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Échographie dans des enquêtes de reproduction expérimentales chez le rat

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Summary

Ce manuscrit décrit l’utilité de l’échographie effectuée sur les rats femelles pour concevoir des modèles expérimentaux pour reproduction et gynécologique enquête. Une explication détaillée de la façon d’effectuer une évaluation échographique est montrée.

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Wang, T., Oltra-Rodríguez, L., García-Carrillo, N., Nieto, A., Cao, Y., Sánchez-Ferrer, M. L. Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats. J. Vis. Exp. (130), e56038, doi:10.3791/56038 (2017).

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Abstract

Avec le développement de techniques de reproduction assistée et les limites éthiques de la recherche sur les êtres humains, des modèles animaux de rat ont été couramment en médecine de la reproduction. Dans le passé, l’étude du développement du système reproducteur chez les rongeurs a reposé sur un examen histologique des tissus excisés ponctuel. Récemment, avec le développement de l’échographie transabdominale à haute résolution, échographie de haute qualité peut désormais être effectuée afin d’évaluer les organes reproducteurs des rats, ce qui permet une nouvelle méthode pour étudier le système reproducteur. Images ont été obtenues à l’aide d’un système haute résolution échographique. Échographie gynécologique a effectué 28 huit semaines non-gestantes et 5 rates Sprague-Dawley. Nous décrivons comment reconnaître les organes du système reproducteur et des structures connexes dans des vues typiques au cours des différentes phases de l’oestrus cycle. Couleur des flux que Doppler a été utilisée pour mesurer le débit sanguin de l’artère utérine et d’évaluer les changements de modèle pour le débit sanguin utérin au cours des différentes étapes de la grossesse. Nous avons démontré que l’exploration de l’échographie est une méthode utile pour évaluer les changements dans les organes reproducteurs internes. Son utilisation soulève la possibilité de mener des expériences additionnelles, y compris les procédures médicales ou chirurgicales et offre la possibilité de suivre l’évolution échographique aux organes internes sans pour autant sacrifier les animaux.

Introduction

Modèles animaux rat ont été largement utilisées en médecine de la reproduction, y compris dans l’embryon et de l’ovaire transplantation1,2. Toutefois, dans le passé, l’étude du développement du système reproducteur chez les rongeurs a reposé sur un examen histologique des tissus excisés ponctuel, et l’étude longitudinale des variations quotidiennes d’organe reproducteur n’a pas été possible à des rats,3. L’échographie a été largement utilisé dans les techniques de reproduction assistée chez les humains depuis plus de 30 ans, mais cette précieuse technologie n’a été appliquée récemment à des rats.

Notre objectif était d’établir une approche échographique pour évaluer les organes reproducteurs des rats Sprague-Dawley pour concevoir des modèles expérimentaux pour reproduction et gynécologie d’investigations et de démontrer la procédure parce qu’à notre connaissance, Il n’y a aucune publication visualisée actuelles au sujet de cette procédure. Nous décrivons la procédure de l’examen échographique du système reproducteur de la femelle rat et résultats échographiques sur l’anatomie et le débit sanguin de l’artère utérine en utilisant des ultrasons de haute définition. Nous avons mesuré les caractéristiques de l’endomètre, des ovaires et des flux sanguin artères utérines chez les femmes non enceintes animaux à différents stades du cycle oestral afin d’évaluer les différences significatives dans l’épaisseur de l’endomètre, de la morphologie ovarienne et de débit sanguin utérin dans différentes étapes du cycle oestral, semblable aux femmes. Nous avons utilisé un appareil à ultrasons de haute qualité avec une fréquence de 70 MHz et un niveau de résolution de 30 µm. Notre autre objectif était d’évaluer les changements dans la résistance du débit sanguin utérin chez des rates gravides. Cette technique permet l’étude des variations quotidiennes dans les organes reproducteurs sans sacrifier les animaux.

Il y a plusieurs difficultés techniques en utilisant des ultrasons sur les rats. Ces difficultés incluent : l’endomètre de rat est beaucoup plus mince qu’un humain femelle4. Difficulté dans les ovaires des rats d’imagerie a été attribuée à peau plus épaisse et la musculature de la paroi abdominale chez le rat, qui a abouti à atténuation quasi-complète de l’échographie à5, et de l’artère utérine est beaucoup plus difficile de trouver des femmes enceintes rats. Nous avons résolu de nombreux problèmes techniques avec la procédure, et pour ces problèmes qui persistent, nous montrons comment minimiser.

Surveillance réussie des changements échographique dans les organes reproducteurs des rats sans avoir à sacrifier les animaux ouvrira la possibilité de construire des futurs modèles animaux de médecine de la reproduction et d’autres interventions chirurgicales.

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Protocol

Cette étude a été réalisée en stricte conformité avec les recommandations du guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, de la National Institutes of Health et conformément à l’arrivée (Animal Research : Reporting des expériences In Vivo) lignes directrices. Le protocole a reçu une licence pour se conformer à la Directive 2010/63/UE, avec le numéro d’autorisation A13170404 (Anexo 1) de l’expérimentation animale. Toutes les expériences ont été effectuées dans un laboratoire certifié Union européenne suite à des directives nationales pour le soin éthique des animaux (RD 53/2013, l’UE Directive 63/2010). Le protocole a été approuvé par le Comité sur l’éthique de l’expérimentation animale de l’Université de Murcia.

1. la préparation animaux

Remarque : Toutes les expériences appuyés par l’Animal Experimentation Section de Murcia Université et Université de département de gynécologie de Murcie et d’obstétrique.

  1. Utiliser 8 semaines rats Sprague-Dawley (28 rates) pesant 200-250 g dans toutes les expériences.
    Remarque : Ici, nous avons également utilisé 5 rates gravides.
  2. Pour obtenir des rates gravides, huit semaines des rats mâles femelles et fertiles en cage et s’accouplent de 17:00 -23:00 h. Identification d’un bouchon vaginal le lendemain matin a été interprété comme accouplement succès. Examiner le 1er jour de la gestation, le jour suivant après que qu’ils ont été accouplés.
  3. Réaliser les expériences à 9, 15 et 18 jours de gestation.
  4. Maison des rats par groupes de deux avec libre accès à la nourriture et l’eau et maintiennent sur les cycles de lumière/obscurité régulier 12 h.
  5. Après acclimater aux conditions facilité pour un minimum de deux semaines, utiliser la cytologie vaginale quotidienne du matin à évaluer pour la régularité et la fréquence de l’oestrus.
    Remarque : Vingt-huit rats avec une phase d’oestrus régulière 4 à 5 jours ont été sélectionnés pour inclusion dans l’étude.

2. préparation des Rats pour l’imagerie

Remarque : Les Images ont été obtenues à l’aide de l’échographie transabdominale à haute résolution. Phases du cycle oestral ont été déterminées par la cytologie frottis vaginal.

  1. Avant l’étude d’imagerie, anesthésier le barrage dans la chambre de l’induction au gaz isoflurane 2 à 3 %.
  2. Enlever l’animal immédiatement mettre le museau dans un cône de nez connecté au système de l’anesthésie et maintenir l’animal sur l’isoflurane 1,5 à 2 % lors de l’examen échographique.
  3. Enlever la fourrure du rebord costal à l’abdomen caudal avec les clippers et crème dépilatoire.
  4. Placez le rat anesthésié en position couchée sur une table chauffée pour sécuriser le rat et assurer un confort optimal et le maintien des paramètres physiologiques pendant la durée de la séance d’imagerie. Tous les paramètres physiologiques doivent être intégrées avec les images et les données saisies en temps réel via l’application d’ultrasons.
  5. Insérer délicatement la sonde rectale (après lubrification) pour surveiller la température du corps (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
  6. Placer le transducteur (30 Hz) dans un support fixe et le déplacer le long de l’axe vertical et axe horizontal (en avant vers l’arrière et côté) à l’aide d’un joystick actionné manuellement ou à la main.
  7. Appliquer à base de pétrole ophtalmique baume pour les yeux du rat pour éviter le séchage au cours de la procédure.

3. procédure d’examen

Remarque : Anatomie des organes reproducteurs rats´ : le vagin se trouve dorsal à la vessie et se divise en deux cornes utérines qui s’étendent vers les reins. Les ovaires sont reliés aux cornes utérines via les oviductes (Figure 1). L’utérus est situé dans la région postérieure aux reins.

  1. Identification de l’utérus
    1. En utilisant la vessie comme un point de repère pour trouver le col de l’utérus, suivez le col de l’utérus pour trouver la succursale des cornes utérines droite et gauche.
    2. Placez-vous dans deux dimensions Regarde un vidéo en sélectionnant le mode « B ». Mesurer le diamètre antéro-postérieur de chaque corne utérine dans la région mid-Isthmiques sur une image de la ligne médiane sagittale. Détecter des mesures en utilisant le logiciel système échographique.
    3. Mesurez l’épaisseur de l’endomètre d’échogène frontière à frontière échogène dans la cavité endométriale sur une image de la ligne médiane sagittale en mode « B ».
    4. Passer en mode Doppler couleur en sélectionnant « Doppler couleur ». Color Doppler permet d’identifier le flux sanguin de l’endomètre et de mesurer le flux sanguin de l’endomètre. Sélectionnez les paramètres suivants en mode Doppler couleur : filtre passe-haut fixé à 4 Hz, ensemble de fréquence pulsée répétition entre 4 et 48 kHz et Doppler pulsé porte situé entre 0,2 et 0,5 mm.
  2. Identification du flux sanguin de l’artère utérine
    1. Obtenir Doppler de signaux dans l’artère utérine, près de la marge latérale inférieure de la jonction utéro-cervical à proximité de l’artère iliaque sur chaque côté.
    2. Utilisez les paramètres suivants en mode Doppler : filtre passe-haut fixé à 6 Hz, ensemble de fréquence pulsée répétition entre 4 et 48 kHz et Doppler pulsé porte situé entre 0,2 et 0,5 mm.
    3. Prendre soin d’aligner le débit sanguin et le faisceau Doppler pour minimiser l’angle Doppler. Enregistrer l’angle entre le faisceau Doppler et le navire. Valeurs prises au-delà d’un angle de 60° sont inexactes et devraient être évités6.
    4. Mesurer la vitesse systolique maximale (PSV) et la vitesse de fin de diastole (EDV) tirées des trois cycles consécutifs. Calculez la tension systolique diastolique (S/M) ratio (PSV/EDV) et indice de résistance (RI) ([PSV-EDV] / PSV) les valeurs pour chaque corne utérine.
    5. Mesurer le débit sanguin de l’artère utérine de 5 rates gravides pendant la 9ème, 15ème, 18ème jour de gestation.
  3. Identification de l’ovaire et le débit sanguin de l’artère ovarienne
    Remarque : Les ovaires des rats femelles sont trouvent latérale aux reins des deux côtés de l’animal et résider dans les coussinets adipeux se trouves à la fin de la corne utérine (Figure 1).
    1. Pour l’image de l’ovaire, commencez avec la sonde dans un plan transversal et placez-le sur la face latérale de l’animal un peu sous les côtes. Le rein et les coussinets adipeux ont une apparence de HYPERECHOGENE par rapport à l’ovaire.
    2. Mesurer la limite externe de l’ovaire et les follicules. Chiffres sur la balance pour chaque image sont en millimètres, avec des incréments de 0,1 mm.
      Remarque : En Mode Doppler couleur et en Mode Doppler puissance d’imagerie contribue avec identification des ovaire intensité et le flux directionnel.

4. conception de l’étude

  1. Vérifier le cycle oestral par cytologie frottis vaginal.
  2. Diviser tous les rats dans les deux groupes. Groupe 1 ou pré fertile (ou périovulatoire), comprennent les rats qui ont été dans le pro-oestrus et l’oestrus des phases du cycle. Pour le groupe 2 ou post fertiles, inclure les rats qui étaient en dioestrus précoce et tardif dioestrus phases du cycle.
  3. Surveiller et comparer le diamètre antéro-postérieur de chaque corne utérine dans la région mid-Isthmiques groupes 1 et 2.
  4. Surveiller et comparer l’épaisseur de l’endomètre et les caractéristiques de l’endomètre dans les groupes 1 et 2.
  5. Surveiller et comparer la taille (diamètre maximal) et les caractéristiques des ovaires et localiser les follicules périovulatoire dans les deux ovaires dans les groupes 1 et 2.
  6. Surveiller et comparer le débit sanguin de l’artère utérine dans les groupes 1 et 2.
  7. Surveiller et comparer le débit sanguin de l’artère utérine de rates gravides à différents stades de la grossesse (jours 9, 15 et 18 de la gestation).
  8. Exécuter des analyses statistiques à l’aide de SPSS. Présentent des données comme la moyenne ± écart-type (SD) ou médiane avec gammes intervalle interquartiles. Analyser les résultats en utilisant le test t de l’étudiant entre les différents groupes. Une P-valeur de moins de 0,05 a été considéré comme une différence statistiquement significative.

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Representative Results

Il n’y a aucune différence significative dans les diamètres antéro-postérieur corne utérine ou dans l’épaisseur de l’endomètre, entre les deux rives de la corne utérine (tableau 1). Par rapport au groupe 2, l’épaisseur moyenne de l’endomètre dans le groupe 1 a des différences plus épais, mais non significatives (P > 0,05) ont été notées entre les deux groupes (Figure 3). Néanmoins, nous avons trouvé fluide à l’intérieur de l’utérus (chez les rats de 8 des 28) près le cycle oestral associé aux changements dans la morphologie de l’endomètre (Figure 2).

Études Doppler a également ne montrent aucune variation significative du débit patrons de forme d’onde de vitesse de chaque côté de la corne utérine ou dans les différentes phases du cycle oestral chez des rats non gravides (tableaux 1 et 2, Figure 4 a). Cependant, chez des rates gravides, en gestation avancée, pic vélocités systoliques et diastoliques-fin a augmenté significativement et l’indice de résistance calculée diminue de façon significative (tableau 3, Figure 4 b).

Le diamètre moyen de l’ovaire n’était pas significativement différente (tableau 1). Lorsque la morphologie de l’ovaire a été comparée entre les deux groupes, follicules periovulatories et fluide autour de l’ovaire ont été observés après l’ovulation (tableau 2, Figure 2).

Figure 1
Figure 1 : Anatomie S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Mesure de l’épaisseur de l’endomètre (mode B). L’épaisseur de l’endomètre (ligne bleue) (A). Le diamètre antéro-postérieur corne utérine (ligne bleue) et l’épaisseur de l’endomètre (ligne bleue court) pendant le œstrus cycle (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : (A) mesure du diamètre de l’ovaire gauche ; (B) ovaire et les follicules pendant la phase d’oestrus.

Figure 4
Figure 4 : Mesure du débit sanguin de l’artère utérine. (A) écoulement de sang de l’artère utérine dans non-gestantes. Écoulement de sang de l’artère utérine (B) dans 15 ième jour de rates gravides.

(P > 0,05, aucune différence significative dans chaque groupe). SD : DesviationPSV Standard : pic systolique velocityEDV : fin de diastole velocityS/D: systolique à ratioRI diastolique : indice de résistance. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Variable
(mm±SD)
Côté gauche Côté droit Valeur P.
Diamètre (mm) de la corne 1.78±0.24 1.73±0.28 0,626
Épaisseur de l’endomètre (mm) 0.75±0.06 0.76±0.05 0.752
Diamètre de l’ovaire (mm) 3.69±0.52 3.62±0.32 0,107
Taille de follicule (mm) 1.68±0.31 1.74±0.29 0,859
PSV (mm/s) 91.52±17.91 93.07±22.87 0,055
EDV (mm/s) 34.18±9.36 36.67±11.14 0,178
S/D 2.78±0.59 2.62±0.50 0,294
RI 0.62±0.08 0.60±0.08 0,876
(P > 0,05, aucune différence significative dans chaque groupe).
SD : Standard Desviation
PSV : vitesse systolique maximale
EDV : vélocité télédiastolique
S/D: systolique diastolique ratio
RI : index de résistance. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tableau 1 : Les différences dans la corne utérine droite et gauche et ovaire.

Variable
(mm±SD)
Phase d’oestrus
(Groupe 1)
Phase de non-oestrus
(Groupe 2)
P.Value
Diamètre (mm) de la corne 1.71±0.18 1.83±0.23 0,433
Épaisseur de l’endomètre (mm) 0.78±0.04 0.72±0.05 0,168
Diamètre de l’ovaire (mm) 3.71±0.56 3.66±0.47 0,515
PSV (mm/s) 92.05±17.93 94.15±20.62 0,886
EDV (mm/s) 37.81±9.64 34.72±5.38 0,096
S/D 2.61±0.58 2.77±0.44 0,249
RI 0.60±0.08 0.63±0.06 0,232
(P > 0,05, aucune différence significative dans chaque groupe).
SD : Standard Desviation
PSV : vitesse systolique maximale
EDV : vélocité télédiastolique
S/D: systolique diastolique ratio
RI : index de résistance. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tableau 2 : Les différences entre les phases différentes cycle oestral chez des rats non enceintes.

Variable D9 D15 D18 Valeur P
PSV(mm/s) 111.08±5.93a, b 122.64±7.49c 131.91±3.50 < 0,05
EDV(mm/s) 38.80±3.37d, e 56.43±3.10f 79.29±5.47 < 0,05
S/D 2.87±0.12g, h 2.17±0.16j’ai 1.67±0.14 < 0,05
RI 0.65±0.02 j, k 0.54±0.04L 0.39±0.05 < 0,05
PSV = vitesse systolique maximale
EDV = vitesse télédiastolique.
S/D = systolique diastolique ratio (PSV/EDV).
RI = index de résistance ((RI) = ([PSV-EDV] / PSV).
D9 = 9 jour de gestation
D15 = 15 jours de gestation
D18 = 18 jour de gestation
SD : les erreurs indiquent l’écart-type (±).
(P < 0,05, aucune différence significative dans chaque groupe)
Valeur P : D9 vs D15 a = 0,03 ; d = 0,001 ; g = 0,01 ; j = 0,01.
B vs D18 D9 = 0,003 ; e = 0,001 ; h = 0,01 ; k = 0,001.
D15 vs D18 c = 0,03 ; f = 0,001 ; J’ai = 0,03 ; L = 0,04.

Tableau 3 : Les différences de débit sanguin de l’artère utérine chez des rates gravides.

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Discussion

En raison des modifications procédurales et dépannage qui s’imposait dans cette étude, malgré notre but d’identifier toutes les phases de l’oestrus cycle chez des rats en utilisant des ultrasons, nous n’avons pu trouver aucune différence significative. Nous émettons l’hypothèse que ces difficultés peuvent être parce que le cycle oestral ne dure que quelques jours chez le rat, à la différence du cycle chez les femmes. Nous sommes sûrs que toutes les mesures ont été effectuées exactement le bon moment pour déterminer les différences. Par conséquent, nous avons regroupé l’oestrus phases du cycle en seulement deux étapes afin d’évaluer les différences, mais aucun n’ont été observés. Comme prévu, nous avons ne trouvé aucune différence significative entre les mesures de chaque corne utérine, ce qui nous permettra de choisir soit corne pour effectuer des mesures à l’avenir. Études sur les effets de l’utilisation de l’isoflurane sur rongeurs sont contradictoires. Il peut être tératogène, mais seulement s’il est administré à des concentrations anesthésiques pour plusieurs heures ou plusieurs jours. Dans notre expérience, le temps d’examen chez les rats enceintes était moins de 30 min, alors nous n’avons trouvé aucun effet néfaste sur des rates gravides ou de leur progéniture.

Nous aimerions avoir trouvé à l’évaluation de l’échographie de l’appareil génital chez les femmes, dans lequel il n’y a plus de similitudes échogène claire des différences entre la phase folliculaire, les périovulatoire et les phases de sécrétion, mais ces changements n’ont pas vu chez le rat modèle. Ce fait peut s’expliquer parce que le œstrus de rat cycle phases ne dure quatre à cinq jours. Oestrus courtes périodes de gestation et de phases du cycle de faire le rat un animal idéal pour la recherche sur la reproduction5. Néanmoins, ce fait peut être la raison pourquoi il n’y a aucune différence significative entre le diamètre de la corne utérine, l’épaisseur de l’endomètre et la diamètre ovarien dans les phases de l’oestrus et non-oestrus. Il est difficile de prendre les mesures exactement le bon moment pour déterminer les différences, et malgré la prise de mesures tous les jours, nous n’avons pas trouvé des changements significatifs.

Malgré les restrictions susmentionnées, nous proposons l’utilisation de l’échographie pour surveiller les changements dans le système reproducteur, y compris l’épaisseur et la morphologie des organes reproducteurs. Nous pouvons affirmer cette utilisation de l’échographie car l’épaisseur de l’endomètre dans 8 semaines Sprague-Dawley rats mesurée examen histopathologique (une couche 359.13 ± 49,70 mm) par Jing et al. 7 est semblable aux résultats ici. Malgré les différentes techniques pour mesurer l’épaisseur de l’endomètre examen histopathologique et échographie, nous avons obtenu des résultats similaires. Bien que power Doppler et Doppler de couleur ont été utilisées sur des rates gravides pour plusieurs années8,9, il y a eu quelques enquêtes de mesure du débit sanguin des artères utérines chez les rats non enceintes. Maintenant, avec le développement de l’échographie, nous pouvons prendre avantage de cette technique pour surveiller les changements dans l’appareil génital au cours de chaque étape différente, même au tout début de grossesse.

Les demandes futures d’échographie peuvent inclure exploration du mécanisme d’implantation de l’embryon et traitement de l’endomètre mince chez les modèles animaux de rat. En outre, en analysant les caractéristiques du développement des follicules, nous pouvons obtenir connaissance plus approfondie sur leur fonction dans un modèle de greffe ovarienne. Actuellement, il y a quelques enquêtes à l’aide de l’imagerie 3D et échographie moléculaire du système reproducteur des rats10, et nous allons appliquer cette technique sur un modèle d’endomètre mince à l’avenir.

Nous tirons la conclusion que le rat est un modèle approprié pour l’étude de la dynamique des organes reproducteurs échographie transcutanée bio-microscope, qui ne nécessite pas de sacrifice de l’animal.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

Cette recherche a été financée par Animal Experimentation Section de l’Université de Murcia et Université de département de gynécologie de Murcie et d’obstétrique. Nous remercions tous les techniciens travaillant à la CEIB (Centro expérimentale en Investigaciones Biomédicas), la section de l’expérimentation animale de l’Université de Murcie, qui ont collaboré à ce projet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD Envigo, inc. Rat strain
Lubricating Gel General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System Cibertec S.A  Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)  General Supply
Isoflurane Esteve Veterinaria Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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