Author Produced

Sagittale flyet kinematiske ganganalyse hos C57BL/6 mus udsat for MOG35-55 induceret eksperimentelle Autoimmune Encephalomyelitis

* These authors contributed equally
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Kinematiske ganganalyse i sagittale flyet giver meget præcise oplysninger om, hvordan flytning udføres. Vi beskriver anvendelsen af disse teknikker til at identificere gangart underskud for mus underkastes autoimmun-medieret demyelinering. Disse metoder kan også bruges til at karakterisere gangart underskud for andre musemodeller med nedsat bevægelsesevne.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Fiander, M. D., Chedrawe, M. A., Lamport, A. C., Akay, T., Robertson, G. S. Sagittal Plane Kinematic Gait Analysis in C57BL/6 Mice Subjected to MOG35-55 Induced Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. J. Vis. Exp. (129), e56032, doi:10.3791/56032 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kinematiske ganganalyse i sagittale flyet er ofte blevet brugt til at karakterisere motor underskud i multipel sklerose (MS). Vi beskriver anvendelsen af disse teknikker til at identificere gangart underskud i en musemodel af MS, kendt som eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE). Lammelse og motor underskud i mus udsættes for EAE vurderes typisk ved hjælp af en klinisk scoring skala. Dog, denne skala udbytter kun ordinal data, der indeholder lidt information om den nøjagtige art af de motoriske underskud. EAE sygdommens sværhedsgrad er også blevet vurderet af rotarod ydeevne, som giver en foranstaltning af generel motoriske koordination. Derimod genererer kinematiske gangart analyse af hind lemmer i sagittale flyet meget præcise oplysninger om, hvordan bevægelse er nedsat. Hvis du vil udføre denne procedure, er reflekterende markører placeret på en hind lemmer til at opdage fælles bevægelse mens musen gå på et løbebånd. Bevægelse analyse software bruges til at måle bevægelse af markører under gang. Kinematiske gangart parametre udledes derefter de resulterende data. Vi viser, hvordan disse gangart parametre kan bruges til at kvantificere nedsat bevægelser i hofte, knæ og ankel leddene i EAE. Disse teknikker kan bruges til bedre at forstå sygdomsmekanismer og identificere potentielle behandlinger for MS og andre neurodegenerative sygdomme, der forringer mobilitet.

Introduction

Gangart er en serie af gentagne bevægelser af arme og ben bruges til at opnå locomotion. Gangart består af trin cyklusser, der er opdelt i to faser: den holdning fase, som er, når foden går baglæns på jorden til at drive kroppen frem; og swing fase, hvor foden er slukket på jorden og bevæger sig fremad. Forstyrrelser af gangart er kendetegnende elementer i mange neurodegenerative sygdomme, såsom rygmarvsskade (SCI), multipel sklerose (MS), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), Parkinsons sygdom (PD) og slagtilfælde; prækliniske gnavere modeller af disse lidelser sammenfatte ofte deres respektive gangart funktionshæmninger1. De grundlæggende kontrolmekanismer for bevægelse i mus har været intensivt undersøgt2,3. Derudover er der musemodeller af mange menneskelige neurologiske4. Ganganalyse hos mus er derfor et attraktivt tilgang til at måle flere aspekter af motor underskud, der har kendt anatomiske korrelerer. Studiet af gangart i musemodeller kan give indsigt i det neuropatologiske grundlag af bevægeapparatet underskud i neurodegenerative sygdomme, og identifikation af mulige behandlinger.

Nogle teknikker, der er blevet brugt til at måle gangart i gnavere omfatter besigtigelse (fx, Basso mus skala5 og open field test6) og analyse af gangart fra den ventrale fly7. Mere nylig, metoder til at måle sagittale flyet kinematik hindlimb bevægelser har vundet popularitet, fordi de giver yderligere oplysninger om udførelse af bevægelse og er derfor mere følsomme over for subtile ændringer i gangart8, 9 , 10 , 11. kinematiske teknikker udviklet for at studere hindlimb bevægelse i sagittale flyet mens du går på et løbebånd9,12 er blevet grundigt undersøgt i forbindelse med SCI, ALS, traumatiske kortikale skader, slagtilfælde, og Huntington's chorea8,9,10,11,13,14,15,16. Derimod har disse teknikker set begrænset anvendelse i studiet af bevægeapparatet underskud for musemodeller af multipel sklerose17.

Eksperimentelle autoimmune encephalomyelitis (EAE) er den mest almindeligt anvendte musemodel af MS18. De to vigtigste metoder til inducerende EAE er via aktiv eller passiv podning. I aktive EAE, er mus immuniseret med myelin antigener, forårsager autoreactive T-celle-medieret neuroinflammation og demyelinering i rygmarven og lillehjernen. Passiv EAE, på den anden side er foranlediget ved at overføre autoreactive T celler fra en mus med aktive EAE til en naiv mus19. Som beskrevet andetsteds, sygdomsforløb og neuropatologiske er påvirket af det centrale nervesystem (CNS) antigen og mus stamme20,21,22,23,24 ,25. I EAE eksperimenter, er kontrol mus indsprøjtet med komplet Freund's adjuvans (CFA) uden myelin antigen. EAE er karakteriseret ved stigende lammelse, som begynder med halen svaghed og kan potentielt indebærer forbens, medførende ataksi og lammelse20. Vi har for nylig karakteriseret gangart ændringer i C57Bl/6 mus underkastes myelin oligodendrocyte glykoprotein 35-55 (MOG35-55)-induceret EAE. Disse undersøgelser har vist gangart analyse at være overlegen end klassisk adfærdsanalyse fordi afvigelser fra normale ankel bevægelse er stærkt korreleret med graden af hvid substans tab i lumbal rygmarv fra EAE mus26. Derimod var styrken af sammenhængen mellem hvide substans tab og to andre traditionelle adfærdsmæssige foranstaltninger (klinisk scoring og rotarod) meget svagere26.

Her beskrives brug af kinematiske gangart analyse til at opdage bevægelse underskud i sagittale flyet af EAE mus gå på et løbebånd. Fem reflekterende markører blev placeret på en hindlimb til at identificere bevægelse af hofte-, knæ- og ankelled i high-speed video optagelser. Bevægelse analyse software blev brugt til at udtrække kinematiske data om fælles udflugter. Nytten af disse teknikker til at kvantificere bevægelse underskud for MOG35-55 model af EAE diskuteres. Disse teknikker anvendes også til undersøgelse af gangart underskud i andre musemodeller for neurodegenerative lidelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

denne protokol i overensstemmelse med den canadiske Rådet om dyrs pleje retningslinjer og blev godkendt af Regionsudvalget Dalhousie University på laboratoriedyr.

1. konstruere reflekterende markører:

  1. ved hjælp af en håndholdt hul punch, punch det ønskede antal små cirkler fra en reflekterende ark. Hvert dyr kræver 5 markører for en enkelt optagelse; to store og tre små markører.
  2. Bruger fine saks, gøre et lige snit, der strækker sig fra omkredsen til midten af cirklen.
  3. Fjerne papiret opbakning af markør til at afsløre den klæbende overflade. Bruger fine pincet, greb markøren fast og krølle det i sig selv ved hjælp af din finger til at danne en konisk. For at gøre en lille markør, curl kegle stramt. For at gøre en stor markør, curl kegle løst.
  4. Ved hjælp af en håndholdt limpistol, fylde den kegle-formet markør med lim mens gribende spidsen af kegle med pincet og overholde markør til et fladt stykke pap. Limen vil forhindre markør fra kollapse og bøjning under optagelse for at sikre optimal refleksion af lys. Når limen er tør (ca. 10 min.), fjerner markøren fra pap med en skalpel ( figur 1A).

2. Forberede optagelse dyret

  1. Anesthetize mus med isofluran gas (2,5%; 2 liter/min O 2) ved at placere musen i en induktion kammer. Når musen er bevidstløs, læg det i en næsen kegle placeret oven på en recirkulerende vand varme tæppe. Formålet med anesthetization er at immobilisere musen til markør placering; proceduren er ikke smertefuld. Derfor, dybde af anæstesi behøver ikke at være vurderet.
  2. Gælde begge øjne et aktuelt øje smøremiddel.
  3. Barbere det ønskede hindlimb med elektrisk trimming. Begynder ved anklen og forlænge rygsøjlen og bunden af ribberne; sikre, at ingen pels er tilbage, da dette vil forringe markør vedhæftning.
    Bemærk: Her, den rigtige hindlimb var optaget; men enten hindlimb kan bruges.
  4. Ved hjælp af en permanent markør, angive placeringen af crista crest og hofteled. Den crista crest er lige under bunden af ribbenene og er let håndgribelig ved at bringe knæ under musen ' s krop.
    Bemærk: Hofteleddet kan findes ved at bøje og udvide ben for at finde punktet, artikulation mellem bækken og lårben.
  5. Brug af fine pincet, forstå den spidse ende af en lille markør og dyppe bunden i hurtigt virkende klæbende lim, eller et tilsvarende alternativ. Placer markøren på spidsen af det fjerde ciffer og holde på plads for 2-3 s at tillade lim til at tørre. Placer de andre to små markører på metatarsofalangealled og ankel på samme måde ( figur 1B).
  6. Sted store markører på crista crest og hofteled ( figur 1B) på samme måde som de små markører.
  7. Fjerne musen fra næsen kegle og straks overføre til optagelse rum ved hjælp af en overførsel bur. Placer musen på den stationære løbebånd og giver mulighed for fuld helbredelse fra anæstesi.

