Laser-Doppler: Ein Instrument zur Messung der Pankreas Islet mikrovaskuläre Vasomotion In Vivo

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Summary

Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion regelt Inselchen Blut Verteilung und behält die physiologische Funktion der Inselzellen β. Dieses Protokoll beschreibt die Nutzung eines Laser-Doppler-Monitors, funktionalen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo zu bestimmen und zu beurteilen, die Beiträge der pankreatischen Inselchen Mikrozirkulation, Bauchspeicheldrüsen-Erkrankungen.

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Liu, M., Zhang, X., Li, B., Wang, B., Wu, Q., Shang, F., Li, A., Li, H., Xiu, R. Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo. J. Vis. Exp. (133), e56028, doi:10.3791/56028 (2018).

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Abstract

Als funktionelle Status der Mikrozirkulation gilt mikrovaskuläre Vasomotion für die Lieferung von Sauerstoff und Nährstoffen und die Entfernung von Kohlendioxid und Abfallprodukte. Die Beeinträchtigung der mikrovaskuläre Vasomotion könnte ein entscheidender Schritt in der Entwicklung der Mikrozirkulation-Erkrankungen sein. Darüber hinaus eignet sich das stark vaskularisierte Pankreas Inselchen, endokrine Funktion zu unterstützen. In diesem Zusammenhang scheint es möglich zu folgern, dass der funktionelle Status pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion pancreatic Islet Funktion beeinträchtigen könnten. Analyse der pathologischen Veränderungen des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise eine praktikable Strategie Beiträge bestimmen das Pankreas Inselchen Mikrozirkulation macht verwandte Krankheiten wie Diabetes Mellitus, Pankreatitis, etc.. Daher beschreibt dieses Protokoll mit einer Laser-Doppler Blut-Strömungswächter zur Bestimmung des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion und Parameter (einschließlich durchschnittliche Blutperfusion, Amplitude, Frequenz und Verwandten herstellen Geschwindigkeit des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion) für die Bewertung des mikrozirkulatorischen funktionellen Status. In einem Streptozotocin-verursachten zuckerkranken Mausmodell beobachteten wir eine beeinträchtigt Funktionsstatus des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion. Zusammenfassend kann dieser Ansatz für die Beurteilung der Bauchspeicheldrüse Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo Mechanismen in Bezug auf Bauchspeicheldrüsenkrebs Inselchen Krankheiten aufdecken.

Introduction

Als Parameter des funktionellen Status der Mikrozirkulation mikrovaskuläre Vasomotion übernimmt die Verantwortung für die Lieferung und der Austausch von Sauerstoff, Nährstoffen und Hormonen und ist entscheidend für die Beseitigung der Stoffwechselprodukte, wie Kohlendioxid und Zelle Abfall 1. mikrovaskuläre Vasomotion regelt auch Blut Strömungsverteilung und Gewebedurchblutung und beeinträchtigt dadurch lokale mikrozirkulatorischen Blutdruck und Antworten auf eine Entzündung, die Ödeme bei vielen Krankheiten auslösen können. Mikrovaskuläre Vasomotion ist daher extrem wichtig, die physiologische Funktion der Organe2,3,4, Gewebe und Zellen Komponente beizubehalten. Die Beeinträchtigung der mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise einer der wichtigsten Schritte bei der Entwicklung der Mikrozirkulation-Erkrankungen5.

Laser-Doppler wurde ursprünglich für Beobachtung und Quantifizierung auf dem Gebiet der Mikrozirkulation Forschung6entwickelt. Diese Technik, zusammen mit anderen technischen Ansätze (z. B. Laser Speckle7, transkutane Sauerstoff, etc.), gilt als der Goldstandard für die Beurteilung der Durchblutung in der Mikrozirkulation. Die Begründung, dass die Durchblutung der lokalen Mikrozirkulation (d.h., Kapillaren, Arteriolen, Venolen, etc.) vom Gerät ausgestattet mit Laser Doppler, ermittelt werden kann basiert auf dem Prinzip der Doppler-Verschiebung. Die Wellenlänge und die Frequenz des Lichtes stimulierte Emission ändern, wenn Lichtteilchen bewegten Blutkörperchen im Mikrogefäßen begegnen oder sie unverändert bleiben. Daher in der Mikrozirkulation sind die Anzahl und die Geschwindigkeit der Blutzellen die Schlüsselfaktoren, die in Bezug auf das Ausmaß und die Verteilung des Lichtes Doppler-verschoben, während die Richtung des mikrovaskulären Blutflusses irrelevant ist. Mit verschiedenen Methoden, eine Vielzahl von Geweben für mikrozirkulatorischen Studien, einschließlich der Mesenterien verwendet wurden und dorsalen Hautfalte Kammern von Mäusen, Ratten, Hamster, und sogar Menschen8. Jedoch in das aktuelle Protokoll, wir konzentrieren uns auf den funktionalen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion, die ausgewertet wird mit laser-Doppler und einer hausgemachten Bewertungssystem Parameter.

Pancreatic Islet Mikrozirkulation besteht hauptsächlich aus Pankreas Inselchen Mikrogefäßen und Besonderheiten aufweist. Ein engmaschiges Netz von Pankreas Inselchen zeigt eine fünf Mal höhere Dichte als engmaschiges Netz von seinen exokrine Gegenstück-9. Bereitstellung einer Leitung für die Lieferung von Eingabe Glukose und Verbreitung von Insulin, liefern endotheliale Inselzellen Sauerstoff metabolisch aktiven Zellen in kleinen Insel β-Zellen. Darüber hinaus zeigt Anzeichen dafür auch, dass Inselchen Mikrogefäßen beteiligt sind, nicht nur bei der Regulierung von Insulin-gen-Expression und β-Zellen überleben, sondern auch in der β-Zelle Funktion beeinträchtigen; Förderung der β-Zell-Proliferation; und produziert eine Reihe von vasoaktive, angiogene Substanzen und Wachstumsfaktoren10. Deshalb schließen wir in diesem Zusammenhang, dass der funktionelle Status pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion kann Inselchen β-Zell-Funktion beeinflussen und engagieren sich in der Pathogenese von Krankheiten wie akute/chronische Pankreatitis, Diabetes und andere Pankreas-Erkrankungen.

Analyse der pathologischen Veränderungen des funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion möglicherweise eine praktikable Strategie um die Beiträge der pankreatischen Inselchen Mikrozirkulation zu den oben genannten Krankheiten zu bestimmen. Eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung beschreibt den Ansatz für die Bauchspeicheldrüse Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo zu bestimmen bieten hier. Typische Messungen werden dann in den Vertreter Ergebnisseangezeigt. Zu guter Letzt werden die vor- und Nachteile der Methode in der Diskussion, zusammen mit weiteren Anwendungen hervorgehoben.

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Protocol

Alle Tierversuche wurden hingerichtet, unter Beachtung aller relevanten Richtlinien, Verordnungen und Aufsichtsbehörden. Dieses Protokolls demonstriert wurde unter der Leitung und Genehmigung von dem Institut der Mikrozirkulation Tier Ethik Ausschuss (IMAEC) in Peking Union Medical College (PUMC) durchgeführt.

(1) Tiere

  1. Halten Sie vor dem Start des Experiments drei BALB/c Mäuse pro Käfig, mit kontrollierter Temperatur (24 ± 1 ° C) und Luftfeuchtigkeit (55 ± 5 %), unter einem 12-h-hell-dunkel-Zyklus. Lassen Sie die Mäuse freien Zugang zur regelmäßigen Nahrung und Wasser.
  2. Nach dem Zufallsprinzip unterteilen Sie die Mäuse in einer nicht-diabetischen Kontrollgruppe und einer diabetischen Gruppe. Genau wiegen Sie jeder einzelnen Maus und berechnen Sie das Injektionsvolumen die Körpermasse jede Maus verwenden.
  3. Schnell die Mäuse für 4 h vor Streptozocin (STZ) Injektion und bieten regelmäßiges Wasser wie gewohnt auf experimentelle Tag 1.
  4. Bereiten Sie 0,1 M Natrium-Citrat-Puffer bei pH 4,3. Genommen Sie 1 mL der Lösung in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch und wickeln Sie den Microcentrifuge Schlauch in Alufolie um Lichteinfall zu vermeiden.
  5. Auflösen der STZ in Natrium-Citrat-Puffer (pH 4,3), eine Endkonzentration von Arbeiten von 5 mg/mL vor dem Gebrauch.
  6. Geben Sie die Mäuse der Diabetiker Gruppe intraperitoneale Injektion der STZ bei einer Dosis von 40 mg/kg mit einer 1-mL-Spritze und ein 25-G-Nadel. Injizieren Sie die Mäuse von den nicht-Diabetikern Kontrolle mit dem gleichen Volumen der Natrium-Citrat-Puffer (pH 4,3).
  7. Setzen Sie die Mäuse wieder in die Käfige und versorgt sie mit regelmäßigen Nahrung und 10 % Saccharose Wasser.
  8. Wiederholen Sie die Schritte 1,3-1,7 auf experimentelle Tage 2 bis 5 (d. h., die nächsten 4 aufeinander folgenden Tagen).
  9. Ersetzen Sie das 10 % Saccharose-Wasser mit Wasser nach der letzten Injektion STZ.
  10. Schnell die Mäuse für 6 h, aber Ihnen freien Zugang zu Wasser, und neun Tage später (experimentelle 14.Tag) ihren Blutzuckerspiegel zu messen. Sammeln Sie eine Blutprobe aus der Rute Vene, Hyperglykämie mit einem Blut-Glukose-monitoring-System zu bestätigen.
    Hinweis: Mäuse mit Blut Glukose Niveau > 200 mg / dL gelten als Diabetiker.

2. Vorbereitung des Instruments

  1. Reinigen Sie die optischen Oberflächen der Sondenspitze und Sonde Stecker des Laser Doppler-Gerätes mit einem weichen, nicht scheuernden Tuch, Staub oder Partikel zu entfernen. Stecken Sie das Kabel an den Anschluss des Gerätes (Abb. 1A).
  2. Montieren Sie die Kalibrierung Stand dadurch, dass das Flussmittel standard im thermischen Gleichgewicht mit experimentellen Umgebung (Raumtemperatur, in der Regel für 30 min). Schütteln Sie das Flussmittel standard sanft für 10 s und lassen Sie es für 2 min ruhen.
  3. Positionieren Sie die Flux-standard-Container in der Mitte der Kalibrierung-Basis. Passen Sie die Klemme auf die maximale Höhe und fixieren Sie die Sonde in die Klemme, so dass es nach unten in den Behälter zeigt. Stellen Sie sicher, dass die Flux-Standard unter der Sonde richtig positioniert ist.
  4. Bewegen Sie langsam die Sonde nach unten, bis die Spitze in der Fluss-Norm richtig eingetaucht ist. Wählen Sie und drücken Sie "Kalibrierung" auf der Laser-Doppler-Gerät und den Arbeitskanal, dem mit die Sonde verbunden ist. Führen Sie die Kalibrierungsprogramm, bis ein "Kalibrierung erfolgreich" Hinweis auf dem Bildschirm der Laser-Doppler-Gerät angezeigt wird.
  5. Sichern Sie die Sonde mit Sonde Haltern. Manuell sichern Sie die Sonde um Bewegung zu vermeiden.
  6. Pflegen Sie Versuchsraum bei konstanter Temperatur (24 ± 1 ° C) und Luftfeuchtigkeit (ca. 50-60 %).
  7. Schalten Sie alle Fremdlicht (z. B. Leuchtstoffröhren und spot Lampen) vor der Durchführung des Experiments um externe Licht-induzierten Veränderung zu vermeiden.

3. Vorbereitung der Tiere

  1. Autoklaven der chirurgischen Instrumente und vor Gebrauch auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
  2. Geben Sie die Mäuse 10 min bis zu experimentellen Umgebung akklimatisieren vor Erkennung pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion von Laser Doppler.
  3. Füllen Sie eine 1-mL-Spritze mit 1 mL 3 % Pentobarbital-Natrium. Spritzen Sie die Pentobarbital-Natrium-Lösung (75 mg/kg i.p.), um die Mäuse zu betäuben.
  4. Decken Sie die Augen der Maus mit vorbefeuchteten medizinische Gaze um Trockenheit zu verhindern.
  5. Sicherstellen Sie, dass die Maus komplett verliert das Bewusstsein und reagiert nicht mehr auf Schweif oder Rückfuß mit der Pinzette drückt. Überwachen Sie die Narkose während der Narkose und intra-operative Veranstaltung alle 15 min. Aufrechterhaltung die Narkose durch die Ergänzung mit 10 % von der ursprünglichen Injektionsvolumen der Pentobarbital Lösung bei Bedarf.
  6. Legen Sie ein Heizkissen mit einer semi-Isolierschicht unter das Tier und legen Sie das Tier in Rückenlage auf der Arbeitsstation des Lasers Doppler Gerät übertragen. Befestigen Sie die Maus, um die Arbeitsbühne mit chirurgischen Klebeband.
  7. Tupfer die Bauchhaut der Maus mit Betadine, und dann 75 % Ethanol wird verwendet, um den Bauchbereich sauber wischen.
  8. 2 % lidocaine/0.5% Bupivacain (50/50) Mischung subkutan zu injizieren.  Schneiden Sie eine ca. 3 cm-Durchmesser-Loch in der Mitte von einem Gaze-Schwamm. Der Bauchregion mit dem Schwamm Gaze abdecken.
  9. Heben Sie die Bauchhaut mit Zange und machen Sie einen ersten vertikalen Schnitt entlang der Mittellinie des Bauches mit einer Schere Skalpell oder Haut.
  10. Fassen Sie die darunter liegenden Muskeln mit der Zange und einzuschneiden Sie, um die Bauchhöhle gelangen. Nicht verletzen Sie alle Organe. Falten Sie die Haut und die darunter liegenden Muskeln über der Brust, die Bauchhöhle zu offenbaren. Sanft aussetzen der Bauchspeicheldrüse Körper und die Milz mit einer stumpfen Nase Zange.

4. Datenerfassung für die Analyse

  1. Starten Sie die Software von der Laser-Doppler-Apparat durch Klicken auf "Datei" → "Neu", um eine neue Messungsdatei erstellen. Konfigurieren der angeschlossenen Monitore unter der Registerkarte "Allgemein", richten Sie die Überwachung Dauer "Frei laufen". Verwenden Sie die werkseitigen Standardeinstellungen für die Registerkarte "LDF-Monitor" und klicken Sie auf "Weiter".
  2. Richten Sie das Grafik-Display die "Anzeige im Dialogfeld einrichten." Wählen Sie die "Flux, Konz, Speed" Kanäle aus, indem Sie die entsprechenden Kontrollkästchen aktivieren. Wählen Sie die folgenden Parameter: "Datenquelle für den Kanal" und "Label, Einheiten und Farbe." Klicken Sie auf "Weiter".
  3. Geben Sie Benutzerinformationen über das Thema und Messung (d. h. Name und Thema Nummer, Operator, Überwachung von Zeit, Kommentare, etc.) in "Datei Informationen im Dialogfeld" und "Next" klicken Sie und die Messkonfiguration beenden.
    Hinweis: Ein Messfenster entsteht automatisch durch die Software (Abbildung 1 b).
  4. Manuell vorab die Elektrode an der Bauchspeicheldrüse. Stellen Sie sicher, dass der Abstand zwischen der Sonde und der Bauchspeicheldrüse Gewebe innerhalb 1 mm liegt. Eine unsachgemäße Entfernung gibt einen künstlich erhöhten oder verringerten Blut fließen Messwert.
  5. Klicken Sie auf das "Start"-Toolbar-Icon zum Starten der Aufnahme der mikrovaskuläre Blut Perfusion Einheiten (PU) Daten. Sammeln Sie die PU-Daten kontinuierlich für 1 min jeden Lauf. Klicken Sie auf "Stopp", um die Messung zu beenden. Wählen Sie "Datei" → "Speichern unter" auf Namen und speichern Sie die Messungsdatei fertig.
  6. Manuell neu positionieren die Sonde nach jedem Lauf, additive Effekte und die lokalisierten Erschöpfung der kontraktilen zu vermeiden und Entspannung. Wiederholen Sie Schritte 4.1-4.4 Mehrpunkt (d. h. drei zufällig ausgewählte Punkte von Bauchspeicheldrüsen-Gewebe) mikrovaskuläre PU-Daten für jede Maus zu ernten. Messen Sie die PU-Daten aus einer nicht-reflektierende Platte als Grundlinie Kontrolle.
  7. Schließen Sie das Bauchmuskel-Schicht und die Hautschicht mit einer Naht. Legen Sie die Tiere in saubere Käfige nach den Experimenten.
  8. Halten Sie dem Tieren Warm, indem die Wiederherstellung Käfig halb-auf das Heizkissen.
    Hinweis: Achten Sie auf Wärme, Hygiene, Flüssigkeit und Nahrung und Infektion. Verwalten Sie Mäuse mit 2 mg/kg Carprofen für 48 h als postoperative Schmerztherapie.  Führen Sie Euthanasie durch die Injektion von 150 mg/kg Natrium Pentobarbital i.p. bei Mäusen beobachtet werden, werden in einem Zustand der Schmerzen oder Ängste, die gelindert werden kann nicht.

5. Berechnung der Parameter des mikrovaskulären Vasomotion

  1. Verwenden Sie den Befehl "Export" der Laser-Doppler-Software Zeit und PU-raw-Daten als eine XLSX-Datei exportieren und öffnen Sie die Datei in einer Tabelle.
  2. Berechnen Sie die durchschnittliche Baseline Perfusion Einheit (PUb) (siehe Punkt 4.6).
  3. Berechnen Sie die durchschnittliche Durchblutung (PUein) für 1 min einer Messung wie folgt: durchschnittliche Durchblutung (PUein) = PU - PUb (Gleichung 1).
  4. Berechnen Sie die Frequenz (Takte/min.) für jeweils 1 min der Messung.
    Hinweis: Die Häufigkeit der mikrovaskuläre Vasomotion ist definiert als die Anzahl der Spitzen, die in einer mikrovaskulären Vasomotion Welle pro Minute aufgetreten sind.
  5. Berechnen Sie die Amplitude (ΔPU) für jeweils 1 min der Messung.
    1. Berechnen Sie die Amplitude der mikrovaskuläre Vasomotion als Differenz zwischen der maximalen (PUmax) und minimalen (PUmin): Amplitude (ΔPU) = PUmax - PUmin (Gleichung 2).
  6. Berechnen Sie die relative Geschwindigkeit (PU) für jeweils 1 min der Messung.

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Representative Results

Abbildung 1Azeigt ein Foto von der mikrovaskuläre Vasomotion Messung Laser Doppler Apparat mit einem Halbleiter Laserdiode ausgestattet. User-Interface Software ist in Abbildung 1 bdargestellt. Mit der oben genannten Methode wurden die hämodynamischen Parameter des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion für nicht-diabetischen Kontrolle und diabetischen Mäusen nachgewiesen. Eine Vielzahl von Techniken, einschließlich Laser Doppler Flowmetry, reflektiert und verteilt Licht, Infrarot-Spektroskopie und bildgebende Verfahren, wurden verwendet, um mikrovaskuläre Vasomotion zu studieren, da es erstmals definiert wurde. Tabelle 1 fasst Forschungsgruppen und veröffentlichte Artikel, die Laser-Doppler-Technologie verwenden, um die Rolle der Mikrozirkulation bei Diabetes und damit verbundenen Krankheiten zu bestimmen.

Im Allgemeinen sind die mikrozirkulatorischen Bedingungen der pankreatischen Insel durch den funktionalen Status der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion mit mikrovaskulären Parameter, einschließlich durchschnittliche Blutperfusion, Amplitude, Frequenz, Relative vertreten. Geschwindigkeit (Abbildung 2). Das repräsentative mikrovaskuläre Vasomotion Schaltbild besteht hauptsächlich aus regelmäßigen Kontraktion und Entspannung Phasen (Abbildung 2A). Die hämodynamischen Phänomene präsentieren eine Muster der Fluss Blutperfusion mikrovaskuläre Netzwerke. PU-Daten mittels Laser Doppler Apparat beschäftigte Diagramm Scatter Diagramme und das Verteilungsmuster der mikrovaskuläre Blutperfusion zeigen. In dem aktuellen Protokoll wurden die Verteilungsmuster der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Durchblutung bei nicht-Diabetikern und diabetischen Mäusen ganz anders (Abb. 2 b). Eine niedrigerere Skala von Durchblutung des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion verzeichneten diabetischen Mäusen im Vergleich zu nicht-Diabetikern Kontrolle. Der Rhythmus der Kontraktionen und Lockerungen des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion war chaotisch und unregelmäßig im STZ-induzierte diabetischen Mäusen, während nicht-diabetischen Steuerelemente rhythmische Schwingungen hatte (Abbildung 2 und Abb. 2D). Wir die 5-s-Daten des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Durchblutung innerhalb der gestrichelten Linien in Abbildung 2 und Abbildung 2D extrahiert und gezeigt, dass die chaotischen Schwankungen der pankreatischen Inselchen mikrovaskulären Perfusion bei diabetischen Mäusen Blut die Fähigkeit verloren, die funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion, zu Regeln, die als Reaktion auf Blut-Glukose Fluktuation (Abb. 2E) erfolgen sollte.

Außerdem benötigen zur Bewältigung der Hyperglykämie pankreatische kleinen Inseln ausreichend und biorhythmic Fluss Blutperfusion, Insulin zu transportieren. Die Bauchspeicheldrüse Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion Parameter (einschließlich durchschnittliche Blutperfusion, Amplitude, Frequenz und Relativgeschwindigkeit) wurden dann berechnet und quantitativ analysiert Basis auf der PU Profile. Wie in Abbildung 3, im Vergleich zu nicht-diabetischen Kontrollen wurde die durchschnittliche Durchblutung der Bauchspeicheldrüse Inselchen Mikrozirkulation im STZ-induzierte diabetischen Mäusen (Abbildung 3A) verringert. Unterdessen gab es deutlichen Rückgänge in der Amplitude (Abb. 3 b) und Frequenz (Abbildung 3) des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion im STZ-induzierte diabetischen Mäusen festgestellt. Die relative Geschwindigkeit der pankreatischen Inselchen Blutperfusion verringerte sich deutlich in der STZ-induzierte Diabetes-Gruppe im Vergleich zu nicht-Diabetikern Kontrolle (Abbildung 3D). Wie bereits erwähnt, wurde die funktionelle Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion bei diabetischen Mäusen beeinträchtigt. Wir spekulieren, dass Rhythmus Anomalien, zusammen mit einer verringerten Frequenz, Amplitude und Relativgeschwindigkeit des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion, ein Eisenmangel mikrovaskuläre Durchblutung führen könnte die Insel β-Zellen schädigen und reduzieren können Insulin-Sekretion.

Figure 1
Abbildung 1. Apparat zur Bestimmung der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Vivo. A. Foto von der Messung Apparat zur Bestimmung der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion von Mäusen. Die Sonde Steckdosen und Schalter Knopf "Laser" sind in der linken Leiste. Das Liquid Crystal Display ist in der mittleren Spalte. Menü-Buttons (z. B. auf "," nach unten, und geben Sie Tasten) und die Power - Leuchtdiode werden im rechten Fensterbereich. Die Peripheriegeräte (z. B. Computer und Kabel) werden nicht angezeigt. B. Screenshot illustriert die typischen Elemente und Graph Kanäle des Lasers Doppler Geräte-Software. "Flux", "Konz,", "DC" und "Speed" Messwerte werden in die Grafik-Kanäle angezeigt. "Flux" steht für mikrovaskuläre Blut Gewebedurchblutung, "Konz" stellt die Gewebe mikrovaskuläre Blut Zellkonzentration "DC" steht für die mittlere Intensität der reflektierendes Licht und "Speed" ist die relative Geschwindigkeit der mikrovaskuläre Blutfluss. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion bei Mäusen. Die Durchblutung des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion wurde durch einen Laser Doppler Apparat beurteilt, und der funktionalen Status wurde analysiert. A. Schaltplan der Parameter in Bezug auf mikrovaskuläre Vasomotion. AC steht für die Amplitude einer mikrovaskulären Vasomotion Kontraktion, Ar stellt die Amplitude einer mikrovaskulären Vasomotion Entspannung Tc steht für die Länge der Zeit einer mikrovaskulären Vasomotion Kontraktion und Tr steht für die Länge der Zeit der eine mikrovaskuläre Vasomotion Entspannung. B. Verteilungsmuster der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Durchblutung bei nicht-Diabetikern und diabetischen Mäusen. Rote Punkte: nicht-diabetischen Mäusen. Blaue Punkte: diabetischen Mäusen. Die gestrichelte grüne Linie zeigt die Abgrenzung zwischen dem nicht-diabetische und diabetische mikrovaskuläre Blut Perfusion Muster. C. Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion in der Kontrollgruppe wurde auf der Grundlage der dynamischen mikrovaskulären Perfusion der Blut-Fluss bewertet. D. Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion in der diabetischen Mäusen war die dynamische mikrovaskulären Perfusion der Blut-Fluss beurteilt. E. Darstellung der Vertreter (5-s-Bereich) pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion zwischen nicht-diabetischen Steuerung und diabetischen Mäusen. Rote Linie: nicht-diabetischen Kontrolle. Blaue Linie: diabetischen Mäusen. PU: Perfusion Einheiten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Quantification der Parameter des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion. Pancreatic Islet mikrovaskuläre Vasomotion Parameter, einschließlich durchschnittliche Blutperfusion, Amplitude, Frequenz und Relativgeschwindigkeit wurden analysiert und im Vergleich zwischen nicht-diabetischen Kontrolle und diabetischen Mäusen. A. Quantification der durchschnittliche Durchblutung (PU/min) des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion bei nicht-Diabetikern und diabetischen Mäusen. Die B. Amplitude (ΔPU), C. Frequenz (Takte/min.) und D. Relativgeschwindigkeit (PU) des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion lagen bei diabetischen Mäusen als in nicht-diabetischen Kontroll-Mäusen. Die Amplitude der mikrovaskuläre Vasomotion wurde als Differenz zwischen der maximalen (PUmax) und minimalen (PUmin) berechnet. Die Häufigkeit der mikrovaskuläre Vasomotion wurde definiert als die Anzahl der Spitzen oder Täler, die in einer mikrovaskulären Vasomotion Welle pro Minute aufgetreten sind. Die Daten wurden als Mittelwert ± SD vorgestellt (n = 6 in jeder Gruppe). P < 0,05, **P < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Krankheiten Objekt Apparat Refs Nr.
Endotheliale Funktion H LDF, LSCI 11, 12, usw.
DN H, R LDF 13, 14, 15, etc.
DR H LDF 16, 17, 18, etc.
Haut/kutane Mikrozirkulation H LDF 11, 19, 20, etc.
Kardiale Mikrozirkulation R LDF 21
Hörbehinderung M LDF 22
DN, diabetischer Neuropathie. DR, diabetische Retinopathie. LDF, Laser Doppler Flowmetry.
LSCI, Laser speckle Kontrast Bildgebung. R, Ratte. H, Mensch, M, Maus.

Tabelle 1. Die Rolle der Mikrozirkulation bei Diabetes und seiner Komplikationen. Forschungsgruppen haben Laser Doppler verwendet, um die Rolle der Mikrozirkulation bei Diabetes und seiner Komplikationen seit Jahrzehnten bestimmen. Verwandte Artikel in den letzten Jahren sind hier aufgelistet. Diese veröffentlichten Artikel konzentrieren sich hauptsächlich auf endothelialen Dysfunktion diabetische Neuropathie (DN), diabetische Retinopathie (DR), Haut und kutanen mikrovaskuläre Beeinträchtigung und relativ selten Komplikationen wie Mikrozirkulation kardiale Dysfunktion und Anhörung Wertminderung. DN: diabetische Neuropathie. DR: diabetische Retinopathie. LDF: Laser Doppler Flowmetry. LSCI: Laser-Speckle-Kontrast-Bildgebung. R: Ratte. H: menschliche. M: Maus.

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Discussion

In den Fällen, bei denen mikrovaskulären Dysfunktion (z. B. Diabetes, akute Pankreatitis, periphere mikrovaskuläre Erkrankungen, etc.), führen einige Krankheiten zu verminderter Blutfluss. Als Veränderungen des Blutflusses sind wichtige Indikatoren, z. B. mikrovaskuläre Vasomotion, die den funktionalen Status der Mikrozirkulation zu spiegeln. Indikators, mikrovaskuläre Vasomotion bezeichnet im Allgemeinen die Schwingung des mikrovaskulären Tones in mikrovaskuläre Betten. In das aktuelle Protokoll ermöglicht eine mikrovaskuläre Blutperfusion monitoring-System für die direkte Visualisierung und Quantitative Analyse des funktionellen Status von mikrovaskulären Vasomotion. Unsere mikrozirkulatorischen Bewertungsansatz kann selektiv auf gezielte Geweben und Organen angewendet werden, durch die Identifizierung dynamischer Veränderungen der Durchblutung. Berichten von anderen Gruppen über die Verwendung von Laser Doppler um zu bestimmen, die Rolle der mikrovaskuläre Durchblutung bei Diabetes und seiner Komplikationen wurden in Tabelle 1zusammengefasst. In der aktuellen Studie wurde um unseren Ansatz zu demonstrieren die funktionelle Status der pankreatischen Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion von diabetischen Mäusen bewertet.

Mikrovaskuläre Vasomotion gilt als Parameter des funktionellen Status der Mikrozirkulation und vermag Blutperfusion fließen durch die Anpassung der Distribution in lokalen Gewebe23zu regulieren. Die Microvasculature der Bauchspeicheldrüse, die in Inseln, Azini und Kanäle unterteilt werden kann, ist seit Jahrzehnten untersucht worden. Grundsätzlich ist diese Trennung der Bauchspeicheldrüse in verschiedene Teile für Bequemlichkeit, nur, weil die Microvasculature tatsächlich miteinander verbunden und als eine organische Einheit24homogen ist. Dieses Microvasculature Netzwerk unterstützt die Regulierung der Durchblutung pancreatic Islet. Daher verwendet wir Parameter des funktionellen Status, durch Laser Doppler, bestimmt zur Bauchspeicheldrüse Inselchen Microvasculature Vasomotion Darstellung. Wir scheiterte jedoch aufgrund der Eigenschaften des Pankreas Architektur, noch um ein Urteil nach Anwendung der aktuellen Methode um festzustellen, ob die Durchblutung von der endokrine Teil oder aus dem exokrinen Teil der Bauchspeicheldrüse abgeleitet ist. Mit Insel-spezifische werden Kennzeichnung Farbstoffe, wie z. B. Dithizone und neutral rot, einer der möglichen Wege, dieses Problem zumindest zu einem gewissen Grad verstehen.

Ein wichtiger Aspekt der Messschritt ist der Abstand zwischen der Sonde und dem Pankreas-Gewebe. Eine unsachgemäße Entfernung gibt einen künstlich erhöhten Blutfluss zu lesen. Die physikalische Krafteinwirkung auf das Gewebe und Organ durch eine Sonde wird mikrovaskuläre Blutfluss reduzieren. Daher sollten minimale Druck ausgeübt werden, wenn Messungen. Ein weiterer Punkt ist die Macht der Laser. Hochleistungslasern verletzen in der Regel leicht Mikrogefäßen im Pankreas Inselchen, so dass die Frequenz des Laserstrahls werden, innerhalb von Grenzen kontrolliert muss. Für allgemeine und zeitlichen Messungen wird eine Frequenz von 1 Hz oder weniger empfohlen. Um die lokalisierten Erschöpfung der mikrovaskuläre Vasomotion Kapazität (einschließlich kontraktile und Entspannung) und die additive Wirkung zu vermeiden, sind multipoint Entschlossenheit und Neupositionierung Seite nach jeder Messung keine Experimente vorgeschlagen.

In der aktuellen Methode dienen die PU-Daten den Blut-Fluss der mikrovaskuläre Blutfluss dar. Wegen der Eigenschaften des mikrovaskulären Blutflusses in Mikrozirkulation ist es nicht möglich, die absolute Flow-Einheiten (z. B. mL/min/100 g von bestimmten Organen oder Geweben) bestimmen. Daher basiert das Bewertungssystem Parameter verwendet, hier auf die relative Blut fließen Perfusion Einheiten. Wavelet-Analyse, schnelle Fourier-Transformation und andere spektrale Analyse-Algorithmen sind gängige Methoden, die Laser-Doppler-Signale führen. In diesem Protokoll haben wir einen Ansatz, der hämodynamischen Parameter (z.B. Blutperfusion, Amplitude, Frequenz und Relativgeschwindigkeit) zeigen den funktionalen Status der mikrovaskuläre Vasomotion verwendet. Darüber hinaus die Genauigkeit der Messung bezieht sich auf die Tiefe des Ziels und die Sonde Design, welches in der Regel etwa 1 mm. So dicker oder kompakte Organe und Gewebe möglicherweise nicht geeignet für die Anwendung der Laser-Doppler und für die aktuelle Methode. Zusätzlich, weil die Daten aus Fluss Durchblutung könnten, durch andere Bedingungen, die bewirkt, dass spürbare Veränderungen betroffen sein, einschließlich Temperatur, Feuchtigkeit, Außenlicht und Veränderungen in der Position der Mäuse, sollten einige Regeln eingehalten werden während der experimentellen Verfahren. Labor muss weiterhin eine konstante Temperatur und Luftfeuchtigkeit, und externer Beleuchtung muss abgeschirmt werden. Es wird empfohlen, die Mäuse zur Vermeidung von Änderungen in Position zu fixieren. Es wird vermutet, dass diese Strategien die oben genannten Einschränkungen überwunden und erhöht die Genauigkeit der Bewegungsdaten Perfusion Blut können.

Der Vorteil dieses Protokolls mit anderen in der Literatur berichtet zu vergleichen ist, dass es empfindlich und reagiert auf die lokalen mikrovaskuläre Vasomotion von Geweben und Organen. Dies erleichtert die breitere Anwendung der Methode für die Bewertung oder Untersuchung der Mikrozirkulation, vor allem die funktionellen Status von mikrovaskulären Vasomotion, in klinischen und laboratorial Forschung. Die Anwendungen umfassen sind aber nicht beschränkt auf: Ischämie Visualisierung, Blut Perfusion Bewertung und Beurteilung des funktionellen Status von mikrovaskulären Vasomotion. Zusammenfassend unsere Methode kann verwendet werden, zu untersuchen und bewerten die funktionellen Status des Pankreas Inselchen mikrovaskuläre Vasomotion in Mäusen in Vivo und möglicherweise in der Lage, die klinische Notwendigkeit einzuschätzen Mikrozirkulation Funktion erfüllen.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus Peking Union Medical College Youth Fund und die grundlegenden Forschungsmittel für die zentralen Universitäten (Grant Nr. 3332015200) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoorVMS-LDF2 Moor Instruments GI80 PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software Moor Instruments GI80-1 Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration base Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration flux standard Moor Instruments GI-cal Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer Johnson and Johnson #1955685 Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips Johnson and Johnson #1297006 Confirm hyperglycemia
Streptozotocin Sigma-Aldrich S0130 Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P3761 Working concentration 3 %
Ethanol Sinopharm Inc. 200121 Working concentration 75 %
Sucrose Amresco 335 Working concentration 10 %
Medical gauze China Health Materials Co. S-7112 Surgical
Blunt-nose forceps Shang Hai Surgical Instruments Inc. N-551 Surgical
Surgical tapes 3M Company 3664CU Surgical
Gauze sponge Fu Kang Sen Medical Device CO. BB5447 Surgical
Scalpel Yu Lin Surgical Instruments Inc. 175C Surgical
Skin scissor Carent 255-17 Surgical
Suture Ning Bo Surgical Instruments Inc. 3325-77 Surgical
Syringe and 25-G needle MISAWA Inc. 3731-2011 Scale: 1 ml

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