Fluorochromes erwerben ' Informationen gleichzeitig (z. B. rot-grün-blaue Fluoreszenz) oder, wie hier erwähnt, einzeln (sequentiell), Fluorochrom durch Fluorochrom. Berücksichtigen Sie die allgemeine Informationen, dass die maximale Anregung/Emission für GFP 395/509 ist nm und die maximale Anregung/Emission für mCherry ist 587/610 nm (siehe Fluorochromes verwendet hier in Abbildung 2 b). Basierend auf diesen Informationen, wählen Sie passende Anregung und Emission Filter für die gewünschte Fluorochromes. Filterauswahl und Scan-Verfahren müssen für jedes confocal Mikroskop optimiert werden.
  6. Für die Induktion von DNA-Läsionen, Einsatz 64 Linie scanning-Modus, schalten Sie die WLL (in ' Erwerb ' Modus), schalten Sie die externe UV-Quelle (auf " UV-Laser " Schaltfläche "), legen Sie die Region of Interest (ROI) (in ' Erwerb ' Modus), und legen Sie die 355 nm Laser-auf 100 % oder alternativ eine 405 nm Laserquelle.
    Hinweis: In der Regel Laserleistung wird eingestellt, indem die geeigneten Laser den Einstellknopf in Bild Akquisitionsmodus.
  7. Für lokale Microirradiation verwenden Laser, die in dem in der Nähe von UVA-Spektrum emittieren. Legen Sie für Microirradiation der ROI im Zellkern und Aufzeichnungsabbild den Hintergrund Bild Akquisitionsmodus Laserintensität außerhalb der ROI regulieren auf Null; Wenn die Zelle richtig bestrahlt wird und das Signal des GFP-Histon H2B verschwindet, beispielsweise mCherry-Tags PCNA Protein zu DNA-Läsionen werden, sofort nach der Bestrahlung rekrutiert wird ( Abb. 2 b und Video 1 ).
    Hinweis: Eine DNA-Schädigung induziert in der ROI eines konfokalen Abschnitt erscheint auch im dreidimensionalen (3D) Projektion (siehe 3D-Drehung und X-y, X-Z, y-Z-Projektionen in Abbildung 2 und Video 2). Beschreibung der kompletten technischen Parameter für 355 nm und 405 nm Laser siehe Stixová Et al. 7
  8. nach ROI bestrahlt worden, schalten Sie die externe UV-Quelle, schalten Sie den ROI, schalten Sie die WLL, ändern Sie Zeile 8 Scannen und suchen Sie eine andere Zelle zur Bestrahlung. Für ROI-Auswahl auf die Schaltfläche anwendbar in der Software ' s Bild Akquisitionsmodus.
    Hinweis: mCherry-PCNA hat eine maximale Ansammlung Spitze bei DNA-Läsionen zwischen 2 und 20 min ( Abb. 2 b). Überprüfen Sie das Ergebnis auf exogene Proteingehalte, Immunfluoreszenz-Färbung sofort nach lokalen Microirradiation fortsetzen. Wählen Sie das Zeitintervall Bestrahlung nach Interesse.
  9. Überprüfen Sie, ob eine Ansammlung von exogene Proteine in der Mehrzahl der Microirradiated Zellen erkannt werden kann. Verwenden Sie für diese Überprüfung die Kriterien in den folgenden Schritten.
    1. Check gibt es keine Überexpression von exogenen Protein in vorübergehend transfizierten Zellen. Als eine mögliche Lösung wählen Sie Zellen mit nur einem schwachen Ausdruck fluoreszierenden Proteins (z.B., mCherry-PCNA oder mCherry-53BP1).
    2. Bewerten die Phototoxizität der WLL-Ausstellung zur Bildaufnahme.
      Hinweis: Zu Testzwecken Phototoxizität, transfected Zellen zu längeren Laser Microirradiation entlarven und stellen Sie sicher, dass Zellen in Mitose Vorgehen, wie in Abbildung 3A -B. Als eine mögliche Lösung zu reduzieren, Scan Zeit und Anzahl der konfokalen Scheiben pro Zelle, optimieren, 3D-Scannen durch Auswahl der optimalen axialen Schritt (0,3 µm wird empfohlen) und legen Sie die Laser ' s macht an seinem Minimum. Alternativ kann Phototoxizität Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Säure, ein wasserlösliches Analogon von Vitamin E) aufgelöst im Anbau Medium mit beseitigt werden. Für DNA-Schäden im Zusammenhang mit Experimenten, es wird nicht empfohlen, der Trolox aufgrund ihrer Schutzwirkung gegen UV-Strahlung.
    3. Bei Bestrahlung mit 355 nm Laser, überprüfen Sie ausreichende Aufnahme von BrdU mit einer entsprechenden BrdU Detektionsantikörper aus der BrdU-Aufnahme kit (siehe Tabelle der Materialien). Da BrdU in DNA während der S-Phase des Zellzyklus integriert ist, muss der Großteil der Zellen während der Presensitization durch die S-Phase gehen. Als eine mögliche Lösung betrachten die Länge des Zellzyklus, die Zelltyp spezifische.
    4. Analysieren, ob die DNA-Reparatur interessierender Proteine haben die Fähigkeit, DNA-Läsionen in bestimmten Zellzyklus Phase(n) erkennen. Eine mögliche Lösung: Um sicherzustellen, dass die Rekrutierung von ausgewählten Proteinen, DNA-Läsionen auf spezifische Zellzyklus Phasen (S/G1/G2) beschränkt, verwenden Sie HeLa-Fucci Zellen. Diese Zellen express RFP-Cdt1 in der G1 und frühen S-Phase und GFP-markierte Geminin in der S/G2-M Zellzyklus Phasen 22 ( Abbildung 1).
    5. Zu vermeiden, Apoptose, Zelltod, wählen Sie eine geeignete Laserquelle und laser-Power Einstellung 23. Denken Sie daran, die Zellen bestrahlt sollten fortfahren, Mitose ( Abbildung 3A -B, Video 3).
      Hinweis: Unerwünschte Apoptose kann durch Annexin V Positivität, Caspase 3 oder lamin B Spaltung nachgewiesen werden. Auf der morphologischen Ebene Zelle Trennung und Bildung von apoptotischen Körper sichtbar werden.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

  1. der Zellschicht (wachsend im Mikroskop Gerichte) mit 1 × PBS kurz abspülen und nach dem Spülen, Zellen mit 4 % Formaldehyd für 10 min (für HeLa-abgeleitete Zellinien) oder 20 min (für D3 ES-Zellen) bei Raumtemperatur zu beheben. Spülen Sie die Schale mit 1 × PBS.
    Vorsicht: Formaldehyd verursacht schwere Augenschäden, kann dazu führen, dass eine allergische Hautreaktion und ist auch ein potential Karzinogen; Daher sollten alle experimentellen Schritte mit Formaldehyd in eine Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
    Hinweis: Zur Vermeidung von unnötigen Bleichen von Fluoreszenz Signale speichern das Gericht in einer dunklen Kammer während der Inkubationszeit für Immunfluoreszenz-Färbung notwendig.
  2. Permeabilize Zellen mit 0,1 % Triton x-100 in H 2 O 8 min aufgelöst und inkubieren Sie die Zellen für 12 min mit 1 × PBS mit 0,1 % Saponin und 0,1 % Triton x-100. Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen in 1 × PBS zwei Mal für 15 min.
  3. Inkubation der Zellen mit 1 % BSA in 1 × PBS für 60 min, unspezifische Bindung von ausgewählten Antikörpern zu blockieren. Waschen Sie Zellen in 1 × PBS für 15 min nach der Inkubation.
  4. Verdünnt Primärantikörper in einem Verhältnis von 1: 100 (oder 1: 200) (dieser Schritt muss oPtimized für einzelne Antikörper) in 1 % BSA in 1 × PBS, mit 25 µL dieser Lösung pro Schale, und die Zellen mit einem Deckgläschen abdecken. Inkubation der Zellen mit der Lösung mit dem Primärantikörper in eine feuchte Kammer über Nacht bei 4 ° c
  5. Am nächsten Tag waschen Zellen in 1 × PBS zwei Mal für 5 min.
  6. Verdünnen der Sekundärantikörper in einem Verhältnis von 1: 100 (oder alternativ 1: 200) in 1 % BSA in 1 × PBS, mit 100 µL dieser Lösung pro Schale, und die Zellen mit einem Deckgläschen abdecken. Inkubieren Sie die Zellen mit der Lösung mit den sekundären Antikörper für 60 min. Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen in 1 × PBS dreimal für 5 min.
  7. Deckglas mit einem Tropfen Eindeckmittel montieren und Abdichten des Deckglases mit Nagellack oder Klebstoff, Trocknung und Bewegung bei der mikroskopischen Beobachtung zu verhindern. Speichern Sie das Gericht im Dunkeln bei 4 ° c