3. Gangart optagelse

  1. forudgående til optagelse musen ' s gangart, tage et billede af en kalibrering blok med kendte dimensioner på løbebåndet.
    Bemærk: Dette vil give mulighed for pixel i videoen at blive konverteret til rigtige målinger. Kameraet skal placeres ca 120 cm fra løbebånd.
    1. Stilling kameraet på samme højde og niveau som løbebånd. Opretholde den samme kamera holdning til optagelserne efter kalibrering billedet.
  2. Når musen er fuldt genoprettet efter anæstesi, drej løbebånd til en lav hastighed (5 cm/s) til at lade musen begynde at gå. Sikre at løbebånd bælte retning er sådan, markørerne på musen vender mod kameraet.
  3. Stigning løbebåndet hastighed gradvist op til 20 cm/s, det er den ideelle hastighed for en konsekvent gangart i de fleste sundt mus.
    Bemærk: Selvom det er ideelt at have alle mus gå på den samme hastighed, kan nogle være afskåret konsekvent nå denne hastighed.
    1. Hvis musen er i stand til at gå på 20 cm/s, reducere hastigheden som nødvendigt og sørg for at notere dette. Reducere hastighed på løbebåndet indtil konsekvente skridt cyklusser er nået.
      Bemærk: Nyere dataanalyse kan justeres for forskelle i hastigheder.
  4. Begynde optagelsen af videoen, når musen går støt (dvs., går i en konsekvent tempo, ikke opdræt eller vævning side til side). Fortsætte optagelsen indtil 8 til 12 på hinanden følgende trin cykler er blevet registreret. For hver video, optage hastighed på løbebåndet og siden af musen indspillede.
  5. Når optagelsen er færdig, slukker løbebånd og returnere musen til sit bur. Ren løbebånd grundigt mellem optagelser som dufte efterladt af andre mus kan ændre funktionsmåden for indgående mus. For at reducere stress og hudskader, Fjern ikke markørerne; Tillad musene at fjerne dem på deres egen.

4. Analyse

  1. behandle videoer ved hjælp af motion-analysesoftwaren.
    Bemærk: I vores eksperimenter, vi brugte brugerdefinerede scripts udviklet til billedbehandling og statistisk software (Se Tabel af materialer) som blev skrevet af Dr. Nicolas Stifani. Følgende trin udføres ved hjælp af den valgte bevægelse analyse software.
    1. Uddrag pixelkoordinater af markører fra videoerne, og ved hjælp af kalibrering video, omdanne pixelværdier til centimeter og beregne de fælles vinkler på hver ramme.
    2. Identificere i begyndelsen og slutningen af hvert trin cyklus, derved at indhente oplysninger om trin varighed og længde.
    3. Normalisere trinnet cyklus varighed til 200 normaliserede rammer, således at swing og holdning er repræsenteret ved 100 frames, henholdsvis.
  2. Ved hjælp af de normaliserede rammer, beregne kinematiske parametre for dataanalyse ved hjælp af regneark software (Se Tabel af materialer).
    1. Til at fastslå den gennemsnitlige vinkel på en bestemt fælles, tager gennemsnittet af alle vinkler i en normaliseret ramme som:

      Note: her x repræsenterer værdien vinkel på et givet normaliseret ramme, og n repræsenterer den normaliserede billednummer.
    2. At etablere vifte af bevægelse af en bestemt fælles for en given musen, trække den mindste vinkel fra den største vinkel i et sæt af normaliserede rammer som følger:
      Vifte af bevægelse = vinkel maksimale - vinkel minimum.
      Bemærk: Her vinkel maksimale og vinkel minimum er de største og mindste vinkler opnået inden for den normaliserede trin cyklus, hhv.
    3. At etablere RMS forskel, først trække hvert eksperimentelle tidspunkt gennemsnitlige vinkel fra den oprindelige optagelse. Næste, firkantet hver forskel, tage gennemsnittet af alle kvadrerede værdier og kvadratroden middelværdien. Ligningen er som følger:

      Note: her repræsenterer den gennemsnitlige vinkel fra den oprindelige optagelse; y repræsenterer den gennemsnitlige vinkel fra hvert eksperimentelle tidspunkt; n og repræsenterer antallet normaliserede rammer. Roden betyde squared (RMS) forskellen er en måling, anvendes til at evaluere afvigelse i gangart fra baseline optagelser.
  3. Bruge videnskabelige graftegning og statistik software til at analysere og præsentere data (Se Tabel af materialer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 er en skematisk fremstilling af den procedure, der anvendes til kinematiske ganganalyse. Første, reflekterende markører er lavet og placeret på en mus på 5 anatomiske punkter. Gangart er indspillet mens musen gå på et løbebånd. Bevægelse analyse software bruges til at udtrække kinematiske data til efterfølgende analyse.

Figur 2A -C repræsenterer trin cyklus kontrol CFA musen for hofte, knæ og ankel fælles vinkler indspillet i tre på hinanden følgende indspilningerne fordelt en uge fra hinanden. Overlapning mellem kurveformer viser minimal afvigelse i trin cykler fra sessioner 1-3. Figur 2D -F repræsenterer trin cyklus af en anden kontrol CFA mus, vises større gåtur variation fra optagelse sessioner 1-3. Selv om skridt cyklusserne er flyttes langs y-aksen, forbliver form af kurveformer konsistent mellem optagelser. Denne variation er typisk for mus gå.

Figur 3A -C repræsenterer trin cyklus af en mus med EAE optaget på tre på hinanden følgende indspilningerne. Der er minimale ændringer i gangart fra først til den anden optagelse session, men ved den tredje samling, gangart er blevet dybt ændret på alle tre led. For hoften opstod en betydelig udfladning konjunkturforløbet trin, viser et betydeligt tab af bevægelse. Knæet er blevet mere bøjet og mindre i stand til at udvide og støtte dyrets krop vægt. Bevægelser på fodleddet var også væsentligt ændret. Foden dorsiflexion og plantar fleksion er forsinket i løbet af swing (hvid panel) og holdning (grøn panel) faser, henholdsvis. Disse mangler er vejledende for muskelsvaghed på denne fælles som dyret er forringet i sin evne til at både øge sin fod i swing fase, og drive kroppen frem i løbet af holdning fase.

Følgende data præsenteret i figur 4 blev genudgivet fra Fiander et al. (2017) 26 med tilladelse. Dataene blev analyseret ved hjælp af en-vejs gentagne foranstaltninger ANOVA med Holm-Sidak flere sammenligninger test for at sammenligne alle tidspunkter til baseline26. Den gennemsnitlige vinkel (figur 4A og figur 4D), vifte af bevægelse (figur 4B og figur 4E) og RMS forskel (figur 4 c og figur 4F) blev beregnet for hver tidspunkt at kvantificere gangart underskud (n = 8 pr. gruppe). I den nuværende EAE eksperiment var udbrud af kliniske scoringer DPI 14, som er efter den anden uge af optagelse. CFA mus viste ingen ændring i gennemsnitlige knæ vinkel (figur 4A) eller knæ RMS forskel (figur 4 c), men udviser en lille stigning i knæet vifte af bevægelse [F(2,7) = 5.871, p = 0.0083], på både DPI 16 og 30 i forhold til baseline ( Figur 4B). Denne lille ændring kan afspejle smerter som følge af CFA injektion. I modsætning til dyrenes CFA var der store ændringer på knæet fælles for EAE dyr for den gennemsnitlige vinkel [F(6,7) = 11,08, p < 0,0001] (figur 4D), vifte af bevægelse [F(6,7) = 14.42, p < 0,0001] (figur 4E) og RMS forskel (figur 4F). Den gennemsnitlige vinkel blev væsentligt reduceret, der angiver, at EAE mus havde deres knæ mere bøjet under gang. Dette kan være tegn på muskelsvaghed, som dyrene ikke var i stand til at udvide deres knæled til at understøtte deres kropsvægt. Vifte af bevægelse også faldt, igen sandsynligvis på grund af en manglende evne til dyrene at udvide knæleddet. Den betydelige stigning i knæet RMS forskel angiver, at bevægelser af knæleddet i EAE mus var markant forskellige fra deres baseline optagelse.

Dataene i figur 5 blev analyseret ved hjælp af en-vejs gentagne foranstaltninger ANAVA med Holm-Sidak flere sammenligninger test, som sammenlignede gangart parameterværdier på kliniske scoringer på 0,5 - 3,5 til dem, der registreres på en klinisk score på 0. Correlational analyse blev også udført ved hjælp af Spearman rho (Rho). Den gennemsnitlige knæ vinkel (figur 5A), vifte af bevægelse (figur 5B) og RMS forskel (figur 5 c) var stærkt korreleret med klinisk scores (p < 0,001). Disse korrelationer mellem fælles bevægelser og klassisk klinisk scoring underbygge gyldigheden af kinematiske gangart analyse til at vurdere motor underskud for EAE mus. Knæ vifte af bevægelse (figur 5A) og RMS forskel (figur 5 c) var faldt betydeligt, begynder på en klinisk score 2.0 (p< 0,05). Disse resultater tyder på, at nedsat knæ bevægelser ikke bidrager til motor underskud opdaget af kliniske scorer lavere end 2,0. Men knæet gennemsnitlige vinkel (figur 5B) faldt begynder på en klinisk score på 1,0 (p< 0,05). Dette tyder på, at for knæ bevægelse, gennemsnitlige vinkel er den mest følsomme af de tre foranstaltninger.

Figure 1
Figur 1 : Skematisk for kinematiske gangart optagelse med mus. Når reflekterende markører er foretaget, er de placeret på crista crest, hofteled, ankel, metatarsofalangealled og spidsen af det fjerde ciffer. Gangart er optaget af et højhastighedskamera mens musen gå på et løbebånd. Bevægelse analyse software bruges til at udtrække gangart parametre til efterfølgende analyse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Eksempel på trin cyklus bølgeformer i to kontrol mus, der fik CFA
De hvide og grønne baggrunde repræsenterer swing og holdning fasen, henholdsvis. For musen 1 overlappe hofte (A), knæ (B) og ankel (C) trin cyklus bølgeformer hinanden i hele 3 på hinanden følgende indspilningerne fordelt en uge fra hinanden. For musen 2 cyklus hofte (D), knæ (E) og ankel (F) trin bølgeformer afviger lidt fra hinanden på grund af den iboende variation i walking adfærd. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Skridt cyklus bølgeformer i mus med EAE. De hvide og grønne baggrunde repræsenterer swing og holdning fase, henholdsvis, for tre på hinanden følgende indspilningerne fordelt en uge fra hinanden. Af de 3rd optagelse session, hofte (A), knæ (B) og ankel er (C) bølgeformer kraftigt ændret på grund af EAE sygdomsprogression. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Gennemsnitlige vinkel, vifte af bevægelse og root mean squared bruges til at analysere kinematiske data. Gennemsnitlige vinkel, vifte af bevægelse og RMS forskelle blev beregnet til at kvantificere motor underskud i EAE mus. Den gennemsnitlige knæ vinkel (A), vifte af bevægelse (B), og RMS (C) for CFA mus forblev forholdsvis konstant. Mus med EAE viste nedsat knæ gennemsnitlige vinkel (D), vifte af bevægelse (E) og RMS (F). Data er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse; p< 0,05, ** p< 0,01, *** p< 0,001, forskel fra dag post immunisering (DPI) -2; # p < 0,05, forskel fra peak underskud. Genoptrykt fra reference 26 med tilladelse fra oprindelige udgivere. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Gennemsnitlige knæ vinkel, vifte af bevægelse og RMS forskellen korrelerer med kliniske score
Korrelation analyse blev udført mellem tre kinematiske foranstaltninger af knæet bevægelser og kliniske score til at sammenligne de to metoder. Den gennemsnitlige knæ vinkel (A), vifte af bevægelse (B), og RMS forskel (C) var stærkt korreleret med kliniske scoringer. Knæ vifte af bevægelse og RMS forskellen faldt begyndelsen på en klinisk score 2.0, mens gennemsnitlige knæ vinkel var reduceret tidligere til en klinisk score på 1,0. Data er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse; p< 0,05 forskel fra kliniske point 0.0. For Spearman rho (Rho), *** p< 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I mus med EAE, de to mest almindelige metoder til måling af motor underskud er klinisk scoring og falde ventetid fra en rotarod27,28. Disse teknikker har flere begrænsninger. Selvom bekvemme og udbredte, er klinisk scoring begrænset af giver kun ordinal niveau data, hvilket betyder, at omfanget af forskellene mellem kliniske scoringer ikke er kendt. Klinisk scoring lider også af at være ude af stand til at give præcise oplysninger om karakteren af de motoriske underskud. Rotarod test forbedrer visse begrænsninger af klinisk scoring, men kun måler generelle motor koordinering og måle ikke specifikke aspekter af at gå.

Til sammenligning, giver kinematiske gangart analyse følsomme foranstaltninger om specifikke aspekter af locomotion, herunder vifte af bevægelse og den gennemsnitlige vinkler på forskellige samlinger. Subtile underskud i hofte og knæ fælles bevægelser for MOG35-55 EAE mus er blevet påvist ved DPI9, ca. 5-9 dage før starten af kliniske symptomer eller rotarod underskud26. Disse underskud fortsatte trods en komplet remission af kliniske tegn og blev observeret i mangel af rotarod underskud26. Vigtigere, nedsat ankel bevægelser som målt ved RMS forskellen korreleret med hvide substans tab i rygmarven26.

Flere metodologiske punkter fortjener særlig omtale: 1) nøjagtig og ensartet placering af de fælles markører er afgørende - hofteleddet og hoftebenskammen skal nøje identificeres ved hjertebanken; 2) det er nødvendigt at få optagelser fra 8-12 trin cyklusser. Disse trin cyklusser i gennemsnit producerer en repræsentativ gennemsnitlig trin cyklus, der kan analyseres yderligere; 3) optimale lysforhold skal være etableret til at sikre, at mærkerne er klart synlig i optagelserne. Hvis markører ikke er belyst ordentligt, kan dette gøre digitalisering videoer en møjsommelig proces, som mange bevægelse analyse programmer vil være i stand til at spore de markører, nødvendiggør manuel sporing.

En yderligere begrænsning af denne teknik er, at det er arbejdskraftintensive. For eksempel, til at optage og analysere data fra en gruppe af 10 mus, anslår vi den samlede proces tager ca 7.0-9.0 timer (h). At gøre 50 markører (5 per mus) tager omkring 2.0 h. kan optagelse mus gå opførsel gøres enten alene eller i et par. Arbejde alene, tager det ca. 25 min. pr. musen, mens arbejder i et par tager omkring 10 min pr. mus; Derfor, registrering 10 mus kan tage fra 1,5 h (par) til 4.0 h (solo). Endelig, dataanalyse og graftegning tage ca 3,5 t. Selv om denne teknik er arbejdsintensive, føler vi, at de potentielle indsigt i sygdomsmekanismer tilbydes af kinematiske gangart analyse retfærdiggør denne investering. Har god adfærdsmæssige korrelerer sygdom patologi er nyttige som serielle målinger kan tages fra en levende mus ikke-invasivt. Da den i nærheden af perfekt korrelation mellem ankel kinematik og lumbal rygmarven hvide substans tab26, denne metode kan bruges til at fastslå den tidsmæssige profil af demyelinering og remyelination i EAE mus i løbet af et eksperiment, så Recovery skal vurderes.

Gangart analyse kompliceres af svær lammelse, der begrænser bevægelsen af hindlimbs. Dog selv alvorligt lammet mus (kliniske score > 3.0) er ofte i stand til at gå til en vis grad. I disse tilfælde forbens er brugt til at trække dyret frem, og nogle hindlimb bevægelse forekommer som kan måles ved kinematiske ganganalyse. Selv i disse svære tilfælde er det stadig muligt at måle inddrivelse af hindlimb funktion over tid. Kun i meget alvorlige tilfælde (20% af dyr med kliniske scoringer > 3.5 på peak sygdom, DPI 16-23) har vi kunnet opnå nyttige optagelser af hindlimb bevægelse. Alligevel, disse dyr normalt genvinde nogle hindlimb funktion af DPI 30, giver mulighed for meningsfuld optagelser der skal indhentes på dette tidspunkt.

En fremtidig anvendelse af denne teknik kobling kinematiske data med samtidige Elektromyografi optagelser af hindlimb under bevægelse. Denne teknik er blevet gjort i musemodeller af ALS og SCI og kan bruges til at belyse forholdet mellem muskel aktivitet, innervation og gangart. Denne teknik kunne også kobles til mere målrettet modeller af MS og demyelinering, der kan producere mere diskrete gangart underskud, herunder fokale EAE modeller29,30 eller cuprizone-induceret demyelinering31.

De teknikker, vi har beskrevet for måling af fælles bevægelser i EAE mus kan også anvendes på andre lidelser, der forringer gangart. Forskellige ændringer i gangart er blevet rapporteret til musemodeller af PD, SCI, ALS og slagtilfælde8,9,10,11,13,14. For eksempel, er gnavere modeller af PD karakteriseret ved nedsat skridtlængde og hastighed, hvilket resulterer i forhøjede kadence at opretholde walking hastighed32. Kinematiske gangart analyse giver derfor magtfulde adfærdsmæssige værktøjer til at belyse sygdomsmekanismer og identificere potentielle behandlinger ved hjælp af disse modeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at oplyse.

Acknowledgments

Vi vil gerne anerkende Sid Chedrawe for sin tekniske bistand med optagelserne. Dette arbejde blev støttet af midler fra MS Society of Canada (Gid 2983).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Camera Nikon Nikon D750 Used to film the video
Reflective tape B&L Engineering MKR-Tape-2
Fine scissors Fine Science Tools 15023-10
Forceps Fine Science Tools 11252-20
Glue gun Craftsmart E231647
scalpel handle #4 Roboz R5-9884
Scalpel Blade No.10 Feather 2020-12
C57BL/6 mice Charles River Laboratories
Anesthetic machine EZ Anesthesia EZ-AF9000 Auto Flow System
Recirculating water heating blanket Androit HTP-1500
topical eye lubricant Refresh DIN00210889
Shaver Oster 78997-010
High speed camera Fastec Fastec IL3-100
High power light Smith Victor Corporation Model 700 SG (600 Watt quartz light, 120 Volts)
Light Stand Promaster LS1
Treadmill Custom built at the Zoological Institute, University of Cologne
Microsoft Excel 2016 Microsoft Version 2016
KinemaJ Nicolas Stifani This is a script generated for use with ImageJ
KinemaR Nicolas Stifani This is a script generated for use with Rstudio
Vicon Motus Vicon Motus Version 9.00
GraphPad Prism GraphPad Version 6.00

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Giladi, N., Horak, F. B., Hausdorff, J. M. Classification of gait disturbances: distinguishing between continuous and episodic changes. Mov Disord. 28, (11), 1469-1473 (2013).
  2. Kiehn, O. Decoding the organization of spinal circuits that control locomotion. Nat Rev Neurosci. 17, (4), 224-238 (2016).
  3. Akay, T., Tourtellotte, W. G., Arber, S., Jessell, T. M. Degradation of mouse locomotor pattern in the absence of proprioceptive sensory feedback. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, (47), 16877-16882 (2014).
  4. Hafezparast, M., Ahmad-Annuar, A., Wood, N. W., Tabrizi, S. J., Fisher, E. M. Mouse models for neurological disease. Lancet Neurol. 1, (4), 215-224 (2002).
  5. Basso, D. M., et al. Basso Mouse Scale for locomotion detects differences in recovery after spinal cord injury in five common mouse strains. J Neurotrauma. 23, (5), 635-659 (2006).
  6. Tatem, K. S., et al. Behavioral and locomotor measurements using an open field activity monitoring system for skeletal muscle diseases. J Vis Exp. (91), e51785 (2014).
  7. Hetze, S., Romer, C., Teufelhart, C., Meisel, A., Engel, O. Gait analysis as a method for assessing neurological outcome in a mouse model of stroke. J Neurosci Methods. 206, (1), 7-14 (2012).
  8. Preisig, D. F., et al. High-speed video gait analysis reveals early and characteristic locomotor phenotypes in mouse models of neurodegenerative movement disorders. Behav Brain Res. 311, 340-353 (2016).
  9. Leblond, H., L'Esperance, M., Orsal, D., Rossignol, S. Treadmill locomotion in the intact and spinal mouse. J Neurosci. 23, (36), 11411-11419 (2003).
  10. Ueno, M., Yamashita, T. Kinematic analyses reveal impaired locomotion following injury of the motor cortex in mice. Exp Neurol. 230, (2), 280-290 (2011).
  11. Zorner, B., et al. Profiling locomotor recovery: comprehensive quantification of impairments after CNS damage in rodents. Nat Methods. 7, (9), 701-708 (2010).
  12. Pearson, K. G., Acharya, H., Fouad, K. A new electrode configuration for recording electromyographic activity in behaving mice. J Neurosci Methods. 148, (1), 36-42 (2005).
  13. Balkaya, M., Krober, J. M., Rex, A., Endres, M. Assessing post-stroke behavior in mouse models of focal ischemia. J Cereb Blood Flow Metab. 33, (3), 330-338 (2013).
  14. Akay, T. Long-term measurement of muscle denervation and locomotor behavior in individual wild-type and ALS model mice. J Neurophysiol. 111, (3), 694-703 (2014).
  15. Taylor, T. N., Greene, J. G., Miller, G. W. Behavioral phenotyping of mouse models of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 211, (1), 1-10 (2010).
  16. Chen, K., et al. Differential Histopathological and Behavioral Outcomes Eight Weeks after Rat Spinal Cord Injury by Contusion, Dislocation, and Distraction Mechanisms. J Neurotrauma. 33, (18), 1667-1684 (2016).
  17. de Bruin, N. M., et al. Multiple rodent models and behavioral measures reveal unexpected responses to FTY720 and DMF in experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 300, 160-174 (2016).
  18. Steinman, L., Zamvil, S. S. How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis. Ann Neurol. 60, (1), 12-21 (2006).
  19. Emerson, M. R., Gallagher, R. J., Marquis, J. G., LeVine, S. M. Enhancing the ability of experimental autoimmune encephalomyelitis to serve as a more rigorous model of multiple sclerosis through refinement of the experimental design. Comp Med. 59, (2), 112-128 (2009).
  20. Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
  21. Beeton, C., Garcia, A., Chandy, K. G. Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis. J Vis Exp. (5), e224 (2007).
  22. Barthelmes, J., et al. Induction of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis in Mice and Evaluation of the Disease-dependent Distribution of Immune Cells in Various Tissues. J Vis Exp. (111), (2016).
  23. Shaw, M. K., Zhao, X. Q., Tse, H. Y. Overcoming unresponsiveness in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) resistant mouse strains by adoptive transfer and antigenic challenge. J Vis Exp. (62), e3778 (2012).
  24. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Passive induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1, (4), 1952-1960 (2006).
  25. Stromnes, I. M., Goverman, J. M. Active induction of experimental allergic encephalomyelitis. Nat Protoc. 1, (4), 1810-1819 (2006).
  26. Fiander, M. D., Stifani, N., Nichols, M., Akay, T., Robertson, G. S. Kinematic gait parameters are highly sensitive measures of motor deficits and spinal cord injury in mice subjected to experimental autoimmune encephalomyelitis. Behav Brain Res. 317, 95-108 (2017).
  27. Jones, M. V., et al. Behavioral and pathological outcomes in MOG 35-55 experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neuroimmunol. 199, (1-2), 83-93 (2008).
  28. van den Berg, R., Laman, J. D., van Meurs, M., Hintzen, R. Q., Hoogenraad, C. C. Rotarod motor performance and advanced spinal cord lesion image analysis refine assessment of neurodegeneration in experimental autoimmune encephalomyelitis. J Neurosci Methods. 262, 66-76 (2016).
  29. Sasaki, M., Lankford, K. L., Brown, R. J., Ruddle, N. H., Kocsis, J. D. Focal experimental autoimmune encephalomyelitis in the Lewis rat induced by immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein and intraspinal injection of vascular endothelial growth factor. Glia. 58, (13), 1523-1531 (2010).
  30. Merkler, D., Ernsting, T., Kerschensteiner, M., Bruck, W., Stadelmann, C. A new focal EAE model of cortical demyelination: multiple sclerosis-like lesions with rapid resolution of inflammation and extensive remyelination. Brain. 129, (Pt 8), 1972-1983 (2006).
  31. Franco-Pons, N., Torrente, M., Colomina, M. T., Vilella, E. Behavioral deficits in the cuprizone-induced murine model of demyelination/remyelination. Toxicol Lett. 169, (3), 205-213 (2007).
  32. Goldberg, N. R., Hampton, T., McCue, S., Kale, A., Meshul, C. K. Profiling changes in gait dynamics resulting from progressive 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced nigrostriatal lesioning. J Neurosci Res. 89, (10), 1698-1706 (2011).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics