नाइट्रोजन Cavitation और अवकलन केंद्रापसारक संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं में परिधीय झिल्ली प्रोटीन के वितरण की निगरानी के लिए अनुमति देता है

Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

यहां हम डिटर्जेंट के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल homogenization स्तनधारी नाइट्रोजन cavitation और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई के आधार पर प्रसंस्कृत कोशिकाओं के मुक्त । यह विधि घुलनशील और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की निगरानी के लिए आदर्श है ।

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

प्रसंस्कृत कोशिकाओं परिधीय झिल्ली प्रोटीन सहित प्रोटीन के उपसेलुलर वितरण का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होते हैं । आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग सेलुलर प्रोटीन वितरण के अध्ययन में क्रांति ला दिया है । हालांकि, यह फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ वितरण, विशेष रूप से जब प्रोटीन आंशिक रूप से cytosolic है यों तो मुश्किल है । इसके अलावा, यह अक्सर अंतर्जात प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है । immunoblots जैसे जैव रासायनिक परख सेलुलर अंश के बाद प्रोटीन वितरण के ठहराव के लिए सोने के मानक बने रहते हैं । हालांकि वहाँ वाणिज्यिक किट है कि cytosolic या कुछ झिल्ली भिन्न अलग करने के लिए लक्ष्य कर रहे हैं, इन किट के अधिकांश डिटर्जेंट के साथ निष्कर्षण पर आधारित हैं, जो परिधीय झिल्ली प्रोटीन है कि आसानी से झिल्ली से निकाले जाते हैं का अध्ययन करने के लिए अनुपयुक्त हो सकता है. यहां हम नाइट्रोजन cavitation द्वारा सेलुलर homogenization के लिए एक डिटर्जेंट मुक्त प्रोटोकॉल वर्तमान और ultracentrifugation द्वारा cytosolic और झिल्ली से बंधे प्रोटीन के बाद जुदाई । हम विभिंन प्रकार के सेल में घुलनशील और गोली भागों में सेलुलर organelles के जुदाई की पुष्टि करें, और कई आम गैर डिटर्जेंट-आधारित यांत्रिक homogenization तरीकों के बीच प्रोटीन निष्कर्षण की तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation के कई फायदों के बीच नाजुक organelles के लिए न्यूनतम शारीरिक और रासायनिक क्षति के साथ सेलुलर व्यवधान की बेहतर दक्षता है । ultracentrifugation के साथ संयुक्त, नाइट्रोजन cavitation cytosolic और झिल्ली भिन्न के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के बदलाव की जाँच करने के लिए एक उत्कृष्ट विधि है ।

Introduction

सेलुलर प्रोटीन दो वर्गों में विभाजित किया जा सकता है: उन है कि झिल्ली और उन है कि नहीं कर रहे है के साथ जुड़े रहे हैं । गैर-झिल्ली संबद्ध प्रोटीन organelles के cytosol, nucleoplasm और lumina जैसे endoplasmic जालिका (ईआर) में पाए जाते हैं. वहां झिल्ली के दो वर्गों-जुड़े प्रोटीन, अभिंन और परिधीय हैं । अभिंन झिल्ली प्रोटीन भी transmembrane प्रोटीन के रूप में जाना जाता है क्योंकि पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के एक या एक से अधिक क्षेत्रों झिल्ली spans, आमतौर पर एक α के रूप में hydrophobic अमीनो एसिड से बना कुंडलित । Transmembrane प्रोटीन सह-अनुवाद उनके गैर संश्लेषण के दौरान झिल्ली में डाला जाता है और जब तक वे catabolized रहे हैं तो कॉन्फ़िगर किया गया है । परिधीय झिल्ली प्रोटीन secondarily झिल्ली के लिए प्रेरित कर रहे हैं, आमतौर पर इस तरह लिपिड के रूप में hydrophobic अणुओं के साथ पोस्ट-शोधों संशोधन का एक परिणाम के रूप में । अभिंन झिल्ली प्रोटीन के विपरीत, सेलुलर झिल्ली के साथ परिधीय झिल्ली प्रोटीन के संघ प्रतिवर्ती है और विनियमित किया जा सकता है । संकेत रास्ते में कई परिधीय झिल्ली प्रोटीन समारोह, और झिल्ली के साथ विनियमित संघ को सक्रिय करने या एक मार्ग बाधा के लिए एक तंत्र है । एक संकेत अणु कि एक परिधीय झिल्ली प्रोटीन है की एक उदाहरण के छोटे GTPase, रास है । एक farnesyl लिपिड के साथ संशोधन शामिल है कि पोस्ट-शोधों संशोधनों की एक श्रृंखला के बाद, सेलुलर झिल्ली के cytoplasmic पुस्तिका में एक परिपक्व रास प्रोटीन आवेषण के संशोधित सी-टर्मिनस. विशेष रूप से, प्लाज्मा झिल्ली जहां रास अपनी बहाव प्रभाव RAF1 संलग्न है । mitogen-सक्रिय प्रोटीन कळेनासे (MAPK) मार्ग के गठन सक्रियण को रोकने के लिए, रास के नियंत्रण के कई स्तरों जगह में हैं । सकल घरेलू उत्पाद में hydrolyzing GTP द्वारा रास निष्क्रिय प्रतिपादन के अलावा, सक्रिय रास भी संशोधनों या solubilizing कारकों के साथ बातचीत द्वारा प्लाज्मा झिल्ली से जारी किया जा सकता है संकेतन बाधित । हालांकि फ्लोरोसेंट लाइव इमेजिंग मुलाजिम सेल जीव को फ्लोरोसेंट प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण का पालन करने का अवसर-परिधीय झिल्ली प्रोटीन1टैग, वहां एक महत्वपूर्ण के लिए झिल्ली एसोसिएशन के मूल्यांकन की जरूरत बनी हुई है अंतर्जात प्रोटीन अर्द्ध मात्रात्मक सरल जैव रासायनिक दृष्टिकोण के साथ ।

झिल्ली और घुलनशील अंशों के बीच प्रोटीन के विभाजन का उचित जैव रासायनिक मूल्यांकन गंभीर रूप से दो कारकों पर निर्भर है: सेलुलर homogenization और झिल्ली और घुलनशील अंशों का कुशल पृथक्करण । हालांकि सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया वाणिज्यिक किट सहित कुछ प्रोटोकॉल, डिटर्जेंट आधारित कोशिका homogenization पर निर्भर करता है, इन तरीकों घुलनशील चरण2में झिल्ली प्रोटीन निकालने के द्वारा विश्लेषण गड़बड़ाने कर सकते हैं । तदनुसार, गैर-डिटर्जेंट आधारित, कोशिका व्यवधान के यांत्रिक तरीके क्लीनर परिणाम प्रदान करते हैं । वहां कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन के कई तरीके है या रक्त या अंगों से काटा संस्कृति में उगाया । ये Dounce homogenization, ठीक सुई व्यवधान, गेंद असर homogenization, sonication और नाइट्रोजन cavitation शामिल हैं । यहां हम नाइट्रोजन cavitation का मूल्यांकन और अंय तरीकों से तुलना करें । नाइट्रोजन cavitation उच्च दबाव के तहत कोशिकाओं के कोशिका में भंग कर रहा है कि नाइट्रोजन पर निर्भर करता है । equilibration के बाद, सेल निलंबन अचानक वायुमंडलीय दबाव ऐसी है कि नाइट्रोजन बुलबुले कोशिका कि आंसू अपने बुदबुदाहट का एक परिणाम के रूप में सेल खोलने में गठन कर रहे है के संपर्क में है । यदि दबाव पर्याप्त उच्च है, नाइट्रोजन बुदबुदाहट नाभिक को बाधित कर सकते हैं3 और झिल्ली बंधे organelles की तरह lysosomes4. हालांकि, अगर दबाव काफी कम रखा है, संपीड़न प्लाज्मा झिल्ली और एर लेकिन नहीं अंय organelles बाधित है, जिससे दोनों cytosol और बरकरार cytoplasmic organelles homogenate कि cavitate5नामित है में फैल जाएगा । इस कारण से, नाइट्रोजन cavitation lysosomes और mitochondria की तरह organelles को अलग करने के लिए पसंद की विधि है ।