5. Fluoreszenzmikroskopie Lebensdauer Bild (FLIM)

  1. Start der FLIM Software. Öffnen der " Anwendungs-Suite " der Software und schalten Sie ihn auf die " FLIM " Modus. Stellen Sie sicher, dass die WLL gepulst betrieben wird.
    Hinweis: Der Betreiber muss eine Hardwaretaste Pulsmodus erreichen wechseln.
  2. Die Schale mit den gefärbten Zellen (gebeizt in Abschnitt 4) auf den Mikroskoptisch in die gleiche Ausrichtung wie bei lokalen Microirradiation und die bestrahlten Zellen nach der Netze auf der Petrischale zu finden. Bilderfassung durch confocal Mikroskop durchführen.
    Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 1024 × 1024 Pixel, 400 Hz, bidirektionalen Modus, 16 Linien, zoom 8 X 12 x.
  3. Vor Beginn der FLIM Messung, führen Sie eine Vorprüfung um eine Echtzeit-Aufzeichnung der exponentiellen Zerfall, zu zeigen, indem er auf " Setup FLIM " und " Erwerb " und drücken " laufen FLIM Test ". Optimieren Sie FLIM Parameter für die Probe durch die Beurteilung der zwei Hauptparameter wie folgt.
    1. Optimieren die Wiederholrate der WLL mit der Erregung Wellenlänge auf die Lebensdauer der Probe abgestimmt (siehe Hinweis unten). In der Software confocal Mikroskop die Intensität Laser mit den entsprechenden Button, der in der Regel heißt " laser-Einstellung " in der ' Bild Erwerb ' Menü. Berechnen Sie dann, ein Verfall Kurve (oder Histogramm zeigt alle Photon zählt) mit Hilfe der FLIM-Software (siehe Abbildung 4A -B).
      Hinweis: Verwenden der WLL im Pulsmodus für Erregung. Die Software muss mit einem Puls-Picker für WLL, die Auswahl an die Wiederholrate ermöglicht ausgestattet werden (80, 40, 20 oder 10 MHz). Die Erregung Wellenlänge bei der Fluoreszenz-Spender, GLP, ist 488 nm. Die Verfall-Kurve ist mit Arbeitsbereich FLIM Software aufgezeichnet. Der Parameter (D, DA τ τ) zeigt exponentiellen Zerfall Zeiten (z. B. Fluorochrom Lebensdauer); Parameter (A) repräsentiert die Amplitude der Verwesung Fluorochrom (siehe Beispiele der FLIM Daten für GLP-Tags p53 und mCherry-Tags 53BP1 in Abbildung 4A -B).
    2. Überprüfen die Zählrate Wiederholung mit dem Software-Erwerb-Tool (Wählen Sie Wiederholung Rate-Modus). Wählen Sie die hellsten Pixel in der Probe; der Bogen für die hellsten Pixel muss unter 10 % der gesamten Fluoreszenzintensität sein.
  4. Klicken Sie auf " Messung ", und drücken Sie " laufen FLIM ".

6. Spender Lebensdauer mit einem FLIM Skript und Berechnung der FRET-Effizienz

  1. starten die Bund-FLIM-Software und öffnen Sie die ' Spender ' Arbeitsbereich.
  2. Wählen Sie die " Analyse " / " Imaging " Registerkarte im Menü und drücken Sie zunächst die FLIM-Skript " beginnen ". Für optimale FRET-FLIM Einstellungen verwenden bekannte Protein Interaktionspartnern.
    Hinweis: Die Bund-FLIM-Effizienz für die bekannten Interaktion Partner GFP-p53 und mCherry-53BP1 war (34,1 ± 2,3) % ( Abbildung 4).
  3. Verwenden Sie nur die Spender-Emission-Kanal (Kanal 1 oder 2) und drücken Sie " berechnen schnell FLIM ".
    Hinweis: Das Bild und das Diagramm werden beide aktualisiert.
  4. In the Bund-FLIM Software, legen Sie die Intensitätsskala (0 - 4000 zählt) und die Lebensdauer-Skala (0 - 5 ns) manuell in der Software. Mit diesem Ansatz, visualisieren die Zelle von Interesse und setzen die Bund-FLIM Messung.
    Hinweis: Diese Einstellung verhindert Unterschiede in der Fluoreszenzintensität zwischen den einzelnen Zellen in der Zellpopulation.
  5. Zerfall im Formular wählen Sie das passende Modell.
    Hinweis: Wir empfehlen n exponentiellen Reconvolution und Auswahl der Modellparameter " n ". Eine optimale Passform hat folgenden Kriterien: die angepassten Kurve Überlagerungen der Verfall Kurve gut und χ 2 - Wert ist gleich 1 ( Abbildung 4 b).
  6. Wählen Sie die " Schwelle " / " Verwendung Schwelle " und setzen Sie den Schwellenwert auf 75. Starten Sie " erste Fit ".
    Hinweis: Die SPT64-Software berechnet die durchschnittliche Spender Lebensdauer ohne Bund (" Amplitude gewichtete durchschnittliche Lebensdauer ", τ Av.Amp)

