Azote Cavitation et Centrifugation différentielle permet de surveiller la Distribution des protéines membranaires périphériques dans des cellules cultivées

Biochemistry

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Summary

Nous présentons ici des protocoles pour l’homogénéisation sans tensioactifs des cellules mammifères cultivées basé sur la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Cette méthode est idéale pour la surveillance de la répartition des protéines membranaires périphériques entre soluble et fractions de membrane.

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

Les cellules cultivées sont utiles pour étudier la distribution subcellulaire des protéines, y compris les protéines membranaires périphériques. Codé génétiquement fluorescent étiquetés protéines ont révolutionné l’étude de la distribution des protéines subcellulaire. Toutefois, il est difficile de quantifier la distribution avec la microscopie fluorescente, surtout lorsque les protéines sont partiellement cytosoliques. En outre, il est souvent important d’étudier les protéines endogènes. Biochemical tests tels que l’immuno-Blot reste l’étalon-or pour la quantification de la distribution des protéines après fractionnement subcellulaire. Bien qu’il existe des kits commerciaux visant à isoler cytosolique ou certaines fractions de la membrane, la plupart de ces kits est basée sur l’extraction avec des détergents, qui peut ne pas convenir pour l’étude des protéines membranaires périphériques qui sont facilement extraits des membranes. Nous présentons ici un protocole sans tensioactifs pour l’homogénéisation cellulaire par la cavitation de l’azote et la séparation ultérieure des protéines cytosoliques et membranaires par ultracentrifugation. Nous confirmer les fractions de granulés et de séparation des organites subcellulaires dans soluble à travers différents types de cellules et comparer l’extraction de la protéine parmi plusieurs méthodes d’homogénéisation mécanique non détergent à base commune. Parmi les nombreux avantages d’azote cavitation est l’efficacité supérieure d’une perturbation cellulaire avec un minimum de dommages physique et chimique aux organelles délicats. Combiné avec l’ultracentrifugation, cavitation d’azote est une excellente façon d’examiner le passage des protéines membranaires périphériques entre cytosolique et fractions de membrane.

Introduction

Les protéines cellulaires peuvent être divisés en deux classes : celles qui sont associées aux membranes et ceux qui ne le sont pas. Non-membrane protéines associées sont trouvent dans le cytosol, le nucléoplasme et le lumina des organites tels que le réticulum endoplasmique (re). Il y a deux classes de protéines associées aux membranes, intégrante et périphériques. Protéines intégrales de membrane sont également connu sous le nom de protéines transmembranaires parce qu’un ou plusieurs segments de la chaîne polypeptidique s’étend sur la membrane, généralement dans une hélice α composée d’acides aminés hydrophobes. Des protéines transmembranaires sont protéines insérées dans les membranes dans le cadre de leur biosynthèse et restent donc configurés jusqu'à ce qu’ils sont catabolisés. Les protéines membranaires périphériques sont secondairement poussés à membranes, généralement par suite de modification post-traductionnelle avec des molécules hydrophobes tels que les lipides. Contrairement aux protéines intégrales de membrane, la liaison des protéines membranaires périphériques avec les membranes cellulaires est réversible et peut être réglée. Nombreuses fonction de protéines membranaires périphériques dans les voies de signalisation et liaison réglementé avec membranes est un mécanisme pour activer ou inhiber une voie. Un exemple d’une molécule de signalisation qui est une protéine de membrane périphérique est la petite GTPase, RAS. Après une série de modifications post-traductionnelles qui incluent la modification avec un lipide farnésyl, mis à jour le C-terminal d’une protéine RAS mature insère dans le feuillet cytoplasmique de la membrane cellulaire. Plus précisément, la membrane plasmique est où le RAS engage son effecteur RAF1. Pour empêcher l’activation constitutive de voie de protéine mitogène-kinase (MAPK), plusieurs niveaux de contrôle de RAS sont en place. Sans compter que RAS rendu inactif par hydrolyse de GTP en PIB, RAS active aussi peut être libéré de la membrane plasmique par des modifications ou des interactions avec les facteurs pour inhiber la signalisation de solubilisation. Bien que fluorescent imagerie live offre aux biologistes cellulaires l’occasion d’observer la localisation subcellulaire des fluorescents membranaires périphériques marqués protéine protéines1, il demeure un besoin essentiel d’évaluer l’association de la membrane de protéines endogènes semi quantitativement avec des approches biochimiques simples.

Une évaluation appropriée biochimique des protéines cloisonnement entre la membrane et fractions solubles est critique dépend de deux facteurs : homogénéisation cellulaire et une séparation efficace de membrane et fractions solubles. Bien que certains protocoles, y compris les kits commercialisés plus largement utilisés, dépendent d’homogénéisation de la cellule de base de détergent, ces méthodes peuvent obscurcir l’analyse par l’extraction des protéines membranaires dans la phase soluble2. En conséquence, non détergente méthodes basés, mécaniques d’une perturbation cellulaire fournissent les résultats plus propres. Il existe plusieurs méthodes de rupture mécanique des cellules en culture ou récolte du sang ou d’organes. Il s’agit de Dounce homogénéisation, perturbation de la fine aiguille, roulement à billes homogénéisation, sonication et cavitation de l’azote. Ici, nous évaluons la cavitation d’azote et de le comparer à d’autres méthodes. Cavitation azote s’appuie sur l’azote qui est dissous dans le cytoplasme des cellules sous haute pression. Après équilibration, la suspension cellulaire est brusquement exposée à la pression atmosphérique tels que les bulles d’azote sont forment dans le cytoplasme qui déchirer la cellule en raison de leur effervescence. Si la pression est suffisamment élevée, effervescence d’azote peut perturber le noyau3 et membrane liée organites comme les lysosomes4. Toutefois, si la pression est maintenue suffisamment faible, la décompression perturbera la membrane plasmique et ER mais pas d’autres organites, déversant ainsi fois cytosol et les organites cytoplasmiques intacts dans l’homogénat désigné le cavitate5. Pour cette raison, la cavitation de l’azote est la méthode de choix pour isoler les organites comme les mitochondries et les lysosomes.

Toutefois, il est également un excellent moyen de préparer un homogénat qui peut être facilement séparé en fractions solubles et de membrane. L’appareil à pression (désormais appelé « the bomb ») utilisé au cours de la cavitation se compose d’un boîtier en acier inoxydable épais qui résiste à une pression élevée, avec une entrée pour la livraison du gaz d’azote d’un réservoir et un orifice de sortie d’une soupape de décharge réglable.

La cavitation d’azote a été utilisée pour l’homogénéisation de la cellule depuis les années 19606. En 1961, Hunter et Commerfold7 créé la cavitation de l’azote comme une option viable pour la rupture de tissus de mammifères. Depuis lors, les chercheurs ont adapté la technique à différentes cellules et tissus avec succès et cavitation de l’azote est devenu un aliment de base dans de multiples applications, y compris la membrane préparation8,9, les noyaux et les organites préparation10,11et extraction biochimique labile. Actuellement, biologistes cellulaires utilisent plus souvent les autres méthodes d’homogénéisation de la cellule parce que les avantages de l’homogénéisation de l’azote n’ont pas été largement annoncés, bombes d’azote sont chers et il y a un malentendu qui est un nombre relativement élevé de cellules Obligatoire. Protocoles de cavitation d’azote atteindre homogénats acellulaires avec noyaux intacts n’ont pas été publiés, et évaluations plus publiées volumes de 20 mL de suspension cellulaire ont été utilisées. Pour adapter cette technique classique aux besoins actuels de travailler avec petits échantillons, nous présentons un protocole modifié de cavitation azote, spécialement conçue pour les cellules cultivées. Après la cavitation de l’azote, l’homogénat est séparée en soluble (S) et les fractions membranaires (P) par centrifugation différentielle, tout d’abord avec une basse-vitesse d’essorage pour enlever les noyaux et ininterrompu de cellules, puis avec un essorage à haute vitesse (> 100 000 x g) pour séparer les membranes de la fraction soluble. Nous analysons l’efficacité de la séparation avec l’immuno-Blot et comparer la cavitation azote avec d’autres techniques de rupture mécanique. Nous étudions aussi l’effet osmotique du tampon de l’homogénéisation au cours de la cavitation de l’azote.

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Protocol

1. tampon et préparations de matériel

  1. Chill bombes de désorganisation cellulaire 45 mL, 15 mL tubes et ultracentrifugation tubes à 4 ° C.
  2. Préparer et refroidissez 25 mL de tampon d’homogénéisation par 2 x 10 7 cellules à 4 ° C. Ajouter une protéase inhibiteur pastille juste avant l’utilisation.
    Remarque : Les tampons d’homogénéisation contiennent typiquement KCl plutôt que NaCl afin de mieux refléter la composition sel intracellulaire. Tampon d’homogénéisation utilisé dans le présent Protocole se compose de 10 mM HEPES à pH 7,4, KCl 10 mM et 1,5 mM MgCl 2 (ci-après dénommé le tampon hypotonique homogénéisation). La plupart des tampons peuvent être adaptées pour cavitation azote (voir Discussion).
  3. Préparer et réfrigérer 6 mL de 1 x tampon salin Phosphate-Buffered (PBS) par échantillon à 4 ° C. Ajouter protéase inhibiteur comprimés frais avant utilisation.
    NOTE : Tampon PBS utilisée dans le présent Protocole se compose de 10 mM Na 2 HPO 4 à pH 7,4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl et KCl 2,7 mM.
  4. Préparer et réfrigérer 4 mL de tampon de solubilisation par échantillon à 4 comprimés ° C. Ajouter inhibiteur de la protéase un juste avant l’utilisation.
    NOTE : Solubilisation tampon utilisé dans le présent protocole est 1 x Radioimmunoprecipitation (RIPA) tampon, qui se compose de 25 mM Tris à pH 7,4, NaCl 150 mM, SDS 0,1 %, désoxycholate de sodium 0,5 % et 1 % NP-40. Voir NOTE 4.6.

2. Récolte de cellules

  1. Grow 2 x 10 7 -10 x 10 cellules de culture de tissus 9 avec les recommandations des milieux de culture pour le type de cellule. En règle générale, un plat de 15 cm donne 2 x 10 7 cellules HEK-293 en DMEM à confluence de 90 % ( Figure 1).
  2. Supprimer le milieu de croissance par le vide.
  3. Pour les cellules adhérentes, placez les récipients de culture sur la glace, laver les cellules directement sur les récipients de culture doucement avec un tampon homogénéisation réfrigéré deux fois (10 mL de tampon par plat de 15 cm par lavage) et récolter les cellules avec un grattoir à grandes cellules dans un volume approprié de tampon d’homogénéisation ; Pour les cellules en suspension, recueillir et laver le culot cellulaire en homogénéisation réfrigérés tampon deux fois (10 mL de tampon par culture de 50 mL par lavage) avec spin g x 500 à 4 ° C pendant 5 min et Resuspendre le culot de cellules lavées dans un volume suffisant de tampon homogénéisation sur glace.
    Remarque : le volume devrait être fondé sur les exigences relatives à la concentration de protéines dans les expériences prévues, mais aussi le volume minimal/maximal autorisé dans la bombe de désorganisation cellulaire. De manière générale est 2-10 x 10 7 cellules/mL, ou environ 10 volumes de la cellule de granule. Ce protocole est optimisé pour les trois plats de 15 cm de cellules HEK-293 dans 2 mL de tampon d’homogénéisation.

3. Cavitation azote

plaque
  1. transfert la suspension cellulaire à une bombe propre et refroidie dans un bain de glace sur un émoi.
    ATTENTION : La bombe a haute pression, basse température, l’azote gazeux – porter une protection personnelle appropriée .
  2. Placer une barre de micro agitation magnétique à l’intérieur de la bombe et tourner sur la plaque de remuer pour maintenir l’homogénéité de la suspension.
  3. Ajouter un comprimé d’inhibiteur de protéase à la suspension et fermez la bombe par fabricant ' instruction de s.
  4. Progressivement pressuriser la bombe avec une bouteille de gaz azote par fabricant ' s instruction jusqu'à ce que le manomètre de bombe lit 300 à 600 lb/po2. Fermer toutes les vannes et débrancher le réservoir d’azote.
    Remarque : La pression nécessaire peut varier selon le type de cellule. Ici, nous avons effectué la cavitation à 350 à 400 lb/po2 pour cellules HEK-293, NIH-3 t 3 et Jurkat.
  5. Attendre 20 min permettre à l’azote à dissoudre et à atteindre l’équilibre au sein des cellules.
  6. Enlever les excès d’eau autour de la soupape de décharge à l’aide d’une serviette. Ouvrir la vanne de décharge doucement afin d’obtenir une libération goutte à goutte de l’homogénat et recueillir dans un tube préalablement réfrigérées 15 mL.
    NOTE : Vers la fin de la collection il y aura une poussée de l’homogénat et gaz verront le jour avec un sifflement. Assurez-vous que le gaz n’est pas cause perçue antérieurement cavitation pour tirer hors du tube (d'où l’utilisation de 15 mL tubes au lieu de tubes de 1,5 mL). Une fois la Poussée commence, fermer la vanne au refoulement et ouvrez le robinet d’arrivé d’azote brusquement pour dépressuriser la bombe et d’atteindre la cavitation des cellules restantes dans la bombe. Ouvrir la bombe pour cavitation récupération et nettoyage en profondeur.
    Remarque : Le cavitate final doit avoir un aspect laiteux avec de la mousse sur le dessus. Remuer doucement avec une pointe de pipette pour permettre à la mousse à se calmer avant la centrifugation.
    NOTE : Examiner la cavitate par microscopie à contraste de phase pour déterminer l’efficacité de l’homogénéisation. Ajouter une goutte de 15 µL de cavitation à la surface d’une lame de microscope et recouvrir d’un lamelle couvre-objet. Répétez l’étape 3.4-3.6 que si trop de cellules ininterrompues sont détectés avec un objectif 20 X.
    Remarque : Si le tampon d’homogénéisation ne contient-elle pas d’EDTA ou l’EGTA, ajoutez-le à la collecte cavitation à une concentration finale de 1 mM à 5 min après le congé.

4. Séparation des Fractions de Membrane et de Cytosolic

  1. centrifugeuse le cavitate à 500 x g pendant 10 min à 4 ° C pour éliminer les cellules ininterrompues et noyaux.
    Remarque : Répétez l’étape de centrifugation jusqu'à ce qu’aucun culot visible n’est produite et recueillir le surnageant nucléaire Post (PNS) tout en évitant la mousse flottante sur le dessus. Re-Centrifuger la mousse pour rassembler et combiner PNS, si nécessaire ( Figure 1).
  2. Traiter les PNS comme vous le souhaitez pour obtenir des fractions d’intérêt. Dans le but de séparer cytosolique et fractions membranaires, transférer le PNS dans un tube d’ultracentrifugeuse et effectuer ultracentrifugation comme vous le souhaitez. Ce protocole est optimisé pour un < 3,5 mL d’échantillon dans un tube d’ultracentrifugation en polycarbonate et d’ultracentrifugation à 350 000 x g pendant 1 h à 4 ° C.
  3. Recueillir le surnageant (la fraction S) à l’aide d’une pipette de 1 mL.
  4. Rincer soigneusement le culot avec 3 mL de PBS froid sans déranger il. Supprimer le PBS par vide.
    Remarque : Si la contamination de la fraction de membrane de protéines cytosoliques est un plus grand souci que la perte d’échantillon, resuspendre le culot dans 3 mL de PBS et re-ultracentrifuge comme à l’étape 4.2 froid. Supprimer le PBS par vide.
  5. Resuspendre le culot entièrement dans un volume approprié de détergent contenant des tampons de solubilisation de choix. Pour obtenir l’équivalence de la cellule, utilisez le même volume de tampon de solubilisation dans le cytosol.
    NOTE : Nous recommandons d’utiliser 1 x RIPA tampon tampon de solubilisation pour extraction de protéine de membrane efficace. Si aucun test en aval n’est nécessaire pour la fraction de membrane, utiliser 1 x laemmli solution tampon d’extraction de protéine de membrane maximale.
    NOTE : Nous vous suggérons délogeant et transvaser l’extrait concentré dans un tampon de solubilisation dans un tube propre sur un rotateur de tube à 4 ° C pour l’extraction de protéines membranaires maximale.
    Remarque : Si la pastille est trop collantes (trop de lipides) à supprimer efficacement du thtube d’ultracentrifugeuse e dans un tampon de solubilisation, nous suggérons de clin d’oeil le culot de congélation dans l’azote liquide et déloger rapidement le culot du tube ultracentrifugeuse avec une spatule métallique minie avant le culot dégèle.
    NOTE : Alternativement, boulettes de membrane peuvent être simplement remis en suspension et pas solubilisées dans un tampon contenant un détergent pas à produire une fraction P de suspension de vésicules de membrane, dans ce cas la centrifugation étape en 4.6 n’est pas requis. Ces fractions de P sont utiles lors de la vérification des fonctions telles que l’activité enzymatique qui dépendent de l’association de la membrane.
  6. Centrifuger la suspension entièrement solubilisée pellet de l’étape 4,5 à 20 000 x g dans une centrifugeuse de table pendant 10 min à 4 ° C. recueillir le surnageant à l’aide d’une pipette de 1 mL (la fraction de P) et jetez le culot (lipides insolubles).
  7. Effectuer des tests souhaitées comme Éponger occidental avec les fractions cytosoliques ou membrane, ou enregistrez-les à-80 ° C pour une utilisation future.

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Representative Results

La figure 2 illustre la répartition des protéines cellulaires de PNS dans le cytosol soluble (S) ou d’une fraction membranaire de pellet (P). Nous avons examiné trois lignées représentatives de différents types de cellules : cellules HEK-293 (épithéliale), NIH-3 t 3 (fibroblastes) et Jurkat (lymphocytes). Inhibiteur de Dissociation de Guanine Rho (RhoGDI) et indépendante des cations mannose-6-phosphate récepteur (CIMPR) ont été utilisés comme témoins positifs pour cytosolique et fractions de membrane, respectivement. Nous avons confirmé la séparation efficace de la membrane et le cytosol après cavitation d’azote à ~ 350 lb/po2 dans tampon hypotonique suivie d’ultracentrifugation à 350 000 x g pendant 1 h. La fraction protéique totale extraite les fractions S et P ont ensuite été analysées avec des marqueurs pour l’ER, endosomes et les lysosomes, mitochondries, Golgi et autres organites. Toutes les protéines transmembranaires sont présents dans la fraction de membrane exclusivement, y compris Na+/k+ ATPase et le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) de la membrane plasmique, la calnexine de ER, protéine de la membrane lysosomale associés à 1 (LAMP1) des lysosomes, F0-ATPase de mitochondries et 97 Golgin de la trans réseau Golgi. Comme prévu, beaucoup de protéines membranaires périphériques qui sont plus ou moins associé à la membrane, présente aussi bien dans les fractions cytosoliques et membranaires à des degrés divers. Des exemples significatifs de l’endosome précoce antigène 1 (EEA1), Rab7/9 (endosomes fin) et l’hexokinase 1 (membrane extérieure mitochondries). Ceci démontre l’utilité de cette technique dans l’évaluation de la force de liaison de membrane de protéines périphériques. Notre laboratoire a pris avantage de cette technique de cavitation pour examiner l’état d’association de membrane de plusieurs molécules signalisation5,12,13,14. Fait intéressant, nous avons trouvé calregulin presque exclusivement dans la fraction soluble, ce qui suggère que les microsomes produits des membranes ER ont également été perturbés au cours de la cavitation de l’azote et les protéines dans la lumière de l’ER sont rejetées dans la fraction soluble. En revanche, l’intégrité des mitochondries après cavitation est dépendante du type de cellule. Nous avons observé F1-ATPase, une protéine périphérique intérieur de mitochondries, partiellement dans le cytosol, allant de 2 % pour les NIH-3 t 3 cellules à environ 35 % pour les cellules HEK-293 et Jurkat. Ceci indique qu’azote cavitation à 350 lb/po2 avec tampon hypotonique ne garantit pas l’intégrité mitochondriale. Malgré trois cycles de 500 x g tours pour générer le PNS de cavitate, pas tous les noyaux ont été supprimés. Histone deacetylase 1 (HDAC1) du nucléoplasme et fibrillarine du nucléole, trouvées dans le PNS et le culot. La présence de HDAC1 dans le culot et non dans le surnageant suggère que le PNS est contaminé avec noyaux, plutôt que la désorganisation nucléaire au cours de la cavitation. Cela concorde avec les rapports que la mise sous pression de la bombe à 350 lb/po2 laisse les noyaux intacts10, même si notre utilisation de tampon hypotonique peut invalider les noyaux fragile, tel que discuté dans la section suivante.

Nous avons comparé l’efficacité de l’homogénéisation de la cavitation de l’azote avec celle des autres méthodes de perturbation physique commun. Une quantité égale de cellules Jurkat ont été suspendue dans un tampon identique homogénéisation hypotonique et soumise à des perturbations différentes méthodes. Il y a perte détectable d’échantillons en Dounce cavitation homogénéisation et de l’azote (dans les deux cas environ 5 à 10 % moins de volume est collectée). Cependant, la cavitation de l’azote a donné la plus grande efficacité d’extraction de protéine ; passage de l’aiguille et Dounce ont donné seulement 60 % autant de protéines (Figure 3). Curieusement, récupération de certaines protéines, tel que déterminé par immunoblot n’a pas montré une différence significative entre les méthodes différentes perturbations mécaniques. Toutefois, le rendement de certaines protéines membranaires périphériques tels que l’hexokinase 1 et RAS était plus élevé chez les échantillons préparés avec la cavitation de l’azote. Cette prend en charge cette cavitation d’azote peut être optimale d’homogénéisation lors d’enquêtes sur les protéines membranaires périphériques. Extraction de HDAC1 des protéines par la cavitation de l’azote est comparable à d’autres méthodes, ce qui suggère que les noyaux demeurent intactes dans toutes les conditions. Ainsi, les données à la Figure 3 démontre que cette cavitation azote offre des résultats supérieurs homogénéisation.

Ensuite, nous avons comparé l’efficacité de l’homogénéisation entre buffer hypotonique et le même mais fait isotoniques avec saccharose ou chlorure de sodium (Figure 4). Des quantités similaires de protéines ont été récupérées dans des cellules Jurkat homogénéisés dans tampon hypotonique par rapport à tampon isotonique de NaCl après cavitation à 350 lb/po2. En revanche, moins de protéines a été récupéré dans le PNS de cellules perturbées dans le tampon fait isotonique avec saccharose. Plupart des protéines étudiées par immunoblot correspondent à ce schéma. Une exception a été fibrillarine qui était relativement enrichi dans le PNS généré dans le tampon isotonique.

Pour déterminer si notre protocole peut être utilisée pour étudier la répartition des protéines membranaires périphériques entre soluble et fractions de membrane, nous avons comparé les modèles entre ARN drapeau-le tag sauvage et son mutant prénylation déficient, () C186S de partitionnement La figure 5). À l’état stable, le type sauvage ARN était présent dans le cytosol et de membranes, semblables aux protéines de la membrane plus périphériques, même si la partie récupérée dans la fraction soluble est supérieure à d’autres protéines RAS14. Quand l’ARN est privé de sa modification prényl, il perd sa capacité à associer des membranes et devient entièrement cytosolique. Les schémas de partitionnement attendues des ARN a confirmé que notre protocole est une option fiable pour étudier la dynamique de la répartition des protéines membranaires périphériques entre le cytosol et membranes.

Figure 1
Figure 1 : organigramme récapitulant les étapes 2 (bleu), étape 3 (rouge) et 4 (jaune) du protocole. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : protéine cloisonnement entre les fractions cytosoliques et membranaires. HEK-293, NIH-3 t 3 cellules Jurkat ont été soumis à la cavitation de l’azote (~ 350 lb/po2 pendant 20 min, en suspension dans un tampon hypotonique homogénéisation) et ultracentrifugation (~ 350 000 x g pendant 1 h) tel que décrit dans le protocole. Taux de protéines endogènes dans différentes fractions ont été analysés par immunoblot. PNS : Antigène de cancer-fixation aux récepteurs exprimé sur les cellules SiSo (ACS), surnageant nucléaire, S: surnageant, P: pellet. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Comparaison de techniques différentes perturbations mécaniques. Contre-valeur des cellules Jurkat ont été suspendues dans un tampon hypotonique et soumis au gel-dégel (3 cycles), homogénéisation de Dounce (5 traverse, 28G½ aiguille), passage (15 passes, Kontes 2 mL Dounce tube avec un pilon de mouture de tissu, clairance de l’aiguille 0,01-0,06 mm) ou la cavitation de l’azote (~ 350 lb/po2 pendant 20 min). Les niveaux relatifs des protéines endogènes dans le PNS ont été analysés par immunoblot pour chaque méthode. Les concentrations de protéine totale de PNS ont été quantifiées par BCA assay et normalisée à la valeur de la PNS préparée par la cavitation de l’azote. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : comparaison des tampons hypotoniques et isotoniques utilisée au cours de la cavitation de l’azote. Quantités équivalentes de Jurkat cellules ont été suspendues en tampon hypotonique ou tampon hypotonique additionné de 8,5 % de sucrose ou de NaCl 150 mM et soumis à la cavitation de l’azote (~ 350 lb/po2 pendant 20 min). Les niveaux relatifs des protéines endogènes dans le PNS ont été analysés par immunoblot pour chaque tampon. Des concentrations de protéines totales de PNS ont été quantifiées par dosage de la BCA et normalisées à la valeur de la PNS préparée dans du tampon hypotonique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : Farnesylated NRAS se répartit en fractions de P et de S. Cellules HEK-293 ont été transfectées de manière transitoire avec des plasmides enjoignant à l’expression d’ARN drapeau-le tag sauvage ou C186S mutant. Partitionnement de la protéine a été effectué tel que décrit à la Figure 2 et les niveaux de protéines indiquées ont été analysés par immunoblot. Reproduit avec la permission (Zhou, M, et al., 2016. Article publié dans le Journal of Cell Biology. https://doi.org/10.1083/JCB.201604061). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Les avantages de cavitation d’azote par rapport aux autres méthodes de perturbation mécanique sont multiples. Peut-être l’avantage le plus significatif est sa capacité d’homogénéiser doucement mais efficacement les spécimens. Les principes physiques de décompression cools échantillons au lieu de générer dommages thermiques locales comme ultrasons et frottement/cisaillage des techniques basées sur. La cavitation est également extrêmement efficace à perturber la membrane plasmique. Parce que l’azote bulles sont générés au sein de chaque cellule individuelle à la décompression, le processus de cavitation est limité moins par la taille des cellules, taille de l’échantillon ou concentration de l’échantillon. Il offre donc des avantages supplémentaires par rapport à Dounce axée sur le jeu ou l’homogénéisation de passage de l’aiguille. Cavitation azote offre également des résultats plus uniformes que le même élément perturbateur qui est appliqué uniformément tout au long de l’échantillon peut être reproduit avec des pressions identiques. En outre, chaque cellule subit seulement le processus de perturbation pour une seule fois et composants subcellulaires ne sont, par conséquent, pas constamment exposés à des forces perturbatrices variables. Cela limite la fragmentation artéfactuelles d’organites. Préoccupation pour l’oxydation des composants cellulaires labiles, causé par la rupture est également atténuée, comme l’azote est utilisé pour saturer la suspension cellulaire et est libre de l’oxygénothérapie. Les contraintes physiques et chimiques restreints, imposées par la cavitation de l’azote en fait une technique idéale pour étudier les enzymes labiles et organites fragiles et la reproductibilité de cette technique d’homogénéisation est bien adaptée pour la quantification.

Cavitation azote offre également une grande flexibilité en ce qui concerne la taille de l’échantillon, la composition des tampons d’homogénéisation et le degré d’intégrité de l’organite. Pour intensifier l’homogénéisation, il faut simplement déployer des appareils à pression de grandes capacités, sans sacrifier la vitesse, la commodité ou l’efficacité de la décompression. N’importe quel tampon homogénéisation peut être utilisée pour la cavitation de l’azote ; choix de la mémoire tampon peut être adaptée pour assurer la compatibilité avec les exigences de chaque expérience. On peut concevoir un tampon d’homogénéisation qui correspond le liquide intracellulaire (par exemple, forte concentration de potassium et faible teneur en sodium) pour minimiser les modifications dans les organites. Par exemple, nous avons développé un tampon « détente » qui minimise l’ex vivo polymérisation de l’actine et ainsi aide à collecter des vésicules cytoplasmiques intacts de granulocytes5. Les fonctionnalités osmotiques et ioniques du tampon peuvent également être modifiées pour contrôler le degré d’homogénéisation de la cellule. En outre, l’agressivité d’une perturbation cellulaire peut être contrôlée en ajustant la pression de l’azote. Une pression modérée réduit la force perturbatrice pour préserver les noyaux, les mitochondries et les autres organites dans un état intact, tandis que la haute pression perturbe ces organites. Brock et al. signalé des succès avec perturbation des cellules leucémiques basophiles Rat tout en conservant la plupart des noyaux intacts à 350 lb/po2 avec tampon hypotonique10, qui constitue la base de la pression de l’azote utilisée dans notre protocole actuel.

Limitations de la cavitation de l’azote, notamment le fait que l’homogénéisation est uniforme dans l’ensemble des échantillons et structures membranaires différents peuvent produire des vésicules de tailles similaires ; Cela peut compliquer une séparation supplémentaire de la membrane plasmique, les microsomes lisses, les endosomes et les membranes golgiennes par centrifugation en gradient de densité taux-zonal. Une autre préoccupation est que les organites sont relativement fragiles après homogénéisation en raison de la rupture de l’intérieur. Ainsi, cette méthode nécessite optimisation minutieuse pour éviter tout bris d’organelle dans des manipulations ultérieures. L’étude visait à répondre à certaines de ces questions dans la présente étude.

Séparation de cytosolique et fractions membranaires par centrifugation a été exploré en limitée rapports détaillant la répartition des fractions protéiques avec une poignée de protéines marqueurs15,16. Notre méthode génère une séparation brute des protéines solubles et membranaires et n’implique pas l’isolement des organites particulières. Pourtant, c’est toujours une préoccupation légitime que les vésicules homogènes des différentes membranes produites par la cavitation peuvent affecter l’efficacité de séparation par ultracentrifugation. Nous avons présenté une étude complète par immuno-blot de l’isolement et la séparation des organites subcellulaires communes après fractionnement avec notre protocole. Comme prévu, les protéines cytosoliques purement comme RhoGDI sont exclusivement dans la fraction soluble et des protéines transmembranaires sur la membrane plasmique (PM) tels que l’EGFR et Na+/k+ ATPase, ont été retrouvés seulement dans le culot. Des protéines transmembranaires sur organites tels que ER, de mitochondries, de Golgi et de lysosomes retrouvés aussi dans le culot, confirmant que les protéines membranaires intrinsèques différentes membranes des organites peuvent être séparés avec succès de protéines solubles avec notre méthode. Cette validation fondamentale est cruciale pour l’analyse des protéines membranaires périphériques, qui est le principal objectif du présent protocole.

La plupart des protéines membranaires périphériques existent dans les deux fractions cytosoliques et membrane. Même si c’est souvent une représentation fidèle de leur localisation, il peut dans certains cas représenter artéfactuelles redistribution de ces protéines à la surface cytoplasmique des membranes à la fraction soluble pendant le processus d’homogénéisation, depuis le la force de leur association avec les membranes n’est pas aussi forte que celle des protéines intégrales de membrane. Bien que la cavitation de l’azote réduit au minimum la redistribution potentielle en exposant les cellules à une perturbation ponctuelle, douce, un doit être conscient de tels objets de fractionnement biochimique et portent sur les changements dans la répartition des protéines entre cytosolique et fractions de membrane dans des conditions expérimentales. Néanmoins, l’examen des protéines membranaires périphériques à différents stades de maturation endosomal est possible avec cette méthode. EEA1, un effecteur Rab5 qui intervient dans les endosomes précoces, amarrage de vésicules recouvertes de clathrine se localise à la surface cytoplasmique des endosomes précoces et est retrouvé principalement dans la fraction de pellet. Protéines Rab7 et Rab9 fin-endosome-connexes sont également dans la fraction de pellet. Cependant, il reste une quantité appréciable de Rab7/9 dans le cytosol. RabGDI étant en mesure d’interagir avec prénylés CCR et rendre ces protéines insolubles dans le cas contraire cytosolique, protéines Rab tendent à être plus cytosolique qu’autres protéines membranaires périphériques liés endosome.

Pour caractériser l’intégrité nucléaire et organelle avec homogénéisation par la cavitation de l’azote, nous immunoblotted les fractions isolées pour les compartiments cytoplasmiques et luminaux. Dans cette analyse, calregulin soit entièrement libérée dans la fraction soluble, démontrant que l’ER est perturbé de microsomes de forme et ainsi les fuites contenu luminal. Étant donné que l’un la moitié de la superficie totale de la membrane d’une cellule eucaryote enferme les espaces labyrinthiques de l’ER, il n’est pas surprenant que son vaste réseau de structure forme de sac ou tubulaire ne parvient pas à rester intact pendant l’expansion des bulles d’azote. En revanche, notre analyse d’intégrité mitochondriale après cavitation montre clairement la dépendance sur le type de cellule, que nous avons observé F1-ATPase, une protéine qui est accessoirement associée à la membrane interne des mitochondries, dans le cytosol à des degrés divers (~ 35 % pour les cellules HEK-293 et Jurkat, 2 % pour les NIH-3 t 3). Ceci indique qu’azote cavitation à 350 lb/po2 avec tampon hypotonique ne garantit pas l’intégrité mitochondriale. En effet, d’autres ont rapporté que pour conserver les mitochondries, cavitation doit être effectuée à une pression inférieure à 150 lb/po²17. En revanche, nous avons constaté que la catalase demeure dans la lumière des peroxysomes. Curieusement, les protéines nucléaires sont observées dans les fractions PNS et pellet. Plus précisément, HDAC1, une histone désacétylase présent dans le nucléoplasme, est absent dans la fraction soluble, ce qui indique que l’intégrité nucléaire n’est pas compromise. Ceci suggère que l’enveloppe nucléaire n’est pas rompue par cavitation, comme on pourrait s’attendre à la libération de HDAC1 dans le soluble fraction dans ce scénario. Il reste probable que les noyaux ne sont pas complètement supprimées au cours du processus de préparation du PNS, et la protéine reste dans le culot après ultracentrifugation. Cette probabilité est étayée par le fait qu’aucune fuite d’ADN n’est détecté dans la fraction soluble. Par conséquent, nous concluons que l’utilisation de tampon hypotonique homogénéisation au cours de la cavitation à ~ 350 lb/po2 avec l’ajout de Mg2 + est capable de préserver l’intégrité nucléaire dans plusieurs lignées cellulaires.

Nos résultats démontrent également que les ribosomes recueillent entièrement dans la fraction de membrane pellet, suggérant que les ribosomes encore libres dans le cytoplasme qui sont dissociées aux membranes ER peuvent être complètement sédimentés dans un tampon non-saccharose-coussin après centrifugation à 350 000 x g pendant 1 h. de même, identification de la protéine autophagie 12 (Atg12)-Atg5 conjugué comme marqueur des autophagosomes, révèle une ségrégation stricte pour les fractions de pellet. Sa présence dans le cytosol peut être causée par le fait que l’attache covalente de Atg12 et Atg5 précède la formation d’autophagosomes. Les protéines du cytosquelette sont difficiles à évaluer en raison de l’ex vivo de polymérisation. Ce phénomène peut être atténuée avec un tampon de relaxation, mais dans le protocole décrit ici, la tubuline est probablement polymérisé ex vivo sur la chélation du calcium 18. Dans nos préparatifs tubuline se trouve dans le culot suggérant la polymérisation, tandis que l’actine se trouve dans les fractions de la P et S.

Afin de caractériser les avantages potentiels de la cavitation de l’azote dans l’efficacité de l’homogénéisation, nous avons examiné certaines techniques courantes de rupture mécanique. Méthodes optimisées pour des échantillons de tissus tels que mélangeur ou mortier/pilon n’étaient pas évalués. Sonication a été également exclue car il est difficile de perturber la membrane de surface tout en conservant les organites internes. Notre analyse a porté sur les méthodes suivantes : gel-dégel, l’aiguille de passage et homogénéisation Dounce, car ils sont faciles à effectuer et ne nécessitent pas de matériel spécial comme un homogénéisateur de roulement à billes. Les cellules Jurkat ont été utilisées dans cette analyse en raison de leur petite taille, ce qui les rend difficiles à homogénéiser efficacement avec des techniques de cisaillement liquides traditionnelles qui dépendent de la garde, comme le passage de l’aiguille et Dounce. Jugé par la concentration des protéines totales récupérées, nous avons constaté que des méthodes de perturbation indépendante-la taille des cellules comme azote cavitation et le gel / dégel montrent en effet une efficacité supérieure de l’extraction de protéines. Une analyse similaire avec des cellules de grandes tailles a révélé des petites différences dans l’efficacité de l’homogénéisation, bien qu’azote cavitation est toujours supérieure à d’autres méthodes physiques testés (données non présentées).

Nombreux cytosolique, protéines endosomale et cytosquelette ont été récupérés efficacement avec toutes les méthodes éprouvées. En revanche, sur le re et le Golgi, les protéines ont été récupérés optimale à l’aide de la cavitation de l’azote. Le rendement légèrement inférieur de F1-ATPase en cavitation d’azote par rapport à d’autres méthodes peut-être tenir compte du fait que les mitochondries sont plus susceptibles de demeurer intacte au cours de la cavitation et donc plus efficacement enlevé dans l’essorage à vitesse lente utilisée pour générer le PNS. L’observation que l’hexokinase 1, une protéine de membrane périphérique trouvé à la fois dans le cytosol et associé à la membrane mitochondriale externe, se sont comportée de la façon opposée par rapport à la F1-ATPase probablement reflète la labilité de l’association des l’hexokinase 1 par rapport à F1-ATPase, qui est piégé à l’intérieur de la mitochondrie. Ce qui est important, bien que capables de perturber les cellules avec une efficacité comparable, méthodes alternatives de rupture mécanique a donné un rétablissement relativement médiocre de certaines protéines membranaires périphériques (hexokinase 1 et RAS). Ainsi, la cavitation est notre technique d’homogénéisation de choix aux fins de l’enquête sur la partition des protéines membranaires périphériques. Parce que l’homogénéisation Dounce est largement utilisée pour préparer des noyaux intacts, nous avons utilisé Dounce comme point de repère pour évaluer l’intégrité nucléaire à travers d’autres méthodes de rupture mécanique. Dans notre analyse, des niveaux semblables de la récupération des protéines HDAC1 confirment que les noyaux demeurent intactes dans des homogénats de Jurkat préparés par cavitation d’azote à ~ 350 lb/po2 avec tampon hypotonique.

Il était évident que la mémoire tampon d’homogénéisation utilisée au cours de la cavitation de l’azote peut affecter significativement l’intégrité de l’efficacité et les organites de perturbation. Alors que la composition du tampon de l’homogénéisation doit être optimisée pour les besoins de l’application prévue, il est à noter que chercheurs effectuant la décompression d’azote des tissus animaux utilisent tampon avec une faible pression osmotique pour extraire nucléaire contenu. Hunter et Commerford a montré des noyaux gonflement et rupture lorsque les solutions ont été diluées et préservation des noyaux lors de l’utilisation des solutions isotoniques7 (qui peut être atteint par chaque ajout de sels inorganiques tels que le chlorure de sodium ou de solutés organiques tels que saccharose ou glycérol). Le tampon isotonique norme utilisé pour isoler les organites subcellulaires autres que les noyaux des cellules mammifères est 0,25 M de sucrose contenant 1 mM EDTA et mis en mémoire tampon Tris, HEPES, ou Tricine à un pH de 7,0 et 7,6. Mais pas toutes les cellules de culture peuvent être efficacement homogénéisés dans l’un des tampons isotoniques. Tampon hypotonique (généralement 10 mM Tris, HEPES, etc.) est souvent utilisé pour fournir un stress osmotique nécessaire à certains types de cellules pour obtenir une homogénéisation complète. Cependant, comme mentionné précédemment, les tampons hypotoniques tendent à rendre les noyaux fragile et sujette aux fuites de l’ADN si l'on inclut l’EDTA. Afin de promouvoir l’intégrité nucléaire, nous remplaçons EDTA avec KCl et de faibles concentrations de cations divalents comme le MgCl2 ou MgSO4. Mg2 + est généralement préféré à Ca2 + parce que ce dernier peut activer certaines phospholipases et protéases et inhiber l’ARN polymérase. Cavitation terminée, EDTA ou EGTA peut être rajouté aux homogénats de chélater le cation, si nécessaire pour inhiber les métalloprotéases.

Les cellules Jurkat affichent un ratio de noyau-à-cytoplasme relativement important, ce qui les rend une lignée de cellules idéal pour étudier l’intégrité nucléaire. L’augmentation de l’efficacité de l’homogénéisation en utilisant le tampon hypotonique est minime lorsque l'on compare au tampon isotonique additionné de NaCl. Toutefois, la cavitation dans un tampon isotonique additionné de saccharose récupère environ la moitié des protéines extraites à l’aide d’un homologue tampon hypotonique. C’est probablement pas la conséquence directe de l’isotonicity, et l’écart entre l’utilisation de NaCl et saccharose pour atteindre isotonicity exige de nouvelles enquêtes. Une explication possible est que sel perturbe les interactions électrostatiques entre les protéines, alors que le saccharose n’est pas. Ainsi, même à la même tonicité, NaCl a une activité pertinente pour l’extraction de la protéine qui n’a pas de saccharose. Wn ce qui concerne à la préservation de l’intégrité nucléaire, nous avons trouvé fibrillarine accrue de protéines récupérées à l’aide des tampons isotoniques, malgré tampons isotoniques étant théoriquement plus protectrice des noyaux. Curieusement, la fraction mitochondriale a été plus efficacement extrait avec tampon isotonique additionné de NaCl, suggérant que le sel est faible pourrait être sous-optimale pour l’extraction de mitochondries. Examen de cavitation avec tampon hypotonique permet d’obtenir le meilleur équilibre entre l’efficacité de l’homogénéisation et l’intégrité nucléaire, le tampon hypotonique devienne le tampon de choix dans notre protocole de cavitation. Cependant, nous mettons en garde les lecteurs qu’aucun tampon n’est une garantie de résultats optimaux d’homogénéisation. Notre protocole devrait servir de modèle pour l’optimisation, et pilote d’essai avec les tampons souhaités, les lignées de cellules d’intérêt et d’autres variables (pression, composition du tampon, etc.) doivent être établies pour de meilleurs résultats.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été financé par GM055279, CA116034 et CA163489.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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References

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