हालांकि, यह भी एक homogenate है कि आसानी से झिल्ली और घुलनशील भागों में अलग किया जा सकता है तैयार करने का एक शानदार तरीका है । दबाव पोत (बाद में कहा जाता है "बम") cavitation के दौरान इस्तेमाल एक मोटी स्टेनलेस स्टील आवरण है कि उच्च दबाव झेलने के होते हैं, एक टैंक से नाइट्रोजन गैस के वितरण के लिए एक प्रवेश और एक समायोज्य निर्वहन वाल्व के साथ एक दुकान बंदरगाह के साथ ।

नाइट्रोजन cavitation सेल homogenization के लिए 1960 के दशक के बाद से इस्तेमाल किया गया है6। १९६१ में, हंटर और Commerfold7 स्तनधारी ऊतक व्यवधान के लिए एक व्यवहार्य विकल्प के रूप में नाइट्रोजन cavitation की स्थापना की । तब से, शोधकर्ताओं ने तकनीक को सफलता के साथ विभिंन कोशिकाओं और ऊतकों को अनुकूलित किया है, और नाइट्रोजन cavitation झिल्ली की तैयारी सहित कई अनुप्रयोगों में एक प्रधान बन गया है8,9, नाभिक और organelle तैयारी10,11, और labile जैव रासायनिक निष्कर्षण । वर्तमान में, सेल जीव अधिक बार सेल homogenization के अंय तरीकों को रोजगार क्योंकि नाइट्रोजन homogenization के लाभों को व्यापक रूप से विज्ञापित नहीं किया गया है, नाइट्रोजन बम महंगे है और वहां एक गलत धारणा है कि कोशिकाओं की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या है आवश्यक. बरकरार नाभिक के साथ सेल मुक्त homogenates प्राप्त करने के लिए नाइट्रोजन cavitation के लिए प्रोटोकॉल प्रकाशित नहीं किया गया है, और सेल निलंबन के 20 मिलीलीटर के सबसे प्रकाशित मूल्यांकन संस्करणों में इस्तेमाल किया गया । छोटे पैमाने के नमूनों के साथ काम करने की वर्तमान आवश्यकताओं के अनुरूप करने के लिए इस क्लासिक तकनीक को अनुकूलित करने के लिए, हम विशेष रूप से संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के लिए बनाया गया नाइट्रोजन cavitation का एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । नाइट्रोजन cavitation के बाद, homogenate में घुलनशील (S) और झिल्ली (P) भिन्न है अंतर केंद्रापसारक द्वारा, नाभिक और अटूट कोशिकाओं को दूर करने के लिए एक कम गति स्पिन के साथ पहले, और फिर एक उच्च गति स्पिन के साथ (& #62; १००,००० x g) अलग करने के लिए घुलनशील अंश से झिल्ली. हम immunoblots के साथ जुदाई की दक्षता का विश्लेषण और अन्य यांत्रिक व्यवधान तकनीक के साथ नाइट्रोजन cavitation की तुलना करें । हम भी नाइट्रोजन cavitation के दौरान homogenization बफर के परासरणी प्रभाव की जांच ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. बफर और उपकरण तैयारियां

  1. चिल ४५ एमएल सेल व्यवधान बम, 15 मिलीलीटर ट्यूबों, और ultracentrifugation ट्यूबों पर 4 & #176; ग.
  2. तैयार और चिल homogenization बफर के 25 मिलीलीटर प्रति 2 x 10 7 कोशिकाओं पर 4 & #176; C. बस उपयोग करने से पहले एक छेड़-छाड़ अवरोधक गोली जोड़ें.
    नोट: Homogenization बफ़र्स आमतौर पर KCl के बजाय बेहतर intracellular नमक संरचना प्रतिबिंबित करने के लिए NaCl होते हैं । Homogenization बफर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 10 मिमी HEPES पर पीएच ७.४, 10 मिमी KCl और १.५ मिमी MgCl 2 (बाद में hypotonic Homogenization बफर के रूप में संदर्भित) के होते हैं । अधिकांश बफ़र्स नाइट्रोजन cavitation के लिए अनुकूलित किया जा सकता ( चर्चा देखें) ।
  3. तैयार है और हल्का 1x फास्फेट के 6 मिलीलीटर-बफर खारा (पंजाब) के प्रति नमूना बफर पर 4 & #176; C. उपयोग करने से पहले नए सिरे से जोड़ने के लिए संकोचन अवरोधक गोलियों जोड़ें.
    नोट: इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त पंजाबियों बफर 10 मिमी न 2 HPO 4 पर पीएच ७.४, १.८ मिमी KH 2 PO 4 , १३७ मिमी NaCl और २.७ मिमी KCl.
  4. तैयार करें और ठंडा 4 एमएल प्रति नमूना solubilization बफर के 4 & #176; C. बस उपयोग करने से पहले एक छेड़-छाड़ अवरोधक गोली जोड़ें.
    नोट: Solubilization बफर इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया 1x Radioimmunoprecipitation परख (RIPA) बफर, जो पीएच ७.४, १५० mm NaCl, ०.१% एसडीएस, ०.५% सोडियम deoxycholate, और 1% NP-४० में 25 मिमी Tris के होते हैं । ४.६ नोट देखें.
< p class = "jove_title" > 2. सेल हार्वेस्टिंग

  1. Grow 2 x 10 7 -10 x10 9 टिशू कल्चर सेल प्रकार के लिए अनुशंसित संस्कृति मीडिया के साथ कोशिकाओं । आमतौर पर, १ १५-cm डिश पैदावार 2 x 10 7 HEK-२९३ cells में DMEM में cultureed ९०% पर प्रवाह (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
  2. वृद्धि मध्यम वैक्यूम द्वारा निकालें ।
  3. अनुयाई कोशिकाओं के लिए
  4. , बर्फ पर संस्कृति व्यंजन जगह, ठंडा homogenization बफर के साथ धीरे संस्कृति व्यंजनों पर सीधे कोशिकाओं को धोने (10 मिलीलीटर बफर प्रति 15 मुख्यमंत्री पकवान) और फसल की एक उपयुक्त मात्रा में एक बड़े सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं homogenization बफर; निलंबन कक्षों के लिए, लीजिए और ठंडा homogenization बफर में सेल गोली धोने दो बार (10 मिलीलीटर बफर प्रति ५०-एमएल संस्कृति प्रति धो) के साथ ५०० x g स्पिन पर 4 & #176; सी के लिए 5 मिनट, और बर्फ पर homogenization बफर का एक उचित मात्रा में धोया सेल गोली reसस्पेंड ।
    नोट: मात्रा इरादा प्रयोगों में प्रोटीन एकाग्रता के लिए आवश्यकताओं पर आधारित होना चाहिए के रूप में अच्छी तरह के रूप में न्यूनतम/अधिकतम मात्रा सेल व्यवधान बम में अनुमति दी । एक सामांय दिशानिर्देश 2-10 x 10 7 कोशिकाओं/एमएल, या सेल गोली के बारे में 10 संस्करणों है । इस प्रोटोकॉल homogenization बफर के 2 मिलीलीटर में HEK-२९३ कोशिकाओं के ३ १५-cm व्यंजन के लिए अनुकूलित है ।
< p class = "jove_title" > 3. नाइट्रोजन Cavitation

  1. एक हलचल प्लेट पर एक बर्फ स्नान में एक स्वच्छ और ठंडा बम करने के लिए सेल निलंबन स्थानांतरण ।
    सावधानी: बम में हाई ब्लडप्रेशर, कम तापमान, नाइट्रोजन गैस & #8211; पहनें उपयुक्त पर्सनल प्रोटेक्शन .
  2. जगह बम के अंदर एक माइक्रो चुंबकीय हलचल बार और निलंबन एकरूपता बनाए रखने के लिए हलचल प्लेट पर बारी ।
  3. निलंबन के लिए एक छेड़-छाड़ अवरोधक टैबलेट जोड़ें और प्रति निर्माता & #39; s अनुदेश.
  4. धीरे से बम के साथ एक नाइट्रोजन गैस की टंकी के साथ दबाव प्रति निर्माता & #39; s अनुदेश तक बम दबाव गेज ३०० से ६०० साई पढ़ता है. सभी वाल्व बंद करें और नाइट्रोजन टैंक को डिस्कनेक्ट कर ᱶ ।
    नोट: आवश्यक दबाव कक्ष प्रकार के साथ भिन्न हो सकते हैं । यहाँ हम HEK-२९३, NIH-3T3 और Jurkat कोशिकाओं के लिए ३५० ४०० psi करने के लिए cavitation पर प्रदर्शन किया.
  5. 20 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए नाइट्रोजन को भंग करने और कोशिकाओं के भीतर संतुलन तक पहुंचने की अनुमति है ।
  6. एक कपड़े तौलिया का उपयोग कर निर्वहन वाल्व के आसपास अतिरिक्त पानी निकालें । homogenate के एक dropwise रिलीज को प्राप्त करने और एक पूर्व ठंडा 15 मिलीलीटर ट्यूब में इकट्ठा करने के लिए धीरे निर्वहन वाल्व खोलो ।
    नोट: संग्रह के अंत के पास homogenate की एक तेजी और एक सिसकारी ध्वनि के साथ उभर जाएगा गैस होगा । सुनिश्चित करें कि गैस पहले एकत्र cavitate ट्यूब से बाहर शूट करने के लिए कारण नहीं है (इसलिए १.५ मिलीलीटर ट्यूबों के बजाय 15 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग) । एक बार तेजी शुरू होता है, निर्वहन वाल्व बंद करो और अचानक depressurize को बम के लिए और बम में शेष कोशिकाओं के cavitation हासिल करने के लिए नाइट्रोजन प्रवेश वाल्व खुला । cavitate वसूली और पूरी तरह से सफाई के लिए बम खोलो ।
    नोट: अंतिम cavitate शीर्ष पर फोम के साथ एक दूधिया उपस्थिति होना चाहिए । धीरे एक पिपेट टिप के साथ हिलाओ करने के लिए फोम की अनुमति के लिए केंद्रापसारक से पहले उपपक्ष ।
    नोट: homogenization दक्षता निर्धारित करने के लिए चरण-कंट्रास्ट माइक्रोस्कोपी द्वारा cavitate की जांच करें । एक माइक्रोस्कोपी स्लाइड की सतह के लिए cavitate की एक 15 & #181; L ड्रॉप जोड़ें और एक coverslip के साथ कवर. केवल बहुत अधिक अटूट कक्ष एक 20X उद्देश्य के साथ पाया जाता है, तो चरण 3.4-3.6 दोहराएँ ।
    नोट: homogenization बफ़र EDTA या EGTA शामिल नहीं है, तो इसे एकत्रित cavitate के लिए 1 mM के अंतिम एकाग्रता में 5 मिनट के भीतर निर्वहन के बाद जोड़ें ।
< p class = "jove_title" > 4. Cytosolic और झिल्ली अंश की जुदाई

  1. केंद्रापसारक पर cavitate ५०० x g पर 10 मिनट के लिए 4 & #176; सी टूटी हुई कोशिकाओं और नाभिक को हटाने के लिए.
    नोट: कोई दिखाई गोली का उत्पादन किया है जब तक कि केंद्रापसारक कदम दोहराने और पोस्ट परमाणु Supernatant (पीएन) इकट्ठा जबकि शीर्ष पर तैर फोम से परहेज । फिर से फोम केंद्रापसारक को आगे इकट्ठा और पीएन गठबंधन, यदि आवश्यक हो (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 1 ).
  2. पीएन की प्रक्रिया के रूप में ब्याज के अंश प्राप्त करने के लिए वांछित । cytosolic और झिल्ली भिन्न अलग करने के प्रयोजन के लिए, एक ultracentrifuge ट्यूब करने के लिए पीएन हस्तांतरण और वांछित के रूप में ultracentrifugation प्रदर्शन. यह प्रोटोकॉल एक & #60 के लिए ऑप्टिमाइज़ किया गया है; एक पाली कार्बोनेट ultracentrifuge ट्यूब में ३.५ मिलीलीटर नमूना और ultracentrifugation के लिए ३५०,००० x g पर 1 ज के लिए 4 & #176; C.
  3. इकट्ठा supernatant (एस अंश) का उपयोग कर एक 1 मिलीलीटर पिपेट.
  4. ध्यान से यह परेशान बिना ठंडा पंजाबियों के 3 मिलीलीटर के साथ गोली कुल्ला । द्वारा पंजाबियों निकालें वैक्यूम.
    नोट: यदि cytosolic प्रोटीन द्वारा झिल्ली अंश के संदूषण नमूना के नुकसान की तुलना में एक बड़ा चिंता का विषय है, ठंड पंजाबियों के 3 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड और ४.२ कदम के रूप में फिर से ultracentrifuge । द्वारा पंजाबियों निकालें वैक्यूम.
  5. पूरी तरह से डिटर्जेंट की एक उपयुक्त मात्रा में गोली reसस्पेंड-पसंद की solubilization बफर युक्त । कोशिका तुल्यता प्राप्त करने के लिए, cytosolic अंश के रूप में solubilization बफ़र का एक ही वॉल्यूम का उपयोग करें ।
    नोट: हम कुशल झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण के लिए solubilization बफर के रूप में 1x RIPA बफर का उपयोग सुझाव देते हैं । कोई बहाव परख झिल्ली अंश के लिए आवश्यक है, तो अधिक से अधिक झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण के लिए 1x laemmli नमूना बफर का उपयोग करें ।
    नोट: हम विsolubilization बफर में 4 & #176 पर एक ट्यूब रोटेटर पर एक साफ ट्यूब करने के लिए, और अधिक से अधिक झिल्ली प्रोटीन निष्कर्षण के लिए नोट: यदि गोली भी चिपचिपा (बहुत अधिक लिपिड) है कुशलतापूर्वक गु से हटा दियाई ultracentrifuge ट्यूब solubilization बफर में, हम सलाह देते हैं स्नैप ठंड गोली में तरल नाइट्रोजन और जल्दी से गोली सड़ ultracentrifuge ट्यूब से एक मिनी धातु रंग से पहले गोली गल.
    नोट: वैकल्पिक रूप से, झिल्ली छर्रों सिर्फ reसस्पैंड किया जा सकता है और एक गैर में solubilized नहीं-डिटर्जेंट-युक्त बफर झिल्ली पुटिका निलंबन के एक पी अंश है, जो मामले में ४.६ में केंद्रापसारक कदम की आवश्यकता नहीं है उपज । ऐसे पी अंशों उपयोगी है जब कार्य की जांच जैसे एंजाइम गतिविधियों कि झिल्ली एसोसिएशन पर निर्भर कर रहे हैं ।
  6. ४.५ कदम से पूरी तरह से solubilized गोली निलंबन केंद्रापसारक २०,००० x जी में एक तालिका में 10 मिनट के लिए 4 पर & #176; C. एक 1 मिलीलीटर पिपेट (पी अंश) का उपयोग कर supernatant लीजिए और गोली (अघुलनशील लिपिड) त्यागें.
  7. cytosolic और/या झिल्ली भिन्न के साथ पश्चिमी सोख्ता के रूप में वांछित परख प्रदर्शन, या उन पर बचाने के लिए-८० & #176; C भविष्य के उपयोग के लिए.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

चित्रा 2 या तो घुलनशील cytosolic अंश (ओं) या झिल्ली गोली अंश (पी) में पीएन से सेलुलर प्रोटीन के विभाजन से पता चलता है । हम विभिंन प्रकार के सेल से तीन प्रतिनिधि सेल लाइनों की जांच: HEK-२९३ (उपकला), NIH-3T3 (fibroblast), और Jurkat (लिम्फोसाइट) । Rho Guanine पृथक्करण अवरोध करनेवाला (RhoGDI) और कटियन-स्वतंत्र mannose-6-फॉस्फेट रिसेप्टर (CIMPR) क्रमशः cytosolic और झिल्ली अंशों के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. हम cytosol और झिल्ली के कुशल जुदाई की पुष्टि की hypotonic बफर में ~ ३५० psi पर नाइट्रोजन cavitation के बाद ३५०,००० एक्स जी के लिए 1 घंटे में ultracentrifugation द्वारा पीछा किया । एस और पी अंश से बरामद कुल प्रोटीन तो एर, endosomes और lysosomes, mitochondria, Golgi, और अंय organelles के लिए मार्करों के साथ विश्लेषण किया गया । सभी transmembrane प्रोटीन झिल्ली अंश में विशेष रूप से मौजूद हैं, ना+/K+ ATPase और एपिडर्मल वृद्धि कारक रिसेप्टर (प्लाज्मा झिल्ली से EGFR), calnexin से एर, लाइसोसोमल से जुड़े झिल्ली प्रोटीन 1 (LAMP1) सहित से lysosomes, च0-ATPase से mitochondria, और ट्रांस Golgi नेटवर्क से Golgin ९७ । के रूप में उंमीद है, कई परिधीय झिल्ली प्रोटीन है कि शिथिल झिल्ली के साथ जुड़े रहे हैं, दोनों cytosolic और झिल्ली भागों में मौजूद है डिग्री बदलती । उल्लेखनीय उदाहरण अर्ली endosome प्रतिजन 1 (EEA1), Rab7/9 (स्वर्गीय endosomes) और hexokinase 1 (बाहरी mitochondria झिल्ली) शामिल हैं । यह परिधीय प्रोटीन की झिल्ली संघ शक्ति के मूल्यांकन में इस तकनीक की उपयोगिता को दर्शाता है । हमारी प्रयोगशाला इस cavitation तकनीक का लाभ ले लिया है कई संकेतन अणुओं की झिल्ली एसोसिएशन की स्थिति की जांच करने के लिए5,12,13,14। दिलचस्प है, हम घुलनशील अंश में लगभग अनंय रूप से calregulin पाया, सुझाव है कि एर झिल्ली से उत्पंन microsomes भी नाइट्रोजन cavitation के दौरान बाधित किया गया है और एर लुमेन में प्रोटीन घुलनशील अंश के लिए जारी किए गए हैं । इसके विपरीत, cavitation के बाद mitochondria की अखंडता कक्ष प्रकार पर निर्भर है । हम एफ1-ATPase, एक इनर mitochondria परिधीय प्रोटीन, आंशिक रूप से NIH-3T3 कोशिकाओं के लिए 2% से लेकर cytosolic अंश में HEK-२९३ और Jurkat कोशिकाओं के लिए ~ ३५% मनाया । यह इंगित करता है कि नाइट्रोजन cavitation hypotonic बफर के साथ ३५० psi पर mitochondrial अखंडता सुनिश्चित नहीं करता है । ५०० x g स्पिन के तीन चक्र cavitate से पीएन उत्पन्न करने के बावजूद, सभी नाभिक नहीं निकाले गए. citrullinated deacetylase 1 (HDAC1) से nucleoplasm और fibrillarin से nucleolus, पीएन और गोली में दोनों पाए गए. गोली में HDAC1 की उपस्थिति और supernatant में नहीं पता चलता है कि पीएन नाभिक के साथ दूषित है, बजाय परमाणु व्यवधान cavitation के दौरान । इस रिपोर्ट के अनुरूप है कि ज़ोर ३५० साई के लिए बम नाभिक बरकरार10छोड़ देता है, हालांकि hypotonic बफर के हमारे उपयोग नाभिक नाजुक प्रदान कर सकते हैं, के रूप में बाद में अनुभाग में चर्चा की ।

हम अंय आम शारीरिक व्यवधान विधियों के साथ नाइट्रोजन cavitation के homogenization दक्षता की तुलना में । समान hypotonic homogenization बफ़र में Jurkat कक्षों की बराबर मात्रा निलंबित किया गया और भिन्न व्यवधान विधियों के अधीन । वहां Dounce homogenization और नाइट्रोजन cavitation में नमूनों की पहचान की हानि (दोनों मामलों में लगभग 5-10% कम मात्रा में एकत्र किया जाता है) था । हालांकि, नाइट्रोजन cavitation उच्चतम प्रोटीन निष्कर्षण क्षमता दी; सुई मार्ग और Dounce अधिक प्रोटीन (चित्रा 3) के रूप में केवल ६०% उपज । मजे की बात है, के रूप में immunoblot द्वारा निर्धारित कुछ प्रोटीन की वसूली अलग यांत्रिक व्यवधान तरीकों के बीच एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखा था । हालांकि, कुछ परिधीय झिल्ली प्रोटीन की उपज जैसे hexokinase 1 और रास नाइट्रोजन cavitation के साथ तैयार नमूनों में अधिक था । यह समर्थन करता है कि नाइट्रोजन cavitation homogenization के लिए इष्टतम हो सकता है जब परिधीय झिल्ली प्रोटीन की जांच । नाइट्रोजन cavitation द्वारा HDAC1 प्रोटीन की वसूली अन्य विधियों के लिए तुलनीय है, सुझाव है कि नाभिक सभी स्थितियों में बरकरार रहते हैं । इस प्रकार, चित्रा 3 में डेटा साबित होता है कि नाइट्रोजन cavitation बेहतर homogenization परिणाम प्रदान करता है ।

अगले, हम hypotonic बफर और एक ही बफर के बीच homogenization दक्षता की तुलना में, लेकिन या तो सुक्रोज या सोडियम क्लोराइड के साथ isotonic बनाया (चित्रा 4). प्रोटीन की समान मात्रा में ३५० साई पर cavitation के बाद hypotonic बफर बनाम NaCl isotonic बफर में Jurkat कोशिकाओं homogenized से बरामद किए गए । इसके विपरीत, सुक्रोज के साथ isotonic किए गए बफर में बाधित कोशिकाओं के पीएन में कम प्रोटीन बरामद किया गया । ज्यादातर व्यक्तिगत प्रोटीन immunoblot द्वारा जांच की इस पद्धति फिट बैठते हैं । एक अपवाद fibrillarin था जो अपेक्षाकृत isotonic बफ़र में जनरेट पीएन में समृद्ध किया गया था ।

निर्धारित करने के लिए यदि हमारे प्रोटोकॉल घुलनशील और झिल्ली भागों के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है, हम ध्वज के बीच पैटर्न विभाजन की तुलना में-NRAS जंगली प्रकार और उसके prenylation-की कमी उत्परिवर्ती, C186S टैग ( चित्र 5) । स्थिर राज्य में, जंगली प्रकार NRAS दोनों cytosol और झिल्ली, सबसे परिधीय झिल्ली प्रोटीन के समान में मौजूद था, हालांकि घुलनशील अंश में बरामद भाग अंय रास प्रोटीन के लिए से अधिक है14। जब NRAS अपने prenyl संशोधन से वंचित है, यह झिल्ली के साथ संबद्ध करने की क्षमता खो देता है और पूरी तरह से cytosolic हो जाता है । NRAS की उंमीद विभाजन पैटर्न की पुष्टि की है कि हमारे प्रोटोकॉल एक विश्वसनीय को cytosol और झिल्ली के बीच परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की गतिशीलता का अध्ययन विकल्प है ।

Figure 1
चित्र 1: फ़्लोचार्ट सारांश चरण 2 (नीला), चरण 3 (लाल) और प्रोटोकॉल का चरण 4 (पीला). कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: cytosolic और झिल्ली भागों के बीच प्रोटीन विभाजन. HEK-२९३, NIH-3T3 और Jurkat कोशिकाओं नाइट्रोजन cavitation के अधीन थे (~ ३५० साई 20 मिनट के लिए, hypotonic homogenization बफर में निलंबित) और ultracentrifugation (~ ३५०,००० एक्स जी के लिए 1 ज) प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में । विभिंन भागों में अंतर्जात प्रोटीन का स्तर immunoblot द्वारा विश्लेषण किया गया । पीएन: रिसेप्टर-बाध्यकारी कैंसर प्रतिजन सिसौ कोशिकाओं पर व्यक्त (्कैस), परमाणु supernatant, एस: supernatant, पी: गोली । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न यांत्रिक व्यवधान तकनीक की तुलना. Jurkat कोशिकाओं की बराबर राशि hypotonic बफर में निलंबित कर दिया गया और फ्रीज के अधीन-गल (3 चक्र), सुई गद्यांश (5 गुजरता है, 28G ½ सुई के माध्यम से), Dounce homogenization (15 गुजरता है, Kontes 2 मिलीलीटर Dounce ट्यूब एक ऊतक पीसने के साथ, की मंजूरी 0.01-0.06 मिमी) या नाइट्रोजन cavitation (~ ३५० साई 20 मिनट के लिए) । पीएन में अंतर्जात प्रोटीन के सापेक्ष स्तर प्रत्येक विधि के लिए immunoblot द्वारा विश्लेषण किया गया । पीएन के कुल प्रोटीन सांद्रता मात्रा थे बीसीए असचy और नाइट्रोजन cavitation द्वारा तैयार पीएन के मूल्य के लिए सामान्यीकृत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4: नाइट्रोजन cavitation के दौरान प्रयुक्त hypotonic और isotonic बफ़र्स की तुलना । Jurkat कोशिकाओं की बराबर मात्रा या तो hypotonic बफर में निलंबित कर दिया गया, या hypotonic बफर ८.५% सुक्रोज या १५० mM NaCl के साथ पूरक, और नाइट्रोजन cavitation (~ ३५० साई 20 मिनट के लिए) के अधीन । पीएन में अंतर्जात प्रोटीन के सापेक्ष स्तर प्रत्येक बफर के लिए immunoblot द्वारा विश्लेषण किया गया । पीएन की कुल प्रोटीन सांद्रता बीसीए परख द्वारा मात्रा और hypotonic बफर में तैयार पीएन के मूल्य को सामान्यीकृत किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: Farnesylated NRAS विभाजन दोनों पी और एस भागों में । HEK-२९३ कोशिकाओं क्षणिक ध्वज की अभिव्यक्ति निर्देशन plasmids के साथ transfected थे-टैग NRAS जंगली प्रकार या C186S उत्परिवर्ती । प्रोटीन विभाजन के रूप में प्रदर्शन किया गया था चित्रा 2 में वर्णित है और संकेत प्रोटीन का स्तर immunoblot द्वारा विश्लेषण किया गया । अनुमति के साथ reproduced (झोउ, एम एट अल., २०१६ । मूल रूप से सेल जीवविज्ञान के जर्नलमें प्रकाशित । https://doi.org/10.1083/jcb.201604061) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यांत्रिक व्यवधान के अंय तरीकों पर नाइट्रोजन cavitation के लाभ कई गुना हैं । शायद सबसे महत्वपूर्ण लाभ अपने धीरे अभी तक कुशलतापूर्वक homogenize नमूनों की क्षमता है । संपीड़न के भौतिक सिद्धांतों के बजाय अल्ट्रासोनिक और घर्षण की तरह स्थानीय हीटिंग क्षति पैदा करने के नमूनों को ठंडा/ Cavitation प्लाज्मा झिल्ली को बाधित करने में भी अत्यंत कुशल है । नाइट्रोजन बुलबुले संपीड़न पर प्रत्येक व्यक्ति सेल के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं, क्योंकि cavitation प्रक्रिया सेल आकार, नमूना आकार या नमूना एकाग्रता से कम सीमित है । इसलिए यह मंजूरी आधारित Dounce या सुई मार्ग homogenization पर अतिरिक्त लाभ प्रदान करता है । नाइट्रोजन cavitation भी समान दबाव के साथ reproduced किया जा सकता नमूना भर समान रूप से लागू है कि एक ही विघटनकारी बल के रूप में अधिक सुसंगत परिणाम प्रदान करता है । इसके अलावा, प्रत्येक कोशिका केवल एक ही समय और सेलुलर घटकों के लिए विघटन की प्रक्रिया का अनुभव कर रहे हैं, इसलिए, लगातार चर विघटनकारी बलों को उजागर नहीं । यह organelles के artefactual फ़्रेग्मेंटेशन को सीमित करता है । labile सेलुलर घटकों के ऑक्सीकरण के लिए चिंता का कारण व्यवधान की वजह से भी कम है, के रूप में नाइट्रोजन सेल निलंबन संतृप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है और पूरक ऑक्सीजन से मुक्त है । प्रतिबंधित भौतिक और रासायनिक तनाव नाइट्रोजन cavitation द्वारा लगाया यह एक आदर्श तकनीक labile एंजाइमों और नाजुक organelles का अध्ययन करने के लिए बनाता है, और इस homogenization तकनीक के reproducibility अच्छी तरह से ठहराव के लिए अनुकूल है ।

नाइट्रोजन cavitation भी नमूना आकार, homogenization बफ़र्स की संरचना, और organelle अखंडता की डिग्री के संबंध में महत्वपूर्ण लचीलापन प्रदान करता है । ऊपर homogenization पैमाने, एक बस की गति, सुविधा या संपीड़न की दक्षता त्याग के बिना, बड़ी क्षमताओं के दबाव वाहिकाओं को तैनात करने की जरूरत है । किसी भी homogenization बफर नाइट्रोजन cavitation के लिए इस्तेमाल किया जा सकता; बफर विकल्प प्रत्येक प्रयोग की आवश्यकताओं के साथ संगतता के लिए सिलवाया जा सकता है । एक एक homogenization बफर डिजाइन कर सकते है कि intracellular द्रव (जैसे, उच्च पोटेशियम और कम सोडियम) मैच organelles में परिवर्तन को कम करने के लिए । उदाहरण के लिए, हम एक "छूट" बफर है कि पूर्व vivo actin बहुलकीकरण कम कर देती है और इस तरह granulocytes5से बरकरार cytoplasmic बुलबुले इकट्ठा करने में सहायता विकसित की है । परासरणी और ईओण बफर की सुविधाओं को भी सेल homogenization की डिग्री को नियंत्रित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । साथ ही, नाइट्रोजन के दबाव को एडजस्ट करके सेलुलर व्यवधान की बुद्धिमता को नियंत्रित किया जा सकता है । उदारवादी दबाव नाभिक, mitochondria और अन्य organelles को अक्षुण्ण स्थिति में बनाए रखने के लिए विघटनकारी शक्ति को कम करता है, जबकि उच्च दाब इन organelles को बाधित कर देता है । बिज्जू एट अल। चूहे Basophilic ल्यूकेमिया कोशिकाओं के विघटन के साथ सफलता की सूचना दी जबकि सबसे नाभिक hypotonic बफर के साथ ३५० साई पर बरकरार बनाए रखने10, जो हमारे वर्तमान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल नाइट्रोजन दबाव के आधार रूपों ।

नाइट्रोजन cavitation की सीमाएं तथ्य यह है कि homogenization नमूने भर में एक समान है और अलग झिल्ली संरचनाओं समान आकार के बुलबुले का उत्पादन हो सकता है शामिल; यह प्लाज्मा झिल्ली के आगे जुदाई जटिल कर सकते हैं, चिकनी microsomes, endosomes और Golgi झिल्ली दर-आंचलिक घनत्व ढाल केंद्रापसारक द्वारा । एक और चिंता का विषय यह है कि organelles के भीतर से टूटना के कारण homogenization के बाद अपेक्षाकृत नाजुक हो जाते हैं. इस प्रकार, इस विधि के बाद जोड़तोड़ में organelle टूटना को रोकने के लिए सावधान अनुकूलन की आवश्यकता है । हम इस अध्ययन में इन मुद्दों में से कुछ को संबोधित करने के उद्देश्य से ।

cytosolic और झिल्ली अंशों के पृथक्करण द्वारा सीमित प्रोटीन के एक मुट्ठी भर के साथ प्रोटीन भागों के विभाजन का ब्यौरा रिपोर्ट में पता लगाया गया है15,16मार्करों । हमारे विधि घुलनशील और झिल्ली से बंधे प्रोटीन की एक क्रूड जुदाई उत्पंन करता है, और विशेष organelles के अलगाव शामिल नहीं है । अभी तक, यह अभी भी एक वैध चिंता का विषय है कि cavitation द्वारा उत्पादित अलग झिल्ली के समरूप बुलबुले ultracentrifugation द्वारा जुदाई की दक्षता को प्रभावित कर सकता है । हम अलगाव के immunoblots और हमारे प्रोटोकॉल के साथ आंशिकीकरण के बाद आम उपसेलुलर organelles के विभाजन के द्वारा एक व्यापक सर्वेक्षण प्रस्तुत किया । के रूप में की उंमीद है, विशुद्ध रूप से RhoGDI तरह cytosolic प्रोटीन घुलनशील अंश में विशेष रूप से कर रहे हैं, और प्लाज्मा झिल्ली (प्रधानमंत्री) पर transmembrane प्रोटीन जैसे EGFR और Na+/K+ ATPase, गोली में ही बरामद किए गए । एर, mitochondria, Golgi और lysosomes जैसे organelles पर Transmembrane प्रोटीन भी गोली में बरामद किए गए थे, पुष्टि की है कि अभिंन झिल्ली प्रोटीन अलग झिल्ली और organelles से सफलतापूर्वक घुलनशील प्रोटीन के साथ से अलग किया जा सकता है हमारी विधि । इस बुनियादी सत्यापन परिधीय झिल्ली प्रोटीन के आगे विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, जो इस प्रोटोकॉल का मुख्य उद्देश्य है ।

परिधीय झिल्ली प्रोटीन के अधिकांश दोनों cytosolic और झिल्ली भागों में मौजूद हैं । हालांकि यह अक्सर अपने स्थानीयकरण के एक सच्चे प्रतिनिधित्व है, यह कुछ उदाहरणों में हो सकता है इन प्रोटीन के artefactual पुनर्वितरण homogenization प्रक्रिया के दौरान घुलनशील अंश को झिल्ली की cytoplasmic सतह से, के बाद से का प्रतिनिधित्व झिल्ली के साथ उनके सहयोग की ताकत अभिंन झिल्ली प्रोटीन के रूप में के रूप में मजबूत नहीं है । हालांकि नाइट्रोजन cavitation कोशिकाओं को एक बार, कोमल व्यवधान को उजागर करने के द्वारा संभावित पुनर्वितरण को कम करता है, एक जैव रासायनिक भिन्नीकरण की ऐसी कलाकृतियों के प्रति सजग होना चाहिए, और cytosolic के बीच प्रोटीन के विभाजन में परिवर्तन पर ध्यान केंद्रित और प्रयोगात्मक शर्तों के पार झिल्ली अंश । फिर भी, endosomal परिपक्वता के विभिंन चरणों में परिधीय झिल्ली प्रोटीन की परीक्षा इस विधि के साथ संभव है । EEA1, एक Rab5 प्रभाव है कि जल्दी endosomes के लिए clathrin लेपित बुलबुले के डॉकिंग मध्यस्थता, जल्दी cytoplasmic की endosomes सतह के लिए स्थानीयकरण और गोली अंश में मुख्य रूप से बरामद किया गया था । देर-endosome से संबंधित Rab7 और Rab9 प्रोटीन भी गोली अंश में होते हैं. हालांकि, वहां cytosol में Rab7/9 की एक प्रशंसनीय राशि बनी हुई है । क्योंकि RabGDI prenylated Rabs के साथ बातचीत और इन अंयथा अघुलनशील प्रोटीन cytosolic प्रदान करने में सक्षम है, ऄब प्रोटीन अंय cytosolic से संबंधित परिधीय झिल्ली प्रोटीन से अधिक endosome हो जाते हैं ।

नाइट्रोजन cavitation द्वारा homogenization के साथ परमाणु और organelle अखंडता की विशेषता के लिए, हम दोनों चमकीले और cytoplasmic डिब्बों के लिए अलग भिन्न immunoblotted । इस विश्लेषण में, calregulin पूरी तरह से घुलनशील अंश में जारी किया गया है, का प्रदर्शन है कि एर microsomes फार्म करने के लिए बाधित है और इस तरह चमकदार सामग्री लीक । यह देखते हुए कि एक युकेरियोटिक कोशिका में झिल्ली के कुल क्षेत्र का एक आधा एर के जटिल रिक्त स्थान पडते, यह आश्चर्य की बात है कि थैली की तरह या ट्यूबलर संरचना के अपने विशाल नेटवर्क नाइट्रोजन बुलबुले के विस्तार के दौरान बरकरार रहने के लिए विफल रहता है । दूसरी ओर, mitochondrial अखंडता के हमारे विश्लेषण के बाद cavitation सेल प्रकार पर स्पष्ट निर्भरता से पता चलता है, के रूप में हम मनाया च1-ATPase, एक प्रोटीन है कि बाह्य mitochondria के भीतरी झिल्ली के साथ जुड़ा हुआ है, cytosolic अंश में डिग्री अलग करने के लिए (~ ३५% HEK के लिए-२९३ और Jurkat, NIH के लिए 2%-3T3) । यह इंगित करता है कि नाइट्रोजन cavitation hypotonic बफ़र के साथ ३५० psi पर mitochondrial अखंडता की गारंटी नहीं है । दरअसल, दूसरों को सूचित किया है कि mitochondria के संरक्षण के लिए, cavitation १५० साई17से कम दबाव पर प्रदर्शन किया जाना चाहिए । इसके विपरीत, हमने पाया है कि catalase peroxisomes के लुमेन में रहता है । पेचीदा, परमाणु प्रोटीन पीएन और गोली भागों में मनाया जाता है । विशेष रूप से, HDAC1, nucleoplasm भर में मौजूद एक citrullinated deacetylase, घुलनशील अंश में अनुपस्थित है, यह दर्शाता है कि परमाणु अखंडता समझौता नहीं है । यह पता चलता है कि परमाणु लिफाफा cavitation द्वारा टूटना नहीं है, के रूप में एक solub में HDAC1 की रिहाई की उंमीद होगीउस परिदृश्य में ले अंश । यह संभावित है कि नाभिक पूरी तरह से पीएन तैयारी की प्रक्रिया के दौरान नहीं हटा रहे है रहता है, और प्रोटीन ultracentrifugation के बाद गोली में रहता है । यह संभावना आगे तथ्य यह है कि कोई डीएनए रिसाव घुलनशील अंश में पता चला है द्वारा समर्थित है । हम निष्कर्ष निकालना, इसलिए, कि cavitation के दौरान hypotonic homogenization बफर का उपयोग कर ~ ३५० psi पर मिलीग्राम के अलावा2 + कई सेल लाइनों में परमाणु अखंडता को संरक्षित करने में सक्षम है ।

हमारे परिणाम भी प्रदर्शित करता है कि ribosomes झिल्ली गोली अंश में पूरी तरह से इकट्ठा, सुझाव है कि कोशिका में भी मुक्त ribosomes कि एर झिल्ली के लिए असीम है पूरी तरह से एक गैर सुक्रोज-तकिया बफर में तलछट हो सकता है के बाद केंद्रापसारक 1 एच के लिए ३५०,००० x जी में इसी तरह, autophagy-संबंधित प्रोटीन की पहचान 12 (Atg12)-autophagosomes के एक मार्कर के रूप में Atg5 संयुग्म, गोली भागों को सख्त अलगाव से पता चलता है । cytosol में इसकी उपस्थिति इस तथ्य के कारण हो सकती है कि Atg12 और Atg5 का आबंध-लगाव autophagosomes गठन से पहले होता है. Cytoskeletal प्रोटीन की वजह से ex vivo बहुलकीकरण का आकलन करना मुश्किल होता है. इस घटना को एक छूट बफर के साथ कम किया जा सकता है, लेकिन प्रोटोकॉल में यहां वर्णित है, tubulin की संभावना है बहुलक पूर्व vivo पर कैल्शियम की केलेशनथेरेपी 18 । हमारी तैयारी में tubulin गोली में पाया जाता है, जबकि बहुलकीकरण सुझाव actin दोनों पी और एस भागों में पाया जाता है ।

homogenization दक्षता में नाइट्रोजन cavitation के संभावित फायदों को चिह्नित करने के लिए, हमने कुछ सामान्य यांत्रिक व्यवधान तकनीकों की समीक्षा की । ऐसे ब्लेंडर या मोर्टार के रूप में ऊतक के नमूनों के लिए अनुकूलित तरीके मूल्यांकन नहीं किया गया/ Sonication भी बाहर रखा गया था के रूप में यह आंतरिक organelles बरकरार रखते हुए सतह झिल्ली को बाधित करने के लिए मुश्किल है । हमारे विश्लेषण निंनलिखित तरीकों पर ध्यान केंद्रित: फ्रीज गल, सुई मार्ग और Dounce homogenization, के रूप में वे प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे है और ऐसी गेंद असर homogenizer के रूप में विशेष उपकरणों की आवश्यकता नहीं है । Jurkat कोशिकाओं क्योंकि उनके छोटे आकार के इस विश्लेषण में इस्तेमाल किया गया है, जो उंहें पारंपरिक तरल कतरनी तकनीक है कि ऐसी सुई मार्ग और Dounce के रूप में मंजूरी पर निर्भर कर रहे है के साथ कुशलतापूर्वक homogenize करने के लिए मुश्किल renders । कुल प्रोटीन की एकाग्रता से ंयाय बरामद किया है, हमने पाया है कि कोशिका आकार ऐसे नाइट्रोजन cavitation और फ्रीज-गल के रूप में स्वतंत्र विघटन तरीकों वास्तव में प्रोटीन निष्कर्षण की बेहतर दक्षता दिखाते हैं । बड़े आकार की कोशिकाओं के साथ इसी तरह के विश्लेषण homogenization क्षमता में छोटे मतभेदों का पता चला, हालांकि नाइट्रोजन cavitation अभी भी वैकल्पिक भौतिक तरीकों का परीक्षण (डेटा नहीं दिखाया गया है) के लिए बेहतर है ।

सभी परीक्षण विधियों के साथ कई cytosolic, endosomal और cytoskeleton प्रोटीन कुशलतापूर्वक पुनर्प्राप्त किए गए । इसके विपरीत, एर और Golgi पर प्रोटीन बेहतर नाइट्रोजन cavitation का उपयोग कर बरामद किया गया । एफ के थोड़ा कम उपज1-ATPase नाइट्रोजन cavitation में अंय विधियों के सापेक्ष तथ्य यह है कि mitochondria अधिक cavitation के दौरान बरकरार रहने के लिए और इसलिए अधिक कुशलता से धीमी गति से इस्तेमाल किया स्पिन में हटा की संभावना है प्रतिबिंबित कर सकते है पीएन जनरेट करें । अवलोकन कि hexokinase 1, एक परिधीय झिल्ली प्रोटीन दोनों cytosol में पाया और बाहरी mitochondrial झिल्ली के साथ जुड़े, एफ के सापेक्ष फैशन में व्यवहार किया1-ATPase की संभावना के संघ के lability को दर्शाता है hexokinase 1 के सापेक्ष च1-ATPase, जो mitochondria के अंदर तनहा है । महत्वपूर्ण बात, हालांकि तुलनीय क्षमता के साथ कोशिकाओं को बाधित करने में सक्षम, वैकल्पिक यांत्रिक विघटन तरीकों कुछ परिधीय झिल्ली प्रोटीन (hexokinase 1 और रास) के अपेक्षाकृत गरीब वसूली दी । इस प्रकार, cavitation परिधीय झिल्ली प्रोटीन के विभाजन की जांच के प्रयोजन के लिए पसंद की हमारी homogenization तकनीक है । क्योंकि Dounce homogenization व्यापक रूप से बरकरार नाभिक तैयार करने के लिए प्रयोग किया जाता है, हम एक बेंचमार्क के रूप में इस्तेमाल किया Dounce अंय यांत्रिक विघटन तरीकों भर में परमाणु अखंडता का मूल्यांकन । हमारे विश्लेषण में, HDAC1 प्रोटीन की वसूली के समान स्तर की पुष्टि करते है कि नाभिक Jurkat homogenates में नाइट्रोजन cavitation द्वारा तैयार hypotonic बफर के साथ ~ ३५० साई में बरकरार रहेगा ।

यह स्पष्ट है कि homogenization बफर नाइट्रोजन cavitation के दौरान इस्तेमाल काफी व्यवधान दक्षता और organelle अखंडता को प्रभावित कर सकता था । जबकि homogenization बफर की संरचना इरादा आवेदन की आवश्यकताओं के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, यह ध्यान देने योग्य है कि शोधकर्ताओं ने पशु ऊतकों की नाइट्रोजन संपीड़न प्रदर्शन परमाणु निकालने के लिए एक कम परासरणी दबाव के साथ बफर का उपयोग करने लायक है सामग्री. हंटर और Commerford दिखाया नाभिक सूजन और टूटना जब समाधान पतला थे, और नाभिक संरक्षण जब isotonic समाधान का उपयोग कर7 (जो या तो जैसे सोडियम क्लोराइड या कार्बनिक solutes के रूप में अकार्बनिक लवण जोड़ने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है जैसे सुक्रोज या ग्लिसरॉल) । मानक isotonic बफर स्तनधारी कोशिकाओं से नाभिक के अलावा अन्य सेलुलर organelles अलग करने के लिए इस्तेमाल किया ०.२५ मीटर सुक्रोज युक्त 1 मिमी EDTA और Tris, HEPES, या Tricine के साथ पीएच 7.0-7.6 में बफर है । लेकिन सभी कल्चरल सेल को isotonic बफ़र्स में से किसी एक में कुशलता से homogenized जा सकता है । Hypotonic बफर (आमतौर पर 10 मिमी Tris, HEPES, आदि) अक्सर पूरा homogenization प्राप्त करने के लिए कुछ कोशिका प्रकार के लिए आवश्यक परासरणी तनाव प्रदान करने के लिए प्रयोग किया जाता है. हालांकि, जैसा कि पहले उल्लेख किया है, hypotonic बफ़र्स नाभिक नाजुक और डीएनए के रिसाव के लिए प्रवण जब EDTA शामिल है प्रदान करते हैं । परमाणु अखंडता को बढ़ावा देने के लिए, हम KCl और divalent cations की कम सांद्रता जैसे MgCl2 या MgSO4के साथ EDTA की जगह । 2 मिलीग्राम + आमतौर पर सीए2 + पर पसंद है, क्योंकि बाद कुछ phospholipases और चिढ़ाने और आरएनए पोलीमरेज़ को बाधित सक्रिय कर सकते हैं । एक बार cavitation समाप्त हो जाने पर, EDTA या EGTA को कटियन में chelate करने के लिए homogenates को वापस जोड़ा जा सकता है, यदि metalloproteases को बाधित करने की आवश्यकता हो ।

Jurkat कोशिकाओं को एक अपेक्षाकृत बड़े नाभिक-से-कोशिका अनुपात प्रदर्शन, उंहें एक आदर्श सेल लाइन बनाने के लिए परमाणु अखंडता का अध्ययन । hypotonic बफर का उपयोग करके homogenization दक्षता की वृद्धि कम है जब NaCl के साथ पूरक isotonic बफर की तुलना. हालांकि, cavitation एक isotonic बफ़र में सुक्रोज के साथ पूरक लगभग आधे प्रोटीन एक hypotonic बफर समकक्ष का उपयोग करके निकाले गए ठीक करता है । यह isotonicity का एक सीधा परिणाम होने की संभावना नहीं है, और NaCl का उपयोग कर के बीच विसंगति और सुक्रोज का उपयोग isotonicity को प्राप्त करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । एक संभव विवरण है कि नमक सुक्रोज जबकि प्रोटीन के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत बाधित नहीं करता है । इस प्रकार, यहां तक कि एक ही टॉनिक पर, NaCl एक प्रोटीन निष्कर्षण कि सुक्रोज अभाव के लिए प्रासंगिक गतिविधि है । wइथ परमाणु अखंडता के संरक्षण के संबंध में, हमने पाया fibrillarin प्रोटीन isotonic बफ़र्स के साथ बरामद, isotonic बफ़र्स सैद्धांतिक रूप से नाभिक की अधिक सुरक्षा के बावजूद । मजे की, mitochondrial अंश और अधिक कुशलता से isotonic बफर NaCl के साथ पूरक के साथ निकाला गया था, सुझाव है कि कम नमक की स्थिति mitochondria निष्कर्षण के लिए इष्टतम हो सकता है । hypotonic बफर के साथ cavitation पर विचार homogenization दक्षता और परमाणु अखंडता के बीच सबसे अच्छा संतुलन प्राप्त होता है, hypotonic बफर cavitation के हमारे प्रोटोकॉल में पसंद का बफर बन जाता है । हालांकि, हम पाठकों है कि कोई बफर इष्टतम homogenization परिणामों की गारंटी है सावधानी । हमारे प्रोटोकॉल अनुकूलन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा करना चाहिए, और वांछित बफ़र्स के साथ पायलट परीक्षण, ब्याज की सेल लाइनों, और अन्य चर (दबाव, बफर संरचना, आदि) सबसे अच्छा परिणाम के लिए स्थापित किया जाना चाहिए ।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

इस काम को GM055279, CA116034 और CA163489 ने वित्तपोषित किया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Miyawaki, A. Proteins on the move: insights gained from fluorescent protein technologies. Nat Rev Mol Cell Biol. 12, (10), 656-668 (2011).
  2. Bunger, S., Roblick, U. J., Habermann, J. K. Comparison of five commercial extraction kits for subsequent membrane protein profiling. Cytotechnology. 61, (3), 153-159 (2009).
  3. Simpson, R. J. Disruption of cultured cells by nitrogen cavitation. Cold Spring Harb Protoc. (11), (2010).
  4. Klempner, M. S., Mikkelsen, R. B., Corfman, D. H., Andre-Schwartz, J. Neutrophil plasma membranes. I. High-yield purification of human neutrophil plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation and differential centrifugation. J Cell Biol. 86, (1), 21-28 (1980).
  5. Philips, M. R., et al. Low molecular weight GTP-binding proteins in human neutrophil granule membranes. Journal of Biological Chemistry. 266, 1289-1298 (1991).
  6. Wallach, D. F., Soderberg, J., Bricker, L. The phospholipides of Ehrlich ascites carcinoma cells: composition and intracellular distribution. Cancer Res. 20, 397-402 (1960).
  7. Hunter, M. J., Commerford, S. L. Pressure homogenization of mammalian tissues. Biochim Biophys Acta. 47, 580-586 (1961).
  8. Wallach, D. F., Kamat, V. B. Plasma and Cytoplasmic Membrane Fragments from Ehrlich Ascites Carcinoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 52, 721-728 (1964).
  9. Birckbichler, P. J. Preperation of plasma membrane vesicles by nitrogen cavitation. TCA manual / Tissue Culture Association. 3, (3), 653-654 (1977).
  10. Brock, T. G., Paine, R. 3rd, Peters-Golden, M. Localization of 5-lipoxygenase to the nucleus of unstimulated rat basophilic leukemia cells. J Biol Chem. 269, (35), 22059-22066 (1994).
  11. Dowben, R. M., Gaffey, A., Lynch, P. M. Isolation of liver and muscle polyribosomes in high yield after cell disruption by nitrogen cavitation. FEBS Letters. 2, (1), (1968).
  12. Dai, Q., et al. Mammalian prenylcysteine carboxyl methyltransferase is in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem. 273, (24), 15030-15034 (1998).
  13. Wynne, J. P., et al. Rap1-interacting adapter molecule (RIAM) associates with the plasma membrane via a proximity detector. J Cell Biol. (2012).
  14. Zhou, M., et al. VPS35 binds farnesylated N-Ras in the cytosol to regulate N-Ras trafficking. J Cell Biol. 214, (4), 445-458 (2016).
  15. Sim, D. S., Dilks, J. R., Flaumenhaft, R. Platelets possess and require an active protein palmitoylation pathway for agonist-mediated activation and in vivo thrombus formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 27, (6), 1478-1485 (2007).
  16. Pace, P. E., Peskin, A. V., Han, M. H., Hampton, M. B., Winterbourn, C. C. Hyperoxidized peroxiredoxin 2 interacts with the protein disulfide- isomerase ERp46. Biochem J. 453, (3), 475-485 (2013).
  17. Annis, M. G., et al. Endoplasmic reticulum localized Bcl-2 prevents apoptosis when redistribution of cytochrome c is a late event. Oncogene. 20, (16), 1939-1952 (2001).
  18. Berkowitz, S. A., Wolff, J. Intrinsic calcium sensitivity of tubulin polymerization. The contributions of temperature, tubulin concentration, and associated proteins. J Biol Chem. 256, (21), 11216-11223 (1981).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics