Gelişmiş protein-protein etkileşimleri ve Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Confocal mikroskobu teknikleri

* These authors contributed equally
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Legartová, S., Suchánková, J., Krejčí, J., Kovaříková, A., Bártová, E. Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions. J. Vis. Exp. (129), e55999, doi:10.3791/55999 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lazerler ile yerel microirradiation canlı hücrelerdeki DNA onarım ile ilgili süreçlerin çalışmaları için yararlı bir araç temsil eder. Burada, yerel olarak microirradiated Kromatin zaman ya da protein-protein etkileşimleri üzerinde protein Kinetik DNA lezyonlar, analiz için bir metodolojik yaklaşım tarif. Biz de tek tek hücre döngüsü bağlı protein Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Fucci hücresel sistem kullanarak hücre döngüsü aşamaları tanımak gösterilmiştir. İki UV lazerler kullanımı metodolojik açıklaması (355 nm ve 405 nm) farklı DNA hasar ikna etmek için de sunulmaktadır. Yalnızca hücre microirradiated 405 nm diode lazer tarafından mitoz normalde devam etti ve cyclobutane pirimidin dimer (CPDs) yoksun olduğunu. Biz de nasıl microirradiated hücre immunodetection ilgi endojen proteinlerin gerçekleştirmek için verilen süre noktada sabit olabilir gösterir. DNA onarım çalışmaları için ayrıca sıkı BAĞLAMAK (floresan kurtarma sonra Photobleaching) ve FLIM (floresan ömür boyu Imaging mikroskobu) kendiliğinden meydana gelen hücreler dahil olmak üzere biyofiziksel yöntemlerin kullanımı tarif DNA hasarı foci. Ayrıca protein-protein etkileşimleri deneysel çalışmalarda FLIM FRET (floresan rezonans enerji transferi) bir uygulama gösterir.

Introduction

DNA hasar oluşan cyclobutane pirimidin dimer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine ve tek iplikçikli DNA lezyonlar görünümünü açar veya iki iplikçikli1,2tatili. Γ-ışınları iyonize radyasyon yüksek enerji ve yüksek alellerle biçimidir, böylece bu kaynağı radyasyon radyoterapi3' te yaygın olarak kullanılır. Öte yandan, deneysel olarak UV lazerler taklit eder doğal maruz UV ışığı neden olduğu DNA hasar indüklenen. UVA microirradiation, mikroskobik bir yöntem olarak, bireysel yaşam hücrelerdeki DNA hasarı çalışmak için deneysel bir araç temsil eder. Microirradiation ilk kez 40 yıl önce kromozom bölgeleri4,5organizasyonu ortaya çıkarmak amacıyla kullanıldı. Bu teknik son derece işlevsel özelliklerini confocal mikroskoplar veya modern nanoscopy teknik sınırları üzerinde bağlıdır. DNA lezyonlar ikna etmek için hücreleri tarafından 5' bromodeoxyuridine (BrdU) veya Höchst 33342 UV Işınlama önce presensitized. Bártová vd. 6 presensitization adım daha önce açıklanan ve son zamanlarda biz bu microirradiation teknik hücre ölümü veya apoptosis önlemek için en iyi duruma getirilmiş. Örneğin, bir 405 nm UV lazer (olmadan Höchst 33342 presensitization) kullanımı pahasına cyclobutane pirimidin dimer (CPDs) 53BP1-pozitif iki iplikçikli kırılmalar (DSBs) indüksiyon için yol açar. Öte yandan, UV microirradiation ile kombine presensitization adımları çok yüksek düzeyde CPDs ve DSBs aynı anda neden7,8. Bu yöntem tek bir DNA onarım yol çalışma odasına uygulamak zordur.

Microirradiation ile protein alımı, kinetik ve etkileşim, canlı hücreler lezyonlarının DNA analiz etmek mümkündür. Bu yöntemi örneği Luijsterburg vd tarafından yayımlandı 9 heterochromatin protein 1β ve biz son zamanlarda pluripotency faktör Oct4 ve Aytac, Cajal organları ile ilişkili bir protein DNA UV kaynaklı lezyonlar6,10' a işe ilk kez gösterdi. Bu DNA lezyonlar, protein Kinetik da sıkı BAĞLAMAK (floresan kurtarma sonra Photobleaching)11,12,13 kullanarak okudu olabilir veya (floresan rezonans enerji transferi) teknikleri14 ÜZÜLMEK ,15. Bu yöntemler basit Difüzyon proteinlerin DNA lezyonlar veya protein-protein etkileşimleri ortaya potansiyeline sahip. Ek protein karakterizasyonu için yararlı bir araç FLIM (floresan ömür boyu Imaging mikroskobu) veya perde teknoloji (FRET-FLIM)16ile onun birlikte olduğunu. Bu yöntemler stabil olan hücreler yaşayan veya geçici protein flüoresan molekül17tarafından öğesini ilgi ifade işlemleri çalışma etkinleştirin. Burada, üstel çürüme kez (τ) GFP öğesini p53 protein ve etkileşim ortak, 53BP1, mCherry öğesini DNA hasarı yanıt18,19 ' önemli bir rol oynayan bir örneği gösterilir. Parametre τ FLIM hesaplamaları tarafından sağlanan fluorochrome ömrünü bir verilen Floresans boya, bağlama yetenekleri ve hücresel çevresi için özeldir. Bu nedenle, bu yöntem bize DNA hasar sonra örneğin, protein altgrupları, bağlama yeteneklerini ve fonksiyonel özellikleri arasındaki farklılıklar gösterebilir.

Burada, bizim laboratuvarda Saat özel protein alımı, Kinetik, difüzyon ve microirradiated Kromatin sitesinde protein-protein etkileşimleri incelemek için kullanılır bir anahat gelişmiş mikroskobu teknikleri metodolojik yaklaşımların sunulur. Canlı hücreler yerel DNA lezyonlarının indüksiyon ve metodolojileri itibariyle yerel olarak bağlı DNA lezyonlar UV lazerler tarafından neden olduğu DNA hasar ile ilgili olayların çalışmaları için yararlı bir açıklama için adım adım yöntemler sağlanır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hücre hatları ekimi

  1. HeLa türetilmiş hücre hatları
    Not: kullanım HeLa serviks Karsinomu hücre: stabil Histon H2B ifade ya HeLa hücreleri RFP-Cdt1 ifade GFP veya HeLa-Fucci hücrelerle öğesini G1 ve erken S aşamaları ve GFP-geminin S/G2-M aşamasında ( şekil 1).
    1. Tüm HeLa türetilmiş hücre satırlarını ekimi için Dulbecco kullanmak ' s modifiye kartal ' % 10 fetal sığır serum ve oksijen bir atmosferde % 5 CO 2 içeren 37 ° C'de uygun antibiyotikler ile takıma s orta (DMEM). Orta 2 - haftada 3 kez yerine.
    2. Kültür orta kaldırmak ve tripsin inhibitörü içeren serum tüm izlerini ortadan kaldırmak için 1 x PBS kullanarak hücreleri durulayın. Oda sıcaklığında bir biohazard başlıklı bu adımı gerçekleştirin.
    3. 1 mL hücre katmanı kapsayacak şekilde prewarmed tripsin-EDTA çözeltisi ekleyip 37 ° c Trypsinize hücreleri, hücre hücre Katmanı (genellikle 3-5 dk) dağınık kadar devam.
    4. Prewarmed tam büyüme orta tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için 3 mL ekleyin ve hafifçe birkaç kez pipetting tarafından orta dağıtmak.
      Not: Bu yordam bir biohazard mahallede kirletici operatör korumak ve optimum hücre yetiştirme koşulları korumak için gerçekleştirilmelidir.
    5. Bir otomatik hücre sayaç veya Bürker odası kullanarak hücreleri hesaplama. Hücre süspansiyon 1 × 10 5 hücre/mL ve 5 mL damlalıklı yeni bir tabak içine sulandırmak. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçkaya.
  2. Ekimi fare embriyonik kök hücre (mESCs), D3 hücre kültürünü
    1. kültür mESCs hücre kültür yemekleri % 0,2 jelatin ve mESC bakım orta ile kaplı. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçkaya.
      Not: 50 mL aliquots mESCs ekimi/bakım ortamda hazırlanması ve 2-8 ° C'de 2 hafta için depolama önerilir. 75 mL ES hücre FBS, 5 mL penisilin G ve streptomisin, 5 mL mESC ortam içeren sigara-esansiyel Amino asitler (10 mM) (son konsantrasyonu 0,1 mM), 50 µL fare lösemi engelleyici faktör (mLIF; 100 µg/mL) (son konsantrasyonu 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; DMEM içinde 1: 100 seyreltme) (son toplama 100 µM) ve yüksek glikoz DMEM orta ilâ 500 mL.
    2. Kültür çanak mESC ekimi ortamından Aspire edin ve 1 x PBS bir kez hücrelerle durulayın.
    3. 0,5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve sadece yemek ayırmak hücreleri başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya. Tripsin 2 mL % 15 fetal sığır serum ile desteklenmiş mESC yetiştirme ortamının hücrelerle yıkayarak devre dışı bırakabilirsiniz.
    4. Kültür çanak kalan hücrelerden çıkarmak için bir pipet kullanın.
      Not: hücrelere farklılaşma hücre kümeleri teşvik tek hücre elde etmek önemlidir çünkü.
    5. Bölünmüş hücreler 1:10 mESC bakım orta ile gelatinized yemekleri üzerine.
      Not: mESC hücre yoğunluğu çok düşük ise, onlar de büyümek değil; yoğunluğu çok yüksek ise, farklılaşma yükseltilir.
    6. MESCs mESC geçiş iki günde dört yeni tabaklar bir Petri kabına hücrelerden bölerek gerçekleştirerek farklılaşmamış bir durumda tutulur emin olun. Ters bir mikroskop altında 100 X veya 200 X büyütme ile mESC sömürgelerinde incelemek ve hücre farklılaşması spontan mES kanıtı ise, Batı lekesi Oct4 protein tükenmesi değerlendirmek için gerçekleştirin.
      Not: optimum hücre passaging ile spontan mESCs vitro farklılaşma azaltılabilir.

2. Transfection hücre

  1. tohum hücreleri gridded mikroskobu yemekleri üzerinde deneyler önce 48 h (çapı 35 mm) microirradiated hücreleri Petri kabına onların koordinatlarına göre bulmak için.
    Not: Bu hangi microirradiation ilk deneysel adımdır bir örnektir ve immunostaining ( şekil 2A) saniyedir.
    1. Tohum için 5 × 10 4 hücre/mL bir konsantrasyon HeLa türetilmiş hücre hatları (veya 1 × 10 4 hücre/mL D3 mES hücreler için) için kullanın. Çanak başına 2 mL tam orta için kullanın. Yetiştirme ve microirradiation sırasında korumak bir termostat veya yetiştirme odası 37 ° C ve % 5 CO 2 hücrelerinde.
    2. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri hesaplama.
      Not: yoğun hücre kullanmayın. D3 mESCs yoğun paketlenmiş kolonileri durumunda özellikle, yüksek hücre yoğunluğu yerel olarak microirradiated hücreleri bir kimlik immunostaining sonra engeller.
  2. Aşağıdaki gibi tercih plazmid DNA ve transfection reaktif hazırlamak. 2-3 µg, seçili plazmid DNA kullanarak Çözüm A hazırlamak (Ayrıntılar için Malzemeler tablo görmek) ve 150 µL 1 x PBS. 3.5 µL transfection reaktif 150 µL 1 × PBS kullanarak Çözüm B hazırlayın. Her çözüm iyi dikkatli pipetting tarafından karışık olun.
    Not: Optimum oranı DNA ve transfection reaktif ampirik olarak her hücre kültürünü ve bireysel plazmid için belirlenmelidir.
  3. , Geçici transfected yaşayan deneysel gözlenmesi önce s 24 hücreleri, birleştirmek çözüm A ve çözüm B vortexing olmadan. 15-20 dakika oda sıcaklığında kombine çözümleri kuluçkaya. Dropwise bir şekilde homojen bu dağıtmak tamamlamak transfection karışımı mikroskobu tabak içinde büyüyen hücre Katmanı (açıklandığı noktası 2.2 olarak 300 µL).
  4. Incubate hücrelerin 37 ° C ve % 5 CO 2 için 4-6 h, sonra transfection karışımı ile taze orta yerini alır. Standart koşullar altında hücre yetiştirmek.
    Not: 405 nm lazer kullanırken, herhangi bir reaktif hücrelerle presensitize değil ama 355 nm lazer kullanırken, hücre presensitization 10 µM 5-bromo-2 ile gerçekleştirmek ' - Deoksi - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization zaman hücre tipi ve hücre döngüsünün uzunluğuna bağlıdır. HeLa hücreleri için 16-20 saat önce yerel microirradiation BrdU ekleyin. MESCs söz konusu olduğunda, 6-8 h microirradiation önce BrdU ekleyin.

3. Yerel DNA lezyonlar ve Confocal mikroskobu indüksiyon

  1. mikroskop Sahne Alanı'nda çanak yerleştirin ve çanak temel konumunu kaydetmek; hücre koordinatları daha fazla analiz için gerekli olacaktır ( şekil 2A a-c).
  2. Transfected hücreleri ile bir sayı ya da harf (d-f 2A rakam, hücrenin konumu panelleri Ae ve Af büyütülmüş reklam gösterisinde oklar) etiketli bir köşeli bulmak. Parlak alan mikroskobu kullanarak hücreleri bir görüntü elde etmek ve hücreleri ve etiketli Meydanı ( şekil 2A) konumunu tanımlamak için bir floresan görüntü elde.
  3. Confocal mikroskop bağlı bir beyaz ışık lazer (WLL) (470-670 nm 1-nm artışlarla) (veya için conf bağlı başka bir kullanılabilir lazer ışınlama önce resim alma için kullanınÖçal mikroskop).
  4. Aşağıdaki ayarları kullanın: 512 × 512 piksel çözünürlük, piksel boyutu 64 nm, 400 Hz, çift yönlü modu (iki yönde tarama), satır ortalama 8 kümesine, 8 x 12 x zum
    Not: Tarama belirli sayıda satır ortalama temsil eder; aynı satıra birden çok kez bir sonraki satıra devam etmeden önce taranır. İnceden inceye gözden geçirmek tüm satırlarının üretmek görüntünün son karesine tekrarladı.
  5. Görüntü gözlem ve satın alma için 63 × petrol amaç 1.4 sayısal bir diyafram ile kullanın ve sırayla Floresans görüntüleri elde etmek. Çapraz-hadis uygun yazılımı sıralı tarama modunu kullanarak iki fluorochromes arasında ortadan kaldırmak.
    Not: Tüm mikroskop bilgisayar yazılımı sözde bir sıralı tarama modu ayarını etkinleştirir. Operatör fluorochromes elde etmek seçebilirsiniz ' bilgi aynı anda (örneğin, kırmızı-yeşil-mavi Floresans içinde) veya burada, tek tek belirtildiği gibi (ardışık) olarak fluorochrome fluorochrome tarafından. Maksimum uyarma/emisyon GFP için 395/509 genel bilgiler dikkate nm ve maksimum uyarma/emisyon mCherry için olduğunu 587/610 nm (burada şekil 2B içinde kullanılan fluorochromes bakınız). Bu bilgilere göre uygun uyarma ve emisyon filtreler için istediğiniz fluorochromes seçin. Filtre seçimi ve yordamlar tarama her confocal mikroskop için optimize gerekir.
  6. DNA lezyonlar, kullanım 64 satır tarama modu, indüksiyon için WLL geçiş (içinde ' Alım ' modu), dış UV kaynağında geçiş (üzerinde " UV lazer " düğme), faiz (ROI) bölgesi ayarlayın (içinde ' edinme ' modu) ve 355 nm ayarla Lazer için % 100 güç veya alternatif olarak, bir 405 nm lazer kaynağı kullanın.
    Not: Genel olarak, uygun lazer ayar düğmesi görüntü alma modunda tarafından lazer güç ayarlanır.
  7. Yerel microirradiation için çevre UVA spektrumunda yayarlar lazerler kullanıyor. Yatırım Getirisini çekirdeği microirradiation ve yakalama yansıması, lazer yoğunluğu ROI dışında düzenlemek için görüntü alma modunda sıfır olarak arka planını ayarlamak; hücre düzgün ışınlanmış, GFP Histon H2B sinyal kaybolur ve örneğin, mCherry öğesini PCNA protein DNA lezyonlar için hemen ışınlama sonra alınacaktır, ( şekil 2B ve Video 1 ).
    Not: Yatırım Getirisi bir confocal Ayrıca üç boyutlu (3D) projeksiyon (bkz: 3D döndürme ve x-y, x-z, y-z projeksiyonlar şekil 2C ve Video 2) bölümün içinde bir DNA hasarı indüklenen. Stixová vd. 355 nm ve 405 nm lazerler tam teknik parametrelerini açıklamaları için bkz: 7
  8. sonra ROI ışınlanmış, dış UV kaynak geçiş, yatırım Getirisi geçiş, WLL üzerinde geçiş, 8'e tarama satırını değiştirin ve ışınlama için başka bir hücreyi bulmak. Yatırım Getirisi seçimi için ilgili düğmeyi yazılımda kullanmak ' s resim alma modunu.
    Not: mCherry-PCNA DNA lezyonlar 2 ve 20 dk ( şekil 2B) arasında en fazla birikimi tepe vardır. Eksojen protein düzeyleri üzerinde sonucu görmek üzere, hemen yerel microirradiation sonra boyama ayirt devam. Işınlama zaman aralığına göre faiz seçin.
  9. Bir birikimi eksojen proteinlerin microirradiated hücrelerin çoğunda algılanabilir doğrula. Bu doğrulama için aşağıdaki adımlarda ölçütü kullanın.
    1. Onay yok overexpression geçici transfected hücrelerdeki eksojen protein olduğunu. Olası bir çözüm, yalnızca zayıf bir ifade (örneğin, mCherry-PCNA veya mCherry-53BP1) floresan protein içeren hücreleri seçin.
    2. Değerlendirmek resim alma için kullanılan WLL pozlama fototoksisite.
      Not: Fototoksisite sınama, uzun süreli lazer microirradiation için transfected hücreleri göstermek ve hücreler mitoz için 3A rakam gösterildiği gibi devam etmek doğrulamak -B. Olası bir çözüm, tarama süresi ve hücre başına confocal dilim sayısını azaltmak, 3D tarama en iyi Aksiyel adım (0.3 µm önerilir) seçime göre en iyi duruma getirme ve lazer ayarla ' s güç onun en azından. Alternatif olarak, fototoksisite ekimi ortamda çözünmüş Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic asit, E vitamini suda çözünen bir analog) kullanarak ortadan kaldırılabilir. DNA hasar ile ilgili deneyler için bu UV ışınlarına karşı koruyucu etkisi nedeniyle Trolox kullanmak için tavsiye edilmez.
    3. İle 355 nm lazer ışınlama durumunda yeterli birleşme BrdU BrdU birleşme üzerinden uygun bir BrdU algılama antikor kullanarak doğrulayın (bkz. Tablo reçetesi) kit. Bu yana BrdU DNA hücre döngüsü S aşamasında kurulmuştur, hücreleri çoğunluğu presensitization sırasında S-faz üzerinden devam etmeliyiz. Olası bir çözüm, hücre türü hücre döngüsünün uzunluğunu dikkate belirli.
    4. DNA tamir olsun ilgi proteinler
    5. analiz belirli hücre döngüsü lezyonlarının DNA evrelerini tanımak için bir yeteneği var. Olası bir çözüm: DNA lezyonlar için seçili protein alımı için belirli hücre döngüsü aşama (G1/S/G2) sınırlı olduğunu doğrulamak için HeLa-Fucci hücreler kullanın. Bu hücreler ifade RFP-Cdt1 G1 ve erken S aşamaları ve GFP öğesini geminin S/G2-M hücre döngüsü aşamaları 22 ( şekil 1).
    6. Apoptozis, hücre ölümü, önlemek için
    7. uygun lazer kaynağı seçin ve güç ayarı 23 lazer. Hücreleri ışınlanmış unutmayın mitoz için devam ( şekil 3A -B, Video 3).
      Not: İstenmeyen apoptosis Annexin V pozitifliği, caspase 3 veya B bölünme Okan tarafından tespit edilebilir. Dekolmanı morfolojik düzeyde, hücre ve apoptotik organları oluşumu görülebilir.

4. Ayirt Staining

  1. (mikroskop yemekleri büyüyen) hücre katmanı kısaca 1 × PBS ile yıkayınız ve hemen sonra durulama, oda sıcaklığında %4 formaldehit 10 dakikadır (HeLa türetilmiş hücre hatları) ya da 20 dk (için D3 ES hücreleri) kullanarak hücreleri tamir. 1 × PBS ile çanak durulayın.
    Uyarı: Formaldehit ciddi göz hasara neden olur, alerjik cilt reaksiyon neden olabilir ve aynı zamanda potansiyel bir kanserojen olduğu; Böylece, formaldehit ile tüm deneysel merdiven-meli var olmak kılınmak bir aspiratör mahallede.
    Not: gereksiz floresan sinyallerini ağartma önlemek için çanak karanlık bir odaya kuluçka zaman ayirt boyama için gerekli sırasında depolamak.
  2. Hücreleri Triton X-100 çözünmüş H 2 O 8 dakika içinde % 0.1 ile permeabilize ve saponin % 0,1 ve %0,1 içeren 1 × PBS ile 12 dk için hücreleri kuluçkaya Triton X-100. Kuluçka sonra iki kez 15 dakika süreyle 1 × PBS hücrelerde yıkama
  3. Incubate hücreleri ile % 1 BSA 1 × seçili antikorların belirsiz bağlama engellemek için PBS 60 dk için. Hücrelerde 1 × PBS 15dk için kuluçka sonra yıka.
  4. 1: 100 (veya 1: 200) oranında
  5. Dilute birincil antikor (Bu adım o olmalıdırptimized bireysel karşı antikorlar) 1 × PBS % 1 BSA içinde bu çözümün 25 µL çanak kullanarak ve bir coverslip hücrelerle kapsar. Hücreleri oksijen odasında birincil antikor gecede 4'te içeren çözüm ile kuluçkaya ° C.
  6. Ertesi gün, hücrelerde 1 × PBS iki kez 5 dakika süreyle yıkayın
  7. 1: 100 (veya alternatif olarak 1: 200) % 1 BSA 1 × PBS, bu çözümün 100 µL çanak kullanarak oranında, ikincil antikor sulandırmak ve bir coverslip hücrelerle kapsar. 60 dk için ikincil antikor içeren çözüm ile hücreleri kuluçkaya. Kuluçka sonra üç kez 5 dakika süreyle 1 × PBS hücrelerde yıkama
  8. Coverslip montaj orta bir damla ile bağlayın ve coverslip tırnak cilası ya da kurutma ve hareket sırasında mikroskobik gözlem önlemek için tutkal ile kapatın. Saat 4'te karanlıkta yemek depolamak ° C.