7. FRET-Effizienz mit dem FLIM-FRET-Skript

  1. Wählen Sie den Spender/Akzeptor-Arbeitsbereich und öffnen Sie " Analyse " | " Imaging " | " Lebens ärgern Image ".
  2. Nur den Spender als der aktive Kanal auswählen und anpassen Pixel Binning, abhängig von der Photon Anzahl/Pixel. Führen Sie dann die Softwaremodus namens " berechnen FastFLIM ". Wenn das Photon Anzahl/Pixel im Bild niedrig ist, erhöhen Sie das Pixel-Binning auf 4 Punkte.
  3. Stellen Sie die Intensität auf 0 - 200 zählt und die Lebensdauer auf 0 - 5 ns.
  4. Aktivieren " Verwendung Schwelle " und geben Sie einen Schwellenwert von 75.
  5. Legen das passende Modell zu " Multi-exp Spender ", geben Sie die Modellparameter " n ", geben Sie τ Av.Amp (Schritt 6.6) als ein τ D, und aktivieren Sie " ersten passen ".
  6. Stellen Sie die Parameter Bkgr Dec, Shift IRF und Bkgr IRF, konstante Werte durch das Häkchen entfernen.
    Hinweis: Die Mehrheit der Parameter konstant eingestellt so weit wie möglich. Dieser Ansatz reduziert die statistische Schwankungen. Drücken Sie in diesem Fall nicht " erste Passform " wieder. Es folgen Beschreibungen der genannten Parameter: IRF = Instrument Antwortfunktion, BkgrDec = Hintergrund von der exponentiellen Fit, ShiftIRF = IRF Verlagerung von der exponentiellen Reconvolution passen, BkgrIRF = IRF Hintergrund vom exponentiellen Reconvolution passen. Alle drei Parameter werden berechnet und können behoben werden, mit Hilfe der Software zur weiteren Analyse.
  7. Presse " berechnen FRETŔ einen Bund Bild (im Bereich FLIM Bild dargestellt) und FRET-Effizienz-Histogramm berechnet und ein Bund Abstand Histogramm dargestellt ( Abbildung 4). Wenn die Bildanalyse abgeschlossen ist, drücken Sie " speichern Ergebnis ".
    Hinweis: Während der Bund Experimente ist es notwendig zu berücksichtigen, dass fluoreszierende Proteine reversibel Übergänge zwischen Leuchtstoff (hell) und nicht-fluoreszierende (dunkel) Staaten auszustellen. Diese Eigenschaft nennt man " blinkt ", FRET-Effizienz ist betroffen von diesem Phänomen (eine Erklärung für diesen Effekt wurde bereitgestellt von Vogerl Et Al. 24).

8. FRAP Analyse

  1. Ort der Dish auf den Mikroskoptisch transfizierten Zellen, die mit dem Ausdruck Eindringmittel tagged Proteins des Interesses zu finden, und führen Sie Bildaufnahme mit Hellfeld Mikroskopieren mit der standard-Mikroskop-Lampe (siehe Abbildung 2Aa-b) und Fluoreszenz-Mikroskopie-Modi.
    1. Für die Bildaufnahme, verwenden die Weißlicht-Laser (WLL) mit confocal Mikroskop (oder einem Laser der Auswahl entsprechend der ausgewählten Fluorochrom) verbunden. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 512 × 512 Pixel, 1000 Hz, bidirektionalen Modus, Linie Durchschnitt 1, zoom 8 X 12 x.
    2. Mindestens 15 prebleaching Bilder (bei ~ 10 % Laserleistung) und definieren die Region of Interest (ROI) im Menü Bild Erwerb.
  2. Für Immunofluoreszenz Experimente verwenden ein Argonlaser (488 nm). Wenden Sie die folgenden Einstellungen: Frame Auflösung 512 × 512 Pixel, 1000 Hz, bidirektionalen Modus, zoom 8 X bis 10 x.
    Hinweis: Fluorochromes wie GFP, mCherry und RFP können begeistert sein, von einem Argonlaser arbeiten bei 488 nm oder 514 nm.
  3. Verwenden die FRAP Softwaremodus des Mikroskops Wahl. Während die Immunofluoreszenz festlegen den Argonlaser ' s macht auf Maximum mit der Laser-Einstellknopf. Bildaufnahme Abständen 0,256 s, bei 10 % Laserleistung durchführen.
    Hinweis: Für postbleaching Schritte, verwenden Sie das standard-Image Akquisitionsmodus des konfokalen Mikroskops Wahl.
    1. Monitor Fluoreszenz Erholungszeit nach Immunofluoreszenz (bis zu 45-50 s nach dem Bleichen Eingriff).
      Hinweis: Wie in Abbildung 4 dargestellt, unterscheidet sich die Erholungszeit nach Immunofluoreszenz für mCherry-markierten 53BP1 auf spontane DNA-Läsionen und UVA-Bestrahlung-induzierte Herde. mCherry-53BP1 bei UVA Läsionen erholte sich schnell im Vergleich zu mCherry-53BP1 Ansammlungen an spontan auftretender DNA-Reparatur Herde; siehe Abbildung 4 und Foltankova Et al. 25
  4. die Daten vom Mikroskop Software (oder Software der Wahl) in eine Tabelle exportieren und führen Sie statistische Analyse.

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Representative Results

Verwenden erweiterte konfokalen Mikroskopie, beobachteten wir eine Ansammlung von mCherry-Tags 53BP1 und mCherry-PCNA Proteine bei der DNA-Läsionen. Analysen wurden von lokalen Microirradiation von lebenden Zellen durchgeführt. Der nuklearen Verteilungsmuster der DNA-Reparatur-Proteine in einzelne Zellzyklus Phasen zu erkennen, wir nutzten die Fucci zelluläre System, mit dem es möglich festzustellen, die G1, frühen S, ist und G2-Phasen der Zelle Zyklus (Abbildung 1). Die biologische Anwendung des zellulären Fucci-Modells, die wir in Suchankova Et Al. veröffentlicht 26 zeigt, dass 53BP1 wurde eingestellt, lokal induzierte DNA-Läsionen in den G1, S und G2-Phasen des Zellzyklus, die während der nicht-homologen Ende verbinden (NHEJ) mit der Funktion dieses Proteins verbunden war, einer der wichtigsten Mechanismen zu Doppel-Strang Pause Reparatur. Auf der anderen Seite zeigte uns dieses experimentelle System einzelnen zellulären Ebene, dass die PCNA-Protein, das mit der homologen Rekombination Reparatur Weg (Erholungsherzfrequenz) verknüpft ist, in die späte S und G2-Phase des Zellzyklus 27DSB erkennt. Für Studien zur DNA-Reparatur-Mechanismus haben wir um sicherzustellen, dass Zellkulturen weiterhin Mitose nach der Exposition gegenüber UV-Lasern (Abbildung 3) unterziehen Bestrahlungsbedingungen optimiert. Microirradiated Zellen in der Mitose beweisen, dass in diesen experimentellen Bedingungen DNA Reparatur Erlös in relativ physiologischer Weise und Zellen nicht durch die Laser verletzt worden sind, die bei höheren Intensitäten Apoptose induzieren. Hier zeigen wir auch wie bewerbe FRET-FLIM Analyse bis hin zur Charakterisierung von Proteinen, DNA-Reparatur. Diese fortschrittliche Technologie ermöglicht es uns, lokale Protein-Protein-Interaktionen in den Zellkern oder, Alternativ, Protein-Interaktionen in Nukleolus Regionen wie der Nukleolus, nuclear Lamina oder Cluster von Heterochromatin zu studieren. Für Einsteiger in diese Technik, möchten wir empfehlen, diese Bund-FLIM-Technik mit bekannten Interaktionspartnern Protein wie p53 und 53BP1 zu optimieren (Abbildung 4A-C). In der Regel führt eine Kenntnis der Proteinprotein Interaktionen zu verstehen, wie Protein-komplexe Prozesse wie Replikation, Genaktivierung, zum Schweigen zu bringen oder DNA-Reparatur regulieren. Darüber hinaus ist ein sehr nützliches Werkzeug für Studien von Protein Kinetik der FRAP-Methode, die die Eigenschaften der lokalen Protein Diffusion und Mobilität (Abbildung 4) zeigt. Zusammengenommen bieten wir hier, dass Studien methodische Anweisungen für die Anwendung von fortgeschrittenen konfokalen Mikroskopiertechniken in der DNA zu reparieren.

Figure 1
Abbildung 1: Bildung von DNA-Reparatur Brennpunkte in HeLa-Fucci Zellen mit dem Ausdruck RFP-cdt1 (rot) in der G1/S Anfangsphase und GLP-Geminin (grün) in der S/G2-Phase des Zellzyklus studiert werden. Spontan auftretende DNA-Läsionen, die positiv für 53BP1 Protein (blau; Alexa 405 Färbung), wurden in der G1 (rot), studierte Anfang S (Orange, Ausdruck von RFP-cdt1 und GLP-Geminin) und G2 (grün) Phasen des Zellzyklus. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Rekrutierung von mCherry getaggt PCNA an DNA-Läsionen im Laufe der Zeit. (A) Zellen, die mit dem Ausdruck mCherry-PCNA (rot), befanden sich auf einem gerasterten Mikroskop Teller in ausgewählten Regionen (grau). Nach Fixierung und Immunostaining bestrahlte Zellen (gelbe Pfeile) befanden sich nach eingetragenen Koordinaten (siehe den grauen Buchstaben K als Beispiel) (Aa-c). Die gelben Rahmen und Pfeile (n. Chr.) zeigen die Zelle, die Microirradiated und vergrößerten in Platten Ae-f war. (B) Ansammlung von mCherry-PCNA (rot) wurde in HeLa-Zellen stabil auszudrücken GFP-Tags Histon H2B (grün) untersucht. Zellen wurden unmittelbar nach lokalen Microirradiation für bis zu 35 min überwacht (siehe Video 1). (C) Microirradiated Zellen analysiert wurden durch 3D konfokalen Mikroskopie und Protein Akkumulation an DNA-Läsionen (z.B. mCherry-53BP1) wurde in allen drei Dimensionen (X-y, X-Z und y-Z) gefunden, wenn auch nur das Mittelteil des Zellkerns wurde Microirradiated (siehe 3D-Zelle-Rotation in Video 2 3D Projektionen in Abbildung 2). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Zellen Microirradiated von 405 nm Laserdiode gehen Sie normalerweise durch den Zellzyklus. (A) nach der Bestrahlung mit einem 405 nm Diodenlaser, HeLa-Zellen (stabil mit dem Ausdruck ihrer GFP-Histon H2B; grün) unterziehen Mitose (siehe auch Video 2). Gelbe Pfeile und Rahmen zeigen bestrahlten ROI in den ausgewählten Zellen. Weißen Rahmen zeigen Mitose. (B) unter den gleichen Versuchsbedingungen wurde die Mitose im bestrahlten Zellen auch Zeit verfallen Mikroskopie in HeLa-Zellen stabil mit dem Ausdruck GFP-H2B (grün) und vorübergehend mCherry-PCNA (rot) beobachtet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: FLIM und Bund-FLIM Analyse der GFP-p53 und mCherry-53BP1. Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) von FLIM und Anwendung der Erholung nach Immunofluoreszenz Fluoreszenz erkanntbei verschiedenen DNA-Läsionen (FRAP). ( A-C) Im Durchschnitt (n = 10) Lebensdauer von GFP-Tags p53 in Abwesenheit und Anwesenheit von den Akzeptor (mCherry-53BP1), gemessen in ganz nichtreplizierende HeLa Zellkerne. (A) repräsentative Fluoreszenz Verfall Kurven und Residuen studierte in HeLa-Zellen GFP-p53 (nur Spender, τD) oder GLP-p53 und mCherry-53BP1 vorübergehend zum Ausdruck zu bringen (Donor-Akzeptor, τDA). (B) Durchschnitt Lebenszeiten (τ1 τ -3) und Amplituden (1 3) (ein) GLP-p53 und (b) mCherry-53BP1 in ganze HeLa Zellkerne gemessen. Χ2 Werte wurden auch berechnet und angezeigt. (C) Zusammenfassung der FRET-Effizienz für die bekannten Interaktionspartnern GFP-p53 und mCherry-53BP1. Skalieren von Balken = 4-5 µm. Bund-FLIM Ergebnis zeigen ~ 35 % FRET-Effizienz für bekannte Interaktion GFP-Tags p53 und mCherry-Tags 53BP1 Partner. (D) Erholung-Kinetik der mCherry-53BP1 studierte an der spontan auftretenden DNA-Läsionen (grüne Kurve) und UVA-induzierten DNA-Läsionen (blaue Kurve). mCherry bei DNA-Läsionen wurde auf das Niveau des Hintergrunds (dispergierte Form des Proteins mCherry-53BP1 Protein) gebleicht und die Hintergrundfluoreszenz wurde von jedem Wert abgezogen. DATA, dargestellt als relativen Fluoreszenzintensität der mCherry-53BP1, als die Mittel ± Standardfehler präsentiert. Studenten t-Test ergab einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen beiden Arten von DNA-Läsionen (* p ≤0.05 zeigt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Video 1
Video 1: Rekrutierung von mCherry getaggt PCNA Protein (rote Fluoreszenz), DNA-Läsionen induziert durch lokale Microirradiation in HeLa Zellen stabil mit dem Ausdruck ihrer GFP-Tags Histon H2B (grüne Fluoreszenz). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 2
Video 2: Ansammlung von mCherry getaggt 53BP1 Protein (rote Fluoreszenz) auf DNA-Läsionen durch lokale Microirradiation in HeLa-Zellen induziert. Der Zellkern ist im 3D-Raum mit einem Softwaremodus, der es die Visualisierung der Zelle Rotation im Raum ermöglicht gezeigt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

Video 3
Video 3: Microirradiated HeLa Zellen stabil auszudrücken GFP-Tags Histon H2B (grüne Fluoreszenz) fahren Sie durch Mitose. Die bestrahlte Region zeichnet sich durch die Erschöpfung der GFP-H2B (schwarzen Bereiche sind bestrahlte Streifen in den Zellkernen). Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterladen.

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Discussion

Mikroskopiertechniken stellen grundlegende Werkzeuge in den Forschungslabors. Hier eine kurze Beschreibung der Methoden für die Untersuchung von Protein-Einstellung verwendet und Kinetik bei DNA-Läsionen wird vorgestellt. Wir vor allem unsere experimentelle Erfahrung auf dem Gebiet der lokalen Microirradiation lebender Zellen zur Kenntnis genommen, und wir besprechen die Untersuchung von Protein-Kinetik von FRAP und Protein-Protein Interaktion auf DNA-Läsionen mit Akzeptor-bleichen Bund28 und seiner fortschrittlichen Änderung FRET-FLIM (Abb. 4A-D). Die hier gezeigten Methoden sind unverzichtbare Werkzeuge für ein wirkliches Verständnis für DNA-Reparaturprozessen, vor allem Protein Kinetik in lebenden zellulären Systemen, wie von fortgeschrittenen konfokale Mikroskope6,7,8kontrolliert, 28. Diese Methoden sind von immensen Nutzen für Medizin der Zukunft im Umgang mit den Auswirkungen der Strahlentherapie auf Gewebe oder Tumor Zellmorphologie charakterisieren. Um diese Methode zu optimieren, möchten wir empfehlen, beginnend mit bekannten Protein Interaktionspartnern, wie in Abbildung 4dargestellt.

Es ist bekannt, dass Protein Anwerbung für DNA-Läsionen hochdynamisch und zeitabhängig ist; Somit ist die Anwendung der Time-Lapse confocal Mikroskopie nach Zelle Bestrahlung erforderlich, nicht nur im Bereich der Grundlagenforschung, sondern auch in Kliniken26. Lokal induzierte DNA-Läsionen durch Laser Microirradiation9,28,29 vertreten genomische Regionen es möglich ist, Rekrutierung, Protein-Protein oder Protein-DNA-Proteinbindung zu studieren und Interaktion. Der Ausgangspunkt dieser Methoden ist, dass die Rekrutierung von exogene Proteine durch entsprechende Antikörper auf die endogene Ebene überprüft werden muss. Als nächstes ist der entscheidende Schritt von solchen Experimenten, dass übermäßig transfizierte Zellen falsch-Positive Ergebnisse liefern können; Somit ist die beste Entscheidung Zelllinien stabil auszudrücken das Eindringmittel tagged interessierenden Proteine herstellen. Darüber hinaus aufgrund der phototoxischen Effekte der Laser verwendet für die Bildaufnahme, die Bedingungen für das Scannen müssen optimiert werden oder Trolox zusammengesetzte Zelle Anbau Mittel-aufgelöst werden muss. Zusätzlich ist die Beseitigung von der presensitization Schritt vor der Bestrahlung empfohlen wird. Nach lokalen Microirradiation DNA-Reparatur gehen, so dass die Zellen ()Abbildung 3A-B Mitose durchlaufen und Video 3). Induktion der Apoptose nach Laserbestrahlung ein weniger wertvollen Prozess aus der Sicht der optimalen DNA ist Reparatur23. Es ist auch offensichtlich, dass einige DNA-Reparatur-Proteine DNA-Schäden nur in bestimmten Zellzyklus-Phasen (z.B., Bártová Et Al. erkennen 30). daher die Verwendung des Zellsystems HeLa-Fucci, zeigen die Zellen in den einzelnen Phasen der Interphase, ist ein nützliches Tool für Studien von DNA-Antwort Schäden. Darüber hinaus können Zellzyklus Phasen nach der nuklearen Verteilungsmuster der PCNA Protein31erkannt werden.

Es ist bekannt, dass die Methoden FRAP und Bund sind sehr nützliche Werkzeuge für die Untersuchung der Eigenschaften der Proteine, die DNA-Läsionen7,8,32rekrutiert werden. Darüber hinaus kann der FLIM Technik32 Informationen über die dynamische Konformationsänderungen der Proteine zeigen, die an DNA-Läsionen ansammeln. Die Verwendung dieser Methode ist wichtig, weil FLIM dynamischer zellulärer Prozesse direkt misst; Steady-State Fluoreszenzintensität wird so im Laufe der Zeit gemessen. FLIM Ansätze Erhöhung der Bildkontrast durch den Wegfall der Hintergrundfluoreszenz. Dies ist ein Vorteil des Bund-FLIM Messung im Vergleich zu herkömmlichen Akzeptor-bleichen Bund. Die Fluoreszenz-Lebensdauer gemessen FLIM geben Auskunft über die Fraktionen von Eindringmittel tagged Proteine und zeigen wie heterogene Sonden sind aufgrund von Umwelteinflüssen. FLIM ist auch die beste und zuverlässigste biophysische Ansatz zur Durchführung von Bund für Protein-Protein Interaktionen in lebenden Zellen32,33.

Zusammen genommen, haben alle beschriebenen Methoden das Potenzial, neue Mechanismen der DNA-Schäden Antwort in menschlichen Zellen zu offenbaren, was vor allem für strahlentherapeutischen Ansätze wichtig ist. Zum Beispiel wurde multiphoton FLIM angewandt, um erhalten hochauflösende Bilder in der Medizin, wo es multiphoton-Tomographie34genannt. Diese hochentwickelte mikroskopische Methode kann in Kliniken zur Krebsdiagnostik histochemische Stichproben angewandt und mit hoher Auflösung analysiert werden. FLIM Methoden bieten zusätzlich eine genaue Analyse der Tumor Zelloberflächen entsprechend ihrer Autofluoreszenz. Ein Nachteil der FLIM-FRET-Methode ist seine hochentwickelten Software-Hintergrund, der durch das Mikroskop Operator verstanden werden muss. Weiter werden biologische Relevanz der FLIM Daten im allgemeinen und in DNA-Reparaturprozessen, sicherlich in naher Zukunft bekannt gegeben.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von der Grant-Agentur der Tschechischen Republik, Projekt P302-12-G157 unterstützt. Experimente wurden auch von der Tschechisch-Norwegisch Forschung Programm CZ09, die von norwegischen Fonds und durch das Ministerium für Bildung, Jugend und Sport der Tschechischen Republik betreut wird unterstützt (gewähren Nummer: 7F14369).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

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References

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88, (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280, (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7, (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74, (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35, (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6, (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7, (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185, (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5, (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22, (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235, (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3, (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20, (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23, (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8, (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160, (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15, (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6, (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7, (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19, (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107, (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116, (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227, (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188, (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9, (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66, (2), 230-236 (2014).

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