Author Produced

Análisis cinemático de la marcha de plano sagital en ratones C57BL/6 sometidos a MOG35-55 inducida por encefalomielitis Autoinmune Experimental

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Análisis de la cinemática de la marcha en el plano sagital obtiene información muy precisa acerca de cómo se ejecuta el movimiento. Se describe la aplicación de estas técnicas para identificar los déficits de marcha para los ratones sometidos a desmielinización autoinmune mediada. Estos métodos pueden usarse para caracterizar los déficits de paso para otros modelos de ratón con locomoción deteriorada.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (129), e56032, doi:10.3791/56032 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Análisis de la cinemática de la marcha en el plano sagital se ha utilizado con frecuencia para caracterizar el déficit motor en esclerosis múltiple (EM). Se describe la aplicación de estas técnicas para identificar los déficits de la marcha en un modelo murino de MS, conocida como encefalomielitis autoinmune experimental (EAE). Déficit motor y parálisis en los ratones sometidos a EAE normalmente se evalúan mediante una escala de puntuación clínica. Sin embargo, esta escala da solamente los datos ordinales que proporciona poca información sobre la naturaleza precisa del déficit motor. Severidad de la enfermedad EAE también ha sido evaluado por rotarod rendimiento, que proporciona una medida de coordinación motora general. Por el contrario, el análisis cinemático de la marcha de las extremidades en el plano sagital genera información muy precisa acerca de cómo se deteriora el movimiento. Para realizar este procedimiento, se colocan marcadores reflectantes en un extremidades para detectar el movimiento articular mientras que un ratón es caminar en una caminadora. Software de análisis de movimiento se utiliza para medir el movimiento de los marcadores durante la marcha. Parámetros cinemáticos de la marcha luego se derivan de los datos resultantes. Mostramos cómo estos parámetros de marcha se pueden utilizar para cuantificar la alteración movimientos de las articulaciones cadera, rodilla y tobillo en EAE. Estas técnicas pueden utilizarse para mejor entender mecanismos de la enfermedad y para identificar potenciales tratamientos para la EM y otras enfermedades neurodegenerativas que afectan la movilidad.

Introduction

Andar es una serie de movimientos repetitivos de las extremidades que utilizan para alcanzar la locomoción. Marcha se compone de ciclos de paso, que se dividen en dos fases: la fase de apoyo, que es cuando el pie se mueve hacia atrás en el suelo para propulsar el cuerpo remite; y la fase de oscilación, donde el pie es de la tierra y movimiento remite. Disturbios de la marcha son seña de identidad de muchos trastornos neurodegenerativos, como la lesión de la médula espinal (SCI), esclerosis múltiple (EM), esclerosis lateral amiotrófica (ELA), enfermedad de Parkinson (EP) y accidente cerebrovascular; modelos preclínicos de roedores de estos trastornos a menudo recapitulan su marcha respectivas deficiencias1. Los mecanismos de control básico de la locomoción en ratones han sido intensamente estudiados2,3. Además, hay modelos de ratón de muchos trastornos neurológicos humanos4. Análisis de la marcha en ratones es un enfoque atractivo para medir múltiples aspectos del déficit motor que ha sabido correlatos anatómicos. El estudio de la marcha en modelos de ratón puede proporcionar penetraciones en las bases de neuropathological del déficit locomotor en trastornos neurodegenerativos y permitir la identificación de potenciales tratamientos.

Algunas técnicas que se han utilizado para medir el paso de roedores incluyen inspección visual (por ejemplo, el Basso ratón escala5 y prueba de campo abierto6) y análisis de la marcha de la ventral plano7. Más recientemente, métodos para medir el plano sagital cinemática de los movimientos del miembro posterior han ganado popularidad porque ofrecen más información sobre la ejecución del movimiento y por lo tanto son más sensibles a cambios sutiles en el paso8, 9 , 10 , 11. técnicas de cinemática para estudiar trasera movimiento en plano sagital mientras camina en una cinta de correr9,12 se han estudiado ampliamente en el contexto de SCI, ALS, lesiones traumáticas corticales, tiempos, y La enfermedad de Huntington8,9,10,11,13,14,15,16. Por el contrario, estas técnicas han visto uso limitado en el estudio del aparato locomotor déficit para los modelos de ratón de esclerosis múltiple17.

Encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) es el modelo de ratón más comúnmente utilizado de MS18. Los dos principales métodos de inducir EAE es a través de la inoculación activa o pasiva. En EAE activo, ratones están inmunizados con antígenos de la mielina, que causa neuroinflamación mediada por células T autorreactivas y desmielinización en la médula espinal y cerebelo. EAE pasivo, por el contrario, es inducida por transferencia de células autorreactivas T de un ratón con EAE activa a un ingenuo ratón19. Como se describe en otra parte, el curso de la enfermedad y la neuropatología son influenciados por los antígenos del sistema nervioso central (SNC) y ratón cepa20,21,22,23,24 ,25. En experimentos EAE, control de ratones se inyectan con completa adyuvante de Freund (CFA) sin los antígenos de la mielina. EAE se caracteriza por parálisis que comienza con la debilidad de la cola y puede potencialmente implicar los miembros anteriores, ascendente dando por resultado parálisis y ataxia20. Hemos caracterizado recientemente cambios en la marcha en ratones C57Bl/6 sometidos a glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG35-55) 35-55-inducida por EAE. Estos estudios han demostrado ser superior que el análisis del comportamiento clásico porque las desviaciones del movimiento normal de tobillo están altamente correlacionadas con el grado de pérdida de materia blanca en la médula espinal lumbar de EAE ratones26análisis de la marcha. Por el contrario, la fuerza de la correlación entre la pérdida de materia blanca y dos otros comportamiento medidas tradicionales (puntuación clínica y rotarod) era mucho más débil26.

Aquí describimos el uso del análisis cinemático de la marcha para detectar déficit de movimiento en el plano sagital de los ratones EAE caminando en una cinta rodante. Cinco marcadores reflectantes se colocaron en una trasera para identificar el movimiento de la cadera, rodilla y articulaciones de tobillo en grabaciones de vídeo de alta velocidad. Software de análisis de movimiento se utiliza para extraer datos cinemáticos sobre excursiones conjuntas. Se discuten la utilidad de estas técnicas para cuantificar el déficit de movimiento para el modelo de35-55 MOG de EAE. Estas técnicas también son aplicables al estudio de los déficits de andar en otros modelos murinos de enfermedades neurodegenerativas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

este protocolo está de acuerdo con el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal y fue aprobado por el Comité de la Universidad de Dalhousie en animales de laboratorio.

1. construir marcadores reflectantes:

  1. utilizando una perforadora manual, perforar el número deseado de círculos pequeños de una hoja de papel reflectante. Cada animal requiere 5 marcadores para una única grabación; dos grandes y tres pequeños marcadores.
  2. Con unas tijeras finas, hacer un corte recto que se extiende desde el perímetro al centro del círculo.
  3. Retire el papel protector del marcador para revelar la superficie adhesiva. Con unas pinzas finas, sujete firmemente el marcador y enrularlo en sí mismo con el dedo para formar una forma de cono. Para hacer un pequeño marcador, enrollamiento firmemente el cono. Para hacer un marcador grande, enrollamiento del cono libremente.
  4. Usar una pistola de pegamento manual, rellenar el interior de la pistola en forma de cono con pegamento mientras que agarre la punta del cono con pinzas y adherir el marcador en una pieza plana de cartón. El pegamento evita que el marcador de contracción y flexión durante la grabación para asegurar una óptima reflexión de la luz. Cuando el pegamento esté seco (aproximadamente 10 min), saque el marcador de la cartulina con un bisturí ( figura 1A).

2. Preparar el Animal para la grabación de

  1. Anesthetize el ratón con gas isoflurano (2,5%; 2 litros/min O 2) colocando el ratón en una cámara de inducción. Una vez que el ratón está inconsciente, colóquelo en un cono de nariz colocado encima de una manta de calentamiento de agua recirculando. El propósito de la anestesia es inmovilizar el ratón para la colocación del marcador; el procedimiento no es doloroso. Por lo tanto, profundidad de la anestesia no necesita evaluarse.
  2. Aplicar un lubricante tópico en los ojos en ambos ojos.
  3. Afeitar la trasera deseada usando cortaúñas eléctricos. Comenzar en el tobillo y extenderse a la columna vertebral y la parte inferior de las costillas; Asegúrese de no piel queda como esto afectará la adherencia marcador.
    Nota: Aquí, el miembro posterior derecho se registró; sin embargo, puede utilizarse cualquier trasera.
  4. Usando un marcador permanente, indicar la ubicación de la cresta ilíaca y la articulación de la cadera. La cresta ilíaca es justo debajo de la parte inferior de las costillas y es fácilmente palpable al reunir las rodillas bajo el ratón ' cuerpo.
    Nota: Se encuentra la articulación de la cadera flexionando y extendiendo la pierna para encontrar el punto de articulación entre la pelvis y el fémur.
  5. Con finas pinzas, sujete el extremo puntiagudo de un marcador pequeño y sumerja la base en pegamento adhesivo de acción rápida, o una alternativa equivalente. Colocar el marcador en la punta del cuarto dígito y mantenga en lugar de 2-3 s permitir que el pegamento se seque. Coloque los otros dos marcadores pequeñas en la articulación metatarsofalángica y el tobillo de la misma manera ( figura 1B).
  6. Colocar marcadores grandes sobre la cresta ilíaca y cadera ( figura 1B) de la misma manera que los pequeños marcadores.
  7. Quitar el ratón de la ojiva y traslado inmediato a la sala de grabación con una jaula de transferencia. Coloque el ratón sobre la caminadora estacionaria y permitir la completa recuperación de la anestesia.

3. Grabación de la marcha

  1. previo a la grabación del ratón ' marcha s, tomar una foto de un bloque de dimensiones conocidas en la caminadora.
    Nota: Esto permitirá que los píxeles del vídeo a convertir a mediciones reales. La cámara debe colocarse aproximadamente 120 cm de la cinta.
    1. Posición de la cámara a la misma altura y el nivel de la cinta. Mantener la misma posición de cámara para las grabaciones tras la imagen de calibración.
  2. Una vez que el ratón ha recuperado de la anestesia, encienda la caminadora a una velocidad baja (5 cm/s) para dejar el ratón empezar a caminar. Asegúrese de que la dirección de la correa de cinta de correr es tal que los marcadores en el ratón estén orientadas hacia la cámara.
  3. Aumento de la caminadora la velocidad gradualmente hasta 20 cm/s; esto es la velocidad ideal para un paso consistente en ratones sanos más.
    Nota: Aunque es ideal que todos los ratones caminando a la misma velocidad, algunos pueden ser incapaces de llegar constantemente a esta velocidad.
    1. Si el ratón es incapaz de andar en 20 cm/s, reducir la velocidad según sea necesario y asegúrese de hacer una nota de esto. Reducir la velocidad de la cinta hasta que se consiguen ciclos de paso constante.
      Nota: Más adelante análisis de los datos puede ajustar por diferencias en velocidades.
  4. Comienza el video de la grabación una vez que el ratón está caminando constantemente (es decir, caminar a un ritmo constante, no cría o tejido de un lado a otro). Continuar grabando hasta que se han registrado el paso consecutivo de 8 a 12 ciclos. Para cada video, registro la velocidad de la caminadora y el lado del ratón grabado.
  5. Una vez completada, la grabación apague la cinta de correr y retomar el ratón de su jaula. Limpiar la cinta fondo entre grabaciones como olores dejados por otros ratones pueden alterar el comportamiento de los ratones entrantes. Para reducir el estrés y daño de la piel, no quitar los marcadores; permitir que los ratones eliminar por cuenta propia.

4. Análisis

  1. procesar los vídeos utilizando el software de análisis de movimiento.
    Nota: En nuestros experimentos, utiliza secuencias de comandos personalizadas diseñadas para el software de imágenes y estadístico (véase Tabla de materiales) que fueron escritos por el Dr. Nicolas Stifani. Los pasos siguientes se realizan utilizando el software de análisis de movimiento seleccionado.
    1. Extraer las coordenadas de píxel de los marcadores de los videos y con el vídeo de calibración, transformar los valores de los píxeles a centímetros y calcular los ángulos de las juntas en cada fotograma.
    2. Identificar el comienzo y final de cada ciclo de paso, obteniendo así información sobre duración de paso y longitud.
    3. Normalizar el paso a 200 bastidores normalizados, la duración del ciclo que swing y postura están representados por 100 marcos, respectivamente.
  2. Los cuadros normalizados, calcular parámetros cinemáticos para el análisis de datos utilizando el software de hoja de cálculo (véase Tabla de materiales).
    1. Para establecer el ángulo promedio de un conjunto particular, tomar la media de todos los ángulos dentro de un marco normalizado como:

      Nota: aquí la x representa el valor de ángulo en un dado normalizado marco y n representa el número de bastidor normalizado.
    2. Para establecer el rango de movimiento de una articulación particular para un ratón dado, reste el ángulo más pequeño desde el ángulo más grande en un conjunto de Marcos normalizados como sigue:
      Gama de movimiento = ángulo máximo - mínimo de ángulo.
      Aquí Nota: Ángulo máximo y mínimo de ángulo son los ángulos más grandes y más pequeño conseguidos dentro del ciclo de paso normalizada, respectivamente.
    3. Para establecer diferencia de RMS, primero restar el ángulo promedio de cada punto experimental del tiempo de la grabación de línea de base. A continuación, cuadrado cada diferencia, tomar la media de valores todo cuadrados y raíz cuadrada del promedio. La ecuación es como sigue:

      Nota: aquí representa el ángulo promedio de la línea de base de grabación; y representa el ángulo promedio de cada punto experimental del tiempo; n representa el número de fotogramas normalizados. Raíz significar cuadrado diferencia (RMS) es una medida usada para evaluar la desviación en la marcha de las grabaciones de la línea de base.
  3. Utilizar gráficos científicos y software de estadísticas para analizar y presentar los datos (véase Tabla de materiales).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figura 1 es una representación esquemática del procedimiento utilizado para el análisis de la cinemática de la marcha. Marcadores primera, reflexivos están fabricados y colocados en un ratón en 5 puntos anatómicos. Marcha entonces se registra mientras el ratón está caminando en una cinta rodante. Software de análisis de movimiento se utiliza para extraer datos cinemáticos para posterior análisis.

Figura 2A C representar el ciclo del paso de un ratón CFA de control para los ángulos de articulación cadera, rodilla y tobillo grabado en tres sesiones de grabación consecutivas espaciadas una semana aparte. El traslapo entre las formas de onda muestra desviación mínima en los ciclos de paso de las sesiones 1-3. Figura 2D -F representan el ciclo del paso de un segundo control CFA del ratón que muestra una mayor variabilidad a pie de 1-3 sesiones de grabación. Aunque los ciclos de paso se cambian de puesto a lo largo del eje y, la forma de la onda permanece constante entre grabaciones. Este nivel de variabilidad es típico ratón caminando.

Figura 3A -C representan el ciclo del paso de un ratón con EAE grabado en tres sesiones consecutivas de la grabación. Hay cambios mínimos en la marcha de la primera a la segunda sesión de grabación, pero en el tercer período de sesiones, la marcha ha sido profundamente alterado en las tres juntas. Para la cadera, un aplanamiento significativo durante el ciclo del paso ha ocurrido, lo que indica una pérdida sustancial del movimiento. La rodilla se ha convertido en peso más flexionado y menos capaces de extender y apoyar el cuerpo del animal. Movimientos en la articulación del tobillo también sustancialmente alterados. Dorsiflexión del pie y flexión plantar se retrasan durante las fases de postura (panel de verde) y swing (grupo blanco) respectivamente. Estos déficits son indicio de debilidad muscular en esta articulación como el animal esté afectado en su capacidad de levantar su pie durante la fase de oscilación y propulsar el cuerpo hacia delante durante la fase de apoyo.

Los siguientes datos presentados en la figura 4 fueron reeditados desde Fiander et al. (2017) 26 con permiso. Los datos se analizaron con medidas repetidas unidireccionales ANOVA Holm-Sidak test de comparaciones múltiples para comparar todos los puntos de tiempo a base26. La gama de ángulo promedio (Figura 4A y figura 4), movimiento (Figura 4B y figura 4E) y diferencia de RMS (figura 4 y figura 4F) se calcularon en cada momento para cuantificar la marcha déficit (n = 8 por grupo). En el presente experimento EAE, el inicio de puntuaciones clínicas era 14 DPI, que es después de la segunda semana de grabación. Ratones CFA no mostraron cambios en el ángulo de la rodilla media (Figura 4A) o diferencia de RMS (figura 4) de la rodilla, pero muestran un pequeño aumento en el rango de movimiento de rodilla [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], DPI 16 y 30 en relación con la línea de base ( Figura 4B). Este pequeño cambio puede reflejar dolor resultando de la inyección de CFA. En contraste con los animales de la CFA, hubo grandes cambios en la rodilla para animales EAE para el ángulo promedio [F(6,7) = 11.08, p < 0.0001] (figura 4), rango de movimiento [F(6,7) = 14.42, p < 0.0001] (figura 4E) y RMS diferencia (figura 4F). El ángulo promedio se redujo significativamente, lo que indica que los ratones EAE tenían sus rodillas flexionadas más durante la marcha. Esto puede ser indicativo de la debilidad de músculo, como los animales no pudieron extender las articulaciones de la rodilla para soportar su peso corporal. También fue disminuido el rango de movimiento, otra vez probablemente debido a una incapacidad de los animales para extender la articulación de la rodilla. El aumento significativo de rodilla diferencia RMS indica que los movimientos de la articulación de la rodilla en ratones EAE substancialmente diferentes de su grabación de línea de base.

Los datos en la figura 5 se analizaron unidireccionales medidas repetidas ANOVA con Holm-Sidak test de comparaciones múltiples que en comparación con valores de los parámetros marcha en puntuaciones clínicas de 0.5 - 3.5 a aquellos detectados en un marcador clínico de 0. Análisis correlacional se realizan también mediante rho de Spearman (ρ). El ángulo de la rodilla media (figura 5A), rango de movimiento (figura 5B) y diferencia de RMS (figura 5) se correlacionaron fuertemente con puntuaciones clínicas (p < 0.001). Estas correlaciones entre los movimientos articulares y el puntaje clínico clásico corroborar la validez del análisis cinemático de la marcha para evaluar déficit motor para ratones EAE. Gama de rodilla de movimiento (figura 5A) y diferencia de RMS (figura 5) fueron disminuidos perceptiblemente a partir de una puntuación clínica de 2.0 (p< 0.05). Estos resultados sugieren que los movimientos de rodilla deteriorada no contribuir a déficit motor detectado por clínicas puntuaciones inferiores a 2.0. Sin embargo, medio ángulo de la rodilla (figura 5B) disminuyó a partir de una puntuación clínica de 1.0 (p< 0.05). Esto sugiere que para el movimiento de la rodilla, ángulo promedio es el más sensible de las tres medidas.

Figure 1
Figura 1 : Esquema cinemático de marcha la grabación con los ratones. Una vez que se hacen los marcadores reflexivos, se colocan en la cresta ilíaca, cadera, tobillo, articulación metatarsofalángica y la punta del cuarto dígito. Marcha es grabada por una cámara de alta velocidad mientras el ratón está caminando en una cinta rodante. Software de análisis de movimiento se utiliza para extraer parámetros de marcha para posterior análisis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Ejemplo de formas de onda de ciclo del paso en dos ratones de control que recibieron Franco de
Los fondos blancos y verdes representan la fase de oscilación y posición, respectivamente. Ratón 1, la cadera (A), (B) de la rodilla y formas de onda ciclo paso de tobillo (C) se superponen en 3 sesiones de grabación consecutivas espaciadas una semana aparte. Para ratón 2, la cadera (D), (E) de la rodilla y tobillo (F) paso del ciclo de formas de onda se desvía ligeramente de uno a debido a la variabilidad inherente en comportamiento de caminar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3 Figura 3 : Formas de onda de ciclo paso en ratones con EAE. Los fondos blancos y verdes son fase de oscilación y posición, respectivamente, para tres sesiones de grabación consecutivas espaciadas una semana aparte. Por la 3 sesión de grabación derd , la cadera (A), (B) de la rodilla y tobillo (C) formas de onda cambian grandemente debido a la progresión de la enfermedad EAE. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4 : Ángulo promedio, rango de movimiento y significa raíz cuadrada se utilizan para analizar datos cinemáticos. Ángulo promedio, rango de movimiento y las diferencias de RMS se calcularon para cuantificar el déficit motor en ratones EAE. El ángulo de la rodilla media (A), rango de movimiento (B) y RMS (C) para los ratones de Franco seguía siendo relativamente constante. Ratones con EAE mostraron ángulo promedio de rodilla deteriorada (D), rango de movimiento (E) y RMS (F). Los datos se expresan como media ± desviación estándar; p< 0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001, la diferencia de inmunización post de día (PPP) -2; p # < 0.05, diferencia de déficit máximo. Reproducido de la referencia 26 con el permiso de los editores originales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5 . Ángulo de la rodilla media, rango de movimiento y diferencia de RMS se correlacionan con la puntuación clínica
Se realizó análisis de correlación entre tres medidas cinemáticas de los movimientos de la rodilla y puntuaciones clínicas para comparar los dos métodos. El ángulo (A) de la rodilla media, rango de movimiento (B) y diferencia de RMS (C) se correlacionaron fuertemente con puntuaciones clínicas. La gama rodilla de movimiento y diferencia de RMS disminuido partir de una puntuación clínica de la 2.0, mientras que el ángulo de la rodilla media fue reducida antes a una puntuación clínica de 1.0. Los datos se expresan como media ± desviación estándar; p< 0.05 diferencia de clínico puntuación de 0.0. Para rho de Spearman (ρ), *** p< 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

En los ratones con EAE, los dos métodos más comunes de medición de déficit motor son puntuación clínica y latencia caigan un rotarod27,28. Estas técnicas tienen varias limitaciones. Aunque conveniente y ampliamente utilizado, puntuación clínica está limitada por la obtención de datos de nivel ordinales sólo, lo que significa que no se conoce la magnitud de las diferencias entre puntuaciones clínicas. Puntuación clínica también sufre de ser incapaces de proporcionar información precisa sobre la naturaleza de los déficits motores. La prueba del rotarod mejora algunas limitaciones de puntuación clínica, pero sólo mide coordinación motora general y no medir aspectos específicos de caminar.

En comparación, análisis de la cinemática de la marcha proporciona medidas sensibles sobre aspectos específicos de locomoción, incluyendo la gama de ángulos de movimiento y medio en varias articulaciones. Se han detectado déficits sutiles en movimientos articulares cadera y rodilla para ratones EAE de35-55 MOG en DPI9, aproximadamente el 5-9 días antes del inicio de los síntomas clínicos o rotarod déficits26. Estos déficits persistieron a pesar de una remisión completa de los signos clínicos y se observaron en la ausencia de rotarod déficits26. Importante, problemas de movimientos de tobillo según lo medido por diferencia de RMS correlacionada muy bien con la pérdida de materia blanca en la médula espinal26.

Varios puntos metodológicos merecen mención específica: 1) la colocación precisa y coherente de los marcadores comunes es crucial - la articulación de la cadera y la cresta ilíaca deben ser cuidadosamente identificados por palpitación; 2) es necesario obtener grabaciones de 8-12 ciclos de paso. Promedio de estos ciclos de paso produce un ciclo de paso promedio representativos que puede analizarse más; 3) las condiciones de iluminación óptimo deben establecerse para asegurarse de que los marcadores son claramente visibles en las grabaciones. Si los marcadores no están iluminados correctamente, esto puede hacer que digitalizar los videos un laborioso proceso que muchos programas de análisis de movimiento serán incapaces de seguir los marcadores, haciendo necesario el seguimiento manual.

Una limitación adicional de esta técnica es que es mano de obra. Por ejemplo, para registrar y analizar los datos de un grupo de 10 ratones, estimamos que el proceso total dura aproximadamente 7.0-9.0 horas (h). Hacer 50 marcadores (5 por ratón) toma aproximadamente 2,0 h. ratón grabación caminar comportamiento puede hacerse solo o en un par. Trabajar solo, tarda unos 25 minutos por ratón, trabajando en un par se lleva alrededor de 10 min por ratón; por lo tanto, la grabación 10 ratones puede llevar de 1,5 h (par) a 4,0 h (individual). Por último, análisis de datos y gráficas toman aproximadamente 3,5 horas. Aunque esta técnica es mano de obra, creemos que las ideas potenciales en mecanismos de la enfermedad por análisis de la cinemática de la marcha justifica esta inversión. Tener buena correlatos conductuales de la patología de la enfermedad es útil como medidas seriales pueden ser tomadas de un ratón en forma no invasiva. Dada la casi perfecta correlación entre la cinemática del tobillo y lumbar de la médula espinal sustancia blanca pérdida26, este método puede utilizarse para determinar el perfil temporal de desmielinización y remielinización en ratones EAE en el transcurso de un experimento, lo que permite recuperación para ser evaluados.

Análisis de la marcha se complica con parálisis severa que restringe el movimiento de los miembros posteriores. Sin embargo, incluso gravemente paralizado ratones (puntaje clínico > 3.0) a menudo son capaces de andar hasta cierto punto. En estos casos, los miembros anteriores se utilizan para tirar del animal hacia adelante, y algún miembro posterior movimiento ocurre que puede ser medida por análisis de la cinemática de la marcha. Incluso en estos casos severos, es posible medir la recuperación de la función del miembro posterior en el tiempo. Sólo en casos muy severos (20% de animales con puntuaciones clínicas > 3.5 en la enfermedad de pico, DPI 16-23) hemos sido incapaces de obtener útiles grabaciones del movimiento del miembro posterior. Sin embargo, estos animales suelen recuperan alguna función trasera de 30 PPP, permitiendo grabaciones significativas a obtenerse en ese momento.

Una futura aplicación de esta técnica es acompañada de datos cinemáticos las grabaciones electromiográficas simultánea de la trasera durante la locomoción. Esta técnica se ha hecho en modelos de ratón de ALS y ciencia y se puede utilizar para aclarar la relación entre la actividad muscular, inervación y la marcha. Esta técnica también puede acoplarse con más blanco modelos de MS y desmielinización que puede producir más déficits de marcha discretas, incluyendo focal EAE modelos29,30 o31de desmielinización inducida por cuprizone.

Las técnicas que hemos descrito para la medición de movimientos articulares en ratones EAE pueden aplicarse también a otros trastornos que afectan la marcha. Distintos cambios en la marcha se han divulgado para los modelos de ratón de PD, SCI, ALS y carrera8,9,10,11,13,14. Por ejemplo, modelos de roedores de la EP se caracterizan por la longitud de zancada reducido y velocidad, dando por resultado una cadencia elevada para mantener la poca velocidad32. Análisis de la cinemática de la marcha por lo tanto proporciona potentes herramientas conductuales para aclarar mecanismos de la enfermedad e identificar posibles tratamientos con estos modelos.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Nos gustaría reconocer Sid Chedrawe para su asistencia técnica con película. Este trabajo fue apoyado por fondos de la MS Society de Canadá (EGID 2983).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon Nikon D750 Used to film the video
Reflective tape B&L Engineering MKR-Tape-2
Fine scissors Fine Science Tools 15023-10
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Glue gun Craftsmart E231647
scalpel handle #4 Roboz R5-9884
Scalpel Blade No.10 Feather 2020-12
C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Anesthetic machine EZ Anesthesia EZ-AF9000 Auto Flow System
Recirculating water heating blanket Androit HTP-1500
topical eye lubricant Refresh DIN00210889
Shaver Oster 78997-010
High speed camera Fastec Fastec IL3-100
High power light Smith Victor Corporation Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts)
Light Stand Promaster LS1
Treadmill Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne
Microsoft Excel 2016 Microsoft Version 2016
KinemaJ Nicolas Stifani This is a script generated for use with ImageJ
KinemaR Nicolas Stifani This is a script generated for use with Rstudio
Vicon Motus Vicon Motus Version 9.00
GraphPad Prism GraphPad Version 6.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28, (11), 1469-1473 (2013).
  2. Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17, (4), 224-238 (2016).
  3. Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16877-16882 (2014).
  4. Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1, (4), 215-224 (2002).
  5. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23, (5), 635-659 (2006).
  6. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
  7. Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206, (1), 7-14 (2012).
  8. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
  9. Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23, (36), 11411-11419 (2003).
  10. Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230, (2), 280-290 (2011).
  11. Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7, (9), 701-708 (2010).
  12. Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148, (1), 36-42 (2005).
  13. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33, (3), 330-338 (2013).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111, (3), 694-703 (2014).
  15. Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211, (1), 1-10 (2010).
  16. Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33, (18), 1667-1684 (2016).
  17. de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
  18. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60, (1), 12-21 (2006).
  19. Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59, (2), 112-128 (2009).
  20. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  21. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
  22. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  23. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  24. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1, (4), 1952-1960 (2006).
  25. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1, (4), 1810-1819 (2006).
  26. Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
  27. Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199, (1-2), 83-93 (2008).
  28. van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  29. Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58, (13), 1523-1531 (2010).
  30. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, (Pt 8), 1972-1983 (2006).
  31. Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169, (3), 205-213 (2007).
  32. Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89, (10), 1698-1706 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics