mRNA从植物原生质体捕获

Biochemistry

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Summary

在这里,我们提出了应用于拟南芥叶肉叶肉原生质体的相互作用捕获方案。该方法严格依赖于体内紫外线交联,并允许从生理环境中分离和鉴定植物mRNA结合蛋白。

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Zhang, Z., Boonen, K., Li, M., Geuten, K. mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts. J. Vis. Exp. (125), e56011, doi:10.3791/56011 (2017).

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Abstract

RNA结合蛋白(RBP)决定RNA的命运。他们参与所有的RNA生物发生途径,特别有助于信使RNA(mRNA)的转录后基因调控(PTGR)。在过去几年中,已经通过使用称为“mRNA相互作用捕获”的新方法成功地分离了许多来自酵母和哺乳动物细胞系的mRNA结合蛋白质组,其允许鉴定mRNA结合蛋白(mRBP)直接从生理环境。该方法由体内紫外(UV)交联,寡核苷酸(dT)珠的信使核糖核蛋白复合物(mRNP)的下拉和纯化以及随后通过质谱(MS)鉴定交联蛋白质组成。最近,通过应用相同的方法,已经从不同的拟南芥组织来源同时报道了几种植物mRNA结合的蛋白质组:病毒幼苗,叶组织,叶肉叶原生质体和培养根细胞。在这里,我们提出了拟南芥叶肉叶片原生质体的优化的mRNA相互作用捕获方法,这是一种细胞类型,其用作包括各种细胞测定的实验的通用工具。最佳蛋白质产量的条件包括起始组织的量和UV照射的持续时间。在从中等规模实验(10 7个细胞)获得的mRNA结合蛋白质组中,发现具有RNA结合能力的RBP被超表达,并且鉴定出许多新的RBP。实验可以放大(10 9个细胞),优化的方法可以应用于其他植物细胞类型和物种,以广泛分离,编目和比较植物中mRNA结合的蛋白质组。

Introduction

真核生物使用多个RNA生物发生调控途径来维持细胞生物学过程。在已知类型的RNA,mRNA的是非常多样的并携带的蛋白质的编码能力和它们的同种型1个 .The PTGR通路引导预的mRNA 2,3的命运。来自不同基因家族的RBPs控制RNA的调节,并且在PTGR中,特异性mRBP通过直接物理相互作用指导mRNAs,形成功能性mRNP。因此,识别和表征mRBPs及其mRNP对于了解细胞mRNA代谢的调节至关重要2。在过去三十年中,各种体外方法 - 包括RNA电泳迁移率转移(REMSA)测定法,通过指数富集测定系统进化配体(SELEX),基于文库衍生构建体,RNA Bind-n-Seq(RBNS),放射性标记或定量荧光RNA结合测定法,X-射线晶体学和NMR光谱法4,5,6,7,8,9 -已被广泛应用到限制性商业惯例的研究,主要是从哺乳动物细胞。这些哺乳动物RBP研究的结果可以通过RNA结合蛋白DataBase(RBPDB)进行搜索,收集了已发表的观察10

尽管这些体外方法是强大的工具,但它们确定了来自给定的RNA序列库的结合RNA基序,因此在发现新的靶RNA的能力方面受到限制。计算策略预测基因组范围的RBP也是如此,它们基于蛋白质序列和结构15的保守性。为了克服这个,一个新的实验方法哈已被确定,其允许识别感兴趣的RBP相互作用的RNA图案,以及用于确定结合的精确位置。这种称为“交联和免疫沉淀”(CLIP)的方法由体内紫外线交联,然后进行免疫沉淀11 。早期研究表明,DNA和RNA核苷酸的光激活可以发生在大于245nm的激发UV波长处。通过胸苷的反应似乎是有利的(按光反应性降低的顺序排列:dT≥dC> rU> rC,dA,dG) 12 。使用波长为254nm(UV-C)的紫外光,观察到当RNA核苷酸和蛋白质残基之间的共价键仅在几埃(Å)的范围内时产生。因此,这种现象称为RNA和RBP的“零长度”交联。之后可以进行严格的净化程序很少背景13,14杜热。

与CLIP相辅相成的策略是将体内紫外线交联与蛋白质鉴定相结合以描述RBP的景观。许多这样的全基因组基因结合的蛋白质组已经从酵母细胞,胚胎干细胞(ESC),并使用该新的实验方法的人细胞系( 即,HEK293和HeLa)中分离,被称为“mRNA的相互作用组捕获” 18 19,20,21。该方法由体内紫外线交联,然后是mRNP纯化和基于MS的蛋白质组学。通过应用这种策略,已经发现了许多含有非典型RBD的新型“月光”RBP,并且已经清楚的是,更多的蛋白质具有比以前所想象的RNA结合能力“> 15,16,17,使用这种方法允许新的应用程序和调查限制性商业惯例时,回答新的生物学问题的能力。例如,最近的一项研究调查了mRNA的结合蛋白质(核心RBP的保护蛋白质组)酵母和人类细胞之间22

已经发现植物限制性商业惯例参与生长和发育( 例如 ,在开花时间的转录后调节,昼夜节律钟,并在线粒体和叶绿体基因表达)的24,25,26,27,28,29 。此外,他们被认为在响应非生物胁迫的细胞过程中进行功能( 例如,感冒,干旱,salinity,和脱落酸(ABA))31,32,33,34。基于RNA识别基序(RRM)和K同源性(KH)结构域序列基因, 拟南芥基因组中有超过200种预测的RBP基因;在水稻,大约250已注意到35,36。值得注意的是,许多预测限制性商业惯例似乎是独特的植物( 例如,没有后生动物直向同源物,以含有RRM结构域预测拟南芥限制性商业惯例的约50%)35,这表明许多可以用作新的功能。大多数预测RBP的功能仍然没有表征23

通过使用来自拟南芥的幼苗,叶组织,培养的根细胞和叶肉叶原生质体的mRNA结合的蛋白质组分离基因相互作用组捕获近日有报道称38,39。这些研究表明在不久的将来系统地对植物功能性RBP进行编目的潜力很大。在这里,我们提出了从植物原生质体( 没有细胞壁的细胞)捕获mRNA相互作用的方案。 拟南芥叶片叶肉原生质体是叶细胞的主要类型。分离的原生质体允许UV光最佳地接近细胞。这种细胞类型可以在瞬时表达功能表征40,41蛋白质测定中。此外,原生质体已被应用到其它几种植物细胞类型和物种42,43,44( 例如,彼得森等人 ,2009;和巴格曼伯恩鲍姆,2010;和Hong 等人 ,2012)。

<p class =“jove_content”>该方法总共包含11个步骤( 图1A )。首先分离拟南芥叶肉叶肉原生质体(步骤1),随后UV照射形成交联的mRNP(步骤2)。当原生质体在变性条件下裂解(步骤3)时,将交联的mRNP释放在裂解/结合缓冲液中,并通过oligo-d(T) 25珠(步骤4)下拉。经过几轮严格洗涤后,将mRNPs纯化并进一步分析。在纯化交联的mRNA之前,通过蛋白酶K消化mRBPs的变性肽,并通过qRT-PCR验证RNA质量(步骤5和6)。经RNA酶处理和蛋白质浓缩(步骤7)后,蛋白质质量由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和银染法(步骤8)进行控制。在交联样品(CL)和非交联样品(非CL;交联样品)之间,蛋白质带图案的差异可以容易地可视化。来自不经受紫外线照射的原生质体的阴性对照样品)。蛋白质的鉴定通过基于MS的蛋白质组学获得。通过一维聚丙烯酰胺凝胶电泳(1D-PAGE)分离来自CL样品的蛋白质以除去可能的背景污染,并使用胰蛋白酶将其“凝胶内消化”成短肽,并进行纯化(步骤9)。偶联到质谱(纳米LC-MS)的纳米反相液相色谱法允许测定mRNA结合蛋白质组中的确定蛋白质的量(步骤10)。最后,使用生物信息学分析对所鉴定的mRBP进行表征和编目(步骤11)。

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Protocol

拟南芥叶片叶肉原生质体分离

注意:如Yoo 等人 ,2007所述, 拟南芥叶肉叶肉原生质体基本上是分离的,有几个修改40

  1. 植物生长
    1. 在黑暗中将大约200个拟南芥 Col-0生态型种子在4℃下在无菌水中浸泡2天以进行分层。
      注意:这个种子数量足够用于一个非CL样品和一个CL样品(见步骤1.3)。
    2. 用50%( v / v )土壤和蛭石混合物制备锅,并将锅中的蒸馏水浸泡在托盘中以润湿土壤。
    3. 播种并分布在湿土上的分层种子。不要用额外的土壤覆盖种子,因为拟南芥种子需要光来发芽。
      注意:植物生长条件是23℃下12小时光/ 12小时黑暗循环,光照强度为100μmol - 2s -1 ,在开花前5周的生长室中。 4周龄的植物也可以使用40
      注意:所有描述的材料和试剂从步骤1.2.1到步骤3.2.3是两个样品( 一个非CL样品(不经受UV-C照射的对照样品)和一个CL样品(研究经受UV-C照射的样品))。
  2. 制备等渗酶溶液
    1. 制备80mL的初级等渗酶溶液(400mM甘露糖醇,20mM KCl和20mM MES缓冲液(pH 5.7)),并立即将该溶液在60℃的培养箱中加热10分钟。
    2. 添加1.2克纤维素酶R10(w / v的1.5%。)和0.32g离析酶R10的(w / v的0.4%)粉末以暖主等渗酶溶液。
    3. 通过温和搅拌,将酶粉小心地加入溶液中。敲击将溶液在60℃的培养箱中轻轻加热10分钟,直到酶溶液澄清为浅棕色。
    4. 将溶液在冰上冷却3分钟,并向溶液中加入800μL1M CaCl 2和800μL10%( w / v )BSA。
    5. 通过0.22μm过滤器的吸移和过滤来均化溶液。将该最终的等渗酶溶液分成两个大型培养皿(150mm×20mm)。
  3. 拟南芥花瓣叶条的制备
    注意:对于一个非CL样品或一个CL样品,推荐每个培养皿的150个叶子。
    1. 选择并切割一共有300完全展开2 -或-pair真叶(平均:3 - 4%莲座) 第三成0.5至1毫米的叶条使用新的和尖锐的剃刀刃。
    2. 将条带立即转移并浸没到等渗酶溶液中。
      注意:为避免与光线接触,请始终盖住他的陪练菜用铝箔。不要粉碎叶子。确认所有的条都浸没在溶液中,并且不漂浮在表面上。
  4. 拟南芥叶肉叶片原生质体的分离
    1. 将铝箔覆盖的培养皿放入真空干燥器中,真空浸泡叶条30分钟。随后,在黑暗中孵育培养皿,在室温下摇动2.5小时。
    2. 轻轻地,手动地轻轻晃动盘子,试图将原生质体完全释放到酶溶液中。
  5. 收获和计数原生质体
    1. 通过35至75μm的尼龙网过滤原生质体悬浮液。将每个样品的滤液等分成两个50mL圆底管(每个管中约20mL滤液)。
    2. 用10mL的W5缓冲液(154mM NaCl,125mM CaCl 2)冲洗每个培养皿
    3. 将所有四个管以100xg旋转5分钟以沉淀原生质体。弃去上清液,轻轻将每个管中的原生质体沉淀重悬于10mL的W5缓冲液中。
      注意:当重新悬浮原生质体颗粒时,轻轻地将管颠倒倒置,轻轻地用手旋转管,直到颗粒消失。不要直接移液,以免损坏细胞。
    4. 重复步骤1.5.3一次,将每个样品的两个管的原生质体悬浮液合并到一个50mL的圆底管中。将管保持在冰上。
    5. 使用血细胞计数器计数原生质体。
      注意:25个立方体内的每个20个细胞等于2×10 5个原生质体/ mL。 150叶应产生约1×10 7个细胞。在非CL和CL样品中调制具有相等的原生质体总数。
    6. 将原生质体保持在冰上30分钟。然后,以100×g旋转管5分钟。弃去上清液并用20mL MMg溶液(400mM甘露醇,15mM MgCl 2和4mM MES缓冲液(pH 5.7))将每个试管中的原生质体重悬浮。

2.通过紫外线照射进行体内 mRNA-蛋白质交联

注意:将非CL样品管保持在冰上。 CL样品必须立即进行紫外线照射。

  1. 将含有1×10 7个细胞的原生质体悬浮液从CL样品管转移到新的大规模培养皿(150mm×20mm),并加入30mL冰冷的MMg溶液以覆盖板表面。通过轻轻移液将细胞扩散到整个MMg缓冲液中。立即将没有顶盖的培养皿放置在紫外线交联装置中。
    注意:UV灯之间的高度而培养皿为8厘米。
  2. 用254nm波长紫外光和0.00875W / cm 2 UV强度照射样品1分钟,3分钟或5分钟。辐射后,将原生质体悬浮液快速等分成两个新的50mL圆底管。用额外的5mL冰冷的MMg溶液洗涤盘的底部以收集剩余的原生质体,并将该细胞悬浮液加入到这两个管中。
    注意:选择1分钟作为最佳条件。说明可以在代表性的结果中找到。

3.变性条件下的原生质体裂解

  1. 原生质体颗粒的制备用于裂解
    1. 将非CL样品管与来自步骤2的两个CL样品管一起以100xg旋转5分钟,并丢弃上清液。将非CL样品原生质体沉淀管放回冰上。
    2. 向每个CL样品管中加入10mL冰冷的MMg溶液重新悬浮颗粒,并将其组合回一个50mL圆底管。将管子以100xg旋转5分钟。去除上清液后,将CL样品管原生质体沉淀物保持在冰上。
  2. 原生质体裂解和均质原生质体裂解物
    1. 加入9mL冰冷的裂解/结合缓冲液(500mM LiCl,0.5%( w / v )的十二烷基硫酸锂(LiDS),5mM二硫苏糖醇(DTT),20mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA(pH8.0))至每个样品的细胞沉淀。通过上下移动约20次大量溶解原生质体,直至悬浮液均匀为浅绿色。
    2. 将原生质体裂解物两次通过具有窄针(0.9×25mm 2 )的50mL的玻璃注射器进行均质化。将溶胞产物在冰上孵育10分钟。在液氮中冷冻裂解物,并在-80°C下储存长达3周。

4. mRNP下拉和净化由Oligo-d(T) 25

注意:从步骤4.1到步骤4.4,所有以下描述的材料和试剂仅适用于一个样品( 一个非CL样品或一个CL样品)。在弃去珠粒上清液裂解/结合缓冲液后,必须将原生质体裂解液立即加入含有珠粒的管中。

  1. 制备寡聚(dT)捕获的oligo-d(T) 25磁珠
    1. 在室温下解冻冷冻的原生质体裂解物。当裂解物完全解冻时,将裂解液管保持在冰上。
    2. 将1.8mL的oligo-d(T) 25磁珠(5mg / mL)分成6个新的2mL圆底微量离心管在冰上。在每个管中,用600μL裂解/结合缓冲液均匀洗涤珠粒悬浮液,通过上下简单吸取和轻轻地在4℃下旋转2分钟。保持珠子在冰上。
  2. 捆绑
    1. 地点所有6个管将珠子在4℃下放入磁性架中3分钟,这将导致磁珠的磁捕获和悬浮液的清除。
      注意:将管放入磁性架时,请等到珠子完全捕获,至少3分钟。
    2. 丢弃上清液,并立即将9 mL原生质体裂解液等分成6个管。通过移液混合均匀,直到出现均匀的棕色悬浮液,并通过缓慢旋转在4℃孵育原生质体裂解物中的珠子1小时。
      注意:建议30分钟至1小时的孵育时间。
  3. 洗涤
    1. 将管置于磁性架上4℃3分钟。当所有小珠被捕获在管的一侧时,收集原生质体溶解产物到6个新的2-mL圆底微量离心管中并将其暂时储存在4℃。不要立即丢弃原生质体裂解物;保持裂解物在4℃。
    2. 加入1.5mL冰冷的洗涤缓冲液1(500mM LiCl,0.1%( w / v )LiDS,5mM DTT,20mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA(pH8.0))至珠粒在每个管中。重悬珠并轻轻旋转1分钟。将管置于4℃的磁性架上3分钟,弃去上清液。用洗涤缓冲液重复此洗涤步骤一次。
    3. 使用1.5mL冰冷的洗涤缓冲液2(500mM LiCl,5mM DTT,20mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA(pH8.0))重复相同的该洗涤步骤两次,一次使用1.5mL冰冷的低盐缓冲液(200mM LiCl,20mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA(pH8.0))。
      注意:如果mRNP已经从原生质体裂解物中有效分离,则在洗涤步骤中,在洗涤缓冲液2( 图1B )中应该存在CL样品中珠粒周围可见的“卤素”。
  4. 洗脱
    1. 加入500μL的洗脱缓冲液(20mM Tris-HCl(pH7.5)和1mM EDTA(pH8.0))加入到每个管中的珠子上。轻轻重悬珠,并在50℃孵育3分钟以释放聚(A)尾缩的RNA。通过移液轻轻重悬珠。将管放回到磁性架上4℃5分钟。
    2. 将所有洗脱液(总共约3mL)转移并结合到冰上的干​​净,无菌的无RNase,15-mL锥形底管上。
      注意:可以使用分光光度计装置立即测定RNA的质量和数量。
      注意:每个样品的RNA浓度约为10 ng /μL, A 260 / A 280比为1.9。 A 260 / A 280的比值应在1.6和2.0之间,因为分离的聚(A) - 尾RNA通常大于70%纯。如果RNA浓度太低,则将起始原生质体的数量增加到最多10 9 。样品可以在液氮中冷冻并保持在80°C长期储存。
    3. 重复步骤4.2至步骤4.4进行另外两轮,并重新使用oligo-d(T) 25珠来消耗原生质体裂解液中的聚(A)尾DNA。
      注意:经过三轮下拉程序,每个非CL或CL样品应总共有9 mL洗脱液。执行4°C的所有工作,以避免RNA的降解。按照步骤4.5或步骤4.6重新使用或再生珠子。
  5. 制备重复使用的oligo-d(T) 25
    1. 用1mL冰冷的洗脱缓冲液洗涤珠子两次,并用1mL冰冷的裂解/结合缓冲液洗涤一次,以将盐LiCl浓度调至500mM。
    2. 按照步骤4.1,丢弃上清液,将每个管中储存的原生质体裂解物转移,再重复从步骤4.2至步骤4.4的整个程序再进行两轮。
  6. 25珠的再生
    注意:珠可以存储并用于另一个实验(最多重复使用三次)。
    1. 按照步骤4.4,向珠中加入1mL 0.1M NaOH,并在室温下旋转5分钟。对于每个管,用1mL洗涤缓冲液1洗涤两次,并用含有0.1%Tween-20的1x PBS(pH 7.4)洗涤三次以进行平衡。将每个管中的珠子保存在含有0.1%Tween-20的300μL无菌RNase-free 1x PBS(pH 7.4)中,4℃下长时间储存​​。
      注意:本实验中用于拟南芥 CL样品的珠子只能在下次使用于相同的植物样品。

5.蛋白酶K处理和mRNA纯化

  1. 蛋白酶K处理
    1. 向每个样品的1 mL洗脱液中加入8μL蛋白酶K溶液(2μg/μL),以消化紫外线交联的蛋白质。 BRiefly涡旋。
  2. mRNA纯化
    1. 将洗脱液在37℃孵育1小时。使用RNA纯化试剂盒纯化RNA以除去残留的污染物。
      注意:纯化后,使用qRT-PCR测定RNA可以进行RNA质量检测。
      注:其它试剂盒,如RNA mini试剂盒和TRIzol试剂,也可以使用14。

6.RT-PCR测定

  1. 逆转录
    1. 使用逆转录系统实现第一链cDNA的高效合成,以1μgRNA为模板。用无核酸酶的水将样品稀释至5 ng /μL。
  2. 使用qRT-PCR进行cDNA定量
    1. 使用qPCR主混合物和实时PCR循环仪扩增和定量cDNA,以10ng cDNA为模板。使用以下PCR程序:95℃10分钟(阶段1,一个循环)和95℃15秒和60℃1分钟(阶段2,40个循环)。
      注意:这里使用的参考基因是内源性内部控制基因UBQ10 (AT4G05320)。为UBQ10和18S rRNA基因的qRT-PCR引物在Li 等人 ,2014和Durut 等人 ,2014,分别为45,46进行了说明。引物序列列在材料表中

7. RNA酶处理和mRBP浓度

  1. 核糖核酸酶处理
    1. 将含有RNase A和RNase T1的约100 U RNase混合液加入8 mL洗脱液中。包括带有RNase鸡尾酒的阴性对照样品,其中洗脱液被无核酸酶的水替代。短暂涡旋并在37℃孵育1小时。
  2. mRBP浓度
    1. RNase消化后,将洗脱液浓缩g离心过滤器单元。终体积为75μL,浓缩后每个样品的总蛋白质产量约为2μg。将样品置于-80°C进行长期储存。

8. SDS-PAGE和银染

  1. SDS-PAGE
    1. 将25μL浓缩洗脱液(CL样品)或对照样品(非CL样品)与15μL2x加载染料混合。将样品在95℃加热5分钟,并将其装载在含有5%堆积凝胶和12%拆分凝胶(包括蛋白质标记物)的SDS-PAGE凝胶上。
    2. 将蛋白质在60V下浓缩40分钟,并在160V下分离约1小时,直到加载染料到达分辨凝胶的末端。
  2. 银染试验
    1. 每次用超纯水洗涤SDS-PAGE凝胶两次5分钟。使用商业银色试剂盒进行蛋白质的银染。
      注意:蛋白质条带必须在5分钟内显示。如果条纹在5分钟以内可见,颜色非常浅,建议将起始原生质体的数量增加到最多10 9

蛋白质带和肽纯化的胰蛋白酶摘要

  1. 胰蛋白酶消化
    注意:通过从每个样品取另外25μL浓缩的mRBP溶液进行mRBP鉴定,运行第二个1D-PAGE凝胶;银染的凝胶不能使用,因为它们与MS分析不兼容。
    1. 运行1D-PAGE凝胶后,将凝胶固定在固定溶液(50%( v / v )甲醇和10%( v / v )乙酸中)1小时。在轻轻摇动下,将污渍溶液(0.1%( w / v )考马斯亮蓝R-250,50%( v / v )甲醇和10%( v / v )乙酸)中的凝胶染色20分钟。去除溶液中的凝胶(40%( v / v )甲醇和10%( v/ v)乙酸)1小时。脱色后,将凝胶保持在5%( v / v )乙酸中。
      注意:在脱色期间,可以更换新的出色解决方案,直到背景完全脱色为止。
    2. 将感兴趣的乐队剪掉凝胶。将条带进一步切成约1mm 3的片段,用于随后的最佳胰蛋白酶消化和提取肽。用50μL的100mM碳酸氢铵(NH 4 HCO 3 )将凝胶块水合10分钟。完全覆盖凝胶片。
      1. 仔细取出保湿溶液,用乙腈(CH 3 CN)将凝胶片脱水10分钟。小心地除去乙腈溶液。
      2. 重复从水化到脱水两次。最后,取出乙腈溶液。
        注意:凝胶运行时间取决于实验的目的。长时间可以很好的分离蛋白质,所以染色的具体凝胶禁止可以删除ds进行进一步分析。如果目的是保持蛋白质和去除污染物,短的运行时间就足够了。
    3. 加入500μL6.6 mM DTT溶液,并将凝胶片孵育10分钟。取出DTT溶液,用500μL95%( v / v )乙腈溶液洗涤凝胶片两次。
      1. 洗涤后,取出乙腈溶液,并在黑暗中将凝胶片与500μL的55mM碘乙酸(IAA)溶液孵育10分钟。
      2. 孵育后,取出溶液,再用500μL的95%( v / v )乙腈溶液再次洗涤凝胶片。干燥凝胶片。
    4. 用消化缓冲液的25μL(50mM的NH 4 HCO 3,5mM的CaCl 2的,和6纳克/μL的胰蛋白酶)中嵌入凝胶块完全,并保持在冰上45分钟,以让胰蛋白酶渗透到凝胶。将凝胶片在37℃孵育过夜,酵母消化。
  2. 肽纯化
    1. 向消化缓冲液中的凝胶片中加入80μL的50mM NH 4 HCO 3 ,并反复涡旋以提取胰蛋白酶肽。收集提取物。用80μL50%( v / v )CH 3 CN和5%( v / v )甲酸(FA)重复该提取步骤两次。
      注意:总的最终提取物应该是大约240μL。
    2. 通过真空浓缩或冷冻干燥将提取物浓缩至约10μL,并加入25μL0.1%( v / v )三氟乙酸水溶液(TFA)溶液。按照制造商的协议,用μ-C18色谱柱除去样品。
    3. 用4-10μL60%( w / v )CH 3 CN和0.1%( v / v )FA洗脱肽。将肽冻干(冷冻干燥)并将其储存在-20°C直到分析。
标题“> 10。纳米LC-MS

  1. 纳米反相液相色谱
    注意:使用与液相色谱仪在线耦合的质谱仪进行LC-MS分析。该仪器应配备C18柱(2μm颗粒,孔径,孔径为50 x x 15 cm)。
    1. 将冻干肽重悬于16μL溶液(2%( v / v )CH 3 CN和0.1%( v / v )FA)中。在C18预柱(3μm粒径,100埃孔径,纳米尺寸和75μm×2cm尺寸)上以5μL/ min的流速注入和加载5μL肽溶液。
    2. 10.1.2。使用流速为300nL / min的95分钟梯度分离肽。在此分离梯度期间,分别在5分钟,50分钟和18分钟内将流动相B从4%提高到10%,10%至25%,25%至45%。最后,1分钟内急剧增加流动相B至95%。后每个95分钟的分离梯度,在5分钟内施加含有10%梯度从4%至95%的固有漂洗步骤。
      注意:流动相A为99.9%H 2 O和0.1%( v / v )FA,流动相B为19.92%H 2 O,80%( w / v )CH 3 CN和0.08%( v / v) )FA。
  2. 质谱测定
    1. 以数据相关模式操作质谱仪,质量范围为400至1,600 m / z。
    2. 在MS1中选择最多十个最强离子以产生碎裂光谱。将分辨率设置为MS1的70,000全宽(FWHM)和MS2的17,000,对于MS1,自动增益控制(AGC)目标为3,000,000和1,000,000个离子,最大离子注入时间(IT)为256和64 ms和MS2。
    3. 将动态排除设置为10秒以避免最丰富的离子反复破碎。
      注意:这里,具有一个或多于六个电荷的离子是e包括MS2。
  3. 定性蛋白质组学:肽和蛋白质鉴定
    1. 使用软件如峰工作室软件47,48,49分析碎片谱。
      注意:其他软件包也可用于肽鉴定,如NovoHMM 30和PepNovo 37,用于从头测序,SEQUEST 54和Mascot 55用于数据库检索。
    2. 结合质量相同(<2 ppm差异)和保留时间(<2分钟)的光谱,只保留质量阈值高于0.65的光谱,以搜索Swiss-Prot数据库(版本:2013年12月),将其设置为模型植物拟南芥 。使用以下搜索参数:通过使用mon的前体质量容差为10 ppm同位素质量片段质量容差为20 mmu;胰蛋白酶作为消化酶,最多2个错分裂;半胱氨酸氨基甲酰化作为固定修饰;甲硫氨酸氧化作为可变修饰;并且每个肽最多有3个可变的翻译后修饰。识别后,手动设置可靠的肽和蛋白质鉴定的分数阈值,以获得<5%的错误发现率(FDR)。
  4. 定量蛋白质组学:质谱数据的统计分析
    1. 使用LC-MS( Progenesis)进行蛋白质组学数据的无标记定量。
      注意:MS1肽峰面积(或强度)与工作室软件根据其质量鉴定的肽连接,容许误差最大为10 ppm。
      注意:该软件通过将所有电荷状态的峰面积进行积分来计算肽的丰度sup> +和8 + 。定量数据通过内部脚本(与最大10ppm的耐受误差的质量匹配)与PEAKS肽鉴定相关​​。
    2. 计算每个肽的平均log2倍变化(CL /非CL)。通过蛋白质分组独特肽的倍数变化。
      注意:在每组中,蛋白质的最终倍数变化等于其肽的平均倍数变化。
    3. 使用Student's t -test计算每个组的p值,以评估统计学显着性。应用R软件包(版本3.3.0),以使用Benjamini-Hochberg(BH)方法更正所有组的FDR的p值。
    4. 使用与R软件包(版本3.3.0)兼容的“校准”功能包(版本1.7.2)绘制火山图。
      注意:这里,-log10调整的p值(-log10(adj。p值))是所有识别的蛋白质的log2倍变化的函数。蛋白质是如果它们的log2倍变化大于2,则被视为mRNA结合蛋白质组的阳性命中,有或没有显着性。

鉴定的mRNA结合蛋白质组的目录

  1. 通过基因本体(GO)数据库和“家族与领域”通过InterPro数据库,将基于“分子功能和生物学过程”的项目从第10步分类为三类。
  2. 作为第I类或“核糖体蛋白”,含有所有检测到的核糖体蛋白,定义来自II类的蛋白质或“主要RBP”,其含有与RNA相互作用或与RNA生物学中已知或未知功能结合的RNA的注释蛋白结构域。
  3. 由于蛋白质具有已知或未知功能的RNA生物学,没有注释的RNA结合域被放入III类或“候选RBP”,根据I的注释定义了III类的酶ntEnz数据库。

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Representative Results

在洗涤步骤4.3中用洗涤缓冲液2( 图1B )观察到围绕CL样品中的珠粒的特征性晕圈。尽管尚未进行研究,但是这种现象可能通过在磁捕获过程中交联的mRNP复合物与珠聚集的干扰来解释,从而导致形成更扩散的聚集体。这表明oligo-d(T) 25珠捕获是有效的14

在非CL对照和CL样品中,显着高于18S rRNA的UBQ10参考mRNA水平显示在图1C中 。这表明由于通过寡聚d(T) 25珠捕获,洗脱液中的mRNA富集,其只能结合poly(A)尾缩的mRNA。 oligo-d(T) 25珠捕获的效率进一步说明通过SDS-PAGE和银染色(步骤8), 如图1D所示,在RNase处理和mRBP浓度之后(步骤7)。可以清楚地观察到非CL对照和CL样品通道之间的蛋白质带图案的差异,并且存在于非CL对照样品泳道中的蛋白质带可以通过RNase的存在来解释。这说明了CL样本中mRBPs的强烈浓缩。

可以通过改变UV照射的持续时间来控制交联效率。足够的交联但避免原生质体损伤和RNA降解是最佳的。在图1D中 ,当比较不同的UV照射时间(1,3和5分钟)时,获得了所有CL样品中的特异性蛋白质带图案。在相同的UV强度(0.00875W / cm 2 )下,由于不可区分,最佳条件为1或3分钟蛋白质带强度。观察到较弱的带强度,交联时间较长(5分钟)。我们认为1分钟是最佳条件,因为较短的交联持续时间具有更容易从培养皿转移和收集原生质体的优点。在紫外线照射期间,原生质体可以迅速沉淀到培养皿的底部,因为它们粘在盘底部。这使得在更长的UV照射时间后更难收集并将其转移到管中。

基于优化的条件,随后通过定性和定量的蛋白质组学实现了来自三个生物重复的蛋白质的鉴定,其在步骤9和10中描述。在通过定性蛋白质组学( 图1E ,右图)的分析中,总共341个蛋白质在CL样本中被鉴定,其中36个在非CL对照组中被发现d CL样品,在非CL对照样品中仅检测到8种蛋白质。两个样品之间鉴定的蛋白质数量的巨大差异与不同的蛋白质条带模式( 图1D )是一致的,支持SDS-PAGE和银染色测定法是验证寡聚体(T)的效率的好工具, 25珠捕获。在定量蛋白质组学分析( 图1E ,左图)中,总共325个蛋白质(蓝绿色)显示大于2的log2倍变化。在这些蛋白质中,100个蛋白质(蓝色)具有小的p价值高于显着性水平。因此,他们也被定义为积极的命中。值得注意的是,由于数据稀疏,另外225个蛋白质(绿色)的p值大于0.05,低于显着性水平。换句话说,对于每种蛋白质存在低丰度的肽,肽强度的变异性高ES。然而,由于所有这些仅在CL样本中才被定性检测,因此被认为是阳性的。

基于GO和InterPro数据库50 (步骤11),这些325个蛋白质进一步分类为I类(核糖体蛋白),II类(主要RBP)和III类(候选RBP)( 图1F )。在I类中有123种核糖体蛋白,而在第二类中,观察到70个注释的经典RBP。这两个类别 - 其中分别包含大多数注释分析的蛋白质与分子RNA结合和RNA生物学( 图1F ,右图),分别占整个mRNA结合蛋白质组的约38%和22% - 表明优化的mRNA相互作用的高效率捕获。由于缺乏常规RBD,最后40%(132个候选RBP)被归类于III类。此外,RNA结合和RNA生物过程中的eir作用尚未得到验证( 图1F ,左图)。我们认为这个类别的蛋白质可以揭示RNA规则中的新功能。

图1
图1:用于从拟南芥叶肉叶片原生质体发现mRNA结合的蛋白质组的优化方法的流程图和结果。A )整个方法的主要步骤从1到11列出。推定的细胞和分子过程由照片和漫画说明。 “议定书”已详细描述了每一步的细节。 ( B )在洗涤步骤4.3期间,在CL样品中围绕珠粒沉积而不是在非CL对照样品中观察到晕圈。 ( C )相对UBQ10 mRNA和18S rRNA水平的比较通过qRT-PCR(值为平均值±SD(n = 3)); *和**:p <0.05和<0.01的显着差异,非CL对照和CL样品中的ls。 ( D )非CL对照样品的浓缩蛋白质洗脱液与连续波紫外线照射1,3和5分钟的CL样品相比,UV强度为0.00875 W / cm 2 。 ( E )蛋白质组学鉴定mRNA结合蛋白质组。在Progenesis软件包执行的定量蛋白质组学(左图)中,火山图显示了平均log2倍变化(CL /非CL)和相关调整的p值(-log10(adj。p值))所有蛋白质。在由Peaks软件包(右)进行的定性蛋白质组学中,样本中的蛋白质在维恩图中进行了说明。蛋白质的数量列在数量中。肽和蛋白质水平的FDR低于5%。浅棕色框架内的蛋白质数量被认为是阳性命中。 ( 等人于2016年修改。 请点击此处查看此图的较大版本。

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Discussion

我们成功应用开发用于酵母和人类细胞的mRNA相互作用捕获,植物叶肉叶原生质体。叶肉叶细胞是植物叶片中主要类型的地面组织。该方法的主要优点是其使用体内交联从生理环境中发现蛋白质。

在这个协议中,我们主要存在许多的优化实验条件50( 例如,原生质体的数量以作为起始原料和UV辐射的持续时间使用)。当使用至少10 7个原生质体(中等规模)时,CL样品中捕获的蛋白质只能通过SDS-PAGE和银染色检测(步骤1.5.5)。较低的浓度在SDS-PAGE上不产生可观察的mRBP模式,应该不能用于蛋白质组学的进一步分析。实际上,使用超过10 7个细胞( 例如, 10 9个细胞)大规模实验)也可能20 。来自银染试验的结果表明,用连续波UV源产生的强度为0.00875W / cm 2的UV照射为1分钟( 图1D )。 RT-qPCR,银染色和MS测定的结果支持关键步骤( mRNP下拉和通过oligo-d(T) 25珠的纯化步骤4)的高效率( 图1C ; 1D ;和1E ,右)。定性和定量蛋白质组学的组合可以帮助确定非CL控制和CL样本之间的重叠区域中的阳性RBP( 图1E )。大多数确定的蛋白质是以前未在数据集中注释的RBP( 图1F )。我们将这些以前未知的RNA结合蛋白在第三类中提出为候选RBPsup class =“xref”> 50( 图1F )。探索这些候选RBP的结合特异性必须使用其他方法来完成,例如前面提到的CLIP方法23 。通过使用CLIP 51调查RBP调节其拟南芥靶mRNA转录物的结合特异性的一个实例可以在Zhang 等人 ,2015中找到。另外,PAR-CLIP的另一种修饰方法称为光活化 -核糖核苷增强交联(PAR-CL,365nm的UV-A)也已经先前建议用于从酵母和人细胞14,23的mRNA结合的蛋白质组的调查。 PAR-CL需要4Su,其由细胞摄取并且在RNA代谢期间并入新生RNA中并且可以是高度反应性的,在UV-A(365nm)照射下与氨基酸52形成共价键通货膨胀。目前,没有研究重点关注4sU对植物细胞的毒性和有效摄取外源4sU到叶肉原生质体53 。然而,我们认为可以在植物上使用传统的CL(254nm UV-C)和PAR-CL(365nm UV-A),这将有助于从生理学上发现和验证不同的RBP未来的环境。

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Disclosures

作者没有什么可以披露的。

Acknowledgements

我们承认Joris Winderickx教授的实验室,该实验室提供配有常规紫外灯的紫外线交联设备。 KG由KU Leuven研究基金支持,并承认FWO授予G065713N的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
0.8 M Mannitol Sigma M1902-500G Primary isotonic Enzyme solution &
MMg solution
2 M KCl MERCK Art. 4935 Primary isotonic Enzyme solution &
W5 buffer
0.2 M MES (pH 5.7)
(4-morpholineethanesulfonic acid)
Sigma-aldrich M2933 Primary isotonic Enzyme solution,
W5 buffer &
MMg solution,
Filtration sterilization
Cellulase R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. CELLULASE
“ONOZUKA”
R-10, 10 g
Final isotonic enzyme solution
Macerozyme R10 Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd. MACEROZYME R-10, 10g Final isotonic enzyme solution
10% (w/v) BSA
(Bovine Serum Albumin)
Sigma-aldrich A7906-100G Final isotonic enzyme solution &
Filtration sterilization
1 M CaCl2 Chem-Lab NV CL00.0317.1000 Final isotonic enzyme solution,
W5 buffer &
Digestion buffer
1 M NaCl Fisher Chemical S/3160/60 W5 buffer
2 M MgCl2 Sigma M8266-100G MMg solution
1 M LiCl
(Lithium Chloride)
Acros 199885000 Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2 &
Low salt buffer
5% (w/v) LiDS
(Lithium Dodecyl Sulphate)
Sigma-aldrich L4632-25G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1 &
Filtration sterilization
1 M DTT
(Dithiothreitol)
Thermo Fisher Scientific
Wash buffer 1 &
Wash buffer 2
307866 Lysis/binding buffer,
1 M Tris-HCl (pH 7.5) (Tris(hydroxymethyl)aminomethane, Hydrochloric acid S.G. (HCl)) Acros &
Fisher Chemical
167620010 &
H/1200/PB15
Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
0.5 M EDTA (pH 8.0) (Ethylenediaminetetraacetic acid) Sigma-aldrich ED-500G Lysis/binding buffer,
Wash buffer 1,
Wash buffer 2,
Low salt buffer &
Elution buffer
Tween 20 MERCK 8.22184.0500 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
0.1 M NaOH VWR PROLABO CHEMICALS 28244.295 Regeneration of oligo-d(T)25 beads
1x PBS (pH 7.4)
(Phosphate Buffered Saline)
containing
(NaCl; KCl; Na2HPO4; KH2PO4)
Fisher Chemical, MERCK,
Sigma-aldrich & SAFC
S/3160/60,
Art. 4935,
71640-250G &
60230
Regeneration of oligo-d(T)25 beads
Proteinase K solution (2 μg/μL) Thermo Fisher Scientific 11789020 Protein digestion
Loading dye Invitrogen LC5925 SDS-PAGE
qPCR master mix Promega A6001 qRT-PCR assay
RNase Cocktail Thermo Fisher Scientific AM2286 RNA digestion
Methanol Sigma-aldrich 322415 Gel fixation and gel destaining
Acetic acid Sigma-aldrich 537020 Gel fixation and gel destaining
Coomassie Brilliant Blue R-250 Thermo Fisher Scientific 20278 Gel staining
1 M NH4HCO3
(Ammonium bicarbonate)
 
Sigma-aldrich 09830-500G Gel hydration &
Digestion buffer
CH3CN
(Acetonitrile)
Sigma-aldrich 34851-100ML Gel dehydration &
Peptide dissolving solution
IAA
(Iodoacetic acid)
Sigma-aldrich I4386-10G Alkylating agent
TFA
(Trifluoroacetic acid)
Sigma-aldrich 302031-10X1ML Peptide dissolving solution
FA
(Formic acid)
Sigma-aldrich 06554-5G Peptide extraction
Trypsin solution (6 ng/μL) Promega V5280 Digestion buffer
Name Company Catalog Number Comments
EQUIPMENT
Soil Peltracom LP2D Plant growth
Vermiculite 3 Sibli AS 05VERMICULIET Plant growth
Petri dish (150 x 20 mm) Sarstedt 82.1184.500 Carrier for protoplast suspension
0.22 μm filter Millipore SE2M229104 Homogenization of final isotonic enzyme solution
Razorblade Agar Scientific T585 Rosette leaf strips
35-75 μm nylon mesh SEFAR NITEX 74010 Protoplast suspension filtration
50 mL round bottom tubes Sigma-aldrich T1918-10EA Carrier for protoplast suspension
Hemocytometer
(Bürker hemocytometer)
MARIENFELD 650030 Protoplast cell counting
UV crosslinking apparatus
(HL-2000 HybriLinker)
UVP, LLC UVP95003101 in vivo UV crosslinking
UV lamp
(Sankyo-Denki G8T5)
SANKYO
DENKI
SD G8T5 in vivo UV crosslinking
50 mL glass syringe FORTUNA Optima Z314560 Homogenization of protoplast lysate
Narrow needle (0.9 x 25 mm) Becton Dickinson microlance 3 2021-04 Homogenization of protoplast lysate
Rotator Model L26 Labinco BV 26110912 Sample incubation by rotating
Oligo-d(T)25 magnetic beads
(5 mg/mL)
New England BioLabs S1419S mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Magnetic rack Invitrogen CS15000 mRNPs and mRNAs binding and pull-down
Centrifugal filter units
(Amicon Ultra-4 centrifugal filter units)
EMD Millipore UFC800308 mRBP concentration
Pierce Silver Stain Kit Thermo Fisher Scientific 24612 Silver-staining assay
RNA purification kit
(InviTrap Spin Plant RNA Mini Kit)
STRATEC Molecular 1064100300 RNA purification
Spectrophotometer device (NanoDrop 1000 Spectrophotometer) Thermo Fisher Scientific ND-1000 RNA quality and quantity
Real-Time PCR cycler
(StepOne Real-Time PCR cycler)
Thermo Fisher Scientific 4376600 cDNA quantification
µ-C18 columns
(Millipore Zip Tip µ-C18 columns)
Sigma-aldrich 720046-960EA Peptide purification
Mass spectrometer
(Q Exactive Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer)
Thermo Fisher Scientific IQLAAEGAAPFALGMAZR Mass spectrometry-based proteomics
Liquid chromatography instrument (Ultimate 3000 ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) instrument) Thermo Fisher Scientific ULTIM3000RSLCNANO Mass spectrometry-based proteomics
C18 column
(Easy Spray Pepmap RSLC C18 column)
Thermo Fisher Scientific ES800 Mass spectrometry-based proteomics
C18 precolumn
(Acclaim Pepmap 100 C18 precolumn)
Thermo Fisher Scientific 160321 Mass spectrometry-based proteomics
Name Company Catalog Number Comments
Primers for qRT-PCR assay Sequences
UBQ10 mRNA
(Li et al., 2014)
Fw: AACTTTGGTGGTTTGTGTTTTGG
Rv: TCGACTTGTCATTAGAAAGAAAGAGATAA
18S rRNA
(Durut et al., 2014)
Fw: CGTAGTTGAACCTTGGGATG
Rv: CACGACCCGGCCAATTA

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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