窒素キャビテーションと差動遠心分離培養細胞の周辺膜蛋白質の分布を監視することができます。

Biochemistry

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Summary

超遠心法による窒素のキャビテーションとゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離に基づく哺乳類細胞の洗剤無料均質化のためのプロトコルをご紹介します。この方法は可溶性の周辺膜蛋白質の分割監視に最適と膜の一部分。

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

培養細胞、末梢膜タンパク質を含む蛋白質の細胞内分布の勉強に役立ちます。蛍光遺伝子エンコード タグ付きタンパク質は細胞内蛋白質の分布の研究をもたらしました。ただし、部分的にゾル性細胞質蛋白質場合は特に、蛍光顕微鏡を用いた分布を定量化することは困難です。さらに、内因性のタンパク質を研究することが重要ですよく。生化学的アッセイ immunoblots まま細胞レベル下の分別後のタンパク質分布の定量化のためのゴールド スタンダードのよう。ゾル性細胞質または特定の膜画分を分離することを目指す商業キットはありますが、これらのキットのほとんどは洗剤、膜から抽出された簡単に周辺膜蛋白質を勉強のために不適当かもしれないと抽出に基づいています。ここで超遠心法による窒素キャビテーション ・ ゾル性細胞質と膜結合蛋白質のそれに続く分離による携帯電話用洗剤無料プロトコルを提案します。我々 は、種類の異なる細胞で水溶性の細胞小器官の分離とペレットの分数を確認し、一般的な洗剤ベース力学的均質化手法の中での蛋白質の抽出を比較します。いくつかの利点の窒素のキャビテーション繊細な細胞小器官を最小限の物理的および化学的損傷細胞破壊の優れた効率であります。超遠心法と組み合わせると、窒素のキャビテーションは周辺膜蛋白質の細胞質間のシフトを調べる優れた方法と膜の一部分。

Introduction

細胞蛋白質は 2 つのクラスに分けることができます: これらの膜に関連付けられています。非膜準蛋白質は、細胞質、核質、小胞体 (ER) などの細胞小器官のルミナで発見されます。膜準蛋白質、整数部と周辺の 2 つのクラスがあります。不可欠な膜タンパク質は、ポリペプチド鎖の 1 つ以上のセグメントが通常は α ヘリックスの疎水性アミノ酸の構成として膜をまたがっているために、膜貫通タンパク質とも呼ばれます。膜貫通タンパク質の生合成の過程で膜に挿入される co-translationally、彼らが異化されてまで、構成されています。周辺膜蛋白質は膜脂質など疎水性分子の翻訳後修飾の結果として通常第二に駆動されます。不可欠な膜タンパク質と対照をなして周辺膜蛋白質の細胞膜との関連付けと戻すことは調整することができます。シグナル伝達経路と膜との規制関連で多くの周辺膜蛋白質機能の有効化または経路を阻害するメカニズムの 1 つであります。周辺膜蛋白質であるシグナリング分子の 1 つの例は、小さな GTPase、RAS です。ファルネシルピロリン酸脂質修飾を含むポスト翻訳の修正のシリーズの後成熟した RAS 蛋白質の修正の C 末端は細胞膜の細胞質のリーフレットに挿入します。具体的には、細胞膜は RAS がその下流エフェクター RAF1 を行っています。マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ (MAPK) 経路の構成的活性化を防ぐためには、複数レベルの RAS の制御は、場所にあります。GTP を GDP へ加水分解によって RAS を非アクティブなレンダリング以外にもアクティブな RA も解放できます膜から修正またはシグナル伝達を阻害する要因を可との相互作用の。膜協会を評価するための重要な必要性が残っているが、蛍光ライブ イメージングは、細胞生物学者蛍光タンパク質タグ周辺膜蛋白質1の細胞内の局在を観察する機会を与える、シンプル生化学的アプローチを半定量的内因性蛋白質。

タンパク質の膜と可溶性画分の間分配の適切な生化学的評価は 2 つの要因に大きく依存する: 細胞の均一化と膜と可溶性画分の効率的な分離。最も広く使用されている商業キットを含むいくつかのプロトコルは、洗剤を用いた均質化に依存して、これらのメソッドは、可溶性のフェーズ2に膜タンパク質を抽出して解析の難読化します。したがって、セル中断の非洗剤ベース、機械的メソッドは、クリーンな結果を提供します。血液や臓器から収穫栽培におけるセルの機械的破壊のいくつかの方法があります。Dounce 均質化、細針の中断、ボール ベアリングの均質化、超音波処理、窒素キャビテーションが含まれます。ここで我々 は窒素のキャビテーションを評価し、他の方法と比較します。窒素のキャビテーションは高圧下での細胞の細胞質に溶解している窒素の依存しています。平衡後、細胞懸濁液は気圧に公開では突然の沸騰の結果としてセルを開いて涙の細胞質窒素気泡が形成されます。圧力が十分に高い場合は、窒素沸騰核3を破壊できる、膜バインド リソソーム4のような細胞小器官。しかし、圧力が十分に低く保たれ、ない他の細胞器官、それにより細胞質とそのまま細胞内小器官の流出 cavitate5を指定されている磨砕液に、小胞体膜で減圧が中断されます。このため、窒素キャビテーションは、リソソーム、ミトコンドリアのような細胞小器官を分離する最適な方法です。

しかし、膜と可溶性画分に簡単に分離することがでく磨砕液を準備するための優れた方法であるも。キャビテーションの中に使用される圧力容器 (「爆弾」と呼ぶ) タンクと調節可能な放電バルブの出口ポートから窒素ガス配信の入口との高圧に耐える厚いステンレス鋼製ケーシングで構成されます。

窒素のキャビテーションは 1960 年代6以来セル均質化のために使用されています。1961 年に、ハンターと Commerfold7は哺乳類の組織破壊のための実行可能な選択肢として窒素キャビテーションを設立しました。以来、研究者は、各種の細胞や組織、成功とするための手法を適応している、窒素キャビテーション膜準備8,9, 核と細胞小器官を含む複数のアプリケーションで定番となっています。準備1011、および不安定な生化学的抽出。細胞生物学者は現在、窒素の均質化の利点が広く宣伝されていない、窒素爆弾は高価であり、セルの比較的大きい数は誤解があるのでセルの均質化の他の方法を多く採用します。必須。そのまま核無細胞のホモジネートを達成するために窒素のキャビテーションのためのプロトコルは公開されていない、パブリッシュされた最も評価の 20 mL の細胞懸濁液の量が使用されました。小規模なサンプルの使用の現在の要件に合うようにこの古典的な手法を適応し、培養細胞に適した窒素キャビテーションの修正されたプロトコルを提案する.窒素キャビテーション後磨砕液と分かれています可溶性 (S) 膜 (P) の一部分差動遠心分離によって最初低速スピン核と切れ目のないセルを削除するとし、高速スピン (> 100,000 × g) を分離するには可溶性画分から膜。Immunoblots を分離の効率を解析し、他の機械的破壊技術窒素キャビテーションを比較します。また窒素のキャビテーションの間に均質化バッファーの浸透効果を調べた。

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Protocol

1 バッファーと機器の準備

  1. 4時 45 mL 細胞破壊爆弾・ 15 mL チューブ ・遠心管を冷やす ° c
  2. 準備と 25 mL の 4 ° C 追加 1 つプロテアーゼ阻害剤のタブレットは使用前に 2 x 10 の 7 セルあたり均質化バッファーを寒さ
    。 注: 通常、均質化バッファーの KCl はより塩化ナトリウムが細胞内の塩類組成を反映ではなくに含まれています。このプロトコルで使用する均質化バッファーは、10 mM HEPES ph 7.4 では、10 mM KCl と 1.5 mM MgCl 2 (低張性均質化バッファーとしてという) で構成されます。ほとんどのバッファーは窒素のキャビテーションのために適応することができます (ディスカッション を参照してください).
  3. の準備で 4 ° C 追加プロテアーゼ阻害剤錠使用前に新鮮なサンプルあたり Phosphate-Buffered 生理食塩水 (PBS) バッファー x 1 の 6 mL を寒さと
    。 注: このプロトコルで使用される PBS バッファー pH 7.4 では、1.8 mM KH 2 PO 4、137 mM NaCl と KCl 2.7 mM で 10 mm Na 2 HPO 4 で構成されています
  4. 準備可溶化バッファー使用直前の 4 ° C 追加 1 つのプロテアーゼ阻害剤のタブレットでサンプルごとの 4 つの mL を寒さと
    。 注: このプロトコルで使用される可溶化バッファーは 1 の x Radioimmunoprecipitation 検定法 (RIPA) バッファー pH 7.4 では、150 mM の NaCl、0.1 %sds、デオキシ コール酸ナトリウム 0.5%、1%、25 mM Tris から成っている NP 40。4.6 の注を参照してください

2。セル収穫

型のセルの
    推奨で 10 9 ティッシュ文化セル x 2 x 10 の成長 7-10
  1. 培地。通常、1 つの 15 cm 皿利回り 2 x 10 7 HEK 293 細胞 DMEM で 90% の confluency ( 図 1) にします
  2. 真空によって成長媒体を削除します
  3. 付着性のセルのため氷の上の培養皿を配置、チルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 15 cm 皿あたり) で軽く文化皿で直接細胞を洗浄し、適切な量で大細胞スクレーパーとセルを収穫均質化バッファー;浮遊細胞の場合収集しチルド均質化バッファー 2 倍 (10 mL 洗浄あたり 50 mL カルチャごと) 4 ° C、5 分で 500 x g スピンに細胞ペレットを洗って、氷の上の均質化バッファーの適切なボリュームで洗浄細胞ペレットを再懸濁します。
    注: ボリュームは、細胞破壊爆弾で許可される最小/最大ボリュームと同様に、意図されていた実験の蛋白質の集中の要件に基づく必要があります。一般的なガイドラインは 2-10 10 7 セル/mL、x またはセルの約 10 巻ペレットします。このプロトコルは、2 mL の均質化バッファーの HEK 293 の細胞の 3 つの 15 cm 料理に最適です

3。窒素キャビテーション

  1. 波紋上氷浴で清潔でチルド爆弾への転送細胞懸濁液プレートします
    。 注意: 爆弾、高圧、低温、窒素ガス – 適切な個人用保護具 . を着用
  2. 爆弾の中マイクロ電磁攪拌棒を置き、懸濁液の均質性を維持するために攪拌プレートをオンにします
  3. 懸濁液に 1 つのプロテアーゼ阻害剤タブレットを追加し、メーカーごとの爆弾を閉じます ' s 命令
  4. 徐々 に加圧窒素ガスのタンク メーカーごとに爆弾 ' 爆弾圧力計まで s 命令は 300 に 600 psi を読み取ります。すべてのバルブを閉じ窒素タンクを切断しています
    。 注: セルの種類によって必要な圧力が異なります。Jurkat、NIH 3T3 HEK 293 の細胞の 400 に 350 psi でキャビテーションを行ったここ
  5. 窒素に分解し、細胞内で平衡に達するように 20 分待つ
  6. 布タオルを使用して吐出バルブ周りの余分な水を削除します。磨砕液の滴下しリリースを達成し、前冷蔵 15 mL チューブに収集に優しく吐出バルブを開きます
    。 注: コレクションの末尾近くあるホモジネートのスパートとシューという音とともにガスが出てくる。ガスがないことを確認してください以前に収集された原因はチューブから撮影する妨 (それ故に 15 mL の使用チューブ 1.5 mL チューブの代わりに)。スパートを開始すると、吐出バルブを閉じて、減圧爆弾と爆弾の残りのセルのキャビテーションを達成するために突然窒素入口弁を開きます。オープンは爆弾の妨の回復と徹底的に掃除します
    。 注: 上の泡と乳白色の外観は、最終的な cavitate 必要があります。ピペット チップ遠心分離前に沈静化して泡を許可すると優しくかき混ぜる
    。 注: は、均質化の効率を判断する位相差顕微鏡による、cavitate を確認します。15 μ L のドロップを追加、coverslip でカバーして顕微鏡スライドの表面に空洞を作る。20 × 対物で 3.4 3.6 多すぎる場合にのみ切れ目のない細胞が検出手順を繰り返します
    。 注: 均質化バッファーに EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸を含まない場合に追加収集した退院後 5 分以内 1 mM の最終的な集中を妨します

4。Cytosolic と膜画分の分離

切れ目のない細胞や核を削除する 4 ° C で 10 分間の
  1. 遠心分離機 500 x cavitate g.
    注: は遠心分離のステップを繰り返して表示されているペレットは生成されませんし、上部に浮かぶ泡を回避しながらポスト核上清 (PNS) を収集します。必要に応じてさらに収集し、PNS を結合するフォームを再遠心分離機 ( 図 1).
  2. は、関心の分数を取得する必要に応じて、PNS を処理します。ゾル性細胞質の分離と膜の一部分を目的として遠心チューブに PNS を転送し、必要に応じて遠心を行います。このプロトコルが最適です、< 3.5 mL サンプル 4 で 1 時間 350,000 × g で遠心、ポリカーボネート製遠心管に ° C
  3. (S 分画) 上清 1 mL ピペットを使用してを収集します
  4. は、それを乱すことがなく慎重に 3 mL の冷 PBS でペレットをすすいでください。真空によって PBS を削除します
    。 注: ゾル性細胞質蛋白質によって膜画分の汚染がサンプルの損失より大きい問題は、ペレット寒さの PBS と 4.2 の手順と再遠心の 3 mL に再懸濁します。真空によって PBS を削除します
  5. は好みの洗剤を含む可溶化バッファーの適切なボリュームでペレットを完全に再懸濁します。セルの等価を達成、内局として可溶化バッファーの同じボリュームを使用します
    。 注: 効率的な膜蛋白質の抽出のための可溶化バッファーとして 1 x RIPA バッファーを使用してお勧めします。下流のアッセイが膜画分の必要ない場合は、最大膜たんぱく質抽出用 1 x laemmli サンプル バッファーを使用します
    。 メモ: 提案は外れ、最大膜蛋白質の抽出のための 4 ° C で管上クリーン チューブ可溶化バッファーにペレットを転送します
    。 注: ペレットが目から効率的に削除する粘り (あまりにも多くの脂質) の場合e 可溶化バッファーの超遠心機チューブ スナップおすすめペレットを液体窒素で凍結、ペレットは分解する前にすぐにミニ金属ヘラで超遠心機チューブからペレットを外れします
    。 注: また、膜ペレットだけ再停止できない膜小胞懸濁液、遠心分離のステップ 4.6 の場合は不要の P 分数を生成する洗剤を含むバッファー中に溶解しました。膜協会に依存する酵素活性などの機能を調査するときその P 端数が役に立つ
  6. 4時 10 分卓上遠心分離機で 20,000 × g ステップ 4.5 から完全に可溶化されたペレット懸濁液を遠心分離機 ° C 上清 1 mL ピペット (P の一部) を使用してを収集し、ペレット (不溶性の脂質) を破棄します
  7. ゾル性細胞質や膜画分を用いてウェスタンブロッティングなど必要なアッセイを実行または将来使用するため-80 ° C で保存します

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Representative Results

図 2は、可溶性細胞質画分 (S) または膜ペレット画分 (P) に PNS から細胞蛋白質の分割を示します。異なる種類の細胞から 3 つの代表的な細胞を調べた: HEK 293 (細胞上皮)、NIH 3T3 (繊維芽細胞) および Jurkat (リンパ球)。Rho グアニン解離阻害剤 (RhoGDI) と陽イオン依存性マンノース-6-リン酸受容体 (CIMPR) のポジティブ コントロールとして使用されたゾル性細胞質と膜の一部分、それぞれ。窒素キャビテーション後細胞質と膜の効率的な分離を確認した 〜 低張バッファー内の 350 の psi に続いて 1 時間 350,000 × g で遠心。総蛋白が治った S と P の分数は小胞体、エンドソーム、リソソーム、ミトコンドリア、ゴルジ体、他の細胞器官のマーカーと、分析しました。すべての膜貫通タンパク質は膜画分に存在のみ、Na+を含む/K+ ATPase と原形質膜、小胞体、リソソーム膜蛋白質 1 (LAMP1) からカルネキシン上皮成長因子受容体 (EGFR)F0、リソソームから-ミトコンドリア、およびtrans Golgi ネットワークからゴルジン 97 ATPase。予想通り、多くの周辺膜蛋白質膜に緩く関連付けられて、様々 な程度にゾル性細胞質と膜画分の両方に存在します。顕著な例は、早期エンドソーム抗原 1 (EEA1)、Rab7/9 (後期エンドソーム) およびヘキソキナーゼ 1 (外側のミトコンドリア膜)。これは周辺蛋白質の膜連想強度の評価でこの手法の有用性を示しています。当研究室がいくつかシグナリング分子の5,12,13,14膜協会のステータスを調べるには、このキャビテーション手法の利点を撮影しました。興味深いことに、我々 は可溶性画分にほとんど専ら窒素キャビテーション中は小胞体膜から生成されたミクロソームも乱れている、可溶性画分に小胞体内腔に蛋白質を解放するを示唆 calregulin を発見します。対照的に、キャビテーション ミトコンドリアの整合性がセルの種類によって異なります。F1を見ました-atp アーゼに至る NIH 3T3 細胞の 2% 〜 35% HEK 293 および Jurkat 細胞の細胞質画分の部分的なミトコンドリア内周辺蛋白質。つまり、窒素低張バッファーと 350 の psi でキャビテーションがミトコンドリアの整合性を保証しません。500 g 回転 cavitate から PNS を生成する x の 3 つのサイクル、にもかかわらずすべての核を取り外しました。ヒストン脱アセチル化酵素 1 (HDAC1) 核質と核小体から fibrillarin からは、PNS とペレットの両方を発見されました。清ではなくペレット HDAC1 の存在は、PNS がキャビテーション中の核の破壊よりもむしろ核に汚染されていることを示唆しています。これは 350 psi に爆弾を加圧する核そのまま10の葉レポートで一貫性のある低張バッファーの私達の使用するかもしれない核壊れ、後のセクションで説明したよう。

他の一般的な物理的な中断の方法のそれと窒素キャビテーションの均質化の効率を比較しました。Jurkat 細胞の同量が同一低張性均質化バッファーに中断され、別の中断方法を受けます。(約 5-10% 以下のボリュームを収集において) Dounce 均質化と窒素のキャビテーションのサンプルの検出可能な損失があった。しかし、窒素のキャビテーションを与えた最高のタンパク質抽出の効率;針の通路と Dounce のみ 60% くらいのタンパク質 (図 3) が得られました。不思議なことに、イムノブロットによって決定されるいくつかの蛋白質の回復は異なる機械的破壊方法間に有意差を示さなかった。ただし、窒素キャビテーションを伴う試料のヘキソキナーゼ 1、RAS など特定の周辺膜蛋白質収量が高かった。このサポート周辺膜蛋白質を調査するときは、その窒素キャビテーションを均質化に最適な可能性があります。窒素のキャビテーションによる HDAC1 タンパク質の回復は核がすべての条件でそのまま残ることを示唆して、他の方法に匹敵します。したがって、図 3のデータは証明その窒素のキャビテーションは、優れた均質化結果を提供しています。

次に、我々 は低張バッファーと同じバッファーの均質化効率を比較したが、張蔗糖あるいは塩化ナトリウム (図 4) で行われました。蛋白質の同じような量は、350 の psi でキャビテーション後塩化ナトリウム等張バッファー対低張バッファーで均質化された Jurkat 細胞から回収されました。対照的より少ない蛋白質はセル中断のスクロースを張したバッファーの PNS で回復されました。このパターンに当てはまらないイムノブロットを用いてほとんどの個々 の蛋白質。1 つの例外はだった張バッファーに生成された PNS に比較的濃縮されました fibrillarin です。

水溶性の周辺膜蛋白質の分割を検討する我々 のプロトコルを用いることができるかどうかを決定するフラグ タグ nras 登録で野生型およびプレニル化欠損変異体 C186S (間パターンを分割と比較した膜の一部分図 5)。定常状態における野生型 nras 登録で細胞質と膜、可溶性画分に回復した部分は他の RAS タンパク質14を超える最も周辺膜蛋白質のように存在していた。Nras 登録では、プレニル修正を奪われて、それは膜を関連付ける機能を失うし、完全ゾル性細胞質になります。周辺膜蛋白質細胞質と膜との間の分割のダイナミクスを研究するための信頼性の高いオプションをプロトコルには nras 登録で予想の分割パターンを確認しました。

Figure 1
図 1: ステップ 2 (青)、ステップ 3 (赤) およびプロトコルの手順 4 (黄) をまとめたフローチャートこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: タンパク質の細胞質と膜分画の間分配します。HEK 293、NIH 3T3 および Jurkat 細胞は窒素キャビテーション (20 分、低張性均質化バッファーで中断 〜 350 psi) とプロトコルに従って遠心 (1 h 〜 350,000 x g) を受けた。内因性のタンパク質レベルの異なる画分では、イムノブロットによって分析されました。PNS: 受容体結合がん抗原の SiSo 細胞 (代替服務研究委)、原子力の上澄み、s: 清、p: ペレットを表明しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: 異なる機械的破壊技術の比較。Jurkat 細胞の相当量が低張性バッファー中に浮遊し、凍結融解 (3 サイクル)、針の通路 (28G½ 針を 5 通過)、Dounce 均質化 (15 のパス、Kontes 2 mL Dounce 管組織挽く杵のクリアランスを受ける0.01 0.06 mm) または窒素キャビテーション (20 分 〜 350 psi)。PNS の内因性蛋白質の相対的なレベルは、各メソッドのイムノブロットによって分析されました。BCA assa によって PNS の総蛋白濃度の定量を行ったy と窒素のキャビテーションによる準備 PNS の値に正規化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4: 窒素のキャビテーションの間に使用される低張性・等張性のバッファーの比較。Jurkat 細胞は、低張性のバッファーまたは低張バッファーのいずれかで中断されたの相当量は 8.5% 蔗糖あるいは 150 mM の NaCl、添加し、窒素キャビテーション (20 分 〜 350 psi) を受けます。PNS の内因性蛋白質の相対的なレベルは、各バッファーのイムノブロットによって分析されました。PNS の総蛋白濃度は、BCA アッセイによって定量化され、低張バッファーの準備 PNS の値に正規化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: Farnesylated nras 登録では P と S 分画にパーティション分割します。HEK 293 細胞いた一過性フラグ タグ nras 登録で野生型または C186S 変異体の表現を演出するプラスミドをトランスフェクトしました。図 2に示すように行われたタンパク質の分配とイムノブロットによって示されている蛋白質レベルが分析されました。(周、M、2016 許可を得て再現。細胞生物学のジャーナルに掲載されたもの。https://doi.org/10.1083/jcb.201604061)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

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Discussion

機械的破壊の他の方法に比べて窒素キャビテーションの利点は多様です。おそらく最も重要なメリットは、静かにはまだ効率的に標本を均質化する能力です。生成の局所加熱ダメージの代わりに減圧冷却試料の物理的原理は超音波など摩擦/せん断ベースの技術。キャビテーションも細胞膜を混乱させるに非常に効率的です。窒素の気泡が解凍、キャビテーション プロセス個々 のセル内では制限されているため小さいセル サイズをサンプル サイズや濃度のサンプルします。したがって、通関ベース Dounce 以上針の通路均質化付加的な利点を提供しています。窒素のキャビテーションは、同じ圧力でサンプル全体に一様に適用される同じ破壊力を再現できるより一貫した結果を提供しています。また、各セルのみの 1 つの単一の時間中断プロセスを経験し、細胞レベル下のコンポーネントが変数の破壊的な力を絶えず公開されます、したがって。これは細胞小器官の artefactual 断片化を制限します。中断によって引き起こされる不安定な細胞成分の酸化の心配は軽減されますまた、窒素は細胞懸濁液を飽和させるため、酸素補給の無料です。窒素キャビテーションによって課せられた制限の物理的・化学的ストレスにより、不安定な酵素と壊れやすい細胞小器官やこの均質化手法の再現性を研究する理想的な手法は定量化に適しています。

窒素のキャビテーションは、サンプル サイズ、均質化バッファーの組成及びオルガネラの整合性の程度に関し重要な柔軟性を提供しています。均質化をスケール アップ、1 つだけのスピード、利便性や圧縮の効率を損なうことがなく、大容量の圧力容器を配置する必要があります。窒素のキャビテーション; 任意の均質化バッファーが使用できます。バッファーの選択は、各実験の要件との互換性をカスタマイズできます。1 つは細胞内小器官の細胞内液 (例えば、高カリウム、低ナトリウム) の変化を最小限に抑えるために一致する均質化バッファーをデザインできます。たとえば、 ex vivoでのアクチン重合を最小限に抑え、それにより顆粒球5からそのまま細胞質小胞を収集を支援「リラクゼーション」バッファーを開発しました。セルの均質化の度合いを制御するバッファーの浸透圧、イオン機能を変更もできます。さらに、細胞破壊の積極性は、窒素圧力を調整することによって制御できます。適度な圧力は、高圧は、これらの小器官を混乱させる間、核、ミトコンドリアとそのままの状態で他の細胞小器官を維持するために破壊的な力を低減します。Brock。ほとんどの核を維持したまま低張バッファー10、私達の現在のプロトコルで使用される窒素圧の基礎を形成すると 350 の psi でラット好塩基性白血病細胞の中断の成功を報告しました。

窒素キャビテーションの制限に均質化試料全体に均一な膜構造と同様のサイズの小胞が生じるという事実があります。このことができます率帯状密度勾配遠心による膜、滑らかなミクロソーム、エンドソーム、ゴルジ膜のさらに分離を複雑にします。別の問題は細胞小器官が内側から破裂による均質化後比較的壊れやすいです。したがって、このメソッドでは、後続の操作で細胞小器官の破損を防ぐために慎重に最適化が必要です。本研究ではこれらの問題のいくつかに対処を目指しました。

ゾル性細胞質の分離、遠心分離によって膜の一部分がタンパク質マーカー15,16の一握りの蛋白の分配を詳述した限られたレポートで検討されています。私たちのメソッドは、可溶性及び膜結合タンパク質の粗分離を生成し、特定の細胞器官の隔離を必要としません。しかし、それはまだキャビテーションによって生成される別の膜の均質な小胞超遠心法による分離効率に影響こと有効な懸念です。私たちは分離の immunoblots と我々 のプロトコルと分別後の一般的な細胞小器官の仕切りで包括的な調査を発表しました。予想通り、RhoGDI のような純粋なゾル性細胞質蛋白質は専ら可溶性画分および EGFR など Na+膜 (PM) 上の膜貫通蛋白質/K+ atp アーゼ、ペレットだけで回復されました。小胞体、ミトコンドリア、ゴルジ体、リソソームなどの細胞内小器官の膜貫通タンパク質の可溶性タンパク質から異なる膜と細胞小器官から不可欠な膜タンパク質を正常に分離できますを確認、ペレットの回収されたも私たちのメソッド。この根本的な検証は、このプロトコルの主な目的である周辺膜蛋白質の詳細な分析に不可欠です。

周辺膜蛋白質のほとんどは、ゾル性細胞質と膜の分画に存在します。これは局在化の真の表現では多くの場合、いくつかのインスタンスを表すもの artefactual 再配布これらの蛋白質の膜の細胞質表面から可溶性画分に均質化過程では、以来、膜との関係の強さが不可欠な膜タンパク質のように強いではないです。窒素のキャビテーションは、ワンタイム、穏やかな混乱に細胞をさらすことによって潜在的な再分配を最小限に、しかし 1 つを生化学的分画と細胞内タンパク質の分配の変化に焦点を当てるのような工芸品の留意実験条件の間で膜の一部分。それにもかかわらず、周辺膜蛋白質のエンドソームの成熟のさまざまな段階での検査はこの方法で可能です。初期エンドソームへのクラスリン被覆小胞のドッキングを仲介する Rab5 エフェクター EEA1 初期エンドソームの細胞質表面に局在してペレットの割合で主に回収されました。後期エンドソーム関連 Rab7 と Rab9 蛋白質はペレットの割合でいます。ただし、Rab7/9 細胞質でかなりの量が残っています。RabGDI プレニル マッピングと対話し、これら以外の場合不溶性タンパク質のゾル性細胞質をレンダリングすることができるが、Rab 蛋白質は他のエンドソーム関連周辺膜蛋白質よりも細胞質より傾向があります。

窒素のキャビテーションによる均質化と核と細胞小器官の整合性を特徴付けるため我々 エスディーエス内腔や細胞質コンパートメントの分離の分数。この分析では、calregulin 完全に ER が乱れフォーム ミクロソームにおよびそれにより内腔の内容をリークを示す可溶性画分に解放されます。1 つ与えられた真核細胞の膜の総面積の半分は小胞体の迷路のようなスペースを囲む、それは窒素の泡の展開時にそのまま残りますに嚢のようなまたは管状構造の広大なネットワークが失敗すること意外ではないです。その一方で、キャビテーション後ミトコンドリアの整合性の分析は、明確な依存性細胞型 F1を見ました-atp アーゼ、末梢細胞質画分におけるミトコンドリアの内膜に関連するタンパク質程度 (HEK 293 の Jurkat ~ 35%、NIH 3T3 2%)。つまり、窒素低張バッファーと 350 の psi でキャビテーション ミトコンドリアの整合性は保証されません。確かに、他の人はミトコンドリアを維持するためにキャビテーションが 150 psi17よりも低い圧力で実行されることを報告しています。対照的に、そのカタラーゼは、ペルオキシソームのルーメンがわかった。興味深いことに, 核蛋白質は PNS とペレットの分数で観察されます。具体的には、HDAC1 ヒストンデアセチラーゼ、核質全体に存在するが存在しない可溶性画分、核の完全性が損なわれないことを示します。これは、solub への HDAC1 の放出期待キャビテーション、核膜が破裂しないことを示唆します。このシナリオではルの割合です。可能性 PNS 準備の過程で核は完全に削除されません、遠心後、ペレットは、蛋白質のままです。この可能性はさらに可溶性画分の DNA 漏れが検出されないという事実によってサポートされています。したがって、Mg2 +添加による 〜 350 psi でキャビテーション中低張性均質化バッファーを使用して、複数の細胞で核の整合性を保つことができる私たちの結論します。

我々 の結果はまたリボゾームを膜画分のペレットが小胞体膜に結合する細胞質にも遊離のリボソーム後非ショ糖クッション バッファー内に完全に沈降したことを示唆している完全に収集することを示す1 h. 同様に、オートファジー関連タンパク質 12 の同定 (Atg12) の 350,000 × g で遠心分離-Atg5 共役、オートファゴソームのマーカーとしてペレット分数に厳格な分離を明らかにします。細胞質でのプレゼンスは、Atg12 の Atg5 キャラクタリゼーション オートファゴソーム形成の前に、事実によって引き起こされる可能性があります。細胞骨格タンパク質重合前のヴィヴォのため評価が困難です。この現象ことができます緩和バッファーを最小化するが、チューブリンは可能性が高い重合前のヴィヴォキレート カルシウム 18 の時に、ここで説明したプロトコル。我々 の準備にチューブリンはアクチンが P と S の両方の一部分であるに対し、重合を示唆ペレットで発見されます。

均質化効率の窒素のキャビテーションの潜在的な利点を特徴付ける、いくつか一般的な機械的破壊手法を検討した.最適なミキサーか乳鉢/乳棒など組織サンプルのメソッドは評価されませんでした。超音波は、内部器官を維持しながら表面の膜を破壊することは困難だとも除外されました。我々 の分析は、次の方法に焦点を当てて: 凍結融解、針の通路と Dounce の均質化、彼らは簡単に、実行し、ボール ベアリング ホモジナイザーなど特別な装置を必要としません。Jurkat 細胞は、小さいサイズの針の通路や Dounce などのクリアランスに依存する従来の液体剪断技術と効率的な均質化することは困難それらをレンダリングするため、この分析で使用されました。回復総蛋白濃度で判断、窒素キャビテーションや凍結融解などのセル サイズの独立した中断方法が確かに蛋白質の抽出の優れた効率を示すことがわかった。大きいサイズの細胞と同様の分析は窒素キャビテーションはまだ代替物理メソッド テスト (データは示されていない) に優れた均質化効率の小さい相違を明らかにしました。

多くのゾル性細胞質、エンドソームと細胞骨格タンパク質効率的に回収されたすべてのテスト メソッドを持つ。対照的に、小胞体とゴルジ体のタンパク質が最適窒素キャビテーションを使用して回収された.F1のわずかに低い利回り-他の方法の相対的な窒素キャビテーションにおける atp アーゼは、ミトコンドリアがキャビテーション中のままに可能性が高い、したがってより効率的に低速回転で削除するために使用事実を反映可能性がありますPNS を生成します。観察、ヘキソキナーゼ 1、周辺膜蛋白質細胞質の両方を発見し、, F1を基準にして反対の方法で行儀のミトコンドリア膜に関連付けられている-ATPase 可能性が反映、情動の不安定性の協会ヘキソキナーゼ 1 F1基準-atp アーゼは、ミトコンドリアの中に隔離されます。重要なが対等な効率を持つ細胞を混乱させることができる、代替の機械停止方法は、特定の周辺膜蛋白質 (ヘキソキナーゼ 1 および RAS) の比較的貧しい人々 の回復を与えた。したがって、キャビテーション周辺膜蛋白質のパーティションを検討するための選択肢の私たちの均質化手法であります。Dounce 均質化が広く使用されるためそのまま核を準備するのには、他の機械的破壊メソッド間で核の整合性を評価するのにベンチマークとして Dounce を使用私たち。我々 の分析にその核が低張性バッファーを持つ 〜 350 psi で窒素キャビテーションにより作製した Jurkat ホモジネートのまま HDAC1 蛋白質の回復の同じようなレベルを確認します。

それは明らかに窒素のキャビテーションの間に使用される均質化バッファーは、大幅破壊効率とオルガネラの整合性に影響を及ぼします。均質化バッファーの組成は、目的のアプリケーションの要件に最適化する必要があります、それは動物組織の窒素圧縮解除を実行する研究者が核を抽出する低浸透圧によるバッファーを使用することは注目に値する内容。ハンターとコマーフォード, 核の膨潤とソリューションが希薄、破裂, 核保全等張解決策7 (これは塩化ナトリウムや有機溶質など無機塩類などを追加するか、達成することができますを使用する場合スクロースまたはグリセロール)。哺乳類セルからの核以外の細胞小器官を分離するために使用される標準的な等張バッファー 1 mM EDTA を含む 0.25 M ショ糖であり ph 7.0 7.6 トリシンや HEPES、トリスとバッファーします。しかし、すべての培養細胞は等張バッファーの 1 つで効率的に均質化されたことができます。低張性のバッファー (通常 10 mM トリス、HEPES、)、完全な均質化を達成するために特定の細胞のタイプに必要な浸透圧ストレスを提供するためによく使用されます。ただし、前に述べたように、低張性バッファーを EDTA が含まれているとき、壊れやすいと DNA の漏れになりやすい核をレンダリングする傾向があります。核の整合性を促進するため、KCl と低濃度 MgCl2または MgSO4などの二価陽イオンの EDTA を置き換えます。Mg2 +は通常 Ca2 +後者することができます特定のホスホリパーゼ及びプロテアーゼをアクティブにして RNA ポリメラーゼを阻害するためです。キャビテーションが完了すると、EDTA またはグリコールエーテルジアミン四酢酸に追加できます戻る、陽イオンをキレート化するため乳剤分解酵素を阻害するため必要な場合。

Jurkat 細胞は、核の完全性を研究する理想的なセルラインをように比較的大きな核-細胞質比を表示します。NaCl を添加した等張のバッファーと比較するとき、低張性のバッファーを使用して均質化効率の増加は最小限です。ただし、ショ糖を添加した張バッファー内のキャビテーションは約低張バッファーの対応するを使用して、抽出された半分の蛋白質を回復します。これは、isotonicity の直接結果であるとは考えにくいし、塩化ナトリウムを使用し、isotonicity を達成するためにショ糖を使用しての間に不一致はさらに調査を必要とします。1 つの可能な説明は、ショ糖がないに対し塩はタンパク質間静電相互作用を混乱させることです。したがって、同じ張でも塩化ナトリウム、ショ糖が欠けている蛋白質の抽出に関連するアクティビティ。With 点張バッファー理論的に核のより保護されているにもかかわらず、等張のバッファーを持つ回復増加 fibrillarin 蛋白質がわかった核の整合性を維持します。不思議なことに、ミトコンドリア分画はより効率的に低塩分条件がミトコンドリアの抽出の最適ではないかもしれないことを示唆している, NaCl を添加した等張のバッファーで抽出しました。低張性のバッファー低張バッファーとキャビテーション核性均質化効率の最適なバランスを実現を考慮した、キャビテーションのプロトコル選択のバッファーになります。ただし、バッファーには最適な均質化結果の保証がないして読者を注意します。我々 のプロトコルの最適化のためのテンプレートとして役立つべきである、必要なバッファーをテスト パイロット、利子、およびその他の変数(圧力、バッファー組成等)の細胞が最良の結果のため確立する必要があります。

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Disclosures

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

Acknowledgments

この作品は、GM055279、CA116034 および CA163489 によって賄われていた。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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References

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