Cavitação de nitrogênio e centrifugação diferencial permite o monitoramento da distribuição de proteínas de membrana periférica em culturas de células

Biochemistry

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Summary

Aqui apresentamos os protocolos para homogeneização de detergente livre de células de mamíferos cultivadas com base no azoto cavitação e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Este método é ideal para monitorar o particionamento de proteínas de membrana periférica entre solúvel e fracções de membrana.

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Zhou, M., Philips, M. R. Nitrogen Cavitation and Differential Centrifugation Allows for Monitoring the Distribution of Peripheral Membrane Proteins in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (126), e56037, doi:10.3791/56037 (2017).

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Abstract

As células cultivadas são úteis para estudar a distribuição subcelular de proteínas, incluindo proteínas periféricas da membrana. Geneticamente codificado fluorescente etiquetadas proteínas revolucionou o estudo da distribuição Subcellular da proteína. No entanto, é difícil quantificar a distribuição com microscopia fluorescente, especialmente quando as proteínas são parcialmente citosólica. Além disso, muitas vezes é importante estudar proteínas endógenas. Bioquímicos ensaios tais como immunoblots permanecem o padrão ouro para quantificação da distribuição de proteínas após fracionamento subcelular. Embora existam jogos comerciais que visam isolar citosólica ou certas fracções de membrana, a maioria destes jogos é baseada na extração com detergentes, que podem ser inadequados para o estudo de proteínas de membrana periférica que facilmente são extraídas de membranas. Aqui nós apresentamos um protocolo livre de detergente para celular homogeneização por cavitação de nitrogênio e posterior separação de proteínas do citosol e membrana-limite por ultracentrifugação. Podemos confirmar a separação de organelas subcelulares em solúvel e pelota frações através de diferentes tipos de células e comparar a extração de proteínas entre vários métodos de homogeneização mecânica não baseados em detergente comum. Entre várias vantagens de azoto cavitação é a eficiência superior de ruptura celular com o mínimo de danos físico e químico para organelas delicados. Combinado com ultracentrifugação, cavitação de nitrogênio é um excelente método para examinar a mudança das proteínas de membrana periférica entre citosol e membrana fracções.

Introduction

Proteínas celulares podem ser divididas em duas classes: aqueles que estão associados com membranas e aqueles que não são. Non-membrana proteínas associadas são encontradas no citosol, nucleoplasma e lumina de organelas como o retículo endoplasmático (ER). Existem duas classes de proteínas de membrana-associado, integrais e periféricas. Proteínas integrais da membrana são também conhecidas como proteínas transmembrana porque um ou mais segmentos da corrente do polypeptide atravessa a membrana, normalmente como um composto de aminoácidos hidrofóbicos α-hélice. Proteínas transmembrana co-translationally são inseridas em membranas no decorrer de sua biossíntese e permanecem assim configuradas até que eles são catabolizados. Proteínas periféricas da membrana secundariamente são levadas a membranas, geralmente como consequência de modificação pós-traducional com moléculas hidrofóbicas, tais como lipídios. Em contraste com as proteínas integrais de membrana, a associação de proteínas de membrana periférica com membranas celulares é reversível e pode ser regulada. Função de proteínas de membrana periférica muitas em vias de sinalização e regulamentada associação com membranas é um mecanismo para ativar ou inibir um caminho. Um exemplo de uma molécula de sinalização que é uma proteína de membrana periférica é a pequena GTPase, RAS. Após uma série de modificações borne-translational que incluem modificação com um lipídico farnesil, modificado C-terminal de uma proteína RAS maduro insere-se no folheto da citoplasmático da membrana celular. Especificamente, a membrana plasmática é onde o RAS envolve sua jusante efetoras RAF1. Para evitar a ativação constitutiva do mitogen-ativado proteína quinase (MAPK) via, vários níveis de controle de RAS estão no lugar. Além de renderização RAS inativo por hidrólise de GTP em GDP, RAS ativo também podem ser liberados da membrana plasmática, modificações ou interações com fatores para inibir a sinalização de solubilizing. Embora fluorescente imagens ao vivo proporciona biólogos de célula a oportunidade de observar a Localização subcellular de proteínas da membrana periférica com tag proteína fluorescente1, ainda há uma necessidade crítica para avaliar a associação de membrana de proteínas endógenas semi-quantitativamente com simples abordagens bioquímicas.

A adequada avaliação bioquímica de proteína particionamento entre a membrana e frações solúveis é criticamente dependente de dois fatores: homogeneização celular e separação eficiente de membrana e frações solúveis. Embora alguns protocolos, incluindo os kits comercializados mais amplamente utilizados, dependem de homogeneização de detergente à base da célula, estes métodos podem ofuscar análise pela extração de proteínas de membrana para a fase solúvel2. Por conseguinte, detergente não-mecânicos, baseado em métodos de rompimento da pilha fornecem resultados mais limpos. Existem vários métodos de ruptura mecânica das células cultivadas em cultura ou colheita de sangue ou órgãos. Estes incluem homogenizacao homogeneização, rompimento de agulha fina, homogeneização do rolamento de esferas, sonication e cavitação de nitrogênio. Aqui podemos avaliar cavitação de nitrogênio e compará-lo com outros métodos. Cavitação de nitrogênio depende de nitrogênio que é dissolvido no citoplasma das células sob alta pressão. Depois de equilibração, a suspensão de eritrócitos é abruptamente exposta à pressão atmosférica tal que formam-se bolhas de nitrogênio no citoplasma que rasgue a célula como consequência de sua efervescência. Se a pressão for suficientemente elevada, efervescência de nitrogênio pode interromper o núcleo3 e membrana limite organelas como lisossomos4. No entanto, se a pressão é mantida baixa o suficiente, a descompressão vai interromper a membrana plasmática e ER mas não outras organelas, desse modo, derramando tanto citoplasma e organelas citoplasmáticas intactas para o homogenate designado o cavitate5. Por esta razão, cavitação de nitrogênio é o método de escolha para isolar organelas como lisossomos e mitocôndrias.

No entanto, também é uma excelente maneira de preparar um homogenate que pode ser facilmente separada em membrana e frações solúveis. O vaso de pressão (doravante denominado "a bomba") usado durante a cavitação consiste de um invólucro de aço inoxidável espesso que resiste a alta pressão, com uma entrada para a entrega do gás nitrogênio de um tanque e uma porta de saída com uma válvula de descarga ajustável.

Cavitação de nitrogênio tem sido usada para homogeneização de célula desde a década de 1960,6. Em 1961, Hunter e Commerfold7 estabeleceu cavitação de nitrogênio como uma opção viável para o rompimento de tecidos de mamíferos. Desde então, pesquisadores adaptaram-se a técnica de várias células e tecidos com sucesso, e cavitação de nitrogênio tornou-se um grampo em vários aplicativos, incluindo preparação de membrana8,9, núcleos e organela preparação de10,11e extração bioquímica lábil. Atualmente, biólogos da célula mais frequentemente empregam outros métodos de homogeneização de celular porque os benefícios de homogeneização de nitrogênio não têm sido amplamente divulgados, bombas de nitrogênio são caras e há um equívoco que é um número relativamente grande de células Necessário. Protocolos para cavitação de nitrogênio alcançar homogenates livre de células com núcleos intactos não tenham sido publicados, e em avaliações publicadas mais volumes de 20 mL da suspensão de células foram usados. Para adaptar esta técnica clássica para atender às necessidades atuais de trabalhar com amostras em pequena escala, apresentamos um protocolo modificado de cavitação de nitrogênio projetado especificamente para pilhas cultivadas. Após a cavitação de nitrogênio, o homogeneizado é separado em solúveis (S) e frações de membrana (P) por centrifugação diferencial, primeiro com uma rotação de baixa velocidade para remover núcleos e células ininterrupta e depois com uma rotação de alta velocidade (> g x 100.000) para separar membranas da fracção solúvel. Podemos analisar a eficiência da separação com immunoblots e comparar a cavitação de nitrogênio com outras técnicas de ruptura mecânica. Também investigamos o efeito osmótico de tampão de homogeneização durante a cavitação de nitrogênio.

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Protocol

1. buffer e preparações de equipamento

  1. Chill 45 mL célula rompimento bombas, tubos de 15 mL e tubos de ultracentrifugação em 4 ° C.
  2. Preparar e relaxar 25 mL de tampão de homogeneização por 2 x 10 7 células em 4 ° C. adicionar uma protease inibidor tablet imediatamente antes da utilização.
    Nota: Buffers de homogeneização normalmente contêm KCl ao invés de NaCl para melhor refletir a composição intracelular de sal. Tampão de homogeneização utilizado neste protocolo consiste de 10 mM HEPES pH 7,4, 10 mM KCl e 1,5 mM de MgCl 2 (adiante designado como tampão de homogeneização hipotônica). A maioria dos amortecedores podem ser adaptados para cavitação de nitrogênio (ver discussão).
  3. Preparar e relaxar 6 mL de tampão de Phosphate-Buffered salino (PBS) por amostra em 4 ° C. Adicionar protease inibidor comprimidos frescos antes de usar 1x.
    Nota: Tampão PBS utilizado neste protocolo consiste de 10 mM Na 2 HPO 4 em pH 7,4, 1.8 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl e 2,7 mM KCl.
  4. Preparar e relaxar 4 mL de tampão de solubilização por amostra em 4 ° C. adicionar uma protease inibidor em comprimidos imediatamente antes da utilização.
    Nota: O buffer de solubilização usado neste protocolo é 1 x Radioimmunoprecipitation buffer de ensaio (RIPA), que consiste de 25 mM Tris pH 7,4, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, Deoxycholate do sódio de 0,5% e 1% NP-40. Ver nota 4,6.

2. Colheita de células

meios de cultura
  1. Grow 2 x 10 7 -10 x 10 9 células de cultura de tecidos com a recomendada para o tipo de célula. Normalmente, um prato de 15 cm rende 2 x 10 7 células HEK-293 cultivadas em DMEM em confluência de 90% ( Figura 1).
  2. Remover o meio de crescimento por vácuo.
  3. Para as células aderentes, coloque os pratos de cultura no gelo, lavar as células diretamente sobre os pratos de cultura suavemente com tampão de homogeneização refrigeradas duas vezes (10 mL de tampão por prato 15 cm por lavagem) e colher as células com um raspador de grandes células em um volume adequado de tampão de homogeneização; Para células de suspensão, recolher e lavar o centrifugado homogeneização refrigerados reserva duas vezes (10 mL de tampão por cultura de 50 mL por lavagem) com rotação de 500 x g a 4 ° C por 5 min e resuspenda o pellet celular lavados em um volume adequado de tampão de homogeneização no gelo.
    Nota: O volume deve basear-se sobre os requisitos para a concentração de proteína em experimentos pretendidos, bem como o volume mínimo/máximo permitido na bomba de rompimento celular. A regra geral é de 2-10 x 10 7 células/mL, ou cerca de 10 volumes da célula de Pelotas. Este protocolo é otimizado para três pratos de 15 cm de células HEK-293 em 2 mL de tampão de homogeneização.

3. Cavitação de nitrogênio

  1. a suspensão de células de transferência para uma bomba limpa e refrigerada em banho de gelo em um rebuliço placa.
    Atenção: A bomba tem alta pressão, baixa temperatura, gás nitrogênio – usar proteção pessoal apropriada .
  2. Colocar uma barra de agitação magnética micro interior da bomba e ligar a placa de agitação para manter a homogeneidade de suspensão.
  3. Adicionar um comprimido de inibidor de protease à suspensão e feche a bomba por fabricante ' instrução de s.
  4. Gradualmente pressurizar a bomba com um tanque de gás nitrogênio por fabricante ' instrução s até o calibre de pressão de bomba lê 300 a 600 libras por polegada quadrada. Fechar todas as válvulas e desconectar o tanque de nitrogênio.
    Nota: A pressão necessária pode variar com o tipo de célula. Aqui realizamos cavitação em 350 a 400 psi para células HEK-293, NIH-3T3 e Jurkat.
  5. Espera por 20 min permitir que o nitrogênio para dissolver e atingir o equilíbrio dentro das células.
  6. Remover o excesso de água ao redor da válvula de descarga, usando uma toalha de pano. Abra a válvula de descarga suavemente para alcançar uma liberação gota a gota do homogeneizado e recolher em um tubo de 15ml pré-refrigerada.
    Nota: Perto do fim da coleção haverá um surto de homogeneizado e gás vão surgir com um som sibilante. Certifique-se de que o gás não causa anteriormente recolhida cavitar para atirar fora o tubo (daí o uso de 15 mL de tubos em vez de tubos de 1,5 mL). Uma vez que começa o jorro, fechar a válvula de descarga e abrir a válvula de entrada de nitrogênio abruptamente para despressurizar a bomba e alcançar a cavitação das restantes células na bomba. Abrir a bomba para cavitar recuperação e limpeza profunda.
    Nota: O cavitate final deve ter um aspecto leitoso com espuma na parte superior. Misture delicadamente com a ponta da pipeta para permitir que a espuma diminuir antes da centrifugação.
    Nota: Examine o cavitate por microscopia de contraste de fase para determinar a eficiência de homogeneização. Adicionar uma gota de 15 µ l de cavitar à superfície de uma lâmina de microscopia e cobrir com uma lamela. Repita a etapa 3.4-3.6 somente se muitas células ininterrupta são detectadas com um objectivo de 20 X.
    Nota: Se o buffer de homogeneização não contém EDTA ou EGTA, adicioná-lo para o coletados cavitar em uma concentração final de 1 mM dentro de 5 min após a alta hospitalar.

4. Separação de Cytosolic e fracções de membrana

  1. centrífuga a cavitate em 500 x g durante 10 minutos a 4 ° C para remover células ininterrupta e núcleos.
    Nota: Repita o passo de centrifugação até nenhum sedimento visível é produzido e recolher o sobrenadante Nuclear Post (PNS), evitando a espuma flutuante por cima. Re-centrifugar a espuma para mais coletar e combinar PNS, se necessário ( Figura 1).
  2. Processo do PNS como desejado para obter fracções de interesse. Com a finalidade de separar citosólico e fracções de membrana, transferir o PNS para um tubo se e executar ultracentrifugação conforme desejado. Este protocolo é otimizado para um < 3,5 mL de amostra em um tubo de se de policarbonato e por ultracentrifugação a 350.000 x g, durante 1 h a 4 ° C.
  3. Recolher o sobrenadante (a fração S) utilizando uma pipeta de 1 mL.
  4. Enxaguar cuidadosamente a pelota com 3 mL de PBS frio sem perturbá-la. Remover a PBS pelo vácuo.
    Nota: Se a contaminação da fração de membrana por proteínas citosólica é uma preocupação maior do que a perda da amostra, resuspenda o pellet em 3 mL de PBS e re-se como na etapa 4.2 frio. Remover a PBS pelo vácuo.
  5. Resuspenda o pellet totalmente em um volume adequado de detergente contendo tampão de solubilização de escolha. Para conseguir a equivalência de célula, use o mesmo volume de buffer de solubilização como a fração citosólica.
    Nota: Sugerimos que usando 1 buffer de x RIPA como buffer de solubilização para extração de proteína de membrana eficiente. Se nenhum ensaio a jusante é exigido para fração de membrana, use 1 amortecedor da amostra x laemmli para extração de proteína de membrana maximal.
    Nota: Sugerimos que desalojar e transferir o sedimento no buffer de solubilização para um tubo limpo em rotacao tubo a 4 ° C para a extração de proteína de membrana maximal.
    Nota: Se a pelota é muito pegajosos (muitos lipídios) para ser eficientemente removido do thtubo da se e no buffer de solubilização, sugerimos snap congelando a pelota em nitrogênio líquido e rapidamente desalojar a pelota do tubo se com uma espátula de metal mini antes da pelota descongela.
    Nota: Como alternativa, pelotas de membrana podem ser apenas resuspended e não solubilizadas em um buffer que contém detergente para produzir uma fração P de suspensão de vesículas de membrana, em que não é necessário caso a centrifugação passo em 4.6. Tais frações de P são úteis quando investigando funções como actividades enzimáticas que dependem da Associação de membrana.
  6. Centrifugar a suspensão totalmente solubilizado pelota da etapa 4.5 a 20.000 x g em uma centrífuga de mesa para 10 min a 4 ° C. recolher o sobrenadante com uma pipeta de 1 mL (a fração de P) e descartar a pelota (lipídios insolúveis).
  7. Realizar ensaios desejados como mancha ocidental com as frações citosólica e/ou membrana, ou salvá-los a-80 ° C para uso futuro.

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Representative Results

A Figura 2 mostra o particionamento de proteínas celulares do PNS na fracção solúvel citosólica (S) ou fração da pelota de membrana (P). Nós examinamos três linhas de celulares representativos de diferentes tipos de células: HEK-293 (epitelial), NIH-3T3 (fibroblasto) e Jurkat (linfócitos). Inibidor de dissociação de guanina Rho (RhoGDI) e o receptor de manose-6-fosfato cação independente (CIMPR) foram usados como controles positivos para citosólico e fracções de membrana, respectivamente. Nós confirmamos a separação eficiente do citosol e membrana após a cavitação de nitrogênio em ~ 350 libras por polegada quadrada em buffer hipotônica seguido por ultracentrifugação a 350.000 x g, durante 1 h. A proteína total recuperou as frações S e P foram então analisadas com marcadores para o ER, endossomos e lisossomos, Golgi, mitocôndrias e outras organelas. Todas as proteínas transmembranares estão presentes na fração de membrana exclusivamente, incluindo at+/k+ ATPase e receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) da membrana plasmática, calnexin de ER, proteína de membrana lisossomal-associado 1 (LAMP1) de lisossomos, F0-ATPase de mitocôndrias e 97 de Golgin da rede de Golgi a trans . Como esperado, muitas proteínas de membrana periférica que são vagamente associada à membrana, presente tanto no citosol e membrana frações em diferentes graus. Exemplos notáveis incluem início endossomo antígeno 1 (EEA1), Rab7/9 (endossomos atrasados) e hexoquinase 1 (membrana externa da mitocôndria). Isto demonstra a utilidade desta técnica na avaliação da resistência de associação à membrana das proteínas periféricas. Nosso laboratório tem tirado partido desta técnica de cavitação para examinar o status de associação de membrana de vários sinalização moléculas5,12,13,14. Curiosamente, encontramos calregulin quase exclusivamente na fração solúvel, sugerindo que o microssomas geradas a partir de membranas de ER também foram interrompidas durante a cavitação de nitrogênio e as proteínas no lúmen do ER são liberadas para a fração solúvel. Em contraste, a integridade da mitocôndria após a cavitação é dependente do tipo de célula. Observamos F1-ATPase, uma proteína periférica interna da mitocôndria, parcialmente na fração citosólica, variando de 2% das células NIH-3T3 ~ 35% para células HEK 293 e Jurkat. Isto indica que nitrogênio cavitação a 350 psi com buffer hipotônica não garante integridade mitocondrial. Apesar de três ciclos de 500 x g rodadas para gerar o PNS de cavitate, nem todos os núcleos foram removidos. Histona deacetilase 1 (HDAC1) de nucleoplasma e fibrillarin partir do nucléolo, foram encontrados tanto no PNS e a pelota. A presença de HDAC1 na pelota e não no sobrenadante sugere que o PNS está contaminado com núcleos, ao invés de rompimento nuclear durante a cavitação. Isto é consistente com relatórios que pressurizar a bomba a 350 psi deixa núcleos intactos10, apesar de nosso uso de buffer hipotônica pode tornar os núcleos frágil, conforme discutido na seção posterior.

Comparamos a eficiência da homogeneização de cavitação de nitrogênio com o de outros métodos de perturbação física comum. Quantidades iguais de células Jurkat foram suspensos em tampão de homogeneização hipotônica idênticos e sujeitos a métodos diferentes de interrupção. Houve perda detectável de amostras em cavitação de homogeneização e nitrogênio homogenizacao (em ambos os casos, cerca de 5-10% menos volume é coletado). No entanto, cavitação de nitrogênio deu a mais alta eficiência de extração de proteínas; passagem da agulha e homogenizacao renderam apenas 60% tanto da proteína (Figura 3). Curiosamente, a recuperação de algumas proteínas, conforme determinado pelo immunoblot não mostrou diferença significativa entre os métodos diferentes de ruptura mecânica. No entanto, o rendimento de certas proteínas de membrana periférica como hexoquinase 1 e RAS foi maior em amostras preparadas com cavitação de nitrogênio. Este suporta essa cavitação de nitrogênio pode ser ideal para homogeneização ao investigar proteínas periféricas da membrana. Recuperação de proteínas HDAC1 por cavitação de nitrogênio é comparável a outros métodos, sugerindo que os núcleos permanecem intactos em todas as condições. Assim, os dados na Figura 3 prova que essa cavitação de nitrogênio oferece resultados superiores de homogeneização.

Em seguida, nós em relação a eficiência de homogeneização entre buffers de hipotônica e a mesma mas fez isotônicas com sacarose ou de cloreto de sódio (Figura 4). Quantidades semelhantes de proteína foram recuperadas de células Jurkat homogeneizadas em buffer hipotônica contra tampão isotônica de NaCl após a cavitação a 350 psi. Em contraste, menos proteína foi recuperada no PNS de células interrompidas no buffer feito isotônica com sacarose. Proteínas mais individuais examinadas por immunoblot se encaixam neste padrão. Uma exceção foi o fibrillarin que foi relativamente enriquecido no PNS gerado em tampão isotônico.

Para determinar se o nosso protocolo pode ser empregado para investigar o particionamento de proteínas de membrana periférica entre solúvel e fracções de membrana, comparamos padrões entre tipo de ARN com tag bandeira selvagem e seu mutante Prenilação deficiente, C186S (de particionamento A Figura 5). No estado estacionário, o tipo selvagem ARN esteve presente no citoplasma e membranas, semelhantes às proteínas de membrana mais periféricas, embora a parte recuperada na fração solúvel é maior do que para outras RAS proteínas14. Quando as ARN é privada de sua modificação de prenyl, ele perde a capacidade de associar com membranas e torna-se inteiramente citosólico. Os padrões esperados de particionamento de ARN confirmaram que nosso protocolo é uma opção confiável para estudar a dinâmica de particionamento de proteínas de membrana periférica entre citosol e membranas.

Figure 1
Figura 1: fluxograma Resumindo passo 2 (azul), etapa 3 (vermelho) e etapa 4 (amarela) do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: proteína particionamento entre os citosol e membrana frações. HEK-293, células NIH-3T3 e Jurkat foram submetidas a cavitação de nitrogênio (~ 350 psi por 20 min, suspendido em tampão de homogeneização hipotônica) e ultracentrifugação (~ 350.000 x g durante 1 h) conforme descrito no protocolo. Níveis de proteína endógena em diferentes frações foram analisados por immunoblot. PNS: Antigénio de câncer-ligação ao Receptor expressado em células de SiSo (RCAS), nuclear sobrenadante, s: sobrenadante, p: pelota. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: comparação de técnicas diferentes de ruptura mecânica. Quantidade equivalente de células Jurkat foram suspensos em buffer hipotônica e submetido ao congelamento-descongelamento (3 ciclos), agulha de homogeneização de homogenizacao de (5 passes, através de agulha de 28G½), passagem (15 passes, Kontes 2 mL homogenizacao tubo com um pilão de moagem de tecido, autorização de 0.01-0,06 mm) ou cavitação nitrogênio (~ 350 psi por 20 min). Relativos níveis de proteínas endógenas o PNS foram analisados por immunoblot para cada método. As concentrações de proteína total do PNS foram quantificadas através do BCA assay e normalizado para o valor do PNS preparado por cavitação de nitrogênio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: comparação de hipotônicas e isotônicos buffers usados durante a cavitação nitrogênio. Quantidades equivalentes de Jurkat células foram suspensas em buffer de hipotônica ou tampão hipotônica suplementado com 8,5% de sacarose ou de 150 mM de NaCl e submetido a cavitação de nitrogênio (~ 350 psi por 20 min). Relativos níveis de proteínas endógenas o PNS foram analisados por immunoblot para cada buffer. As concentrações de proteína total do PNS foram quantificadas por meio de ensaio BCA e normalizadas para o valor do PNS preparado em tampão hipotônica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: Farnesylated NRAS particiona em frações tanto P e S. Células HEK-293 transitoriamente foram transfectadas com plasmídeos direcionando a expressão de tipo selvagem de bandeira-tag ARN ou C186S mutante. Particionamento de proteína foi realizado conforme descrito na Figura 2 e os níveis de proteína indicado foram analisados por immunoblot. Reproduzido com permissão (Zhou, M. et al, 2016. Originalmente publicado na Revista de biologia celular. https://doi.org/10.1083/JCB.201604061). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

As vantagens da cavitação de nitrogênio sobre outros métodos de ruptura mecânica são múltiplas. Talvez o benefício mais significativo é a sua capacidade para suavemente ainda eficientemente homogeneizar as amostras. Os princípios físicos de descompressão esfria amostras em vez de gerar danos de aquecimento local como ultra-som e fricção/corte com base em técnicas. A cavitação é também extremamente eficiente em rompendo a membrana plasmática. Porque o nitrogênio bolhas são geradas dentro de cada célula individual após a descompressão, o processo de cavitação é limitado menos pelo tamanho da célula, tamanho da amostra ou concentração da amostra. Portanto, oferece vantagens adicionais sobre homogenizacao baseado no apuramento ou homogeneização de passagem de agulha. Cavitação de nitrogênio também oferece resultados mais consistentes como a mesma força de ruptura que é aplicada uniformemente por toda a amostra pode ser reproduzida com pressões idênticas. Além disso, cada célula apenas experiências do processo de ruptura para uma única vez e componentes subcelulares são, portanto, não constantemente expostos a forças disruptivas variáveis. Isso limita a fragmentação artefactual de organelas. Preocupação com a oxidação de componentes celulares lábil, causada pelo rompimento também é mitigada, como o nitrogênio é usado para saturar a suspensão de eritrócitos e é livre de oxigênio suplementar. As restritas tensões físicas e químicas impostas pela cavitação de nitrogênio torna uma técnica ideal para estudar lábil enzimas e organelas frágil e a reprodutibilidade desta técnica de homogeneização é bem adequada para quantificação.

Cavitação de nitrogênio também oferece flexibilidade significativa no que diz respeito a tamanho da amostra, a composição de buffers de homogeneização e o grau de integridade das organelas. Para escalar até a homogeneização, precisa de um simples implantar vasos de pressão de maiores capacidades, sem sacrificar a velocidade, conveniência ou eficiência de descompressão. Qualquer reserva de homogeneização pode ser usada para cavitação de nitrogênio; escolha do tampão pode ser adaptada para compatibilidade com os requisitos de cada experimento. Um pode projetar um buffer de homogeneização que coincide com o fluido intracelular (por exemplo, alto de potássio e baixo teor de sódio) para minimizar as alterações em organelas. Por exemplo, nós desenvolvemos um buffer de "relaxamento" que minimiza ex vivo polimerização de actina e, assim, auxilia na coleta de vesículas citoplasmáticas intactas de granulócitos5. As características osmóticos e iônicas do buffer também podem ser modificadas para controlar o grau de homogeneização da célula. Além disso, a agressividade de rompimento celular pode ser controlada ajustando a pressão de nitrogênio. Pressão moderada reduz a força de ruptura para preservar núcleos, mitocôndrias e outras organelas em estado intacto, enquanto estas organelas interrompe a alta pressão. Brock et al. relatado sucesso com o rompimento das células de leucemia Basophilic rato, mantendo a maioria dos núcleos intacta a 350 psi com tampão hipotônica10, que constitui a base da pressão do nitrogênio usado em nosso protocolo atual.

Limitações de cavitação de nitrogênio incluem o fato de que a homogeneização é uniforme em toda as amostras e estruturas de membrana diferentes podem produzir vesículas de tamanhos semelhantes; Isso pode complicar ainda mais separação da membrana plasmática, microssomas suaves, endossomos e membranas de Golgi por centrifugação gradiente de densidade taxa-zonal. Outra preocupação é que as organelas tornam-se relativamente frágil após homogeneização devido a ruptura de dentro. Assim, este método exige otimização de cuidado para evitar quebra de organela em manipulações subsequentes. Nós tinha como objectivo abordar alguns desses problemas neste estudo.

Separação do citosol e fracções de membrana por centrifugação tem sido explorado em limitada relatórios detalhando o particionamento de frações de proteína com um punhado de proteína marcadores15,16. Nosso método gera uma separação bruta de proteínas solúveis e membrana-limite e não implica o isolamento das organelas particulares. No entanto, ainda é uma preocupação válida que as vesículas homogêneas de diferentes membranas produzidas por cavitação podem afetar a eficiência de separação por ultracentrifugação. Apresentamos uma pesquisa abrangente por immunoblots do isolamento e particionamento de organelas subcelulares comuns após fracionamento com nosso protocolo. Como esperado, puramente cytosolic proteínas como RhoGDI são exclusivamente na fração solúvel e proteínas transmembrana na membrana plasmática (PM), tais como o EGFR e at+/k+ ATPase, foram recuperados somente na pelota. Proteínas transmembranares em organelas como ER, mitocôndrias, Golgi e lisossomos também foram recuperadas em pelota, confirmando que as proteínas de membrana integrais de diferentes membranas e organelas podem ser agrupadas com êxito de proteínas solúveis com nosso método. Esta validação fundamental é crucial para a uma análise mais aprofundada das proteínas de membrana periférica, que é o principal objectivo do presente protocolo.

A maioria das proteínas de membrana periférica existe em ambas as frações citosol e membrana. Embora isto seja frequentemente uma representação verdadeira da sua localização, pode em alguns casos representar artefactual redistribuição destas proteínas da superfície das membranas citoplasmática para a fração solúvel durante o processo de homogeneização, desde a força de sua associação com membranas não é tão forte quanto o de proteínas integrais da membrana. Apesar de cavitação de nitrogênio minimiza o potencial redistribuição, expondo as células para uma ruptura one-time, gentil, um deve ser consciente de tais artefatos de fracionamento bioquímico e foco sobre as mudanças no particionamento de proteínas entre citosólica e frações de membrana em condições experimentais. No entanto, o exame das proteínas periféricas da membrana em vários estágios de maturação CDDP é possível com este método. EEA1, um efetor Rab5 que medeia o acoplamento de vesículas revestidas de Clatrina para os endossomos iniciais, localiza-se na superfície citoplasmática de endossomos iniciais e foi recuperado principalmente na fração de pelota. Proteínas de Rab7 e Rab9 atrasado endosome-relacionados são também na fração da pelota. No entanto, ainda há uma quantidade apreciável de Rab7/9 no citosol. Porque RabGDI é capaz de interagir com composição rabinos e processar estas proteínas insolúveis caso contrário citosólica, proteínas Rab tendem a ser mais citosólica do que outras proteínas de membrana periférica endossomo-relacionados.

Para caracterizar a integridade nuclear e organela com homogeneização por cavitação de nitrogênio, nós immunoblotted as frações isoladas para compartimentos luminal e citoplasmáticas. Nesta análise, calregulin é totalmente liberado para a fração solúvel, demonstrando que ER é interrompida de microssomas de forma e, assim, vazamentos de conteúdo luminal. Dada essa metade da área total da membrana de uma célula eucariótica encerra os espaços labirínticos do PS, não é surpreendente que a sua vasta rede de estrutura tubular ou sac como falha permaneceu intacto durante a expansão das bolhas de nitrogênio. Por outro lado, nossa análise de integridade mitocondrial após a cavitação mostra clara dependência do tipo de célula, como observamos F1-ATPase, uma proteína perifericamente associada à membrana interna da mitocôndria, na fração citosólica em graus variados (~ 35% para HEK-293 e Jurkat, 2% para NIH-3T3). Isto indica que nitrogênio cavitação a 350 psi com buffer hipotônica não garante integridade mitocondrial. De fato, outros relataram que, para preservar as mitocôndrias, cavitação deve ser realizada com pressões inferiores a 150 psi17. Por outro lado, encontramos que a catalase permanece no lúmen dos peroxissomos. Curiosamente, proteínas nucleares são observadas nas fracções PNS e pelota. Especificamente, HDAC1, uma histona deacetilase presente em todo o nucleoplasma, está ausente na fração solúvel, indicando que a integridade nuclear não seja comprometida. Isto sugere que o envoltório nuclear não é rompido por cavitação, como seria de esperar o lançamento do HDAC1 para a fusãofração de Le nesse cenário. Continua a ser provável que os núcleos não são completamente removidos durante o processo de elaboração do PNS, e a proteína permanece na pelota após ultracentrifugação. Esta probabilidade é mais suportada pelo fato de que nenhum escapamento de DNA é detectado na fração solúvel. Concluímos, portanto, que usando o buffer de homogeneização hipotônica durante a cavitação ~ 350 psi com a adição de Mg2 + é capaz de preservar a integridade nuclear em várias linhas de célula.

Nossos resultados também demonstram que os ribossomas recolher inteiramente na fração de pelota de membrana, sugerindo que mesmo livre ribossomas no citoplasma que são não vinculados às membranas ER podem ser completamente sedimentados em um buffer não-sacarose-coxim após centrifugação a 350.000 x g, durante 1 h. da mesma forma, a identificação das proteínas relacionadas com autofagia 12 (Atg12)-Atg5 conjugado como um marcador de autophagosomes, revela segregação rigorosa para as frações da pelota. Sua presença no citosol pode ser causada pelo fato de que as ligações covalentes-acessório de Atg12 e Atg5 precede autophagosomes formação. Proteínas do citoesqueleto são difíceis de avaliar devido à polimerização ex vivo . Este fenômeno pode ser minimizado com um buffer de relaxamento, mas o protocolo descrito aqui, tubulina é provável polimerizado ex vivo sobre quelação de cálcio 18. Em nossos preparativos tubulina é encontrada na pelota sugerindo a polimerização, Considerando que o actínio encontra-se em frações o P e S.

Para caracterizar potenciais vantagens da cavitação de nitrogênio na eficiência da homogeneização, revisamos algumas técnicas comuns de ruptura mecânica. Método otimizado para amostras de tecido, como o liquidificador ou pilão/argamassa não foram avaliados. Sonication também foi excluído como é difícil romper a membrana de superfície mantendo as organelas internas intacto. Nossa análise centrou-se os seguintes métodos: congelamento e descongelamento, agulha passagem e homogeneização da homogenizacao, como eles são fáceis de executar e não exigem equipamentos especiais, tais como um homogeneizador de rolamento de esferas. Células Jurkat foram utilizadas nesta análise por causa de seu tamanho pequeno, o que torna difícil homogeneizar eficientemente com líquido corte as técnicas tradicionais que dependem de autorização, como a passagem da agulha e homogenizacao. Julgado pela concentração da proteína total recuperada, encontramos que métodos de perturbação independente de tamanho da célula como cavitação de nitrogênio e congelamento-descongelamento de fato mostram superior eficiência de extração de proteínas. Uma análise similar com células de tamanhos maiores revelou menores diferenças nas eficiências de homogeneização, embora nitrogênio cavitação é ainda superior aos métodos físicos alternativos testados (dados não mostrados).

Muitos citosólica, proteínas CDDP e citoesqueleto foram recuperadas eficientemente com todos os métodos testados. Em contraste, as proteínas no ER e Golgi otimamente foram recuperadas usando cavitação de nitrogênio. O ligeiramente menor rendimento de F1-ATPase em cavitação de nitrogênio em relação as outros métodos pode refletir o fato de que as mitocôndrias são mais propensas a permanecer intacto durante a cavitação e portanto mais eficientemente removido com a rotação de velocidade lenta usada para gere o PNS. Observação esse hexoquinase 1, uma proteína periférica de membrana encontrada tanto no citosol e associada com a membrana mitocondrial externa, se comportou da maneira oposta em relação a F1-ATPase provavelmente reflete a labilidade da Associação de hexoquinase 1 em relação à F-1-ATPase, que é sequestrado dentro da mitocôndria. Importante, embora capaz de interromper as células com eficiência comparável, métodos alternativos de ruptura mecânica deram relativamente pobre recuperação de certas proteínas de membrana periférica (hexoquinase 1 e RAS). Assim, a cavitação é nossa técnica de homogeneização de escolha com a finalidade de investigar a partição de proteínas periféricas da membrana. Porque homogenizacao homogeneização é amplamente utilizada para preparar núcleos intactos, usamos homogenizacao como referência para avaliar a integridade nuclear através de outros métodos de ruptura mecânica. Em nossa análise, níveis semelhantes de recuperação de proteínas HDAC1 confirmam que núcleos permanecem intactos em Jurkat homogenates preparado por cavitação de nitrogênio ~ 350 psi com buffer hipotônica.

Era evidente que o buffer de homogeneização utilizado durante a cavitação de nitrogênio pode afetar significativamente a integridade de eficiência e organela de interrupção. Enquanto a composição do tampão de homogeneização deve ser otimizada para as exigências da aplicação pretendida, é interessante notar que os pesquisadores realizando descompressão de nitrogênio de tecidos animais usam buffer com uma baixa pressão osmótica para extrato nuclear conteúdo. Hunter e Commerford mostraram núcleos inchaço e ruptura quando as soluções foram diluídas e preservação de núcleos quando usando soluções isotônicas7 (que pode ser conseguido adicionando sais inorgânicos como o cloreto de sódio ou solutos orgânicos tais como sacarose ou glicerol). O buffer de isotônico padrão usado para isolar organelas subcelulares, além de núcleos de células de mamíferos é de 0,25 M de sacarose contendo 1 mM EDTA e tampão Tris, HEPES ou Tricine em pH 7,0-7,6. Mas nem todas as células de cultura podem ser homogeneizadas com eficiência em um dos buffers de isotônico. Buffer de hipotônica (geralmente 10 mM Tris, HEPES, etc) muitas vezes é usado para fornecer o estresse osmótico necessário para certos tipos de células para alcançar a completa homogeneização. No entanto, como mencionado antes, buffers de hipotônicas tendem processar os núcleos frágil e propenso a fuga do DNA quando o EDTA é incluído. Para promover a integridade nuclear, substituímos o EDTA com KCl e baixas concentrações de cátions divalentes como MgCl2 ou MgSO4. Mg2 + é geralmente preferido por Ca2 + porque este último pode ativar certas fosfolipases e proteases e inibir a RNA polimerase. Cavitação é finalizada, EDTA ou EGTA pode ser adicionado para o homogenates de quelato cátion, se necessário para inibir as metaloproteases.

Células Jurkat exibem uma proporção relativamente grande de núcleo-para-citoplasma, tornando-os uma linha de celular ideal para estudar a integridade nuclear. O aumento da eficiência de homogeneização usando tampão hipotônica é mínimo quando comparando com tampão isotônico suplementado com NaCl. No entanto, a cavitação em um tampão isotônico suplementado com sacarose recupera aproximadamente metade das proteínas extraídas usando uma contrapartida de reserva hipotônica. Isso é improvável que seja um resultado direto de isotonicity, e a discrepância entre usando NaCl e sacarose para alcançar isotonicity requer mais investigação. Uma possível explicação é que o sal interrompe interações eletrostáticas entre proteínas enquanto sacarose não. Assim, mesmo com a mesma tonicidade, NaCl tem uma actividade relevante para a extração de proteínas que carece de sacarose. WIth em conta para preservar a integridade nuclear, encontramos proteínas aumento fibrillarin recuperadas com buffers isotônicos, apesar de buffers de isotônicos teoricamente ser mais protetora dos núcleos. Curiosamente, a fracção mais eficientemente foi extraída com tampão isotônico suplementado com NaCl, sugerindo que baixas condições de sal podem ser subótimos para extração de mitocôndrias. O buffer hipotônica considerando cavitação com buffer hipotônica alcança o melhor equilíbrio entre eficiência de homogeneização e integridade nuclear, torna-se o buffer de escolha em nosso protocolo de cavitação. No entanto, alertamos aos leitores que nenhum buffer é uma garantia de resultados de homogeneização ideal. Nosso protocolo deve servir como um modelo para otimização, e piloto de testes com buffers desejados, linhas de células de interesse e outras variáveis (pressão, composição do tampão, etc.) devem ser estabelecidas para obter melhores resultados.

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Disclosures

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo GM055279, CA116034 e CA163489.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Cell Disruption Vessel (45 mL) Parr Instrument 4639 Nitrogen cavitation Bomb
Dounce homogenizer (2 mL) Kontes 885300-0002 Dounce pestle and tube
U-100 Insulin Syringe 28G½ Becton Dickinson 329461 Needle
Atg12 antibody Santa Cruz 271688 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-actin antibody Santa Cruz 47778 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
β-tubulin antibody DSHB E7-s Mouse antibody, use at 1:5000 dilution
Calnexin antibody Santa Cruz 23954 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Calregulin antibody Santa Cruz 373863 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Catalase antibody Santa Cruz 271803 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
CIMPR antibody Abcam 124767 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
EEA1 antibody Santa Cruz 137130 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
EGFR antibody Santa Cruz 373746 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F0-ATPase antibody Santa Cruz 514419 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
F1-ATPase antibody Santa Cruz 55597 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Fibrillarin antibody Santa Cruz 374022 Mouse antibody, use at 1:200 dilution
Golgin 97 antibody Santa Cruz 59820 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
HDAC1 antibody Santa Cruz 81598 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Hexokinase 1 antibody Cell Signaling Technology 2024S Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Lamin A/C antibody Santa Cruz 376248 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
LAMP1 antibody DSHB H4A3-c Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Na+/K+ ATPase antibody Santa Cruz 48345 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Rab7 antibody Abcam 137029 Rabbit antibody, use at 1:1000 dilution
Rab9 antibody Thermo MA3-067 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RCAS1 antibody Santa Cruz 398052 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
RhoGDI antibody Santa Cruz 360 Rabbit antibody, use at 1:3000 dilution
Ribosomal protein S6 antibody Santa Cruz 74459 Mouse antibody, use at 1:1000 dilution
Sec61a antibody Santa Cruz 12322 Goat antibody, use at 1:1000 dilution
Thickwall Polycarbonate ultracentrifuge tube Beckman Coulter 349622 Sample tube for ultracentrifugation
TLK-100.3 rotor Beckman Coulter 349481 rotor for ultracentrifugation
Optima MAX High-Capacity Personal Ultracentrifuge Beckman Coulter 364300 ultracentrifuge
cOmplete protease inhibitor cocktail tablets Roche 11697498001 protease inhibitors
Cell Scrapers with 25cm Handle and 3.0cm Blade Corning 353089 large cell scraper
Magnetic Stir Bar Fisher Scientific 14-513-57SIX micro stir bar
Ceramic-Top Magnetic Stirrer Fisher Scientific S504501AS magnetic stirrer

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References

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