질소 현상과 차등 원심 분리 배양된 세포의 주변 막 단백질의 분포를 모니터링 가능

Biochemistry

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Summary

여기 선물이 세제 무료 균질 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 따라 경작된 한 포유류 세포에 대 한 프로토콜. 이 방법은 주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 모니터링을 위한 이상적인 막 분수.

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

배양된 세포는 주변 막 단백질을 포함 한 단백질의 subcellular 분포를 공부 하는 데 유용. 유전자 붙일 인코딩 태그 단백질 subcellular 단백질 분포의 연구를 혁명 있다. 그러나, 특히 단백질 부분적으로 cytosolic 때 형광 현미경 검사 법, 함께 분포를 계량 하기가 어렵습니다. 또한, 그것은 종종 내 생 단백질을 공부 하는 것이 중요입니다. 생화학 분석기 immunoblots 단백질 subcellular 분류 후 배포의 정량화에 대 한 황금 표준 남아 같은 분석 실험. Cytosolic 또는 특정 막 분수를 분리 하는 것을 목표로 상업 키트는,이 키트의 대부분 주변 막 단백질 세포 막에서 쉽게 추출 되는 공부에 적합 수 있는 세제와 추출 기반. 여기 우리 ultracentrifugation에 의해 질소 현상과 cytosolic와 막-바인딩 단백질의 후속 분리에 의해 세포 균질에 대 한 세제 무료 프로토콜 제시. 우리 다른 세포 유형, 전체에 녹는 subcellular 세포의 분리 및 펠 릿 분수를 확인 하 고 몇 가지 일반적인 세제 기반이 아닌 기계적 균질 방법 중에서 단백질 추출 비교. 질소의 여러 장점 가운데 현상 섬세 한 세포에 최소한의 물리적, 화학적 손상 세포 장애의 뛰어난 효율성입니다. Ultracentrifugation와 결합, 질소 현상입니다 cytosolic 사이 주변 막 단백질의 변화를 검사 하는 훌륭한 방법 막 분수.

Introduction

세포질 단백질 2 개의 종류로 분할 될 수 있다: 막과 하지 않은 그와 관련 된 그. 비 막 관련된 단백질 cytosol, nucleoplasm 및 바인딩과 그물 (ER) 같은 세포의 루미나에서 발견 된다. 두 가지 수준의 막 관련 단백질, 정수 및 주변을 확인 하 고 있습니다. Polypeptide 체인의 하나 이상의 세그먼트 걸쳐 멤브레인, 소수 성 아미노산의 구성 하는 α-나선으로 일반적으로 있기 때문에 완전 한 막 단백질은 막 횡단 단백질 라고도. 막 횡단 단백질 co-translationally 그들의 생 합성 과정에서 세포 막에 삽입 되 고 그래서 구성 된 catabolized는 그들이 때까지 남아. 주변 막 단백질 이차 세포 막 지질 같은 소수 성 분자와 포스트 번역 상 수정 때문에 일반적으로 구동 됩니다. 달리 완전 한 막 단백질, 세포 막의 주변 막 단백질 연관 가역 이며 통제 될 수 있다. 신호 경로, 그리고 멤브레인과 규제 협회에 많은 주변 막 단백질 기능 활성화 하거나 억제 하는 통로 대 한 메커니즘 중 하나입니다. 주변 막 단백질은 신호 분자의 한 예로 작은 GTPase RAS입니다. 포스트 번역 상 수정 수정 farnesyl 지질을 포함 하는 시리즈, 후 성숙한 RAS 단백질의 수정된 C-말단 세포 막의 세포질 전단지에 삽입 합니다. 특히, 플라즈마 멤브레인 RAS의 다운스트림 이펙터 RAF1를 종사 하는 곳입니다. 물질 활성화 한 단백질 키 니 아 제 (MAPK) 통로의 구성 적인 활성화를 방지 하기 위해 여러 수준의 RAS의 제어 장소에 있습니다. GDP를 GTP를 hydrolyzing에 의해 RAS 비활성 렌더링, 게다가 활성 RAS 또한 수 나올 원형질 막에서 수정 또는 solubilizing 신호를 억제 하는 요소와의 상호 작용. 막 협회의 평가 하는 중요 한 필요 남아 있지만 형광 라이브 영상 극 세포 생물학 형광 단백질 태그 주변 막 단백질1의 subcellular 지 방화를 관찰할 수 있는 기회, 간단한 생 화 확 적인 접근으로 세미 양적 생 단백질입니다.

단백질 막과 수용 성 분수 사이 분할의 적절 한 생 화 학적 평가 비판적으로 두 가지 요소에 따라: 세포 균질 및 효율적인 분리 막과 수용 성 분수. 가장 널리 상용화 키트를 포함 하 여 일부 프로토콜 세제 기반 셀 균질에 있지만, 이러한 메서드는 분석 난독 하 처리할 용 해 단계2로 막 단백질을 추출 하 여 수 있습니다. 따라서, 세포 파쇄의 세제 비 기반으로, 기계적 방법 청소기 결과 제공합니다. 셀 문화에서 성장 또는 혈액 이나 장기에서 수확의 기계적 장애의 여러 가지 방법이 있다. Dounce 균질, 정밀한 바늘, 볼 베어링 균질, 쥡니다 있으며 질소 현상 포함 됩니다. 여기 우리가 질소 현상 평가 하 고 다른 방법에 그것을 비교. 질소 공동 현상은 높은 압력 하에서 세포의 세포질에 녹아 있는 질소에 의존 합니다. 평형, 후 세포 현 탁 액 질소 거품 때문에 그들의 비등 셀 열고 눈물 세포질에 형성 되는 등 갑자기 대기압에 노출 됩니다. 압력이 충분히 높은 경우 질소 비등 수 핵3 고 막 바인딩된 세포 리소좀4처럼 됩니다. 그러나, 압력은 충분히 낮게 유지 되는 경우 감압 원형질 막 및 응급실만 하지 다른 organelles, 그로 인하여 cavitate5지정 된 homogenate에 cytosol와 그대로 세포질 세포를 흘리 고 중단 됩니다. 이러한 이유로, 질소 현상 리소좀과 미토 콘 드리 아와 같은 세포를 고립 시키기를 위한 선택의 방법입니다.