5. Floresans ömür boyu görüntü (FLIM) mikroskopi

  1. Başlangıç FLIM yazılım. Açık " Application Suite " yazılım ve geçiş yapmak " FLIM " modu. WLL darbeli modda çalıştığından emin olun.
    Not: Operatör pulse modu ulaşmak için donanım düğmesi geçmelidir.
  2. Yerel microirradiation sırasında aynı yönde mikroskop sahnede (Bölüm 4 lekeli) lekeli hücreleri içeren çanak yerleştirin ve Izgaralar üzerinde Petri kabına göre radyasyonlu hücreleri bulmak. Resim alma tarafından confocal mikroskop gerçekleştirmek.
    Not: aşağıdaki ayarları kullanın: 1024 × 1024 piksel, 400 Hz, çift yönlü modu, 16 satır, 8 x 12 yakınlaştırma
  3. FLIM ölçüm başlamadan önce bir gerçek zamanlı kayıt üstel girdabında yanında tıkırtı üstünde göstermek için bir ön test gerçekleştirmek " Kur FLIM " ve " Alım " basarak " çalıştırmak FLIM test ". Örnek FLIM parametrelerini aşağıdaki gibi iki ana parametre değerlendirmek tarafından en iyi duruma getirme.
    1. Uyarma dalga boyu ile WLL tekrarlama oranı ayarlı örnek ömür boyu en iyi duruma getir (aşağıdaki nota bakın). Confocal mikroskop yazılım, genellikle denir uygun düğmeyi ile lazer yoğunluğunu ayarlayın " lazer yararlanma ayarı " içinde ' görüntü edinme ' menü. Sonra bir bozunma eğrisi (veya foton hepsi gösterilen çubuk grafik) FLIM yazılımını kullanarak hesaplamak ( şekil 4A görmek -B).
      Not: WLL uyarma için nabız modunda kullanın. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ile bir darbe seçici tekrarlama oranı gibi seçilmesine olanak tanıyan WLL için donatılmış olmalıdır (80, 40, 20 veya 10 MHz). 488 uyarma dalga boyu Floresans donör, GFP, durumunda olan nm. Bozunma eğrisi FLIM yazılım çalışma alanı kullanarak kaydedilir. Parametre (τ D, τ DA) üstel çürüme kez gösterir (örneğin, fluorochrome ömür boyu); parametre (A) temsil fluorochrome çürüme genliğini (p53 GFP öğesini ve mCherry öğesini 53BP1 şekil 4A içinde için FLIM verileri örnekler bkz: -B).
    2. Yazılımları satın alma aracı'nı (select tekrarlama oranı kipi) kullanarak sayısı tekrarlama oranı kontrol edin. En parlak piksel örnek seçin; Eğrinin en parlak piksel için genel floresan yoğunluğu % 10'u olmalıdır.
  4. Tıklayın " ölçüm " ve basın " çalıştırmak FLIM ".

6. donör ömür boyu bir FLIM komut dosyası ve verimliliği hesaplama, FRET kullanarak

  1. perde-FLIM yazılımını başlatın ve açık ' donör ' çalışma.
  2. Select " analiz " / " görüntüleme " tab menü ve FLIM komut dosyasını tıklatarak başlatmak " başlatmak ". Optimum FRET-FLIM ayarlar için iyi bilinen etkileşen protein ortakları kullan.
    Not: iyi bilinen etkileşimli olarak çalışmak için FRET-FLIM verimliliği GFP p53 ortakları ve mCherry-53BP1 oldu (34.1 ± 2.3) % ( şekil 4 c).
  3. Kullanmak sadece donör emisyon kanal (channel 1 veya 2) ve basın " hızlı hesaplamak FLIM ".
    Not: Resim ve grafik de güncelleştirilir.
  4. FRET-FLIM içinde yazılım, yoğunluk ölçeği ayarlayın (0 - 4000 adet) ve ömür boyu ölçeği (0 - 5 ns) el ile belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde. Bu yaklaşım ile ilgi hücre görselleştirmek ve FRET-FLIM ölçüm ayarla.
    Not: Bu ayar floresan yoğunluğu hücre nüfus tek tek hücreleri arasında farklılıkları ortadan kaldıran.
  5. Çürüme formunda, uygun modeli seçin.
    Not: N-üstel reconvolution ve seçim modeli parametresi önerilir " n ". Bir oturması aşağıdaki kriterlerden: monte iyi bozunma eğrisi ve χ 2 bindirmeleri eğri - 1'e ( şekil 4B) eşit değerdir.
  6. Select " eşik " / " kullanım eşik " ve eşik 75'e ayarlayın. Başlangıç " ilk uyum ".
    Not: SPT64 yazılım FRET yokluğu ortalama donör hayatta hesaplar (" genlik ağırlıklı ortalama ömür boyu ", τ Av.Amp)

7. FLIM-perde komut dosyası kullanarak FRET verimlilik

  1. donör/alıcısı çalışma alanını seçin ve açın " analiz " | " görüntüleme " | " ömür boyu FRET görüntü ".
  2. Sadece donör aktif kanalı seçin ve piksel Binning foton numarası/piksel bağlı olarak ayarlayın. Daha sonra adı verilen yazılım modunda çalıştırın " hesaplamak FastFLIM ". Foton numarası/piksel görüntü düşükse, piksel Binning 4 puan için yükseltin.
  3. 0 - 200 sayar ve ömür boyu 0 - yoğunluğu ayarla 5 ns.
  4. Harekete geçirmek " kullanım eşik " ve 75 eşiğinde girmek.
  5. Uygun modelini ayarlamak " Multi-Exp. donör ", modeli parametresi girin " n ", τ girin Av.Amp (adım 6,6) olarak bir τ D ve harekete geçirmek " ilk uygun ".
  6. Set parametreler Bkgr Aralık, Shift IRF ve Bkgr IRF işareti kaldırarak sabit değerlere.
    Not: sabit kalmasını parametreleri çoğunluğu mümkün olduğu kadar ayarla. Bu yaklaşım istatistiksel dalgalanmaları azaltır. Bu durumda, basın mı " ilk uygun " tekrar. Belirtilen parametre açıklamaları izleyin: IRF enstrüman yanıt işlevi, BkgrDec = arka plan üstel uygun, ShiftIRF = üstel reconvolution BkgrIRF uygun, vardiya IRF = üstel reconvolution uygun IRF arka plan =. Tüm üç parametre hesaplanır ve daha fazla analiz için yazılım kullanarak sabit olabilir.
  7. Basın " hesaplamak FRETŔ bir perde (FLIM görüntü alanında çizilen) görüntü FRET verimliliği histogram hesaplanır ve bir FRET mesafe çubuk grafik çizilir ( şekil 4 c). Görüntü analiz ettikten sonra tuşuna basın " Kaydet sonucu ".
    Not: perde deneyler sırasında bu floresan proteinler floresan (parlak) ve sigara-floresan (karanlık) Birleşik arasına tersinir geçişler sergi düşünün gereklidir. Bu özelliği denir " yanıp ", ve perde verimliliği (Bu etkisi açıklaması sağlanan Vogerl vd tarafından bu olay tarafından etkilenen 24).

8. Sıkı BAĞLAMAK analizi

  1. yer dish mikroskop sahnede fluorescently tagged protein ilgi ifade transfected hücreleri bulmak ve parlak alan mikroskobu ile standart mikroskop lamba kullanarak resim alma gerçekleştirmek (bkz şekil 2Aa:-b) ve Floresans mikroskobu modları.
    1. Confocal mikroskop (veya lazer seçimi, seçili fluorochrome göre) bağlı beyaz ışık lazer (WLL) resim alma için kullanın. Kullanma ertesi gün koyma: 512 × 512 piksel, 1000 Hz, çift yönlü mod, satır ortalama 1, 8 x 12 yakınlaştırma
    2. (~ %10 lazer güçte) en az 15 prebleaching görüntüleri ve faiz (ROI) için resim alma menüsündeki bölgesi tanımlamak.
  2. Photobleaching deneyler için bir argon lazer kullanın (488 nm). Aşağıdaki ayarlar uygulanır: çerçeve Çözünürlük 512 × 512 piksel, 1000 Hz, çift yönlü modu, 8 x 10 zoom
    Not: GFP, mCherry ve RFP gibi Fluorochromes 488 çalışan bir argon lazer heyecanlı nm veya 514 nm.
  3. Seçim mikroskop sıkı BAĞLAMAK yazılım modunu kullanın. Photobleaching sırasında argon lazer ayarla ' s güç lazer ayar düğmesini kullanarak maksimum. Resim alma % 10 lazer güç 0,256 s aralıklarla gerçekleştirmek.
    Not: adımları postbleaching için tercih confocal mikroskop standart resim alma modunu kullanın. Photobleaching sonrası
    1. monitör Floresans toparlanma süresini (beyazlatma prosedür sonra 45-50 s ilâ).
      Not: şekil 4 d içinde gösterildiği gibi mCherry öğesini 53BP1 için photobleaching sonrası toparlanma süresini spontan DNA lezyonlar ve UVA ışınlama indüklenen foci farklıdır. mCherry-53BP1 UVA lezyonlar, hızla kendiliğinden meydana gelen DNA onarım foci adlı mCherry 53BP1 birikimleri ile karşılaştırıldığında kurtarıldı; bkz: şekil 4 d ve Foltankova vd. 25
  4. mikroskop yazılım (veya yazılım) verileri elektronik tabloya verme ve istatistiksel analiz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Gelişmiş confocal mikroskobu kullanarak, mCherry öğesini 53BP1 ve mCherry-PCNA proteinler DNA lezyonlar adlı bir birikimi görülmektedir. Analizleri canlı hücreler yerel microirradiation tarafından gerçekleştirilmiştir. Proteinlerin DNA onarım ile ilgili nükleer dağıtım desenleri tek hücre döngüsü aşamalı olarak tanımak için biz hangi G1, erken S, belirlemek mümkündür Fucci hücresel sistem ve G2 aşama hücre döngüsü (şekil 1). Biz Suchankova ve ark. Yayınlanan Fucci hücresel model biyolojik uygulanması 26 gösterir o 53BP1 (NHEJ) katılmadan homolog olmayan sonlarında bu proteinin işlevi ile ilişkili, hücre döngüsü, G1, S ve G2 aşamalarında yerel olarak bağlı DNA lezyonlar için işe bir yol açan ana mekanizmaları iki iplikçikli sonu onarım. Öte yandan, bu deneysel sistem bize homolog rekombinasyon onarım yolu (HRR) bağlı olduğu, PCNA proteinin geç S ve G2 aşamalarında hücre döngüsü 27DSBs tanır bireysel hücresel düzeyde gösterdi. DNA onarım makine üzerinde çalışmalar için biz de ışınlama koşulları hücre kültürleri UV lazerler (şekil 3) maruz kaldıktan sonra mitoz geçmesi devam sağlamak için optimize. Microirradiated hücreler mitoz geçiren bu deneysel koşullar içinde DNA onarım gelirleri nispeten fizyolojik bir şekilde ve hücre hangi yüksek yoğunluklarda apoptosis neden lazerler tarafından yaralandı değil, kanıtlamak. Burada, biz de DNA onarım proteinler karakterizasyonu için FRET-FLIM çözümleme uygulamak nasıl göstereceğim. Bu ileri teknoloji hücre çekirdeğinde yerel protein-protein etkileşimleri veya alternatif olarak, protein etkileşimleri çekirdekçik, nükleer lamina veya heterochromatin kümeleri gibi genelde bölgelerde çalışmaya sağlar. Bu teknoloji yeni başlayanlar için p53 ve 53BP1 gibi tanınmış etkileşen protein ortakları kullanarak bu FRET-FLIM tekniği en iyi duruma getirme önermek istiyorum (şekil 4A-C). Genel olarak, protein-protein etkileşim bilmek nasıl işlem çoğaltma, gen harekete geçirmek, susturmak veya DNA tamiri gibi protein kompleksleri düzenleyen anlamak için getirir. Buna ek olarak, protein Kinetik çalışmalar için çok yararlı bir araç yerel protein Difüzyon ve hareketlilik (şekil 4 d) özellikleri gösteren sıkı BAĞLAMAK yöntemidir. Birlikte ele alındığında, burada biz DNA gelişmiş confocal mikroskobu teknikleri uygulamak için metodolojik yönergeleri çalışmalar onarım sağlar.

Figure 1
Şekil 1: DNA onarım foci oluşumu RFP-cdt1 (kırmızı) G1/erken S aşamaları ve GFP-geminin (yeşil) hücre döngüsünün S/G2 aşamalarını ifade HeLa-Fucci hücrelerdeki okudu. Kendiliğinden meydana gelen DNA lezyonlar olumlu 53BP1 protein (mavi; «««Boyama) Alexa 405, (kırmızı), G1 incelenmiştir erken S (turuncu; RFP-cdt1 ve GFP-geminin ifade) hem de hücre döngüsü aşamalarının G2 (yeşil). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: DNA lezyonlar, mCherry öğesini PCNA alımı zaman içinde. (A) mCherry-PCNA (kırmızı), ifade hücreleri bir gridded mikroskop tabak içinde seçili bölgeler (gri) üzerinde yer alan. Fiksasyon ve immunostaining sonra ışınlanmış hücre (sarı ok) (bkz: gri harf K bir örnek) kayıtlı koordinatları göre bulunduğu (Aa-c). Sarı çerçeve ve oklar (Ad) microirradiated ve büyütülmüş olarak panelleri Ae-f cep göster. (B) mCherry-PCNA (kırmızı) birikimi stabil GFP öğesini Histon H2B (yeşil) ifade HeLa hücreleri incelenmiştir. Hücreleri hemen sonra 35 dakikaya kadar için yerel microirradiation sınıf başkanı ( Video 1bakınız). (C) Microirradiated hücreleri 3D confocal mikroskobu tarafından analiz edildi ve DNA lezyonlar (örneğin, mCherry-53BP1) adlı protein birikimine rağmen tek bütün üç boyutlu (x-y, x-z ve y-z) bulundu hücre çekirdeği midsection microirradiated yapıldı (bkz. şekil 2C Video 2 3D projeksiyonları 3D-hücre rotasyon). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: hücreleri microirradiated 405 nm lazer diyot tarafından normalde hücre devir-den geçerek devam. (A) kullanarak bir 405 nm diode lazer ışınlama sonra HeLa hücreleri (stabil ifade GFP Histon H2B; yeşil) mitoz geçmesi (Ayrıca bkz: Video 2). Sarı ok ve çerçeveler Seçili hücrelerdeki radyasyonlu yatırım Getirisini gösterir. Beyaz kare Haritayı mitoz. (B) aynı deneysel koşullar altında radyasyonlu hücrelerindeki mitoz da zaman atlamalı mikroskobu stabil GFP-H2B (yeşil) ifade ve geçici mCherry-PCNA (kırmızı) şeklinde ifade HeLa hücreleri tarafından gözlenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: FLIM ve FRET-FLIM analizi GFP p53 ve mCherry-53BP1. Floresans rezonans enerji transferi (FLIM ve floresan kurtarma Photobleaching sonra uygulama tarafından algılanan FRET)(sıkı BAĞLAMAK) çeşitli DNA lezyonlar. ( A-C) Ortalama (n = 10) bütün nonreplicating HeLa hücre çekirdeği içinde ölçülen GFP öğesini p53 devamsızlık ve alıcısı (mCherry-53BP1) varlığı, yaşam süreleri. (A)temsilcisi Floresans çürüme eğrileri ve fazlalıklar okudu geçici GFP-p53 (salt donör τD) veya GFP p53 ve mCherry-53BP1 ifade HeLa hücreleri (donör-alıcısı, τDA). (B) dant yaşam süreleri (τ1 τ -3) ve genlikleri (1 -3) (bir) GFP p53 ve (b) mCherry-53BP1, ölçülen bütün HeLa hücre çekirdeği içinde. Χ2 değerler de hesaplanan ve gösterilir. (C) özetini FRET verimlilik için iyi bilinen etkileşen ortakları GFP p53 ve mCherry-53BP1. Ölçek çubukları iyi bilinen etkileşim GFP öğesini p53 ve mCherry öğesini 53BP1 ortakları için 4-5 µm. FRET-FLIM sonucu gösteren ~ %35 FRET verimlilik =. (D) MCherry-53BP1 kurtarma Kinetik kendiliğinden meydana gelen DNA lezyonlar (yeşil eğri) ve UVA kaynaklı DNA lezyonlar (mavi eğrisi) okudu. DNA lezyonlar, mCherry arka plan (protein mCherry-53BP1 protein dağınık formu) seviyeye ağartılmış ve arka plan Floresans her değerinden çıkarılır. Data, mCherry-53BP1, göreli floresan yoğunluğu gösterildiği anlamına gelir ± standart hata sunulmaktadır. Öğrenci t-Testi ortaya DNA lezyonlar iki tür arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark (* p ≤0.05 gösterir). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Video 1
Video 1: İşe Alım mCherry öğesini PCNA proteinin (kırmızı Floresans) DNA lezyonlar için indüklenen HeLa hücreleri stabil ifade GFP öğesini Histon H2B içinde yerel microirradiation tarafından (yeşil floresan). Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

Video 2
Video 2: DNA lezyonlar, mCherry öğesini 53BP1 protein (kırmızı Floresans) birikimi indüklenen tarafından HeLa hücreleri içinde yerel microirradiation. Hücre çekirdeği hücre döndürme uzayda görselleştirme sağlayan bir yazılım modu kullanarak 3B alanda gösterilir. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

Video 3
Video 3: Microirradiated HeLa hücreleri stabil Histon H2B GFP öğesini ifade (yeşil floresan) mitoz devam. Radyoaktif bölge GFP H2B (siyah hücre çekirdeği içinde ışınlanmış şeritler bölgeleridir) tükenmesi ile karakterizedir. Bu videoyu indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikroskopi teknikleri temel araçları araştırma laboratuarları'nda temsil eder. Burada, protein alımı için çalışma yöntemleri hakkında kısa bir açıklama kullanılan ve Kinetik DNA lezyonlar, sunulur. Biz özellikle deneysel deneyimi yaşayan hücrelerin yerel microirradiation alanında kaydetti ve sıkı BAĞLAMAK ve protein-protein etkileşim alıcısı ağartma FRET28 DNA lezyonlar ve onun gelişmiş protein Kinetik incelenmesi konuşalım değişiklik FRET-FLIM (şekil 4A-D). Burada gösterilen yöntemleri gelişmiş confocal mikroskoplar6,7,8tarafındankontrol DNA onarım işlemleri, özellikle protein Kinetik yaşam hücresel sistemleri, gerçek bir anlayış için temel araçları şunlardır, 28. Bu yöntemler dokular veya tümör hücre morfolojisi karakterize radyoterapi etkisi ile ilgili olarak gelecekte tıp muazzam yardımcı programı vardır. Bu yöntem en iyi duruma getirmek için biz iyi bilinen etkileşen protein ortaklarıyla başlayan önermek şekil 4 ciçinde gösterildiği gibi istiyorum.

İyi protein alımı DNA lezyonlar için son derece dinamik ve zamana bağımlı olduğu bilinmektedir; Böylece, hızlandırılmış confocal mikroskobu uygulamadan sonra hücre ışınlama değil sadece temel bilim alanında aynı zamanda klinikler26gereklidir. Yerel olarak bağlı DNA lezyonlar lazer microirradiation9,28,29 nedeniyle protein alımı, protein-protein veya protein-DNA bağlayıcı çalışmaya mümkün nerede genomik bölgeleri temsil ve etkileşim. Bu yöntemlerin başlangıç noktası eksojen protein alımı endojen düzeyde uygun antikorlar tarafından doğrulanması gerekir olduğunu. Ardından, bu tür deneyler kritik adım aşırı transfected hücreleri yanlış pozitif sonuçlar sağlayabilir mi; Bu nedenle, en iyi karar stabil ifade ilgi fluorescently tagged proteinler hücre hatları oluşturmaktır. Ayrıca, resim alma için kullanılan lazerler Fototoksik etkileri, nedeniyle koşullar tarama için optimize edilmiş olması gerekir ya da Trolox bileşik hücre ekimi ortamda çözünmüş gerekir. Ayrıca ortadan kaldırılması ışınlama önerilir önce presensitization adım. Öyle ki hücreler mitoz ()şekil 3A-B geçmesi yerel microirradiation sonra DNA tamiri devam etmeliyiz ve Video 3). Lazer ile en uygun DNA görünümünü daha az değerli bir işlemden sonra apoptosis indüksiyon23onarın. Bu da bazı DNA onarım proteinler DNA hasar sadece belirli hücre döngüsü aşamalarını (örneğin, Bártová ve ark. tanımak açıktır 30). DNA'ın çalışmaları yanıt zarar için böylece, hücreleri interfaz, tek tek aşamalı olarak gösterilen HeLa-Fucci hücresel sistem kullanımı yararlı bir araçtır. Buna ek olarak, hücre döngüsü aşamaları PCNA protein31nükleer dağıtım kalıba uygun kabul edilebilir.

İyi sıkı BAĞLAMAK ve perde yöntemleri özellikleri proteinlerin DNA lezyonlar7,8,32' ye işe soruşturma için çok yararlı araçlar temsil bilinmektedir. Ayrıca, FLIM tekniği32 DNA lezyonlar birikir proteinlerin dinamik konformasyon değişiklikler hakkında bilgiler ortaya çıkarabilir. Çünkü FLIM dinamik hücresel süreçler doğrudan önlemler, bu yöntemin kullanılması önemlidir; Böylece, kararlı durum floresan yoğunluğu zaman içinde ölçülür. Arka plan Floresans ortadan kaldırarak FLIM yaklaşımlar artış görüntü kontrastı. Bu ile karşılaştırıldığında geleneksel alıcısı ağartma perde perde-FLIM ölçü bir avantajdır. FLIM tarafından ölçülen Floresans ömürleri fluorescently tagged proteinlerin kesirler hakkında bilgi ve nasıl heterogenic sondalar göstermek çevresel koşullar nedeniyle. FLIM de en iyi ve en güvenilir biyofiziksel yaklaşım protein-protein etkileşim yaşam için FRET performans32,33hücreleri.

Birlikte ele alındığında, tüm açıklanan yöntemleri insan hücrelerinde DNA hasarı yanıtının yeni mekanizmaları özellikle radiotherapeutic yaklaşımlar için önemli olduğu ortaya çıkarmak için potansiyel var. Örneğin, multiphoton FLIM multiphoton tomografi34çağrıldığı tıp, yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde etmek için uygulanmıştır. Bu son derece sofistike mikroskobik yöntem kliniklerde kanser tanısı histochemical örnekler için uygulanan ve yüksek çözünürlük ile analiz. FLIM yöntemleri Ayrıca tümör hücre yüzeyleri onların autofluorescence göre kesin bir analizini sağlar. FLIM-perde yönteminin bir dezavantajı mikroskop operatörü tarafından tam olarak anlaşılması gerekir olan son derece gelişmiş yazılım arka plan olduğunu. Daha fazla biyolojik alaka FLIM veri, genel olarak ve DNA onarım işlemleri, kesinlikle yakın gelecekte ortaya çıkacak.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması vardır bildirin.

Acknowledgments

Bu eser Çek Cumhuriyeti, proje P302-12-G157 Grant ajansı tarafından desteklenmiştir. Deneyler de Norveç fon tarafından ve Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor Çek Cumhuriyeti tarafından denetimli çek-Norveç araştırma programı CZ09 tarafından desteklenen (sayı vermek: 7F14369).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell cultivation
HeLa ATCC CCL-2TM
ES-D3 [D3] ATCC CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM PAN-Biotech P03-0710
DMEM high glucose Sigma-Aldrich D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS) HyClone SV30180.03
ES Cell FBS Gibco 16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA) Gibco 11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor) Merck Millipore ESG1107
MTG (1-Thioglycerol) Sigma-Aldrich M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution Biosera XC-A4122/100
Trypsin - EDTA Biosera XC-T1717/100 dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes Sigma-Aldrich P7866 cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500 Ibidi GmbH 81166 microscopic dish
0.2% Gelatine Sigma-Aldrich G1890-100G dilute in destille water and autoclaved
Name Company Catalog Number Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid Addgene 12091
mCherry-PCNA plasmid generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid Addgene 19835
Metafecetene Biontex Laboratories GmbH T020–2.0
10 × PBS Thermo Fisher Scientific AM9625 for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine Sigma-Aldrich 11296736001
Name Company Catalog Number Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5 Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8 Leica Microsystems
White-light laser Leica Microsystems
355-nm laser Coherent Inc. laser power 80 mW
405-nm laser Leica Microsystems laser power 50 mW
Name Company Catalog Number Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip VWR International Ltd 631-1580
4% paraformaldehyde Affymetrix 19943 1 LT
Triton X100 MP Biomedicals 2194854
Saponin from quillaja bark Sigma-Aldrich S4521
BSA Sigma-Aldrich A2153
53BP1 Abcam ab21083 primary antibody
AlexaFluore 647 Thermo Fisher Scientific A27040 secondary antibody
Vectashield Vector Laboratories Ltd H-1000 mounting medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88, (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280, (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7, (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74, (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35, (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6, (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7, (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, Suppl 1. 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185, (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5, (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22, (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235, (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3, (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. 3rd ed, Springers Science+Business Media, LLC. New York, USA. (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32, (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20, (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91, (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23, (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8, (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160, (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15, (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6, (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7, (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19, (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107, (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116, (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227, (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188, (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9, (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66, (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66, (2), 230-236 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics