Laser Doppler: Uma ferramenta para medir ilhota Pancreatic Microvascular Vasomotion In Vivo

Medicine

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Summary

Ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion regula distribuição de sangue ilhéu e mantém a função fisiológica das células β de ilhéu. Este protocolo descreve usando um monitor de laser Doppler para determinar o estado funcional das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular na vivo e avaliar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para doenças relacionadas com o pâncreas.

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Liu, M., Zhang, X., Li, B., Wang, B., Wu, Q., Shang, F., Li, A., Li, H., Xiu, R. Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo. J. Vis. Exp. (133), e56028, doi:10.3791/56028 (2018).

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Abstract

Como um estado funcional da microcirculação, vasomotion microvascular é importante para a entrega de oxigênio e nutrientes e a remoção de dióxido de carbono e resíduos de produtos. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser um passo crucial no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação. Além disso, a ilhota pancreatic altamente vascularizada é adaptada para suportar a função endócrina. A este respeito, parece-me possível inferir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função da ilhota pancreática. Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições que microcirculação ilhota pancreatic faz a doenças relacionadas, tais como diabetes mellitus, pancreatite, etc. Portanto, este protocolo descreve como usar um monitor de fluxo do laser Doppler sangue para determinar o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion e para estabelecer parâmetros (incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência e parente velocidade de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion) para avaliação do status funcional microcirculatory. Em um modelo do rato de diabéticos induzido por estreptozotocina, observamos um estado funcional prejudicado de ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular. Em conclusão, esta abordagem para avaliar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo pode revelar os mecanismos relacionados com doenças de ilhotas pancreáticas.

Introduction

Como um parâmetro da situação funcional da microcirculação, microvascular vasomotion assume a responsabilidade para a entrega e a troca de oxigênio, nutrientes e hormônios e é fundamental para a remoção de produtos metabólicos, tais como o dióxido de carbono e resíduos de célula 1. vasomotion microvascular também regula a distribuição do fluxo de sangue e perfusão do tecido, afectando assim a pressão de sangue microcirculatory local e respostas à inflamação, que pode induzir a edema em muitas doenças. Portanto, vasomotion microvascular é extremamente importante para manter a função fisiológica do componente de células, tecidos e órgãos,2,3,4. A deficiência de vasomotion microvascular pode ser uma das principais etapas no desenvolvimento de doenças relacionadas com a microcirculação5.

Laser Doppler foi desenvolvido inicialmente para observação e quantificação no campo da microcirculação investigação6. Esta técnica, juntamente com outras abordagens técnicas (por exemplo, laser speckle7, oxigênio transcutâneo, etc.), tem sido considerada como o padrão ouro para avaliar o fluxo sanguíneo na microcirculação. A lógica que a perfusão sanguínea de microcirculação local (i.e., capilares, arteríolas, vênulas, etc) pode ser determinado pelos aparelhos equipados com laser Doppler, baseia-se o princípio de efeito Doppler. O comprimento de onda e a frequência da emissão estimulada de luz mudam quando partículas de luz encontram células do sangue em movimento em microvessels, ou permanecem inalterados. Portanto, na microcirculação, o número e a velocidade das células do sangue são os fatores-chave relacionados com a magnitude e a distribuição de frequência da luz Doppler-deslocados, enquanto a direção do fluxo sanguíneo microvascular é irrelevante. Usando métodos diferentes, uma variedade de tecidos têm sido utilizados para estudos microcirculatory, incluindo os mesenteries e dorsal câmaras dobras cutâneas de camundongos, ratos, hamsters e até mesmo os humanos8. No entanto, no actual protocolo, focalizamos o funcional status de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion, que é avaliada usando laser Doppler e um sistema de parâmetro de avaliação caseiro.

Microcirculação do pâncreas ilhéu é composta principalmente por microvessels de ilhotas pancreáticas e apresenta características distintivas. Uma rede capilar de ilhotas pancreáticas mostra uma densidade cinco vezes maior do que a rede capilar de sua contraparte exócrino9. Fornecendo um conduíte para a entrega da entrada de glicose e insulina divulgação, células endoteliais ilhéu entregam oxigênio às células metabolicamente ativas no Ilhéu células β. Além disso, também emergentes evidências demonstra que o ilhéu microvessels estão envolvidos não só na regulação da expressão do gene de insulina e células β-sobrevivência, mas também em afetar a função da célula β; promover a proliferação de células β; e produzir um número de angiogênico vasoativas, substâncias e fatores de crescimento10. Portanto, a este respeito, podemos concluir que o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion pode afetar a função de células β ilhéu e envolver-se na patogênese de doenças como a pancreatite aguda/crónica, diabetes e outros doenças relacionadas com o pâncreas.

Analisar as alterações patológicas do estado funcional das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion pode ser uma estratégia viável para determinar as contribuições da microcirculação de ilhotas pancreáticas para as doenças mencionadas acima. Um procedimento passo a passo detalhado descrevendo a abordagem para determinar ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo fornecer aqui. Medições típicas então são mostradas nos Resultados de representante. Finalmente, os benefícios e limitações do método são destacadas na discussão, juntamente com outras aplicações.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram executados em conformidade com todas as orientações pertinentes, regulamentos e órgãos reguladores. O presente protocolo sendo demonstrado foi realizado sob a orientação e aprovação do Instituto da microcirculação Animal ética Comissão (IMAEC) na faculdade médica da União (PUMC) a Pequim.

1. os animais

  1. Antes do início do experimento, manter três camundongos BALB/c por gaiola, com temperatura controlada (24 ± 1 ° C) e umidade (55 ± 5%), sob um ciclo claro-escuro de 12-h. Permitir que os ratos livre acesso à água e comida normal.
  2. Aleatoriamente, divida os ratos em um grupo controle de não-diabéticos e um grupo de diabético. Com precisão pesar cada rato individual e calcular o volume de injeção usando a massa corporal de cada rato.
  3. Depressa os ratos por 4h antes da injeção de estreptozotocina (STZ) e fornecer água regular como normal no dia experimental 1.
  4. Prepare o tampão de citrato de sódio 0,1 M em pH 4.3. Colocar 1 mL da solução num tubo de 1,5 mL microcentrifuga e enrolar o tubo microcentrifuga em papel de alumínio para evitar a exposição à luz.
  5. Dissolva o STZ em tampão de citrato de sódio (pH 4,3) a uma concentração final de trabalho de 5 mg/mL antes da utilização.
  6. Dê os ratos das injeções intraperitoneal grupo diabético de STZ na dose de 40 mg/kg, usando uma seringa de 1 mL e uma agulha 25-G. Injete os ratos do controle não-diabéticos com o mesmo volume de tampão citrato de sódio (pH 4,3).
  7. Repor os ratos em jaulas e fornecê-los com 10% de sacarose água e comida normal.
  8. Repita as etapas de 1,3-1,7 na experimentais dias 2 a 5 (ou seja, os próximos 4 dias consecutivos).
  9. Substitua a água de 10% de sacarose com água normal após a última injecção de STZ.
  10. Rápido, os ratos para 6 h, mas dar-lhes livre acesso à água e medir seus níveis de glicose do sangue, nove dias depois (experimental dia 14). Recolha uma amostra de sangue da veia cauda para confirmar a hiperglicemia usando um sistema de monitoramento de glicose de sangue.
    Nota: Os ratos com sangue os níveis de glicose > 200 mg / dL são considerados diabéticos.

2. preparação do instrumento

  1. Limpe as superfícies ópticas da ponta da sonda e o conector da sonda do aparelho Doppler laser com um pano não abrasivo para remover qualquer poeira ou partículas. Conecte o cabo na porta do instrumento (figura 1A).
  2. Monte o suporte de calibração, permitindo o fluxo padrão para estar em equilíbrio térmico com o ambiente experimental (temperatura ambiente, geralmente por 30 min). Agitar o fluxo padrão suavemente durante 10 s e deixá-lo descansar por 2 min.
  3. Posicione o contêiner padrão de fluxo no meio da base de calibração. Ajustar a braçadeira para a altura máxima e fixar a sonda na mordaça tal que aponta para baixo para o recipiente. Certifique-se que o padrão de fluxo está corretamente posicionado debaixo da sonda.
  4. Mova lentamente a sonda para baixo até que a ponta está submersa corretamente na norma de fluxo. Selecione e pressione "calibragem" do laser Doppler aparelhos e escolher o canal de trabalho que a sonda é conectada. Execute o programa de calibração até um aviso de "Calibração bem sucedida" é exibido na tela do laser Doppler aparelho.
  5. Fixe a sonda utilizando suportes de sonda. Manualmente, fixe a sonda para evitar o movimento.
  6. Manter a sala experimental, a temperatura constante (24 ± 1 ° C) e umidade (~ 50-60%).
  7. Desligue qualquer luz externa (tais como lâmpadas fluorescentes e local) antes de realizar o experimento para evitar mudança induzida por luz externa.

3. preparação dos animais

  1. Autoclave a cirúrgica instrumentos e deixe-as arrefecer à temperatura ambiente antes do uso.
  2. Dê os ratos 10 min para aclimatar o ambiente experimental antes detectando ilhota pancreatic microvascular vasomotion pelo laser Doppler.
  3. Encha uma seringa de 1 mL com 1 mL de 3% de pentobarbital de sódio. Injecte a solução de pentobarbital de sódio (75 mg/kg, i.p.) para anestesiar os ratos.
  4. Cubra os olhos do rato com gaze médica pré-umedecidos para evitar ressecamento.
  5. Garantir que o rato perde completamente a consciência e já não responde a cauda ou retropé pitadas com fórceps. Monitore a anestesia durante todo o evento anestésica e intra-operatório cada 15 min. manter a anestesia, completando com 10% do volume inicial de injeção da solução de pentobarbital quando necessário.
  6. Coloque uma almofada de aquecimento com uma camada semi isolante abaixo do animal e coloque o animal em posição supina e transferi-lo para a estação de trabalho do laser Doppler aparelho. Corrigi o mouse para a plataforma de trabalho com fita cirúrgica.
  7. Cotonete da pele abdominal do mouse com betadine e em seguida etanol 75% é usado para limpar a área abdominal limpo.
  8. 2% lidocaine/0.5% bupivacaína (50/50) mistura Injecte por via subcutânea.  Cortar um ~ 3 cm-furo de diâmetro no centro de uma compressa de gaze. Cobrir a região abdominal com a compressa de gaze.
  9. Levante a pele abdominal com fórceps e fazer uma incisão vertical inicial ao longo da linha mediana do abdômen, usando uma tesoura, bisturi ou pele.
  10. Segure o músculo subjacente com fórceps e incise para entrar na cavidade abdominal. Não feri nenhum órgão. Dobre a pele e o músculo subjacente no peito para revelar o interior da cavidade abdominal. Delicadamente, expor o corpo do pâncreas e do baço, usando um par de pinças nariz sem corte.

4. dados aquisição para análise

  1. Executar o software do aparelho laser Doppler clicando em "Arquivo" → "Novo" para criar um novo arquivo de medição. Para configurar os monitores conectados, sob a guia "Geral", configurar a monitoramento de duração para "Graça executar." Use o padrão de fábrica para a guia "LDF Monitor" clique em "Next".
  2. Configurar o display gráfico em "Exibir caixa de diálogo configuração." Selecione os canais de "Velocidade de fluxo, Conc," verificando as respectivas caixas. Selecione os seguintes parâmetros: "Fonte de dados para o canal" e "rótulo, unidades e cor." Clique em "Next".
  3. Inserir informações de usuário sobre o assunto e medição (i.e., nome e número de assunto, operador, monitoramento de tempo, comentários, etc.) no "arquivo caixa de diálogo informações" e clique em "Next" para concluir a configuração de medição.
    Nota: Uma janela de medição é criada automaticamente pelo software (figura 1B).
  4. Manualmente, avança o eletrodo para o pâncreas. Certifique-se que a distância entre as sonda e pâncreas tecidos é dentro de 1 mm. Uma distância inadequada dá uma leitura do fluxo de sangue artificialmente aumentada ou diminuída.
  5. Clique no ícone de barra de ferramentas "Iniciar" para começar a gravar os dados de unidades (PU) de perfusão microvascular sangue. Colete os dados de PU continuamente por 1 min cada execução. Clique em "Stop" para parar a medição. Selecione "Arquivo" → "Salvar como" ao nome e salve o arquivo de medições acabado.
  6. Manualmente, reposicionar a sonda após cada corrida para evitar efeitos aditivos e a exaustão localizada de contrátil e capacidade de relaxamento. Repita as etapas de 4,1-4,4 para colher dados de PU microvasculares multi-ponto (ou seja, três pontos aleatoriamente escolhidos de tecido pancreático) para cada rato. Medir os dados do plutônio de uma placa não-reflexivo como um controle de linha de base.
  7. Feche a camada muscular abdominal e a camada de pele com uma sutura. Coloque os animais em gaiolas limpas após os experimentos.
  8. Manter o animal morno colocando a gaiola de recuperação meio-sobre a almofada de aquecimento.
    Nota: Preste atenção ao calor, higiene, fluido e ingestão de alimentos e infecção. Administra os ratos com 2 mg/kg de carprofeno por 48 h como dor pós-operatória.  Realizar eutanásia pela injeção i.p. de pentobarbital de sódio de 150 mg/kg, quando os ratos são observados em um estado de dor ou sofrimento que não pode ser aliviado.

5. calcular os parâmetros de Vasomotion Microvascular

  1. Use o comando "Export" do laser Doppler software para exportar o tempo e dados brutos do plutônio como um arquivo *. xlsx e abra o arquivo em uma planilha.
  2. Calcular a unidade de perfusão de base média (PUb) (consulte a etapa 4.6).
  3. Calcular a média de sangue da perfusão (PUum) por 1 min de uma medição da seguinte forma: média de perfusão sanguínea (PUum) = PU - PUb (equação 1).
  4. Calcule a frequência (ciclos/min), para cada 1 min de medição.
    Nota: A frequência de vasomotion microvascular é definida como o número de picos que ocorreu em uma onda de vasomotion microvascular por minuto.
  5. Calcule a amplitude (ΔPU) para cada 1 min de medição.
    1. Calcular a amplitude de vasomotion microvascular como a diferença entre o máximo (PUmáx) e mínimo (PUmin): Amplitude (ΔPU) = PUmáx - PUmin (equação 2).
  6. Calcule a velocidade relativa (PU) para cada 1 min de medição.

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Representative Results

Uma fotografia do laser vasomotion microvascular medição Doppler aparelhos equipados com um diodo semicondutor é mostrada na figura 1A. Software de interface do usuário é apresentado na figura 1B. Usando o método acima mencionado, os parâmetros hemodinâmicos de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foram detectados para controle de não-diabéticos e ratos diabéticos. Uma variedade de técnicas, incluindo laser Doppler flowmetry, refletido espalhados espectroscopia de infravermelha, luz e imagem técnicas, têm sido usada para estudar vasomotion microvascular, desde que o primeiro foi definido. Tabela 1 resume os grupos de pesquisa e artigos publicados que usam laser Doppler tecnologia para determinar o papel da microcirculação em diabetes e doenças relacionadas.

Em geral, as condições microcirculatory de ilhotas pancreáticas são representadas pelo status funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion usando os parâmetros microvasculares, incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência relativa velocidade (Figura 2). O diagrama esquemático representativo vasomotion microvascular é composto principalmente de fases periódicas de contração e relaxamento (Figura 2A). Os fenômenos hemodinâmicos apresentam um padrão de perfusão de fluxo de sangue em redes microvasculares. Dados de PU coletados pelo laser Doppler aparelhos foram empregados para diagramas de gráfico dispersão e para mostrar o padrão de distribuição da perfusão sanguínea microvascular. O protocolo atual, os padrões de distribuição da perfusão microvascular sangue de ilhotas pancreáticas em ratos não-diabéticos e diabéticos eram totalmente diferentes (Figura 2B). Numa escala inferior de perfusão sanguínea de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foi observada em ratos diabéticos, em comparação com o controle de não-diabéticos. O ritmo das contrações e relaxamentos de ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular foi caótica e irregular em ratos diabéticos induzido por STZ, enquanto que controles não-diabéticos tinham oscilações rítmicas (Figura 2 e Figura 2D). Estamos os 5-s dados da perfusão de sangue microvascular ilhota pancreatic dentro das linhas tracejadas na Figura 2 e Figura 2D extraídos e demonstrou que as flutuações caóticas da ilhota pancreatic microvascular sangue perfusão em ratos diabéticos perdeu a capacidade de regular o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion, que deve ocorrer em resposta ao sangue fluctuation de glicose (Figura 2E).

Além disso, para responder a hiperglicemia, ilhotas pancreáticas precisam sufficient e perfusão de sangue biorítmica flow para o transporte de insulina. A ilhota pancreatic microvascular vasomotion parâmetros (incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência e velocidade relativa) foram então calculados e analisaram quantitativamente com base em perfis de PU. Como mostrado na Figura 3, em comparação com controles não-diabéticos, a perfusão de sangue médio da microcirculação da ilhota pancreatic foi diminuída em ratos diabéticos induzido por STZ (Figura 3A). Entretanto, houve significativa diminui observada na amplitude (Figura 3B) e frequência (Figura 3) das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular em ratos diabéticos induzido por STZ. A velocidade relativa da perfusão sanguínea de ilhotas pancreáticas diminuiu significativamente no grupo diabético STZ-induzido, em comparação com o controle de não-diabéticos (Figura 3D). Como mencionado acima, o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion foi prejudicado em ratos diabéticos. Nós especulamos que anormalidades de ritmo, juntamente com uma diminuição da frequência, amplitude e velocidade relativa de ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular, podem resultar em um deficiency de perfusão microvascular do sangue, que pode danificar as células β do Ilhéu e reduzir secreção de insulina.

Figure 1
Figura 1. Aparelho utilizado para determinar a ilhota pancreatic vasomotion microvascular na vivo. R. fotografia do aparato de medição usado para determinar a vasomotion microvascular ilhotas pancreáticas de ratos. A sonda soquetes e botão do interruptor de laser estão no painel esquerdo. O display de cristal líquido é no painel do meio. Botões de menu (ou seja, a cima, para baixo e inserir botões) e o diodo luminoso poder estão no painel direito. Os dispositivos periféricos (por exemplo, computadores e cabos) não são mostrados. B. Screenshot ilustrando os elementos típicos e os canais de gráfico do software de aparelho Doppler laser. "Fluxo", "Conc", "DC", e "Velocidade" leituras de medição são exibidas nos canais do gráfico. "Flux" representa a perfusão microvascular sangue de tecido, "Conc" representa a concentração de glóbulos microvascular do tecido, "DC" representa a intensidade média de luz reflexiva e "Velocidade" representa a velocidade relativa do fluxo sanguíneo microvascular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2. Estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion em camundongos. A perfusão sanguínea das ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foi avaliada por um laser Doppler aparelho, e o estado funcional foi analisado. R. esquema de parâmetros relacionados com a vasomotion microvascular. AC representa a amplitude de uma contração de vasomotion microvascular, Ar representa a amplitude de um relaxamento vasomotion microvascular, Tc representa o comprimento do tempo de uma contração de vasomotion microvascular e Tr representa o comprimento do tempo de um relaxamento vasomotion microvascular. B. padrão de distribuição da perfusão microvascular sangue de ilhotas pancreáticas em ratos não-diabéticos e diabéticos. Pontos vermelhos: ratos não-diabéticos. Azul de pontos: ratos diabéticos. A linha tracejada verde mostra a demarcação entre o padrão de perfusão de sangue microvascular não-diabéticos e diabéticos. C. ilhota Pancreatic microvascular vasomotion no grupo controle foi avaliada com base a perfusão microvascular dinâmica de flow o sangue. M. ilhota Pancreatic microvascular vasomotion nos ratos diabéticos foi avaliada com base a perfusão microvascular dinâmica de flow o sangue. E. diagrama de representante (intervalo de 5-s) ilhota pancreatic microvascular vasomotion entre o controle de não-diabéticos e ratos diabéticos. Linha vermelha: controle de não-diabéticos. Linha azul: ratos diabéticos. PU: unidades perfusão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3. Quantification dos parâmetros da ilhota pancreatic microvascular vasomotion. Parâmetros de ilhotas pancreáticas vasomotion microvasculares, incluindo a perfusão sanguínea média, amplitude, frequência e velocidade relativa foram analisados e comparados entre controle de não-diabéticos e ratos diabéticos. R. Quantification da perfusão de sangue médio (PU/min) das ilhotas pancreáticas vasomotion microvascular em ratos não-diabéticos e diabéticos. A amplitude de B. (ΔPU), C. frequência (ciclos/min) e m. velocidade relativa (PU) de ilhotas pancreáticas microvascular vasomotion foram menores em ratos diabéticos do que em ratos de controle não-diabéticos. A amplitude da vasomotion microvascular foi calculada como a diferença entre o máximo (PUmáx) e mínimo (PUmin). A frequência de vasomotion microvascular foi definida como o número de picos ou vales que ocorreu em uma onda de vasomotion microvascular por minuto. Os dados foram apresentados como a média ± DP (n = 6 em cada grupo). P < 0.05, * *P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Doenças Objeto Aparelho N º de árbitros
Função endotelial H LDF, LSCI 11, 12, etc.
DN H, R LDF 13, 14, 15, etc.
DR H LDF 16, 17, 18, etc.
Microcirculação cutânea/pele H LDF 11, 19, 20, etc.
Microcirculação cardíaca R LDF 21
Deficiência auditiva M LDF 22
DN, neuropatia diabética. DR, retinopatia diabética. LDF, laser Doppler flowmetry.
LSCI, laser marcam imagens de contraste. R, rato. Rato humano, M, H.

Tabela 1. O papel da microcirculação em diabetes e suas complicações. Grupos de pesquisa têm usado laser Doppler para determinar o papel da microcirculação em diabetes e suas complicações por décadas. Artigos relacionados nos últimos anos estão listados aqui. Estes artigos publicados principalmente focar-se na disfunção endotelial, neuropatia diabética (DN), retinopatia diabética (DR), pele e comprometimento microvascular cutâneo e relativamente raras complicações como disfunção cardíaca da microcirculação e audiência por imparidade. DN: neuropatia diabética. DR: retinopatia diabética. LDF: laser Doppler flowmetry. LSCI: laser speckle contraste imagem latente. R: rato. H: humano. M: rato.

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Discussion

Nos casos que envolvem disfunção microvascular (por exemplo, diabetes, pancreatite aguda, doenças microvasculares periféricas, etc.), algumas doenças levam à redução do fluxo sanguíneo. Para além de alterações no fluxo sanguíneo, existem indicadores importantes, tais como vasomotion microvascular, que espelham o estado funcional da microcirculação. O indicador específico, vasomotion microvascular, geralmente é definido como a oscilação do Tom em camas microvasculares microvascular. O protocolo atual, uma perfusão de sangue microvascular, sistema de monitoramento permite a visualização directa e análise quantitativa do status funcional de vasomotion microvascular. Nossa abordagem de avaliação microcirculatory pode ser aplicada seletivamente para alvo de tecidos e órgãos, identificando alterações dinâmicas na perfusão sanguínea. Relatórios publicados por outros grupos sobre o uso do laser Doppler para determinar o papel da perfusão microvascular sangue no diabetes e suas complicações foram resumidas na tabela 1. No estudo atual, para demonstrar a nossa abordagem, foi avaliado o estado funcional do vasomotion microvascular ilhotas pancreáticas de ratos diabéticos.

Vasomotion microvascular é reconhecido como um parâmetro da situação funcional da microcirculação e é capaz de regular a perfusão do fluxo de sangue, ajustando a distribuição no tecido local23. A microvasculatura do pâncreas, que pode ser dividido em Ilhéus, ácinos e ductos, tem sido estudada há décadas. Basicamente, esta separação do pâncreas em diferentes partes é por conveniência somente porque a microvasculatura é realmente interligados e homogênea como uma entidade orgânica24. Esta rede de microvasculatura suporta a regulação do fluxo sanguíneo de ilhotas pancreáticas. Daí, usamos parâmetros do estatuto funcional, determinado pelo laser Doppler, para representar a ilhota pancreatic microvasculatura vasomotion. No entanto, devido às características da arquitetura do pâncreas, ainda não conseguimos fazer um julgamento depois de aplicar o método atual para verificar se a perfusão sanguínea é derivada da parte endócrina ou da parte exócrina do pâncreas. Usando o ilhéu específicos rotulagem corantes, como ditizona e vermelho neutro, pode tornar-se uma das formas possíveis de entender esta questão, pelo menos em certa medida.

Um aspecto importante da etapa de medição é a distância entre a sonda e o tecido do pâncreas. Uma distância inadequada dá um fluxo de sangue aumentada artificialmente lendo. A força física aplicada ao tecido e órgão por uma ponta reduz o fluxo sanguíneo microvascular. Portanto, pressão mínima deve ser aplicada quando a medição. Outro ponto a salientar é a potência de lasers. Lasers de alta potência em geral facilmente ferem microvessels em ilhotas pancreáticas, portanto, a frequência do raio laser precisa ser controlado, dentro das limitações. Para medições gerais e temporais, recomenda-se uma frequência de 1 Hz ou menos. Para evitar a exaustão localizada de capacidade vasomotion microvascular (incluindo contrátil e relaxamento) e o efeito aditivo, determinação multiponto e reposicionamento local após cada medição são sugeridos em quaisquer experiências.

No método atual, os dados do plutônio são usados para representar o fluxo de sangue do fluxo sanguíneo microvascular. Por causa das características do fluxo sanguíneo microvascular na microcirculação, não é viável para determinar as unidades de fluxo absoluto (por exemplo, mL/min/100 g de determinados órgãos ou tecidos). Portanto, o sistema de parâmetro de avaliação utilizado aqui baseia-se nas unidades de perfusão do fluxo de sangue relativo. Análise de wavelet, rápida de Fourier e outros algoritmos de análise espectral são métodos comuns que conduzem sinais Doppler do laser. No presente protocolo, estabelecemos uma abordagem que usa parâmetros hemodinâmicos (ou seja, a perfusão sanguínea, amplitude, frequência e velocidade relativa) para mostrar o status funcional do vasomotion microvascular. Além disso, a precisão da medição está relacionada com a profundidade do alvo e o design da sonda, que é geralmente em torno de 1 mm. Assim, os tecidos e órgãos mais espessos ou compactos não podem ser apropriados para a aplicação do laser Doppler e para o método atual. Além disso, porque os dados derivados de perfusão de fluxo de sangue podem ser afetados por outras condições que provoca mudanças visíveis, incluindo temperatura, umidade, luz externa e alterações na posição dos ratos, algumas regras devem ser obedecidas durante o processo experimental. O laboratório precisa manter a umidade e a temperatura constante, e a iluminação externa precisa ser protegido. Recomenda-se corrigir os ratos para evitar mudanças na posição. Acredita-se que estas estratégias podem superar as limitações mencionadas acima e aumentarão a precisão dos dados de perfusão de fluxo de sangue.

A vantagem do presente protocolo comparando com outros relatado nas literaturas é que é sensível e ágil para o vasomotion microvascular local de tecidos e órgãos. Isto facilitará a aplicação mais ampla do método para a avaliação ou investigação da microcirculação, especialmente o estado funcional do vasomotion microvascular, em investigação clínica e laboratorial. As aplicações incluem mas não estão limitadas a: visualização de isquemia, avaliação de perfusão de sangue e a avaliação do status funcional de vasomotion microvascular. Em conclusão, nosso método pode ser usado para investigar e avaliar o estado funcional da ilhota pancreatic microvascular vasomotion em ratos na vivo e pode ser capaz de satisfazer a necessidade clínica para avaliar a função da microcirculação.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações de Peking Union Medical faculdade juventude fundo e os fundos de pesquisa Fundamental para as universidades Central (Grant no. 3332015200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoorVMS-LDF2 Moor Instruments GI80 PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software Moor Instruments GI80-1 Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration base Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration flux standard Moor Instruments GI-cal Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer Johnson and Johnson #1955685 Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips Johnson and Johnson #1297006 Confirm hyperglycemia
Streptozotocin Sigma-Aldrich S0130 Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P3761 Working concentration 3 %
Ethanol Sinopharm Inc. 200121 Working concentration 75 %
Sucrose Amresco 335 Working concentration 10 %
Medical gauze China Health Materials Co. S-7112 Surgical
Blunt-nose forceps Shang Hai Surgical Instruments Inc. N-551 Surgical
Surgical tapes 3M Company 3664CU Surgical
Gauze sponge Fu Kang Sen Medical Device CO. BB5447 Surgical
Scalpel Yu Lin Surgical Instruments Inc. 175C Surgical
Skin scissor Carent 255-17 Surgical
Suture Ning Bo Surgical Instruments Inc. 3325-77 Surgical
Syringe and 25-G needle MISAWA Inc. 3731-2011 Scale: 1 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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