그러나, 막과 수용 성 부분으로 쉽게 분리 될 수 있다 homogenate를 준비 하는 훌륭한 방법 이기도 합니다. 탱크 그리고 가변 배출 밸브와 출구 포트에서 질소 가스의 배달에 대 한 입구와 높은 압력을 견딜 수 있는 두꺼운 스테인리스 케이싱 압력 용기 (이제부터 "폭탄"에 게 불리는) 공동 현상 동안에 사용에 의하여 이루어져 있다.

질소 공동 현상은 1960 년대6이후 셀 균질에 대 한 사용 되었습니다. 1961 년, 사냥꾼 및 Commerfold7 포유류 조직 장애에 대 한 실행 가능한 옵션으로 질소 공동 현상은 설립. 그 이후, 연구원은 다양 한 세포와 성공, 조직에 기술을 적응 및 질소 현상 막 준비8,9, 핵과 세포 기관이 포함 하 여 여러 응용 프로그램에서 고정 되고있다 준비10,11, 그리고 불안정 생화학 추출. 현재, 세포 생물학 더 자주 다른 방법을 채택 셀 균질 질소 균질의 장점을 널리 광고 되지 있다, 질소 폭탄 비싼 이며 셀의 비교적 큰 숫자는 오해 때문에 필수. 그대로 핵과 세포-무료 homogenates를 달성 하기 위해 질소 현상에 대 한 프로토콜 게시 되지 않은, 그리고 가장 게시 된 평가에서 볼륨 세포 현 탁 액의 20 mL의 사용 되었다. 이 고전적인 기법 소규모 샘플 작업의 현재 요구 사항에 맞게 적응 하 선물이 질소 공동 현상은 특별히 배양된 세포의 수정 된 프로토콜. 질소 공동 현상은, 후는 homogenate로 분리 된다 성 (S)와 막 (P) 분수 차등 원심 분리에 의해 먼저 핵 및 손상 되지 않은 세포를 제거 하는 저속 회전 급강하 그리고 고속 스핀 (> 100000 x g) 분리 녹는 분수에서 막입니다. 우리 immunoblots는 분리의 효율을 분석 하 고 다른 기계적 장애 기술로 질소 현상 비교. 우리는 또한 질소 현상 중 균질 버퍼의 삼 투 효과 조사.

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Protocol

1. 버퍼 및 장비 준비

  1. 4 45 셀 중단 폭탄, 15 mL 튜브, 및 ultracentrifugation 튜브를 진정 ° c.
  2. 준비 25 mL 당 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 2 x 10 7 셀 균질 버퍼의 진정 하 고.
    참고: 더 나은 NaCl 반영 세포내 소금 성분 보다는 오히려 균질 버퍼는 일반적으로 KCl를 포함. PH 7.4, 10mm KCl와 1.5 m m MgCl 2 (이 하 소형 균질 버퍼 라고도 함)에서 10 mM HEPES이이 프로토콜에 사용 되는 균질 버퍼에 의하여 이루어져 있다. 대부분 버퍼 질소 현상에 대 한 적용할 수 있습니다 (내용 참조).
  3. 준비 6 mL 당 4 ° C. 추가 protease 억제제 정제 사용 하기 전에 신선한에 샘플 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 버퍼 x 1의 진정 하 고.
    참고:이 프로토콜에 사용 되는 PBS 버퍼 pH 7.4, 1.8 m m KH 24, 137 mM NaCl, KCl 2.7 mM에서 10 mM 나 2 HPO 4 이루어져 있다.
  4. 준비 4 ° C. 추가 한 protease 억제제 태블릿 사용 직전에 샘플 당 가용 화 버퍼의 4 mL를 진정 하 고.
    참고:이 프로토콜에 사용 되는 가용 화 버퍼는 1 x Radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1 %SDS, 0.5% 나트륨 deoxycholate, 및 1%에서 25 mM Tris 이루어져 있는 NP-40. 4.6를 참조 하십시오.

2. 수확을 셀

셀 형식에 대 한
    10 9 조직 문화 셀 권장된 x
  1. 성장 2 x 10 7-10 문화 미디어. 일반적으로, 한 15 cm 접시 수익률 2 x 10 7 HEK 293 세포 90 %confluency ( 그림 1)에서 DMEM에 교양.
  2. 진공에 의해 성장 매체를 제거.
  3. 부착 셀 문화 요리에 얼음, 냉장된 균질 버퍼 두 번 (15 cm 접시 세척 당 당 10 mL 버퍼)으로 부드럽게 문화 요리에 직접 세포를 씻어 놓고 셀의 적절 한 볼륨에 큰 셀 스 크레이 퍼와 수확 균질 버퍼; 현 탁 액 셀에 대 한 수집 및 냉장된 균질 버퍼에 두 번 (10 mL 버퍼 세척 당 50 mL 문화 당) 5 분, 4 ° C에서 500 x g 스핀과 셀 펠 릿을 세척 하 고 얼음에 균질 버퍼의 적절 한 볼륨에 씻어 셀 펠 릿 resuspend.
    참고: 볼륨 셀 중단 폭탄에 허용 최소/최대 볼륨으로 의도 된 실험에서 단백질 농도 대 한 요구 사항에 기반 해야 합니다. 일반적인 지침 2-10 배 10 7 셀/mL, 또는 세포의 약 10 볼륨 작은. 이 프로토콜은 균질 버퍼의 2 ml에서 HEK 293 세포의 3-15cm 요리에 대 한 최적화.

3. 질소 공동 현상은

  1. 전송 셀 서 스 펜 션 파문에 얼음 목욕에서 깨끗 하 고 냉장 폭탄 접시.
    주의: 폭탄은 높은 압력, 낮은 온도, 질소 가스 – 착용 적절 한 개인 보호 .
  2. 마이크로 자기 볶음 바 폭탄 안에 놓고 정지 동질성을 유지 하기 위해 저 어 접시에 설정.
  3. 하나 protease 억제제 태블릿 정지를 추가 하 고 제조 업체 당 폭탄을 닫습니다 ' s 지시.
  4. 점차 압력 제조 업체 당 질소 가스 탱크와 폭탄 ' 폭탄 압력 게이지까지 s 명령 300 ~ 600 psi를 읽습니다. 모든 밸브를 닫고 질소 탱크 분리.
    참고: 필요한 압력 셀 유형으로 달라질 수 있습니다. 여기 우리는 HEK 293, NIH-3T3과 Jurkat 세포에 대 한 350 ~ 400 psi에서 현상 수행.
  5. 질소 분해 하 여 셀 내에서 평형에 도달 수 있도록 20 분 기다립니다.
  6. 피복 수건을 사용 하 여 배출 밸브 주위 초과 물을 제거 합니다. Homogenate의 dropwise 릴리스를 달성 하 고 미리 냉장된 15 mL 튜브에 수집을 부드럽게 배출 밸브를 엽니다.
    참고: 컬렉션의 끝에 근처 거기 homogenate의 분출 되며 가스 쉿 소리와 함께 나타날 것입니다. 가스 하지 않습니다 있는지 확인 이전 수집 원인은 튜브 촬영 cavitate (따라서 15 mL를 사용 하 여 튜브 1.5 mL 튜브 대신). 일단은 기 시작, 배출 밸브 닫고 갑자기 하 폭탄 depressurize 폭탄에 나머지 셀의 현상 질소 유입 밸브를 엽니다. 오픈에 대 한 폭탄 cavitate 복구 및 철저 한 청소.
    참고: 마지막 cavitate 거품과 밀키 모양 위에 있어야 한다. 원심 분리 전에 가시고 거품 수 있도록 피 펫 팁으로 부드럽게 저 어.
    참고: 단계 대조 현미경 검사 법 균질 효율을 결정 하 여는 cavitate를 검사 합니다. 15 µ L 드롭 추가 cavitate 현미경 슬라이드와 커버는 coverslip의 표면에. 반복 단계 3.4-3.6 너무 많은 경우에 손상 되지 않은 세포는 20 X 목표 발견.
    참고: 균질 버퍼는 EDTA 또는 EGTA를 포함 하지 않으면, 그것에 추가 수집 된 후 5 분 이내 1 m m의 최종 농도에 cavitate.

4. Cytosolic와 막 분수 분리

손상 되지 않은 세포와 핵 제거 하 4 ° C에서 10 분 동안
  1. 분리기 500 x cavitate g.
    참고: 없음 보이는 펠 릿 생산 원심 분리 단계를 반복 하 고 위에 떠 있는 거품을 피하 면 서 포스트 핵 표면에 뜨는 (PNS)를 수집 합니다. 필요한 경우 추가 수집 PNS, 결합 하는 거품을 다시 원심 ( 그림 1).
  2. 관심의 분수를 원하는 대로 PNS를 처리 합니다. Cytosolic 분리 하 고 막 분수, 목적 ultracentrifuge 튜브에 PNS를 전송 하 고 원하는 대로 ultracentrifugation를 수행 합니다. 이 프로토콜에 대 한 최적화는 < 3.5 mL 샘플 폴 리카 보 네이트 ultracentrifuge 튜브에서 및 ultracentrifugation 350000 x g 1 h 4에 대 한에 대 한 ° C.
  3. 상쾌한 (S 분수) 1 mL 피 펫을 사용 하 여 수집.
  4. 신중 하 게 그것을 방해 하지 않고 차가운 PBS의 3 mL와 펠 릿을 씻어. 진공으로 PBS를 제거.
    참고: cytosolic 단백질에 의해 막 분수의 오염 샘플의 손실 보다 더 큰 관심사 인 경우에, 3 ml PBS 춥고 단계 4.2에서 다시 ultracentrifuge의 펠 릿을 resuspend. 진공으로 PBS를 제거.
  5. 선택의 가용 화 버퍼 세제를 포함 하는 적절 한 볼륨에는 펠 릿을 완벽 하 게 resuspend. 셀 등가 달성 하기 위해 사용 하 여 가용 화 버퍼의 동일한 볼륨 cytosolic 분수.
    참고: 효율적인 막 단백질 추출에 대 한 가용 화 버퍼 1 x RIPA 버퍼를 사용 하 여 것이 좋습니다. 없음 다운스트림 분석 결과 막 일부분에 대 한 필요한 경우, 1 x laemmli 샘플 버퍼를 사용 하 여 최대한 막 단백질 추출에 대 한.
    참고: 좋습니다 dislodging 하 고 최대한 막 단백질 추출에 대 한 4 ° C에서 튜브 회전자에 깨끗 한 튜브를 가용 화 버퍼에 펠 릿을 전송.
    참고: 펠 릿은 너무 끈 적 (너무 많은 지질) 일에서 효율적으로 제거 하는 경우가용 화 버퍼에서 e ultracentrifuge 튜브, 좋습니다 스냅 액체 질소에는 펠 릿을 동결 하 고 펠 릿 녹아서 전에 미니 금속 주걱으로 신속 하 게 ultracentrifuge 튜브에서 펠 릿을 dislodging.
    참고: 또는, 막 펠 릿 그냥 resuspended 고 막 소포 서 스 펜 션, 어떤 경우는 원심 4.6 단계 필요 하지 않습니다 P 일부 생산 세제 포함 된 버퍼에 solubilized 하지. 이러한 P 분수는 막 협회에 의존 하는 효소 활동 등의 기능을 조사 하는 경우에 유용.
  6. 4 시 10 분에 대 한 탁상 원심 분리기에 20000 x g에서 4.5 단계에서 완전히 solubilized 펠 릿 정지 원심 ° C. 상쾌한 1 mL 피 펫 (P 분수)를 사용 하 여 수집 하 고 펠 릿 (불용 성 지질) 삭제.
  7. Cytosolic 또는 막 분수와 서 부 럽 등 원하는 분석을 수행 하거나 나중에 사용-80 ° C에 저장.

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Representative Results

그림 2 는 녹는 cytosolic 분수 (S) 또는 막 펠 릿 분수 (P) PNS에서 세포질 단백질의 분할을 보여 줍니다. 우리는 다른 종류에서 3 개의 대표적인 셀 라인 검사: HEK 293 (상피), NIH-3T3 (fibroblast) 및 Jurkat (림프 구). 로 구 아닌 분리 억제 물 (RhoGDI) 및 양이온 독립만 노 오 스 6 인산 염 수용 체 (CIMPR)에 대 한 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다 cytosolic 막 분수, 각각. 우리에서 질소 현상 후 cytosol 그리고 막의 효율적인 분리 확인 ~ ultracentrifugation 350000 x g h 1에 이어서 소형 버퍼에서 350 psi. 발견 한 총 단백질 S 및 P 분수 다음 응급실, endosomes 리소좀, 미토 콘 드리 아, 골, 그리고 다른 세포에 대 한 마커를 분석 했다. 모든 막 횡단 단백질은 막 분수에 독점적으로, Na+를 포함 하 여 /K+ ATPase 그리고 원형질 막, 응급실, lysosomal 관련 막 단백질 1 (LAMP1)에서 calnexin에서에서 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR) 리소좀, F0에서-미토 콘 드리 아, 그리고 trans Golgi 네트워크에서에서 Golgin 97에서 ATPase. 예상 했던 대로, 막에 느슨하게 연관, 다양 한 각도에 cytosolic와 막 분수에 모두 존재 하는 많은 주변 막 단백질. 주목할 만한 예로 초기 endosome 항 1 (EEA1), Rab7/9 (늦은 endosomes) 및 hexokinase 1 (외부 미토 콘 드리 아 막). 이 주변 단백질 막 협회의 평가 있는이 기술의 유틸리티를 보여 줍니다. 우리의 실험실 여러 신호 분자5,12,,1314막 연결 상태를 검사 하이 캐 비테이 션 기법의 장점은 촬영 하고있다. 흥미롭게도, 우리는 발견 calregulin 수용 성 부분에서 거의 독점적으로 ER 막에서 생성 된 microsomes 질소 현상 동안 중단도 있다 고 응급실 루멘에 있는 단백질 수용 성 부분을 해제 제안. 대조적으로, 현상 후 미토 콘 드리 아의 무결성 셀 형식에 따라 달라 집니다. 우리는 F1을 관찰-ATPase, NIH-3T3 세포에 대 한 2%에서 HEK 293과 Jurkat 세포에 대 한 ~ 35%에 이르기까지 cytosolic 분수에서 부분적으로 내부 미토 콘 드리 아 주변 단백질. 이 질소를 나타냅니다 소형 버퍼 350 psi에 현상 미토 콘 드 리아 무결성을 보장 하지 않습니다. PNS cavitate에서 생성 하 g 회전 x 500의 3 주기에 불구 하 고 모든 핵 제거 되었습니다. 히스톤 deacetylase 1 (HDAC1) nucleoplasm와 fibrillarin는 핵소체에서 PNS와 펠 릿에서 발견 됐다. 펠 릿에는 상쾌한에 HDAC1의 존재는 PNS 공동 현상 동안에 핵 중단 보다는 핵, 오염 되어 나왔다. 이 보고서는 가압 350 psi 폭탄 핵 그대로10, 일치 이후 섹션에서 설명 했 듯이 소형 버퍼의 사용 핵 깨지기 쉬운, 렌더링 수 있습니다.

우리는 다른 일반적인 물리적 중단 방법의 질소 현상의 균질 효율 비교. Jurkat 세포의 동일 금액 동일 당뇨 균질 버퍼에 일시 중단 하 고 다른 중단 방법에 복종 했다. Dounce 균질과 질소 현상 (두 경우 모두 약 5-10% 적은 볼륨 수집)에 있는 샘플의 감지 손실이 했다. 그러나, 질소 현상 준 최고의 단백질 추출 효율; 바늘 통행 및 Dounce 나왔고만 60% 만큼 단백질 (그림 3). 호기심, 복구 immunoblot에 따라 어떤 단백질의 다른 기계적 중단 방법 사이의 중요 한 차이 보여주지 않았다. 그러나, 특정 주변 막 단백질 hexokinase 1 등 RAS의 수익률 샘플 질소 현상 준비에서 높았다. 이 지원 그 질소 현상 수 있습니다 균질에 대 한 최적의 조사 주변 막 단백질. HDAC1 단백질 질소 현상에 의해의 복구는 핵 그대로 모든 조건에서 유지 하는 것을 건의 하는 다른 방법에 비교 합니다. 따라서, 그림 3 에서 데이터는 질소 현상 제공 뛰어난 균질 결과 증명 한다.

다음, 우리는 소형 버퍼와 같은 버퍼 간의 균질 효율 비교 하지만 isotonic 자당 또는 염화 나트륨 (그림 4)와 함께 만든. 비슷한 양의 단백질 NaCl isotonic 버퍼 대 소형 버퍼에서 350 psi에 현상 후 무 균 Jurkat 세포에서 발견 했다. 반면에, 적은 단백질 셀 자당와 isotonic 만든 버퍼에 중단의 PNS에서 복구 되었습니다. 대부분의 개별 단백질 immunoblot에 의해 검사 적합이 패턴. 한 가지 예외 isotonic 버퍼에서 생성 된 PNS에서 상대적으로 농축 했다 fibrillarin 했다.

주변 막 단백질 수용 성 사이 분할 조사 하 우리의 프로토콜을 사용할 수 경우 확인 하려면 막 분수, 우리 비교 플래그 태그 NRAS 야생 유형 및 그것의 prenylation 불충분 한 돌연변이, C186S (사이의 패턴을 분할 그림 5)입니다. 정상 상태에서 야생 유형 NRAS cytosol에 막, 부분 녹는 분수에 복구는 다른 RAS 단백질14보다 큰 가장 주변 막 단백질 유사한 존재 했다. NRAS prenyl 수정의 박탈은, 막 연관 기능을 잃는다 고 완전히 cytosolic 된다. NRAS의 예상된 분할 패턴 확인 우리의 프로토콜은 cytosol와 세포 막 사이 주변 막 단백질의 분할의 역학을 공부 하는 신뢰할 수 있는 옵션입니다.

Figure 1
그림 1: 순서도 단계 2 (블루), 3 (적색) 단계 및 단계 4 (노란색) 프로토콜의 요약. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 단백질을 cytosolic와 막 분수 사이 분할. HEK 293, NIH-3T3과 Jurkat 세포 질소 (소형 균질 버퍼에 20 분 ~ 350 psi) 현상과 프로토콜에 설명 된 대로 ultracentrifugation (~ 350000 x 1 h g)를 받게 되었다. 다른 분수에서 내 생 단백질 레벨 immunoblot에 의해 분석 되었다. PNS: 수용 체 바인딩 암 항 원에 SiSo 셀 (RCAS), 핵 상쾌한, s: 상쾌한, p: 펠 릿을 표현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 다른 기계 중단 기법 비교. Jurkat 세포의 상응 하는 금액 소형 버퍼에 중단 되었고 동결-해 동 (3 주기), 통로 (5 패스, 28G½ 바늘을 통해), Dounce 균질 (15 패스, Kontes 2 mL Dounce 튜브는 조직 갈기 유 봉의 바늘 0.01-0.06 m m) 또는 질소 현상 (20 분 ~ 350 psi). PNS에서 생 단백질의 상대적 수준은 각 메서드에 대 한 immunoblot에 의해 분석 되었다. PNS의 총 단백질 농도 BCA assa에 의해 계량 했다y와 질소 현상에 의해 준비 된 PNS의 값을 정규화 된. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 질소 현상 중에 사용 하는 당뇨와 isotonic 버퍼의 비교. Jurkat 세포 침투성 버퍼, 또는 소형 버퍼에서 중단 되었다의 상응 하는 금액 8.5% 자당 또는 150 mM NaCl, 보충 하 고 들어서는 질소 공동 현상 (20 분 ~ 350 psi). PNS에서 생 단백질의 상대적 수준은 각 버퍼에 대 한 immunoblot에 의해 분석 되었다. PNS의 총 단백질 농도 BCA 분석 결과 의해 정량 되었고 당뇨 버퍼에 PNS의 값으로 정규화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: Farnesylated NRAS P와 S 조각으로 분할. HEK 293 세포 플래그 태그 NRAS 야생 유형 또는 C186S 돌연변이의 식을 감독 하는 플라스 미드와 페 뚜렷이 했다. 그림 2 에 설명 된 대로 수행한 단백질 분할 하 고 표시 된 단백질 수준 immunoblot에 의해 분석 되었다. 복제 허가 (Zhou, M 그 외 여러분, 2016. 세포 생물학 저널에서에서 출판. https://doi.org/10.1083/jcb.201604061)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

기계 장애의 다른 방법을 통해 질소 현상의 장점은 매니폴드입니다. 아마도 가장 중요 한 장점은 부드럽게 아직 효율적으로 균질 표본 하는 기능입니다. 생성 지역 난방 손상 대신 압축 냉각 샘플의 원리는 초음파 좋아하고 기술을 기반으로 마찰/전단. 공동 현상 또한 원형질 막 방해에 매우 효과적입니다. 질소 거품 감압, 현상 프로세스에 따라 각 개별 셀 내에서 생성 되는 제한 때문에 셀 크기에 의해 더 적은 크기 샘플 또는 샘플 농도. 따라서 정리 기반 Dounce 또는 바늘 통과 균질 추가적인 이점을 제공합니다. 질소 공동 현상은 또한 샘플에 걸쳐 균일 하 게 적용 되는 동일한 파괴적인 힘은 동일한 압력으로 재생 될 수 있다로 더 일관 된 결과 제공 합니다. 또한, 각 셀만 중단 프로세스 1 시간에 대 한 경험과 subcellular 구성 요소, 따라서, 아니라 끊임없이 노출 변수 파괴 세력. 이 세포의 artefactual 조각화를 제한합니다. 중단으로 인 한 불안정 세포 구성 성분의 산화에 대 한 우려 또한 완화, 질소 포화 세포 현 탁 액을 사용 하 고 보충 산소의 무료입니다. 질소 현상에 의해 부과 된 제한 된 물리적, 화학적 스트레스 하면 정한 효소 및 연약한 세포, 그리고이 균질 화 기술은의 재현성을 공부 하는 이상적인 기법 잘 정량화에 대 한 적합 한 수 있습니다.

질소 공동 현상은 또한 샘플 크기, 균질 버퍼의 구성 및 세포 기관이 무결성 정도의 상당한 유연성을 제공합니다. 균질 최대 규모, 하나는 단순히 속도, 편의 또는 압축의 효율성을 희생 하지 않고 더 큰 용량, 압력 용기를 배포 해야 합니다. 질소 현상; 어떤 균질 버퍼를 사용할 수 있습니다. 버퍼 선택 각 실험의 요구와 호환 맞출 수 있습니다. 하나의 세포에서 세포내 액체 (예를 들어, 높은 칼륨과 낮은 나트륨) 변경 최소화 하기 위해 일치 하는 균질 버퍼를 디자인할 수 있습니다. 예를 들어 우리는 말라 합 비보 전 을 최소화 하 고 따라서 granulocytes5에서 그대로 세포질 소포 수집 지원 "휴식" 버퍼를 개발 했다. 버퍼의 삼투성과 이오니아 기능 또한 정도 세포 균질의 제어를 수정할 수 있습니다. 또한, 세포 장애의 적극성은 질소 압력을 조정 하 여 제어할 수 있습니다. 적당 한 압력 고압이이 세포를 방해 하는 동안 핵, 미토 콘 드리 아 및 그대로 상태에서 다른 세포를 유지 하기 위해 파괴적인 힘을 감소 시킨다. 브록 . 대부분 핵 침투성 버퍼10, 우리의 현재 프로토콜에 사용 되는 질소 압력의 근거를 형성 하 350 psi에 그대로 유지 하면서 쥐 Basophilic 백혈병 세포의 붕괴와 함께 성공을 보고.

균질 샘플에 걸쳐 균일 하 고 다른 막 구조; 비슷한 크기의 소포를 생성할 수 있습니다 사실 질소 현상의 포함 이 속도 영역 밀도 그라데이션 원심 분리에 의해 원형질 막, 부드러운 microsomes, endosomes 및 골 막의 추가 분리를 복잡 하 게 수 있습니다. 또 다른 관심사는 세포 내부에서 파열 때문에 균질 후 상대적으로 연약 될 것입니다. 따라서,이 메서드는 후속 조작에서 세포 기관이 파손을 방지 하기 위해 주의 최적화를 해야 합니다. 우리는이 연구에서 이러한 문제를 해결 하기 위해 목적입니다.

분리의 cytosolic 단백질 마커15,16의 소수와 함께 단백질 분수의 분할 적 제한 된 보고서에서 원심 분리 하 여 막 분수를 탐험 하 고. 우리의 방법의 가용성과 막-바인딩 단백질, 원유 분리 생성 하 고 특정 세포의 고립은 포함 되지 않습니다. 그러나, 그것은 여전히 유효한 우려 현상에 의해 생성 하는 다른 세포 막의 균질 성 소포 ultracentrifugation에 의해 분리의 효율성을 제한할 수 있습니다. 우리는 고립의 immunoblots 및 우리의 프로토콜 분류 후 일반적인 subcellular 세포의 분할에 의해 광범위 한 조사를 제시. 예상 했던 대로, RhoGDI 처럼 순전히 cytosolic 단백질은 독점적으로 녹는 분수와 EGFR 등 나+플라즈마 멤브레인 (오후)에 막 횡단 단백질에 /K+ ATPase, 펠 릿에만 회수 했다. 응급실, 미토 콘 드리 아, 골, 리소좀과 같은 세포에 막 횡단 단백질 또한 다른 세포 막 및 세포에서 완전 한 막 단백질 성공적으로 수용 성 단백질에서 분리 될 수 있다 확인 펠 릿에 재기 했다 우리의 방법입니다. 이 기본 유효성 검사는이 프로토콜의 주요 목적은 주변 막 단백질의 추가 분석을 위해 결정적 이다.

주변 막 단백질의 대부분 cytosolic와 막 분수에 존재 한다. 이 종종 있지만 그들의 지 방화의 진정한 표현, 그것은 수 있습니다 어떤 경우에 대표 artefactual 재배포가이 단백질의 세포 막의 세포질 표면에서 녹는 분수 균질 과정 이후는 멤브레인과 그들의 협회의 강도 완전 한 막 단백질의 강한. 생 화 확 적인 분류와 변화 사이 cytosolic 단백질의 분할에 이러한 유물을 염두 해야 질소 cavitation 셀, 부드러운 중단에 노출 하 여 잠재적인 재배포를 최소화, 비록 그리고 막 분수 실험 조건에서. 그럼에도 불구 하 고, endosomal 성숙의 다양 한 단계에서 주변 막 단백질의 시험이이 방법으로 가능 하다. EEA1, 초기 endosomes clathrin 입히는 소포의 도킹 중재 Rab5 이펙터 초기 endosomes의 세포질 표면에 localizes 고 펠 릿 분수에 주로 재기 했다. 늦은 endosome 관련 Rab7 및 Rab9 단백질 펠 릿 분수에 있습니다. 그러나, 거기는 cytosol에서 Rab7/9의 큰 금액을 남아 있다. RabGDI prenylated Rabs와 상호 작용 하 고 이러한 다른 불용 성 단백질을 cytosolic 렌더링 할 수 있기 때문에, 랩 단백질 다른 endosome 관련 주변 막 단백질 보다 더 cytosolic 될 경향이 있다.

질소 현상에 의해 균질 화와 함께 핵과 세포 기관이 무결성을 특성화 하기 위해 우리 immunoblotted luminal 및 세포질 구획에 대 한 격리 된 분수. 이 분석에 calregulin 완전히 녹는 분수, 응급실 양식 microsomes을 중단 하 고 그로 인하여 누수 luminal 콘텐츠 시연으로 발표 했다. 진 핵 세포에 있는 막의 전체 면적의 절반 응급실의 미로 공간을 포함 한 주어진, sac 또는 관 구조의 그것의 광대 한 네트워크 질소 거품의 확장 하는 동안 그대로 유지 하지 못하는 놀라운 일이 아니다. 다른 한편으로, 현상 후 미토 콘 드 리아 무결성의 우리의 분석 표시 셀 형식에 명확한 의존 우리 F1을 관찰-ATPase, 주변 cytosolic 분수에서 미토 콘 드리 아의 내 막과 관련 된 단백질 다양 한 수준 (HEK 293와 Jurkat ~ 35%, NIH-3T3 2%) 이 질소를 나타냅니다 소형 버퍼 350 psi에 현상 미토 콘 드 리아 무결성을 보장 하지 않습니다. 실제로, 다른 미토 콘 드리 아를 유지 하려면 현상 수행 해야 함을 150 psi17보다 낮은 압력에서 보고 있다. 대조적으로, 우리는 그 catalase peroxisomes 루멘에 남아 발견. 글, 핵 단백질 PNS와 펠 릿 분수에 관찰 된다. 특히, HDAC1, nucleoplasm, 걸쳐 존재 히스톤 deacetylase은 결 석 핵 무결성 손상 되지 나타내는 성 분수. 이것은 핵 현상에 의해 파열 하지 하나는 solub에 HDAC1의 출시 기대그 시나리오에 르 분수입니다. 그것은 핵 PNS 준비의 과정에서 완전히 제거 되지 않습니다 그리고 단백질 ultracentrifugation 후 펠 릿에 남아 가능성이 남아 있습니다. 이 가능성은 DNA 누설 녹는 분수에서 발견 되는 사실에 의해 더 지원 된다. 우리가, 그러므로, Mg2 + 의 추가 함께 ~ 350 psi에 공동 현상 동안 당뇨 균질 버퍼를 사용 하 여 여러 셀 라인에서 핵 무결성을 보존할 수는 결론.

우리의 결과 또한 리보솜 막 펠 릿 분수, 응급실 막 바운드 되지 않은 세포질에도 무료 리보솜 후 비 자당 쿠션 버퍼에 완전히 sedimented 수 제안에 전적으로 수집 입증 1 헤 마찬가지로, 식별 12 autophagy 관련 된 단백질 (Atg12)에 대 한 350000 x g에서 원심 분리-Atg5 autophagosomes의 표식으로 공액 펠 릿 분수에 엄격한 분리를 보여. cytosol에서 그것의 존재는 사실 공유-첨부 파일 Atg12와 Atg5의 autophagosomes 형성 앞에 의해 발생할 수 있습니다. Cytoskeletal 단백질은 중 합 비보 전 때문에 평가 하기 어렵습니다. 이 현상 휴식 버퍼 최소화 할 수 있습니다만 여기에 설명 된 프로토콜 tubulin 가능성이 생산 비보 전 킬레이트 칼슘 18 시. 우리의 준비에 tubulin 중 합을 제안 하는 걸 P와 S 분수에서 발견 되는 반면 펠 릿에서 발견 된다.

균질 효율성에 질소 현상의 잠재적인 장점 하, 우리는 몇 가지 일반적인 기계적 중단 기법 검토. 믹서 기 또는 박격포/유 봉 등 조직 샘플에 대 한 최적화 방법은 평가 하지 했다. 그것은 내부 세포를 그대로 유지 하면서 표면 막 중단 하기 어려운 쥡니다 제 또한 했다. 우리의 분석은 다음과 같은 방법에 초점을 맞춘: 동결-해 동, 바늘 통행과 Dounce 균질, 그들은 쉽게 수행 하 고 볼 베어링 균질 화기 등 특수 장비를 필요 하지 않습니다. Jurkat 세포는 그들을 렌더링 하는 바늘 통행 및 Dounce와 같은 허가에 종속 된 전통적인 액체 깎는 기술을 효율적으로 균질 하기 어려운 그들의 작은 크기 때문에이 분석에 사용 되었다. 복구 하는 총 단백질의 농도 의해 판단, 우리는 질소 현상과 동결-해 동 같은 셀 크기 독립 중단 방법 실제로 단백질 추출의 우수한 효율을 보여 발견. 더 큰 크기의 세포와 비슷한 분석 질소 현상은 여전히 다른 물리적 방법 테스트 (데이터 표시 되지 않음)에 우수한 균질 효율성, 작은 차이 밝혔다.

많은 cytosolic, endosomal 및 세포 골격 단백질은 효율적으로 모든 테스트 방법으로 복구 했습니다. 반면, ER 및 Golgi에 단백질 질소 공동 현상은 사용 하 여 최적의 복구 되었습니다. F1의 약간 낮은 수익률-다른 방법에 상대적으로 질소 현상에 ATPase 미토 콘 드리 아 현상 하는 동안 그대로 유지 더 높습니다 따라서 더 효율적으로 저속 회전에 제거 하는 데 사용 사실 반영 될 수 있습니다 PNS를 생성 합니다. 관찰 그 hexokinase 1, 주변 막 단백질 둘는 cytosol에서 발견 하 고 F1을 기준으로 반대로 패션에 행동 하는 외부 미토 콘 드리 아 막 연관-ATPase 가능성이 반영의 협회의 lability F1을 기준으로 1 hexokinase-ATPase는 미토 콘 드리 아 안으로 압수 하는. 중요 한 것은, 비록 방해 유사한 효율성으로 셀 수 있는, 다른 기계적 중단 방법 (hexokinase 1 및 RAS) 특정 주변 막 단백질의 상대적으로 가난한 복구를 했다. 따라서, 현상 주변 막 단백질의 분할 조사 목적을 위해 선택의 우리의 균질 기술입니다. Dounce 균질은 널리 그대로 핵을 준비 하는 데 사용 됩니다, 때문에 우리 사용 Dounce를 기준으로 다른 기계 중단 방법에 걸쳐 핵 무결성을 평가 하. 우리의 분석에서 HDAC1 단백질의 복구의 핵 Jurkat homogenates ~ 350 psi 소형 버퍼에서 질소 현상에 의해 준비에 그대로 유지 확인 합니다.

그것은 분명 질소 현상 하는 동안 사용 되는 균질 버퍼 중단 효율성과 세포 기관이 무결성에 영향을 크게 수 있습니다. 균질 버퍼의 구성 의도 된 응용 프로그램의 요구 사항에 최적화 되어야 합니다, 하는 동안 그것은 동물의 조직의 질소 압축을 수행 하는 연구원 핵 추출 낮은 삼투성 압력 버퍼 사용 협조할 내용입니다. 헌터와 Commerford 보여주었다 핵 붓기 및 솔루션 희석 때 파열 및 핵 보존 isotonic 솔루션7 (와 같은 나트륨 염화 물 또는 유기 용액 등 무기 염 중 하나 추가 하 여 달성 될 수 있는 사용 하는 경우 자당 또는 글리세롤)입니다. 포유류 세포에서 핵 이외의 subcellular 세포를 분리 하는 데 사용 되는 표준 isotonic 버퍼 1 mM EDTA를 포함 하는 0.25 M 자당 이며 pH 7.0 7.6에서 트리 스, HEPES, 또는 Tricine 버퍼. 그러나 모든 문화 셀 효율적으로 isotonic 버퍼 중 하나에 무 균 될 수 있다. 소형 버퍼 (일반적으로 10 mM Tris, HEPES, )는 자주 완전 한 균질 화를 달성 하기 위해 특정 세포 유형에 필요한 삼투성 스트레스를 제공 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 전에 설명 했 듯이, 소형 버퍼 허약 하 고 DNA의 누설 하는 경향이 EDTA는 포함 하는 때 핵을 렌더링 하는 경향이 있다. 핵 무결성을 홍보, 우리는 KCl와 MgCl2 등 MgSO4divalent 양이온의 낮은 농도 EDTA를 교체 합니다. Mg2 + 는 일반적으로 선호 캘리포니아2 + 수 있기 때문에 후자 특정 phospholipases 및 프로 테아 제 활성화 RNA 중 합 효소를 억제. 공동 현상 완료 되 면, EDTA 또는 EGTA 추가할 수 있습니다 양이온, 킬레이트에 homogenates를 다시 metalloproteases을 억제 하는 데 필요한 경우.

Jurkat 세포 그들 핵 무결성을 공부 하는 이상적인 셀 라인을 만드는 비교적 큰 핵-세포질 비율을 표시 합니다. NaCl 보충 isotonic 버퍼에 비교할 때 소형 버퍼를 사용 하 여 균질 효율성의 증가 최소 이다. 그러나, 자당 보충 isotonic 버퍼에 현상 복구 약 절반 단백질 소형 버퍼 대응을 사용 하 여 추출 합니다. 이것은 isotonicity의 직접적인 결과 될 것 그리고 isotonicity를 달성 하기 위해 자당 및 NaCl를 사용 하 여 사이의 불일치 더 조사 해야. 1 개의 가능한 설명은 자당 하지 않는 반면 소금 단백질 사이 정전기 상호 작용을 방해는 이다. 따라서, 같은 샘 에서도 NaCl는 자당 부족 단백질 추출에 관련 된 활동. With 관계 핵 무결성을 보존 하기 위해 우리 isotonic 버퍼 이론적으로 핵의 더 보호 되 고에 불구 하 고 isotonic 버퍼가 복구 증가 fibrillarin 단백질 발견. 호기심, 미토 콘 드 리아 분수 NaCl, 낮은 소금 조건 미토 콘 드리 아 추출 최적이 될 수 있습니다 제안 보충 isotonic 버퍼 보다 효율적으로 추출 했다. 소형 버퍼 현상 달성 균질 효율성과 핵 무결성 사이의 최고의 균형을 고려, 소형 버퍼 선택 현상의 우리의 프로토콜에 버퍼가 된다. 그러나, 우리는 아무 버퍼 최적의 균질 결과의 보장은 독자 주의. 우리의 프로토콜 최적화에 대 한 템플릿 역할을 해야 하 고 원하는 버퍼 테스트 파일럿, 관심, 그리고 다른 변수 (압력, 버퍼 구성 )의 셀 라인 최상의 결과 대 한 설정 해야 합니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgments

이 작업은 GM055279, CA116034 및 CA163489에 의해 투자 되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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References

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