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ラットの生殖実験における超音波検査

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Summary

本稿では、超音波の雌ラット生殖器・婦人科の調査のための実験モデルを設計する上で実行のユーティリティについて説明します。超音波検査を行う方法についてのステップバイ ステップの説明が表示されます。

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Wang, T., Oltra-Rodríguez, L., García-Carrillo, N., Nieto, A., Cao, Y., Sánchez-Ferrer, M. L. Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats. J. Vis. Exp. (130), e56038, doi:10.3791/56038 (2017).

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Abstract

生殖補助医療技術の発展と人間の研究の倫理的な限界、ラット動物モデルは生殖医療で広く使用されています。過去には、齧歯動物に生殖システムの開発に関する研究摘出組織の病理検査を一度だけに基づいています。最近では、高解像度超音波の発展に伴い、高品質の超音波今実行できます生殖システムを研究するための新しい方法を許可するラットの生殖器官を評価します。画像は、高解像度の超音波システムを使用して得られました。婦人科の超音波検査は、28 の 8 週齢非妊娠ラットおよび 5 妊娠ラットで実行されました。生殖器系の器官を認識する方法について述べるし、発情期のさまざまなフェーズでの一般的なビューに関連付けられている構造のサイクルします。子宮動脈の血流を測定し、妊娠中のさまざまな段階で子宮の血流パターンの変化を評価する使用されたドップラー流れを色します。超音波探査が内部の生殖器の変化を評価するための有用な方法であることを確認しました。その使用は医療や外科的処置を含む、追加の実験を行うことの可能性を提起、動物を犠牲にすることがなく内部の臓器に超音波検査の変更を監視する機能を提供します。

Introduction

ラット動物モデルは、胎児の卵巣移植1,2を含む生殖医療で広く使用されています。しかし、過去には、摘出組織の病理検査を 1 回限りに基づいている齧歯動物に生殖システムの開発に関する研究、日常的な生殖器の変化に関する縦断的研究はラット3では不可能であった。超音波は 30 年以上にわたって人間の生殖補助医療技術で広く使用されていますが、この貴重な技術は最近ラットに適用されてのみ。

再現と産婦人科の調査のための実験モデルを設計し、ために、手順をデモンストレーションするラットの生殖器官を評価するための超音波のアプローチを確立する私達の目的は私達の知る限り、この手順に関する現在の可視化されたパブリケーションがありません。解剖学と高解像度超音波を用いた子宮動脈の血流の雌ラットの生殖系および所見の存在の超音波の検査の手順をについて説明します。我々 は子宮内膜の厚さ、卵巣と子宮の血流の差を評価する発情サイクルのさまざまな段階での子宮内膜、卵巣および非妊娠動物の子宮動脈の血流の特性を監視女性に似た発情サイクルのさまざまな段階。70 MHz の周波数と 30 μ m.の解像度レベルで高品質の超音波診断装置を用いてください。私たちの他の目的は、妊娠ラット子宮血流の抵抗の変化を評価するためだった。この技法は、生殖器官の毎日の変化の調査のための動物を犠牲にすることがなくできます。

ラットの超音波を利用したいくつかの技術的な問題があります。これらの難しさを含める: ラット子宮は人間女性4よりはるかに薄いです。ラットの卵巣をイメージングの難しさは、厚い皮膚と腹壁筋肉超音波5のほぼ完全な減衰につながったラットに起因しているし、子宮動脈は非妊娠の検索を非常に難しくラット。私たちは、プロシージャが多くの技術的な問題を解決しているし、それらを最小限に抑える方法を示す残っているこれらの問題。

超音波動物を犠牲にすることがなくラットの生殖器の正常なモニタリング、生殖医学の将来の動物モデルと他の外科手術の可能性を開きます。

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Protocol

ガイドのケアと実験動物の使用のための勧告を健康の国民の協会および到着に従いに従い、本研究を行った (動物資源研究領域: 生体実験のレポート) のガイドライン。プロトコルは、ディレクティブ 2010年/63/EU 承認番号 A13170404 を使用 (Anexo 1) を遵守する動物実験のライセンスを受けた。すべての実験は、(EU 指令 63年/2010, RD 53/2013) 動物の倫理的な心配のための国民のガイドラインに従う欧州連合認定の研究所で行われました。プロトコルは、ムルシア大学の動物実験の倫理委員会で承認されました。

1. 動物の準備

注: すべての実験は、ムルシア大学動物実験セクションと産科婦人科部のムルシア大学によって支えられました。

  1. すべての実験で 200 〜 250 グラムの重量を量る 8 週齢 Sprague-dawley ラット (28 雌ラット) を使用します。
    注意: ここでは、またを使用して 5 妊娠ラット。
  2. 妊娠ラットを得るためには、ケージの 8 週齢雄ラットおよび肥沃な女性と 17:00 からメイト-23: 00 h 次の朝に膣にプラグの同定は、交配成功.として解釈されました。次の日彼らは交配後妊娠 1 日目を検討します。
  3. 胎齢 9、15、18 日に、実験を行います。
  4. 家ラットを 2 つのグループの食べ物と水へのアクセスを無料し、通常 12 h 明暗サイクルを維持します。
  5. 後 2 週間の最低限の設備条件に慣れて、発情の頻度および規則性を評価するために毎日の朝膣細胞診を使用します。
    注: 20 8 4 に 5 の規則的な日発情期ラットにおける包含に選ばれました。

2. ラットのイメージングのための準備

注: 画像は、高解像度の超音波を使用して得られました。発情周期の段階は、膣細胞診により決定しました。

  1. イメージング研究の前に 2-3% イソフルラン ガス誘導室におけるダムを麻酔します。
  2. 動物を削除麻酔システムに接続されたノーズコーン内鼻を置くし、すぐに超音波の検査の間に 1.5-2% イソフルランの動物を維持します。
  3. バリカンと脱毛クリームを肋骨の縁から尾鰭の腹部に毛皮を削除します。
  4. ラットを保護し、撮像セッションの持続期間のため最適な快適性と生理学的パラメーターのメンテナンスを確実に加熱されたテーブルの上に仰臥位に麻酔下のラットを配置します。画像が統合されるすべての生理学的パラメーターとデータでキャプチャする超音波アプリケーションを介してリアルタイム。
  5. 優しく (37.5 ° C ± 0.5 ° C) の体の温度を監視する (潤滑油) 後直腸プローブを挿入します。
  6. 固定ホルダーのトランスデューサー (30 Hz) を置き、垂直軸と水平軸 (前進・ バックとサイド ・ ツー ・ サイド) 移動手動で操作するジョイスティックを使用してまたは手で。
  7. プロシージャの間に乾燥を避けるためにラットの目に石油ベースの眼クリームを適用されます。

3. 審査の手続

注: rats´ の生殖器官の解剖: 膣膀胱の背側にあるし、腎臓の方向に向けて 2 つの子宮角に分かれます。卵巣は、子宮角を (図 1) 卵管を介して接続されています。子宮は、腎臓の後方の地域にあります。

  1. 子宮の同定
    1. 子宮頸部を見つけるための目印として膀胱を使用して、左と右子宮角の枝を見つけるために子宮頸部に従ってください。
    2. 「B モード」を選択して/ビデオを 2次元表示するに切り替えます。正中矢状面画像を半ば辷り地域でそれぞれの子宮角の前後径を測定します。超音波システム ソフトウェアを使用して計測を検出します。
    3. 「B モード」で正中矢状面画像を子宮内膜腔に高エコーの国境に高エコーとの国境から子宮内膜の厚さを測定します。
    4. カラードプラ モードに変更するには、「カラードプラ」を選択します。色ドップラーを使用して子宮内膜の血液供給を識別し、子宮内膜の血流を測定します。カラードプラ モードで次のパラメーターを選択: 0.2 〜 0.5 mm の間の設定パルス ・ ドップラーのゲート 4 と 48 kHz のパルス繰り返し周波数セット 4 hz ハイパス フィルターを設定します。
  2. 子宮動脈の血流の同定
    1. ドップラーの両側の総腸骨動脈に近い子宮頸部のジャンクションの外側下縁近く子宮動脈の波形を取得します。
    2. ドップラー モードで次のパラメーターを使用: 0.2 〜 0.5 mm の間の設定パルス ・ ドップラーのゲート 4 と 48 kHz のパルス繰り返し周波数セット 6 hz ハイパス フィルターを設定します。
    3. 血流ドップラー角度を最小限に抑えるためにドップラーの梁の配置に注意してください。ドップラーのビームと容器の間の角度を記録します。60 ° の角度を超えて取得した値は正確であり、回避6をする必要があります。
    4. 収縮期波 (PSV) と終期速度 (EDV) 3 つの連続したサイクルから測定します。収縮期血圧拡張期 (S/D) 比 (PSV/EDV) と抵抗係数 (RI) を計算 ([PSV EDV]/psv アイントホーフェン) それぞれの子宮角の値。
    5. 9th、15th、妊娠 18 日中 5 妊娠ラットの子宮動脈の血流を測定します。
  3. 卵巣と卵巣動脈の血流の同定
    注: 雌ラット卵巣がある外側を動物の両側腎臓と子宮角 (図 1) の終わりに見つけた脂肪パッドに存在します。
    1. 卵巣をイメージするには、横断面のプローブ、肋骨の少し下動物の外側面の上に置きます。腎臓と脂肪パッドに比べて、卵巣エコー出現があります。
    2. 卵巣と卵胞の外部境界を測定します。各画像にスケールの数字は、0.1 mm 単位でのミリにあります。
      注: カラードプラ モードとパワーモード ドップラー イメージングは、卵巣の強さと方向の同定に役立ちます。

4. 研究のデザイン

  1. 腟細胞診発情サイクルを確認します。
  2. すべてのラットを 2 つのグループに分割します。1 または事前肥沃なグループ (または腔) の proestrus と発情サイクルの段階は、ラットが含まれます。グループ 2 またはポスト肥沃な早期発情と後半の発情サイクルの段階は、ラットが含まれます。
  3. 監視し、グループ 1 の半ば辷り地域でそれぞれの子宮角と 2 の前後径を比較します。
  4. 監視し、子宮内膜の厚さとグループ 1 と 2 の子宮内膜の特性を比較します。
  5. 監視しサイズ (最大径) と卵巣の特性を比較し、グループ 1 で両方の卵巣と 2 の任意の排卵卵胞をローカライズします。
  6. 監視し、グループ 1 と 2 の子宮動脈の血流を比較します。
  7. 監視し、妊娠中のさまざまな段階での妊娠ラットの子宮動脈の血流の比較 (9、15、妊娠の 18 日間)。
  8. 実行統計解析の SPSS を使用します。四分位範囲、平均 ± 標準偏差 (SD) や中央値としてデータを提示します。異なるグループの間スチューデントの t 検定を使用して結果を分析します。P 値が 0.05 未満は、統計的に有意な差を考えられていた。

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Representative Results

子宮角 (表 1) の 2 つの側面間に有意差前後子宮角直径または子宮内膜の厚みはありませんでした。グループ 2 と比較して、グループ 1 で平均子宮内膜厚が厚い、しかし有意差 (P > 0.05) (図 3) の 2 つのグループの間に発見されました。それにもかかわらず、子宮内膜の形態 (図 2) の変更に伴う発情サイクルの近く (8 のうち 28 ラット) で子宮の中の液体を見つけました。

ドップラー研究は、また速度波形パターン子宮角のそれぞれの側でまたは (テーブル 12図 4 a) 非妊娠ラットの発情サイクルのさまざまなフェーズでのフローの重大な変更を示した。しかし、妊娠ラットにおける高度な妊娠として最高収縮期と末期の速度が大幅に増加と有意に減少した計算された抵抗係数 (表 3図 4 b)。

卵巣の平均直径は大きく異なる (表 1) でした。卵巣の形態は、2 つのグループを比較した、periovulatories 卵胞と卵巣の周りの流体が (表 2図 2) 排卵後見られました。

Figure 1
図 1: 解剖学この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: (B モード) の子宮内膜の厚さの測定。(青線) の子宮内膜の厚さ (A)。前後の子宮角直径 (大きい青線) と発情中 (短い青線) を子宮内膜の厚さはサイクル (B) です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: (A) 左卵巣の直径の測定(B) 卵巣と卵胞は発情期。

Figure 4
図 4: 子宮動脈の血流の測定。(A) 非妊娠ラットにおける子宮動脈の血流。妊娠ラットの 15番目の日に (B) の子宮動脈の血流。

(P > 0.05、各グループに有意差なし)。SD: 標準的な DesviationPSV: ピーク時収縮期血圧 velocityEDV: 末期 velocityS ・ D 収縮期拡張期 ratioRI に: 抵抗係数。((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

変数
(mm±SD)
左側にあります。 右側にあります。 P. 値
角直径 (mm) 1.78±0.24 1.73±0.28 0.626
子宮内膜の厚さ (mm) 0.75±0.06 0.76±0.05 0.752
卵巣の直径 (mm) 3.69±0.52 3.62±0.32 :0.107
卵胞のサイズ (mm) 1.68±0.31 1.74±0.29 0.859
PSV (mm/s) 91.52±17.91 93.07±22.87 0.055 天文単位
EDV (mm/s) 34.18±9.36 36.67±11.14 0.178
S は/D 2.78±0.59 2.62±0.50 0.294
RI 0.62±0.08 0.60±0.08 0.876
(P > 0.05、各グループに有意差なし)。
SD: 標準 Desviation
PSV: 収縮期波
EDV: 末期の速度
S ・ D 収縮期と拡張期の比率
RI: 抵抗係数。((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

表 1: 左と右子宮角と卵巣の違い。

変数
(mm±SD)
発情期
(グループ 1)
非発情期
(グループ 2)
P.value
角直径 (mm) 1.71±0.18 1.83±0.23 0.433
子宮内膜の厚さ (mm) 0.78±0.04 0.72±0.05 0.168
卵巣の直径 (mm) 3.71±0.56 3.66±0.47 0.515
PSV (mm/s) 92.05±17.93 94.15±20.62 0.886
EDV (mm/s) 37.81±9.64 34.72±5.38 0.096
S は/D 2.61±0.58 2.77±0.44 0.249
RI 0.60±0.08 0.63±0.06 0.232
(P > 0.05、各グループに有意差なし)。
SD: 標準 Desviation
PSV: 収縮期波
EDV: 末期の速度
S ・ D 収縮期と拡張期の比率
RI: 抵抗係数。((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

表 2: 非妊娠ラットの発情周期の異なる段階の間の違い。

変数 D9 D15 D18 P 値
PSV(mm/s) 111.08±5.93a、b 122.64±7.49c 131.91±3.50 < 0.05
EDV(mm/s) 38.80±3.37d、e 56.43±3.10f 79.29±5.47 < 0.05
S は/D 2.87±0.12g, h 2.17±0.16 1.67±0.14 < 0.05
RI 0.65±0.02 j、k 0.54±0.04L 0.39±0.05 < 0.05
PSV = 最大収縮速度
EDV = 末期の速度。
S は/D = 収縮期拡張期比 (PSV/EDV) へ。
RI = 抵抗係数 ((RI) = ([PSV-EDV]/psv アイントホーフェン)。
D9 = 妊娠の日 9
D15 = 妊娠の日 15
D18 = 妊娠の日 18
SD: エラーを示す標準偏差 (±)。
(P < 0.05、各グループに有意差なし)
P 値: D9 対 D15、= 0.03;d = 0.001;g = 0.01;j = 0.01。
D9 対 D18 b = 0.003;e = 0.001;h = 0.01;k = 0.001。
D15 対 D18 c = 0.03;f = 0.001;私 = 0.03;L = 0.04。

表 3: 妊娠ラットにおける子宮動脈の血流の違い。

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Discussion

手続きの変更とトラブルシューティング、発情の満ち欠けの周期、超音波を用いて、ラットのすべての私たちの目的にもかかわらず、この研究で必要だったため大きな違いを見つけることができませんでした。我々 は仮説、発情サイクルのみ女性のサイクルとは異なり、ラットでは数日を持続するのでこれらの問題可能性があります。すべての測定が正確に任意の違いを決定する適切なタイミングで行われたことを確認しております。したがって、我々 は、任意の違いを評価する唯一の 2 つのフェーズに、サイクルのフェーズ、発情を再編成、どれもが観察されました。予想通り、私たちは、私たちは、将来的に測定を実行するいずれかの角を選択するそれぞれの子宮角の測定値間に有意差を見つかりません。イソフルランの使用齧歯動物に及ぼす影響に関する研究が矛盾しています。催奇形性、しかし、数時間または数日の麻酔濃度で投与した場合にのみがあります。実験で妊娠ラットにおける試験時間は、我々 は任意の妊娠ラットやその子孫にも悪影響を及ぼすを見つけられませんでしたので 30 分未満をだった。

我々 は、卵胞期、排卵、分泌の段階の明確な高エコーの違いが女性の生殖管の超音波評価に多くの類似点を発見したと思いますが、ラットでこのような変化は見られなかったモデル。ラット発情周期段階のみ最後の 4 〜 5 日のため、この事実を説明できます。短い発情サイクルのフェーズと妊娠期間は、再現5ラットの研究のための理想的な動物を作る。それにもかかわらず、この事実が理由かもしれないなぜ発情期および非発情期の段階で子宮角, 子宮内膜の厚さと卵巣の直径の直径に有意差がないです。違いを確認するために右の時正確に測定を取ることは困難だし、毎日測定を実施したにもかかわらず、我々 は重要な変更を見つけられませんでした。

上記の制限にもかかわらず厚さと生殖器官の形態を含む、生殖システムの変更を監視するための超音波の使用を提案します。この超音波の使用と断言できる我々 の 8 週齢 Sprague-dawley における子宮内膜の厚さラットの病理組織学的に測定されるので (1 層 359.13 ± 49.70 mm) 静によって7は、ここでの結果に似ています。病理組織学的、sonographically、子宮内膜の厚さを測定するための様々 なテクニック、にもかかわらず同じような結果を得た.力ドップラー、カラードップラーは、いくつかの年8,9妊娠ラットで使用されている、しかし非妊娠ラットにおける子宮動脈の血流を測定調査はほとんどされています。今、超音波検査の発展に伴い、妊娠の非常に初めにも、それぞれの異なる段階で生殖管の変化を監視するためのこの方法の利点を取ることができます。

超音波の将来のアプリケーションは、ラット動物モデルで薄い子宮内膜の胚の着床のメカニズムと治療の調査を含めることができます。また、小胞の開発の特性を監視することによって、卵巣移植モデルでの機能についてより包括的な知識を取得できます。現在、3 D イメージングとラット10、生殖器系の分子超音波イメージングを使用していくつかの調査と、将来的に薄い子宮内膜モデルにこの手法が適用されます。

我々 は、結論は、ラットの経皮的超音波バイオ - 顕微鏡、動物の犠牲を必要としない生殖器官ダイナミクスの研究に最適のモデルを描くことができます。

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Disclosures

著者が明らかに何もありません。

Acknowledgements

この研究は、ムルシア大学動物実験セクションと産科婦人科部のムルシア大学によって支えられました。このプロジェクトに協力している人ムルシア大学の動物実験施設部 CEIB (セントロ実験 en 研究 Biomédicas) で働くすべての技術者に感謝いたします。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD Envigo, inc. Rat strain
Lubricating Gel General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System Cibertec S.A  Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)  General Supply
Isoflurane Esteve Veterinaria Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.

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References

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