Laser Doppler: Uno strumento per la misurazione dell'isolotto pancreatico Vasomotion microvascolare In Vivo

Medicine

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Summary

Isole pancreatiche microvascolare vasomotion regola la distribuzione di sangue dell'isolotto e mantiene la funzione fisiologica delle cellule β dell'isolotto. Questo protocollo descrive l'utilizzo di un monitor Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo e a valutare il contributo della microcircolazione di isole pancreatiche per malattie del pancreas.

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Liu, M., Zhang, X., Li, B., Wang, B., Wu, Q., Shang, F., Li, A., Li, H., Xiu, R. Laser Doppler: A Tool for Measuring Pancreatic Islet Microvascular Vasomotion In Vivo. J. Vis. Exp. (133), e56028, doi:10.3791/56028 (2018).

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Abstract

Come una condizione funzionale della microcircolazione, vasomotion microvascolare è importante per la consegna di ossigeno e nutrienti e la rimozione di anidride carbonica e prodotti di scarto. Il danno della vasomotion microvascolare potrebbe essere un passo cruciale nello sviluppo delle malattie collegate alla microcircolazione. Inoltre, l'isolotto pancreatico altamente vascularized e adattato per supportare la funzione endocrina. A questo proposito, sembra possibile inferire che la condizione funzionale del vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico potrebbe colpire la funzione delle isole pancreatiche. Analizzare i cambiamenti patologici della condizione funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare può essere una strategia fattibile per determinare i contributi che microcircolazione dell'isolotto pancreatico rende alle malattie correlate, come il diabete mellito, pancreatite, ecc. Di conseguenza, questo protocollo viene descritto utilizzando un monitor di flusso di anima di Doppler laser per determinare lo stato funzionale di isole pancreatiche microvascolare vasomotion e di stabilire parametri (tra cui la perfusione sanguigna media, ampiezza, frequenza e relativa velocità di isole pancreatiche microvascolare vasomotion) per la valutazione della condizione funzionale microcircolatoria. In un modello del mouse diabetici streptozotocin-indotti, abbiamo osservato un'alterata condizione funzionale della vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico. In conclusione, questo approccio per la valutazione dell'isolotto pancreatico vasomotion microvascolare in vivo può rivelare meccanismi relativi alle malattie pancreatiche.

Introduction

Come parametro della condizione funzionale della microcircolazione, vasomotion microvascolare si assume la responsabilità per la consegna e lo scambio di ossigeno, sostanze nutritive e ormoni ed è fondamentale per la rimozione dei prodotti metabolici, quali anidride carbonica e rifiuti cella 1. microvascolare vasomotion regola anche la distribuzione del flusso di sangue e la perfusione tissutale, interessando così la pressione sanguigna microcircolatoria locale e risposte ad infiammazione, che può indurre l'edema in molte malattie. Di conseguenza, vasomotion microvascolare è estremamente importanti per mantenere la funzione fisiologica di organi2,3,4, tessuti e cellule di componente. Il danno della vasomotion microvascolare potrebbe essere uno dei passaggi chiavi nello sviluppo delle malattie relative microcircolazione5.

Laser Doppler è stato inizialmente sviluppato per l'osservazione e la quantificazione nel campo della microcircolazione ricerca6. Questa tecnica, insieme ad altri approcci tecnici (ad es., laser speckle7, ossigeno transcutanea, ecc.), è stata considerata come lo standard d'oro per valutare il flusso di sangue nel microcircolo. Il razionale che l'aspersione del sangue di microcircolazione locale (cioè, capillari, arteriole, venule, ecc.) può essere determinata da apparato dotato di laser Doppler, si basa sul principio dell'effetto Doppler. La lunghezza d'onda e la frequenza della luce di emissione stimolata cambia quando particelle di luce incontro commovente globuli nei microvessels, o rimangono invariati. Pertanto, nella microcircolazione, il numero e la velocità delle cellule del sangue sono i fattori chiavi per la grandezza e la distribuzione di frequenza della luce Doppler-spostato, mentre la direzione del flusso sanguigno microvascolare è irrilevante. Utilizzando diversi metodi, una varietà di tessuti sono stati utilizzati per studi microcircolatori, compreso i mesenteries e dorsale dello skinfold alloggiamenti di topi, ratti, criceti e anche gli esseri umani8. Tuttavia, nel protocollo attuale, ci concentriamo sull'aspetto funzionale status di vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico, che viene valutato utilizzando laser Doppler e un sistema di parametri di valutazione fatti in casa.

Microcircolazione dell'isolotto pancreatico è principalmente composto di isole pancreatiche microvasi e presenta caratteristiche peculiari. Una rete capillare di isole pancreatiche mostra una densità cinque volte più alto rispetto alla rete capillare della sua controparte esocrina9. Un condotto che prevede la consegna di ingresso del glucosio e di insulina divulgazione, le cellule endoteliali dell'isolotto forniscono ossigeno ai cellule metabolicamente attive nell'isolotto cellule β. Inoltre, la prova emergente dimostra inoltre che l'isolotto microvasi sono coinvolti non solo nella regolazione dell'espressione genica dell'insulina e sopravvivenza della β-cellula, ma anche nell'influenzare la funzione β-cellulare; promuovere la proliferazione delle cellule β; e producendo un numero di sostanze e fattori di crescita angiogenici vasoattivi,10. Pertanto, a questo proposito, si deduce che la condizione funzionale del vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico può influenzare la funzione della β-cellula dell'isolotto ed essere coinvolta nella patogenesi di malattie come la pancreatite acuta/cronica, diabete e altri malattie del pancreas-relative.

Analizzare i cambiamenti patologici dello stato funzionale delle insule pancreatiche microvascolare vasomotion potrebbe essere una strategia fattibile per determinare i contributi della microcircolazione dell'isolotto pancreatico per le malattie di cui sopra. Fornire una descrizione dettagliata della procedura che descrive l'approccio per determinare isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo . Misure tipiche vengono visualizzate nei Risultati di rappresentante. Infine, i vantaggi e le limitazioni del metodo sono evidenziate nella discussione, insieme a ulteriori applicazioni.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti nel rispetto di tutte le pertinenti linee guida, regolamenti e agenzie di regolamentazione. Il presente protocollo in questione è stato effettuato sotto la guida e l'approvazione dell'Istituto della microcircolazione animale etica Comitato (IMAEC) al Peking Union Medical College (PUMC).

1. gli animali

  1. Prima dell'inizio dell'esperimento, è necessario tenere tre topi BALB/c per gabbia, con temperatura controllata (24 ± 1 ° C) e umidità (55 ± 5%), sotto un ciclo luce-buio di 12 h. I topi consentire il libero accesso al cibo normale e acqua.
  2. Dividere in modo casuale i topi in un gruppo di controllo non-diabetico ed un gruppo diabetico. Pesare ogni singolo mouse e calcolare il volume di iniezione utilizzando la massa corporea di ogni mouse preciso.
  3. Veloce i topi per 4 h prima iniezione di streptozotocin (STZ) e fornire acqua normale come di consueto il giorno sperimentale 1.
  4. Preparare il tampone di citrato di sodio 0,1 M a pH 4,3. Mettere 1 mL di soluzione in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e avvolgere il tubo del microcentrifuge nella carta stagnola per evitare l'esposizione alla luce.
  5. Sciogliere il STZ in tampone citrato di sodio (pH 4.3) ad una concentrazione finale di lavoro di 5 mg/mL prima dell'uso.
  6. Dare i topi delle iniezioni intraperitoneali gruppo diabetico di STZ alla dose di 40 mg/kg, utilizzando una siringa da 1 mL e un ago 25-G. Iniettare i topi del controllo non-diabetico con lo stesso volume di tampone citrato di sodio (pH 4,3).
  7. Rimettere i topi nelle gabbie e fornire loro cibo normale e 10% di acqua di saccarosio.
  8. Ripetere i passaggi da 1.3-1.7 sperimentale giorni 2-5 (cioè, i prossimi 4 giorni consecutivi).
  9. Sostituire l'acqua di 10% di saccarosio con acqua normale dopo l'ultima iniezione di STZ.
  10. Velocemente i topi per 6 h, ma dare loro libero accesso all'acqua e misurare i livelli di glucosio del sangue nove giorni più tardi (14 giorno sperimentale). Raccogliere un campione di sangue dalla vena caudale per confermare l'iperglicemia utilizzando un sistema di monitoraggio del glucosio nel sangue.
    Nota: I topi con sangue glucosio livelli > 200 mg / dL sono considerati diabetici.

2. preparazione dello strumento

  1. Pulire le superfici ottiche della punta della sonda e il connettore della sonda dell'apparato Doppler laser con un panno morbido e non abrasivo per rimuovere polvere o particelle. Collegare il cavo alla porta dello strumento (Figura 1A).
  2. Montare il supporto di calibrazione permettendo il flusso standard per essere in equilibrio termico con un ambiente sperimentale (temperatura ambiente, solitamente per 30 min). Agitare il flusso standard delicatamente per 10 s e lasciate riposare per 2 min.
  3. Posizionare il contenitore standard di flusso al centro della base di calibrazione. Sistemare il morsetto per l'altezza massima e fissare la sonda nel morsetto tale che punti verso il basso al contenitore. Assicurarsi che lo standard di flusso sia correttamente posizionato sotto la sonda.
  4. Spostare lentamente la sonda verso il basso fino a quando la punta è sommerso correttamente nello standard flusso. Selezionare e premere "taratura" sul laser Doppler apparato e scegliere il canale di lavoro che la sonda è collegata al. Eseguire il programma di calibrazione fino a quando un avviso di "Calibrazione riuscita" viene visualizzato sullo schermo del laser Doppler apparato.
  5. Fissare la sonda utilizzando supporti di sonda. Proteggere manualmente la sonda per evitare movimenti.
  6. Mantenere la stanza sperimentale a temperatura costante (24 ± 1 ° C) e umidità (~ 50-60%).
  7. Disattivare qualsiasi luce esterna (come lampade fluorescenti e spot) prima di eseguire l'esperimento per evitare il cambiamento indotto dalla luce esterna.

3. preparazione degli animali

  1. Autoclave la chirurgico strumenti e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente prima dell'uso.
  2. Dare i topi 10 min per acclimatarsi all'ambiente sperimentale prima rilevazione dell'isolotto pancreatico microvascolare vasomotion dal laser Doppler.
  3. Riempire una siringa da 1 mL con 1 mL di sodio pentobarbital 3%. Iniettare la soluzione di sodio pentobarbital (75 mg/kg i.p.) per anestetizzare i topi.
  4. Coprire gli occhi del mouse con garza medica pre-umidificata per prevenire la secchezza.
  5. Assicurarsi che il mouse perde completamente la coscienza e non risponde più alla coda o retropiede pizzica con il forcipe. Monitorare l'anestesia durante tutto l'evento di anestetico e intra-operatoria ogni 15 min. mantenere l'anestesia, completandola con il 10% del volume iniziale iniezione della soluzione pentobarbital quando necessario.
  6. Posizionare un rilievo di riscaldamento con uno strato semi-isolante sotto l'animale e metti l'animale in posizione supina e trasferimento per la stazione di lavoro del laser Doppler apparato. Difficoltà il mouse per la piattaforma di funzionamento con nastro chirurgico.
  7. Tampone pelle addominale del mouse con betadine e poi 75% etanolo viene utilizzato a tampone pulito la zona addominale.
  8. Iniettare per via sottocutanea 2% lidocaine/0.5% bupivacaine miscela (50/50).  Tagliare un cm ~ 3-foro di diametro al centro di una garza-spugna. Coprire la regione addominale con la spugna di garza.
  9. Sollevare la pelle addominale con il forcipe e praticare un'incisione verticale iniziale lungo la linea mediana dell'addome utilizzando un paio di forbici bisturi o pelle.
  10. Afferrare il muscolo sottostante con la pinzetta e incise per entrare nella cavità addominale. Non ferire qualsiasi altro organo. Piegare la pelle e il muscolo di fondo sopra la cassa per rivelare la cavità addominale. Delicatamente esporre il corpo del pancreas e la milza usando un paio di pinze dal naso smussato.

4. dati acquisizione per l'analisi

  1. Eseguire il software dell'apparato Doppler laser facendo clic su "File" → "Nuovo" per creare un nuovo file di misurazione. Per configurare il monitor connessi, nella scheda "Generale", impostare la durata del monitoraggio su "Free run". Utilizzare le impostazioni predefinite per la scheda "Monitor LDF" fare clic su "Avanti".
  2. Impostare la visualizzazione del grafico in the "display setup dialog box." Selezionare i canali di "Velocità di flusso, Conc," selezionando le rispettive caselle. Selezionare i seguenti parametri: "Origine dati per il canale" e "etichetta, unità e colore." Fare clic su "Avanti".
  3. Immettere le informazioni utente il soggetto e la misurazione (cioè, nome e numero di soggetto, operatore, monitoraggio tempo, commenti, ecc.) in "file informazioni nella finestra di dialogo" e fare clic su "Next" per terminare la configurazione di misura.
    Nota: Una finestra di misurazione viene creata automaticamente dal software (Figura 1B).
  4. Manualmente è possibile avanzare l'elettrodo al pancreas. Assicurarsi che la distanza tra la sonda e pancreas tessuti sia all'interno di 1mm. Una distanza inappropriata dà una lettura del flusso di sangue artificialmente aumentata o diminuita.
  5. Fare clic sull'icona della barra degli strumenti "Start" per iniziare a registrare i dati di unità (PU) aspersione sanguigno microvascolare. Raccogliere i dati di PU continuamente per 1 minuto ogni run. Fare clic su "Stop" per interrompere la misurazione. Selezionare "File" → "Salva come" per nome e salvare il file finito misura.
  6. Riposizionare manualmente la sonda dopo ogni corsa per evitare effetti additivi e l'esaurimento localizzata di contrattile e la capacità di rilassamento. Ripetere i passaggi 4.1-4.4 per raccogliere dati di PU microvascolari multi-punto (cioè, tre punti scelti a caso dal tessuto pancreatico) per ogni mouse. Misurare i dati dell'unità di elaborazione di un piatto antiriflesso come controllo della linea di base.
  7. Chiudere lo strato del muscolo addominale e lo strato della pelle con una sutura. Sistemare gli animali in gabbie pulite dopo gli esperimenti.
  8. Mantenere l'animale caldo inserendo la gabbia di recupero mezzo-il termoforo.
    Nota: Prestare attenzione al calore, igiene, fluido e l'ingestione di cibo e infezione. Amministrare i topi con 2 mg/kg Carprofen per 48 h come trattamento del dolore postoperatorio.  Eseguire l'eutanasia iniettando 150 mg/kg i.p. di sodio pentobarbital quando topi sono osservati per essere in uno stato di grave dolore o disagio che non può essere alleviato.

5. calcolo dei parametri di Vasomotion microvascolare

  1. Utilizzare il comando "Esporta" del laser Doppler software per esportare il tempo e dati grezzi PU come file *. xlsx e aprire il file in un foglio di calcolo.
  2. Calcolare l'unità di perfusione basale medio (PUb) (Vedi punto 4.6).
  3. Calcolare l'aspersione di sangue medio (PUun) per 1 min di una misura come segue: media aspersione del sangue (PUun) = PU - PUb (equazione 1).
  4. Calcolare la frequenza (cicli/min) per ogni 1 min di misurazione.
    Nota: La frequenza di vasomotion microvascolare è definita come il numero di picchi che si è verificato in un'onda di vasomotion microvascolare al minuto.
  5. Calcolare l'ampiezza (ΔPU) per ogni 1 min di misurazione.
    1. Calcolare l'ampiezza del vasomotion microvascolare come differenza tra il minimo (PUmin) e massimo (PUmax): ampiezza (ΔPU) = PUmax - PUmin (equazione 2).
  6. Calcolare la velocità relativa (PU) per ogni 1 min di misurazione.

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Representative Results

Una fotografia del laser di misurazione microvascolare vasomotion Doppler apparato dotato di un diodo laser a semiconduttore è mostrata in Figura 1A. Software di interfaccia utente è presentato in Figura 1B. Utilizzando il metodo di cui sopra, i parametri emodinamici di vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico sono stati rilevati per controllo non-diabetico e topi diabetici. Una varietà di tecniche, tra cui flussometria del laser Doppler, riflessa e sparsi spettroscopia a raggi infrarossa, luce e tecniche, di formazione immagine è stata usata per studiare vasomotion microvascolare in quanto è stato prima definito. La tabella 1 riassume i gruppi di ricerca e articoli pubblicati che utilizzano laser Doppler tecnologia per determinare il ruolo della microcircolazione in diabete e malattie correlate.

In generale, le condizioni microcircolatorie dell'isolotto pancreatico sono rappresentate dallo stato funzionale delle insule pancreatiche microvascolare vasomotion utilizzando i parametri microvascolari, tra cui l'aspersione del sangue di media ampiezza, frequenza, relativa velocità (Figura 2). Il diagramma schematico rappresentante vasomotion microvascolare è composta principalmente di periodiche fasi di contrazione e rilassamento (Figura 2A). I fenomeni emodinamici presentano un modello di aspersione di flusso di sangue in reti microvascolare. Dati PU raccolti dal laser Doppler apparato sono stati impiegati ai diagrammi di grafico a dispersione e a mostrare il modello di distribuzione della perfusione sanguigno microvascolare. Nel protocollo attuale, i modelli di distribuzione di aspersione di sangue microvascolare di isole pancreatiche in topi diabetici e non diabetici erano totalmente diverso (Figura 2B). Una scala inferiore di aspersione di sangue di vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico è stata osservata nei topi diabetici rispetto al controllo non-diabetico. Il ritmo delle contrazioni e rilassamenti della vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico era caotico e irregolare in topi diabetici indotti STZ, mentre comandi non-diabetico ha avuto oscillazioni ritmiche (Figura 2 e Figura 2D). Abbiamo estratto i dati 5-s di aspersione di sangue microvascolare dell'isolotto pancreatico all'interno delle linee tratteggiate in Figura 2 e Figura 2D ed abbiamo dimostrato che le fluttuazioni caotiche di isole pancreatiche microvascolare perfusione in topi diabetici sanguigna perso la capacità di regolare la condizione funzionale del vasomotion microvascolare di isole pancreatiche, che dovrebbe verificarsi in risposta a glucosio fluctuation (Figura 2E) di sangue.

Inoltre, per rispondere all'iperglicemia, isole pancreatiche bisogno sufficiente e aspersione del flusso bioritmica sangue per trasportare l'insulina. Le isole pancreatiche microvascolare vasomotion parametri (tra cui l'aspersione di sangue medio, ampiezza, frequenza e velocità relativa) sono stati quindi calcolati e quantitativamente analizzato basato sui profili PU. Come illustrato nella Figura 3, rispetto ai comandi non-diabetico, l'aspersione di sangue medio della microcircolazione dell'isolotto pancreatico è stata diminuita in topi diabetici indotti STZ (Figura 3A). Nel frattempo, c'erano diminuzioni significativo notate nell'ampiezza (Figura 3B) e nella frequenza (Figura 3) di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in topi diabetici indotti STZ. La velocità relativa di aspersione di sangue dell'isolotto pancreatico è diminuito significativamente nel gruppo diabetico indotto STZ rispetto al controllo non-diabetico (Figura 3D). Come accennato in precedenza, la condizione funzionale del vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico è stata alterata in topi diabetici. Speculiamo che anomalie del ritmo, insieme ad una diminuzione di frequenza, ampiezza e velocità relativa di isole pancreatiche microvascolare vasomotion, potrebbero provocare un deficit di perfusione sanguigno microvascolare, che possa danneggiare le cellule β dell'isolotto e ridurre secrezione dell'insulina.

Figure 1
Figura 1. Apparecchio utilizzato per determinare isole pancreatiche vasomotion microvascolare in vivo. R. fotografia dell'apparato di misura utilizzata per determinare il vasomotion microvascolare di isole pancreatiche dei topi. La sonda prese e pulsante interruttore laser sono nel pannello di sinistra. Display a cristalli liquidi è nel pannello centrale. Pulsanti del menu (cioè, il fino, giù e inserire pulsanti) e il potenza diodi emettitori di luce sono nel pannello di destra. I dispositivi periferici (ad esempio, computer e cavi) non vengono visualizzati. B. schermata che illustra gli elementi tipici e canali grafico del software di apparecchi Doppler laser. "Flux", "Conc,", "DC," e "Velocità" misura letture vengono visualizzate nei canali grafico. "Flux" rappresenta la perfusione tissutale sanguigno microvascolare, "Conc" rappresenta la concentrazione di globuli microvascolare del tessuto, "DC" rappresenta l'intensità media della luce riflettente e "Velocità" rappresenta la velocità relativa di flusso sanguigno microvascolare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2. Lo stato funzionale di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in topi. L'aspersione del sangue di isole pancreatiche vasomotion microvascolare è stata valutata da un laser Doppler apparato, e lo stato funzionale è stato analizzato. R. schema dei parametri riguardanti vasomotion microvascolare. AC rappresenta l'ampiezza di una contrazione microvascolare vasomotion, Ar rappresenta l'ampiezza di un rilassamento microvascolare vasomotion, Tc rappresenta la lunghezza del tempo di una contrazione di vasomotion microvascolare e Tr rappresenta la lunghezza del tempo un rilassamento vasomotion microvascolare. B. modello di distribuzione della perfusione di sanguigno microvascolare di isole pancreatiche in topi diabetici e non diabetici. Puntini rossi: topi non-diabetico. Blu puntini: topi diabetici. La linea verde tratteggiata indica la delimitazione fra il pattern di perfusione sanguigno microvascolare diabetici e non diabetici. C. il vasomotion microvascolare dell'isolotto pancreatico nel gruppo di controllo è stato valutato sulla base la perfusione microvascolare dinamica del flusso di sangue. D. dell'isolotto pancreatico vasomotion microvascolare nei topi diabetici è stata valutata sulla base di perfusione microvascolare dinamica del flusso di sangue. E. diagramma di rappresentante (gamma 5-s) dell'isolotto pancreatico microvascolare vasomotion tra il controllo di non-diabetico e topi diabetici. Linea rossa: controllo non-diabetico. Linea blu: topi diabetici. PU: unità di perfusione. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3. Quantification dei parametri di isole pancreatiche microvascolare vasomotion. Isole pancreatiche microvascolare vasomotion parametri, compreso l'aspersione del sangue medio, ampiezza, frequenza e velocità relativa sono stati analizzati e confrontati fra i topi diabetici e non diabetici controllo. R. Quantification della perfusione sanguigna media (PU/min) di isole pancreatiche vasomotion microvascolare in topi diabetici e non diabetici. L'ampiezza di B. (ΔPU), C. frequenza (cicli/min) e velocità relativa D. (PU) di isole pancreatiche microvascolare vasomotion erano più bassi nei topi diabetici rispetto a topi di controllo non-diabetico. L'ampiezza della vasomotion microvascolare è stata calcolata come la differenza tra il minimo (PUmin) e massimo (PUmax). La frequenza di vasomotion microvascolare è stata definita come il numero di picchi o valli che si è verificato in un'onda di vasomotion microvascolare al minuto. I dati sono stati presentati come media ± DS (n = 6 in ogni gruppo). P < 0,05, * *P < 0.01. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Malattie Oggetto Apparato N. refs
Funzione endoteliale H LDF, LSCI 11, 12, ecc.
DN H, R LDF 13, 14, 15, ecc.
DR H LDF 16, 17, 18, ecc.
Microcircolazione cutanea/pelle H LDF 11, 19, 20, ecc.
Microcircolo cardiaco R LDF 21
Indebolimento dell'udito M LDF 22
DN, neuropatia diabetica. DR, retinopatia diabetica. LDF, laser Doppler flussometria.
LSCI, laser speckle imaging contrasto. R, ratto. H, del mouse umani, M.

Tabella 1. Il ruolo della microcircolazione in diabete e delle sue complicanze. Gruppi di ricerca hanno utilizzato laser Doppler per determinare il ruolo della microcircolazione in diabete e delle sue complicanze per decenni. Articoli correlati negli ultimi anni sono elencate qui. Questi articoli pubblicati si concentrano principalmente sulla disfunzione endoteliale, neuropatia diabetica (DN), retinopatia diabetica (Dott), pelle e danno microvascolare cutaneo e complicazioni relativamente rare come la disfunzione cardiaca microcircolazione e l'udito danno. DN: neuropatia diabetica. DR: retinopatia diabetica. LDF: flussometria di Doppler del laser. LSCI: imaging di contrasto laser speckle. R: ratto. H: umano. M: il mouse.

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Discussion

Nei casi che coinvolgono la disfunzione microvascolare (ad es., diabete, pancreatite acuta, malattie microvascolari periferiche, ecc.), alcune malattie portare alla riduzione del flusso sanguigno. Diverso da cambiamenti nel flusso sanguigno, non ci sono indicatori importanti, quali microvascolare vasomotion, che rispecchiano la condizione funzionale del microcircolo. L'indicatore specifico, vasomotion microvascolare, è generalmente definito come l'oscillazione del tono microvascolare in letti microvascolari. Nel protocollo attuale, un'aspersione di sangue microvascolare sistema di monitoraggio permette la visualizzazione diretta e analisi quantitativa dello stato funzionale della vasomotion microvascolare. Il nostro approccio di valutazione microcircolatorie può essere applicato in modo selettivo ai tessuti mirati e organi identificando i cambiamenti dinamici nell'aspersione di sangue. Rapporti pubblicati da altri gruppi sull'utilizzo di laser Doppler per determinare il ruolo di aspersione di sangue microvascolari nel diabete e sue complicanze sono stati riassunti nella tabella 1. Nello studio corrente, per dimostrare il nostro approccio, è stato valutato lo stato funzionale del vasomotion microvascolare di isole pancreatiche di topi diabetici.

Vasomotion microvascolare è riconosciuta come un parametro della condizione funzionale della microcircolazione ed è in grado di regolare l'aspersione di sangue flusso regolando la distribuzione nel tessuto locale23. Il microvasculature del pancreas, che possono essere suddivisi in isolotti, acini e dotti, è stato studiato per decenni. Fondamentalmente, questa separazione del pancreas in diverse parti è per comodità solo perché microvasculature è in realtà interconnessa ed omogenea come un' entità organica24. Questa rete di microvasculature supporta la regolazione del flusso sanguigno dell'isolotto pancreatico. Quindi, abbiamo utilizzato i parametri della condizione funzionale, determinata dal laser Doppler, per rappresentare le insule pancreatiche microvasculature vasomotion. Tuttavia, a causa delle caratteristiche dell'architettura del pancreas, non ancora riusciti a dare un giudizio dopo aver applicato il metodo corrente per accertare se l'aspersione di sangue è derivata dalla parte endocrina o dalla parte esocrina del pancreas. Utilizzando specifici dell'isolotto etichettatura coloranti, come Ditizone e rosso neutro, può diventare uno dei possibili modi di comprendere questo problema, almeno in una certa misura.

Un aspetto importante del passaggio di misurazione è la distanza tra la sonda e il tessuto pancreatico. Una distanza inappropriata dà un flusso sanguigno aumentato artificialmente lettura. La forza fisica applicata al tessuto e organo da una punta di sonda ridurrà il flusso sanguigno microvascolare. Quindi, una pressione minima deve essere applicata quando si eseguono misure. Un altro punto da notare è la potenza del laser. Laser ad alta potenza in genere facilmente ferire microvasi nell'isolotto pancreatico, così la frequenza del fascio laser deve essere controllata, entro i limiti. Per le misure generali e temporale, è consigliabile una frequenza di 1 Hz o meno. Per evitare l'esaurimento localizzata della capacità vasomotion microvascolari (tra cui contrattile e relax) e l'effetto additivo, determinazione multipunto e riposizionamento sito dopo ogni misurazione sono suggeriti in qualsiasi esperimenti.

Nel metodo corrente, i dati dell'unità di elaborazione sono utilizzati per rappresentare il flusso di sangue di flusso sanguigno microvascolare. A causa delle caratteristiche del flusso sanguigno microvascolare nella microcircolazione, non è possibile determinare l'unità di flusso assoluto (ad es., mL/min/100 g di specifici organi o tessuti). Di conseguenza, il sistema di parametro di valutazione utilizzato qui è basato sulle unità di aspersione di sangue relativo flusso. Analisi wavelet, Fourier veloce e altri algoritmi di analisi spettrale sono metodi comuni che conducono segnali Doppler laser. Nel presente protocollo, abbiamo istituito un approccio che utilizza parametri emodinamici (cioè, aspersione del sangue, ampiezza, frequenza e velocità relativa) per mostrare la condizione funzionale del vasomotion microvascolare. Inoltre, la precisione della misurazione è imparentata con la profondità del bersaglio e il design della sonda, che è generalmente di circa 1 mm. Quindi, tessuti e organi più spessi o compatti non potrebbero essere appropriati per l'applicazione del laser Doppler e per il metodo corrente. Inoltre, poiché i dati derivati da aspersione di flusso di sangue potrebbero essere influenzati da altre condizioni che provoca cambiamenti notevoli, tra cui temperatura, umidità, luce esterna e alterazioni nella posizione dei topi, alcune regole dovrebbero essere obbedite nel corso del procedimento sperimentale. Il laboratorio deve mantenere umidità e temperatura costante, e illuminazione esterna deve essere schermato. Si consiglia di fissare i topi per evitare variazioni di posizione. Si ritiene che queste strategie possono superare le limitazioni di cui sopra e aumenteranno la precisione dei dati di aspersione del flusso di sangue.

Il vantaggio del presente protocollo il confronto con altri segnalati nei literatures è che è sensibile e reattivo per il locale vasomotion microvascolare di tessuti e organi. Questo faciliterà la più ampia applicazione del metodo per la valutazione o l'indagine della microcircolazione, soprattutto la condizione funzionale del vasomotion microvascolare, nella ricerca clinica e di laboratoria. Le applicazioni includono ma non sono limitate a: visualizzazione di ischemia, valutazione di aspersione di sangue e la valutazione dello stato funzionale della vasomotion microvascolare. In conclusione, il nostro metodo può essere utilizzato per indagare e valutare lo stato funzionale delle insule pancreatiche vasomotion microvascolare in topi in vivo e può essere in grado di soddisfare l'esigenza clinica per valutare la funzione della microcircolazione.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Peking Union Medical College Youth Fund e i fondi di ricerca fondamentali per le Università centrale (Grant No. 3332015200).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MoorVMS-LDF2 Moor Instruments GI80 PeriFlux 5000 (Perimed Inc.) can be used as an alternative apparatus to harvest data
MoorVMS-PC Software Moor Instruments GI80-1 Software of MoorVMS-LDF2
Calibration stand Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration base Moor Instruments GI-cal Calibration tool
Calibration flux standard Moor Instruments GI-cal Calibration tool
One Touch UltraEasy glucometer Johnson and Johnson #1955685 Confirm hyperglycemia
One Touch UltraEasy strips Johnson and Johnson #1297006 Confirm hyperglycemia
Streptozotocin Sigma-Aldrich S0130 Dissolve in sodium citrate buffer (pH 4.3)
Pentobarbital sodium Sigma-Aldrich P3761 Working concentration 3 %
Ethanol Sinopharm Inc. 200121 Working concentration 75 %
Sucrose Amresco 335 Working concentration 10 %
Medical gauze China Health Materials Co. S-7112 Surgical
Blunt-nose forceps Shang Hai Surgical Instruments Inc. N-551 Surgical
Surgical tapes 3M Company 3664CU Surgical
Gauze sponge Fu Kang Sen Medical Device CO. BB5447 Surgical
Scalpel Yu Lin Surgical Instruments Inc. 175C Surgical
Skin scissor Carent 255-17 Surgical
Suture Ning Bo Surgical Instruments Inc. 3325-77 Surgical
Syringe and 25-G needle MISAWA Inc. 3731-2011 Scale: 1 ml

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