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Ecografia in indagini sperimentali riproduttive sui ratti

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Summary

Questo manoscritto descrive l'utilità dell'ultrasuono eseguito su ratti femminili di progettare modelli sperimentali per ricerca riproduttiva e ginecologica. Una spiegazione dettagliata di come eseguire la valutazione ecografica è mostrata.

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Wang, T., Oltra-Rodríguez, L., García-Carrillo, N., Nieto, A., Cao, Y., Sánchez-Ferrer, M. L. Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats. J. Vis. Exp. (130), e56038, doi:10.3791/56038 (2017).

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Abstract

Con lo sviluppo della tecnologia riproduttiva aiutata e i limiti etici della ricerca sugli esseri umani, modelli animali ratto sono stati ampiamente utilizzati in medicina riproduttiva. Nel passato, lo studio dello sviluppo del sistema riproduttivo nei roditori è stato basato su una tantum esame istologico dei tessuti asportati. Recentemente, con lo sviluppo dell'ecografia transaddominale ad alta risoluzione, l'ecografia di alta qualità ora possa essere eseguita per valutare gli organi riproduttivi dei ratti, permettendo un nuovo metodo per studiare il sistema riproduttivo. Immagini sono state ottenute utilizzando un sistema ad alta definizione ultrasonographic. Ecografia ginecologica è stata effettuata il 28 otto-settimana-vecchi ratti non gravide e 5 ratti Sprague-Dawley incinti. Descriviamo come riconoscere gli organi del sistema riproduttivo e strutture associate nelle tipiche viste durante le diverse fasi dell'estro del ciclo. Colore flusso che Doppler è stato usato per misurare il flusso sanguigno dell'arteria uterina e valutare i cambiamenti di modello del flusso di sangue uterino durante diverse fasi della gravidanza. Abbiamo dimostrato che l'esplorazione di ultrasuono è un metodo utile per la valutazione dei cambiamenti negli organi riproduttivi interni. Il suo utilizzo genera la possibilità di condurre ulteriori esperimenti, comprese le procedure mediche o chirurgiche e fornisce la possibilità di monitorare i cambiamenti ecografici agli organi interni senza sacrificare animali.

Introduction

Modelli animali di ratto sono stati ampiamente utilizzati in medicina riproduttiva, tra cui in embrione e trapianto ovarico1,2. Tuttavia, in passato, lo studio dello sviluppo del sistema riproduttivo nei roditori è stato basato su una tantum esame istologico dei tessuti asportati e studio longitudinale delle variazioni quotidiane organo riproduttivo non è stato possibile in ratti3. Ultrasuono è stato ampiamente usato in riproduzione assistita in esseri umani da oltre 30 anni, ma questa preziosa tecnologia è stata applicata ai ratti recentemente.

Il nostro obiettivo era di stabilire un approccio ultrasonographic per valutare gli organi riproduttivi dei ratti Sprague-Dawley di progettare modelli sperimentali per la riproduzione e ginecologia inchiesta e per illustrare la procedura perché a nostra conoscenza, non ci sono pubblicazioni non visualizzato in quel momento attuale per quanto riguarda questa procedura. Descriviamo la procedura di esame ultrasonographic del sistema riproduttivo del ratto femmina e presentare i risultati ultrasonographic anatomia e flusso sanguigno dell'arteria uterina usando l'ultrasuono ad alta definizione. Abbiamo monitorato le caratteristiche dell'endometrio, ovaie e flusso sanguigno dell'arteria uterina in animali non gravidi nelle diverse fasi del ciclo di estro per valutare le differenze significative nello spessore dell'endometrio, morfologia ovarica e flusso di sangue uterino in diverse fasi del ciclo di estro, simile alle donne. Abbiamo usato attrezzature ad ultrasuoni di alta qualità con una frequenza di 70 MHz e un livello di risoluzione di 30 µm. Altro nostro obiettivo era di valutare i cambiamenti nella resistenza di flusso di sangue uterino in ratti incinti. Questa tecnica consente lo studio dei cambiamenti giornalieri negli organi riproduttivi senza sacrificare animali.

Ci sono diverse difficoltà tecniche che utilizzano ultrasuoni sui ratti. Queste difficoltà sono: l'endometrio di ratto è molto più sottile di una femmina umana4. Difficoltà nell'imaging le ovaie dei ratti è stato attribuito alla pelle più spessa e muscolatura della parete addominale in ratti, che ha provocato quasi completa attenuazione di ultrasuono5, e l'arteria uterina è molto più difficile da trovare non gravide ratti. Abbiamo risolto molti problemi tecnici con la procedura, e per quei problemi che rimangono, mostreremo come loro riduzione al minimo.

Successo di monitoraggio dei cambiamenti ecografici negli organi riproduttivi dei ratti senza dover sacrificare animali si aprirà la possibilità di costruire modelli futuri animali di medicina riproduttiva e altre procedure chirurgiche.

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Protocol

Questo studio è stato effettuato in stretta conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e secondo all'arrivo (Animal Research: Reporting In Vivo esperimenti) linee guida. Il protocollo ha ricevuto una licenza per la sperimentazione animale conformi direttiva 2010/63/UE con il numero di autorizzazione A13170404 (Anexo 1). Tutti gli esperimenti sono stati effettuati in un laboratorio certificato di Unione europea seguendo le linee guida nazionali per la cura etica degli animali (SR 53/2013, direttiva UE 63/2010). Il protocollo è stato approvato dal comitato etico di esperimenti di animale dell'Università di Murcia.

1. animale preparazione

Nota: Tutti gli esperimenti sono stati sostenuti dalla sezione animale di sperimentazione dell'Università di Murcia e ostetricia e ginecologia dipartimento di Murcia University.

  1. Utilizzare 8 settimana-vecchi topi Sprague Dawley (28 ratti femminili) 200-250 g di peso in tutti gli esperimenti.
    Nota: Qui, abbiamo anche usato 5 ratti incinti.
  2. Per ottenere i ratti incinti, otto-settimana-vecchi ratti maschii femminili e fertile della gabbia e si accoppiano da 17:00 -23:00 h. identificazione di un plug vaginale la mattina seguente è stato interpretato come accoppiamento di successo. Considera il 1 ° giorno di gestazione, il giorno dopo sono stati accoppiati.
  3. Svolgere gli esperimenti a 9, 15 e 18 giorni della gestazione.
  4. Casa ratti in gruppi di due con libero accesso al cibo e acqua e mantengono sui cicli di luce/buio regolare h 12.
  5. Dopo ambientarsi alle condizioni della struttura per un minimo di due settimane, è necessario utilizzare citologia vaginale al giorno, mattina per valutare per regolarità e frequenza di estro.
    Nota: Ventotto ratti con una fase di estro regolare 4 o 5 giorni sono stati selezionati per l'inclusione nello studio.

2. preparazione dei ratti per l'Imaging

Nota: Le immagini sono state ottenute usando l'ecografia transaddominale ad alta risoluzione. Fasi del ciclo estrale sono stati determinati mediante citologia striscio vaginale.

  1. Prima dello studio di imaging, anestetizzare la diga nella camera di induzione con 2-3% isoflurane gas.
  2. Rimuovere l'animale e immediatamente posto il muso all'interno di un cono di naso collegato al sistema di anestesia e mantenere l'animale in 1.5-2% isoflurane durante l'esame ultrasonographic.
  3. Rimuovere la pelliccia dal margine costale all'addome caudale con clippers e crema depilatoria.
  4. Posizionare il ratto anestetizzato in posizione supina su una tabella riscaldata per garantire il ratto e garantire un comfort ottimale e la manutenzione di parametri fisiologici per tutta la durata della sessione di imaging. Tutti i parametri fisiologici dovrebbero essere integrati con le immagini e dati acquisiti in tempo reale tramite l'applicazione di ultrasuoni.
  5. Inserire delicatamente una sonda rettale (dopo aver lubrificato) per monitorare la temperatura corporea (37,5 ° C ± 0,5 ° C).
  6. Posizionare il trasduttore (30 Hz) in un titolare fisso e spostarlo lungo l'asse verticale e l'asse orizzontale (avanti-to-back e side-to-side) usando un joystick azionato manualmente o a mano.
  7. Applicare il balsamo oftalmica a base di petrolio agli occhi del ratto per evitare la disidratazione durante la procedura.

3. esame procedura

Nota: Anatomia degli organi riproduttivi rats´: la vagina si trova dorsale alla vescica urinaria e si divide in due corni uterini che si estendono verso i reni. Le ovaie sono collegate ai corni uterini tramite ovidotti (Figura 1). L'utero è situato nella regione posteriore ai reni.

  1. Identificazione dell'utero
    1. Tramite la vescica come un punto di riferimento per trovare la cervice, seguire la cervice per trovare la filiale dei corni sinistra e destra uterini.
    2. Passare alla visualizzazione bidimensionali/video selezionando "B-mode". Misurare il diametro antero-posteriore di ogni corno uterino nella regione metà di-isthmic su un'immagine sagittale del midline. Rilevare le misurazioni con il software di sistema ultrasonographic.
    3. Misurare lo spessore dell'endometrio dal confine echogenic echogenic confine attraverso la cavità dell'endometrio su un'immagine sagittale del midline in "B-mode".
    4. Passare alla modalità Doppler colore selezionando "Color Doppler". Utilizzare colore Doppler per identificare la vascolarizzazione dell'endometrio e di misurare il flusso di sangue dell'endometrio. Selezionare i seguenti parametri nel modo di Doppler di colore: filtro passa-alto impostato a 4 Hz, ripetizione pulsata frequenza impostata tra 4 e 48 kHz e Doppler pulsato cancello situato tra 0,2-0,5 mm.
  2. Identificazione del flusso sanguigno dell'arteria uterina
    1. Ottenere Doppler forme d'onda nell'arteria uterina vicino al margine inferiore laterale della giunzione utero-cervicale vicino l'arteria iliaca su ogni lato.
    2. Utilizzare i seguenti parametri in modalità Doppler: filtro passa-alto impostato a 6 Hz, ripetizione pulsata frequenza impostata tra 4 e 48 kHz e Doppler pulsato cancello situato tra 0,2-0,5 mm.
    3. Prendersi cura di allineare il fascio Doppler per ridurre al minimo l'angolo di Doppler e flusso sanguigno. Registrare l'angolo fra il fascio Doppler e il serbatoio. Valori presi oltre un angolo di 60° sono inesatti e dovrebbero essere evitati6.
    4. Misurare la velocità di picco sistolico (PSV) e la velocità telediastolica (EDV) da tre cicli consecutivi. Quindi calcolare la pressione sistolica diastolica (S/D) rapporto (PSV/EDV) e indice di resistenza (RI) ([PSV-EDV] / PSV) valori per ogni corno uterino.
    5. Misurare il flusso sanguigno dell'arteria uterina di 5 ratte gravide durante il 9th, 15th, 18° giorno di gestazione.
  3. Identificazione dell'ovaia e del flusso sanguigno dell'arteria ovarica
    Nota: Ovaie del ratto femmina si trovano laterali ai reni su entrambi i lati dell'animale e risiedono in cuscinetti adiposi trovati all'estremità del corno uterino (Figura 1).
    1. Immagine dell'ovaia, iniziare con la sonda in un piano trasversale e posizionarlo sulla funzione laterale dell'animale leggermente sotto le costole. Il rene e il cuscinetto di grasso hanno un aspetto di hyperechoic rispetto all'ovaia.
    2. Misurare il contorno esterno dell'ovaia e follicoli. I numeri sulla scala per ogni immagine sono espresse in millimetri, con incrementi di 0,1 mm.
      Nota: Modalità Doppler colore e Power Doppler imaging aiuta con identificazione di ovarico intensità e direzione del flusso.

4. progettazione dello studio

  1. Controllare il ciclo di estro da citologia striscio vaginale.
  2. Dividere tutti i ratti in due gruppi. Per gruppo 1 o pre-fertile (o periovulatory), sono i ratti che erano nel proestro ed estro fasi del ciclo. Per il gruppo 2 o post-fertile, includere i ratti che sono stati in diestro precoce e tardiva diestro fasi del ciclo.
  3. Monitorare e confrontare il diametro antero-posteriore di ogni corno uterino nella regione metà di-isthmic in gruppi 1 e 2.
  4. Monitorare e confrontare lo spessore dell'endometrio e caratteristiche dell'endometrio in gruppi 1 e 2.
  5. Monitorare e confrontare le dimensioni (diametri massimi) e le caratteristiche delle ovaie e localizzare qualsiasi periovulatory follicoli in entrambe le ovaie in gruppi 1 e 2.
  6. Monitorare e confrontare il flusso di sangue dell'arteria uterina in gruppi 1 e 2.
  7. Monitorare e confrontare il flusso di sangue dell'arteria uterina di ratte gravide nelle diverse fasi della gravidanza (giorni 9, 15 e 18 di gestazione).
  8. Eseguire analisi statistiche utilizzando SPSS. Presentare i dati come media ± deviazione standard (SD) o mediana con range interquartile. Analizzare i risultati utilizzando il test t di Student fra i gruppi differenti. Un valore P di meno di 0,05 è stato considerato una differenza statisticamente significativa.

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Representative Results

Non c'erano differenze di significative, nei diametri anteroposteriore corno uterino o nello spessore dell'endometrio, tra i due lati del corno uterino (tabella 1). Rispetto al gruppo 2, lo spessore dell'endometrio medio nel gruppo 1 era più spesse, ma non significative differenze (P > 0,05) sono state trovate fra i due gruppi (Figura 3). Tuttavia, abbiamo trovato liquido all'interno dell'utero (in 8 dei 28 ratti) vicino il ciclo di estro connesso con i cambiamenti nella morfologia dell'endometrio (Figura 2).

Gli studi Doppler ha mostrato anche nessun cambiamento significativo nel flusso modelli di forma d'onda di velocità in ogni lato del corno uterino o in diverse fasi del ciclo di estro in ratti non gravide (tabelle 1 e 2, fig. 4A). Tuttavia, nei ratti incinti, picco come gestazione avanzata, velocità fine-diastolica e sistolica è aumentata significativamente e l'indice di resistenza calcolato è diminuito significativamente (tabella 3, Figura 4B).

Il diametro medio dell'ovaia non era significativamente differente (tabella 1). Quando la morfologia dell'ovaia è stata confrontata fra i due gruppi, periovulatories follicoli e fluido intorno ovaia sono stati veduti dopo l'ovulazione (tabella 2, Figura 2).

Figure 1
Figura 1 : Anatomia Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Misurazione dello spessore dell'endometrio (B-mode). Lo spessore dell'endometrio (linea blu) (A). Il diametro antero-posteriore corno uterino (linea blu) e spessore dell'endometrio (breve linea blu) durante l'estro del ciclo (B). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : (A) misurazione del diametro dell'ovaia di sinistra; (B) dell'ovaia e follicoli durante la fase di estro.

Figure 4
Figura 4 : Misura di flusso sanguigno dell'arteria uterina. (A) il flusso sanguigno dell'arteria uterina in ratti non gravide. (B) il flusso sanguigno dell'arteria uterina nel 15 ° giorno di ratte gravide.

(P > 0.05, nessuna differenza significativa in ogni gruppo). SD: DesviationPSV Standard: picco sistolica velocityEDV: fine-diastolica velocityS/d: sistolica di diastolica ratioRI: Indice di resistenza. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Variabile
(mm±SD)
Lato sinistro Lato destro Valore p.
Diametro di corno (mm) 1.78±0.24 1.73±0.28 0.626
Spessore endometrio (mm) 0.75±0.06 0.76±0.05 0.752
Diametro dell'ovaia (mm) 3.69±0.52 3.62±0.32 0,107
Dimensione del follicolo (mm) 1.68±0.31 1.74±0.29 0,859
PSV (mm/s) 91.52±17.91 93.07±22.87 0,055
EDV (mm/s) 34.18±9.36 36.67±11.14 0,178
S/D 2.78±0.59 2.62±0.50 0,294
RI 0.62±0.08 0.60±0.08 0.876
(P > 0.05, nessuna differenza significativa in ogni gruppo).
SD: Standard Desviation
PSV: picco di velocità sistolica
EDV: velocità fine-diastolica
S/d: sistolica diastolica rapporto
RI: Indice di resistenza. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tabella 1: Le differenze nel corno di sinistro e destra dell'utero e dell'ovaio.

Variabile
(mm±SD)
Fase di estro
(Gruppo 1)
Fase di non-estro
(Gruppo 2)
P.Value
Diametro di corno (mm) 1.71±0.18 1.83±0.23 0,433
Spessore endometrio (mm) 0.78±0.04 0.72±0.05 0,168
Diametro dell'ovaia (mm) 3.71±0.56 3.66±0.47 0.515
PSV (mm/s) 92.05±17.93 94.15±20.62 0,886
EDV (mm/s) 37.81±9.64 34.72±5.38 0,096
S/D 2.61±0.58 2.77±0.44 0,249
RI 0.60±0.08 0.63±0.06 0.232
(P > 0.05, nessuna differenza significativa in ogni gruppo).
SD: Standard Desviation
PSV: picco di velocità sistolica
EDV: velocità fine-diastolica
S/d: sistolica diastolica rapporto
RI: Indice di resistenza. ((RI)=[PSV–EDV]/PSV)

Tabella 2: Le differenze tra le fasi di ciclo estrale differenti in ratti non gravide.

Variabile D9 D15 D18 Valore di P
PSV(mm/s) 111.08±5.93a, b 122.64±7.49c 131.91±3.50 < 0.05
EDV(mm/s) 38.80±3.37d, e 56.43±3.10f 79.29±5.47 < 0.05
S/D 2.87±0.12g, h 2.17±0.16ho 1.67±0.14 < 0.05
RI 0.65±0.02 j, k 0.54±0.04L 0.39±0.05 < 0.05
PSV = picco di velocità sistolica
EDV = velocità fine-diastolica.
S/D = sistolica diastolica rapporto (PSV/EDV).
RI = indice di resistenza ((RI) = ([PSV – EDV] / PSV).
D9 = 9 giorno di gestazione
D15 = 15 giorno di gestazione
D18 = 18 giorno di gestazione
SD: indicano gli errori di deviazione Standard (±).
(P < 0,05, nessuna differenza significativa in ogni gruppo)
Valore di P: D9 vs D15 un = 0,03; d = 0,001; g = 0,01; j = 0,01.
D9 vs D18 b = 0,003; e = 0,001; h = 0,01; k = 0,001.
D15 vs D18 c = 0,03; f = 0,001; Io = 0,03; L = 0,04.

Tabella 3: Le differenze nel flusso sanguigno dell'arteria uterina in ratti incinti.

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Discussion

A causa delle modifiche procedurale e risoluzione dei problemi che è stato richiesto in questo studio, nonostante il nostro scopo di individuare tutte le fasi dell'estro ciclo in ratti facendo uso dell'ultrasuono, siamo stati in grado di trovare eventuali differenze significative. Supponiamo che queste difficoltà possono essere perché il ciclo di estro dura solo pochi giorni in ratti, a differenza del ciclo nelle donne. Siamo sicuri che tutte le misurazioni sono state fatte proprio il momento giusto per determinare eventuali differenze. Pertanto, abbiamo raggruppato l'estro fasi del ciclo in solo due fasi per valutare eventuali differenze, ma nessuno sono stati osservati. Come previsto, abbiamo non trovato alcuna differenza significativa tra le misurazioni di ogni corno uterino, che ci permetterà di scegliere o corno di eseguire misure in futuro. Gli studi sugli effetti dell'uso di isoflurane su roditori sono contraddittori. Può essere teratogeno, ma solo se somministrato a concentrazioni di anestetiche per molte ore o diversi giorni. Nel nostro esperimento, il tempo di esame in ratti incinti era meno di 30 min, quindi non abbiamo trovato alcun effetto avverso a qualsiasi ratti incinti o dalla loro progenie.

Ci piacerebbe hanno trovato più somiglianze alla valutazione ecografia dell'apparato riproduttivo in donne, in cui ci sono echogenic chiare differenze tra la fase follicolare, periovulatory e fasi secretive, ma tali modifiche non sono state vedute nel ratto modello. Questo fatto può essere spiegato perché l'estro di ratto fasi solo ultimi quattro o cinque giorni del ciclo. Estro breve fasi di ciclo e periodi di gestazione fare il topo un animale ideale per la ricerca sulla riproduzione5. Tuttavia, questo fatto può essere la ragione perché non ci sono differenze significative nel diametro del corno uterino, lo spessore dell'endometrio e diametro ovarico nelle fasi di estro e non-estro. È difficile prendere le misure esattamente il momento giusto per l'accertamento di differenze, e malgrado la presa misure ogni giorno, non abbiamo trovato cambiamenti significativi.

Nonostante le limitazioni di cui sopra, vi proponiamo l'uso dell'ecografia per monitorare i cambiamenti nel sistema riproduttivo, compreso lo spessore e la morfologia degli organi riproduttivi. Possiamo affermare questo uso dell'ecografia perché lo spessore dell'endometrio in 8-settimana-vecchio Sprague-Dawley ratti come misurato histopathologically (uno strato 359.13 ± 49,70 millimetri) di Jing et al. 7 è simile ai risultati qui. Nonostante le varie tecniche per la misurazione dello spessore endometriale histopathologically e sonographically, abbiamo ottenuto risultati simili. Se potere Doppler e Doppler di colore sono stati utilizzati su ratte gravide per diversi anni8,9, ci sono stati poche indagini misurazione flusso sanguigno dell'arteria uterina in ratti non gravide. Ora con lo sviluppo dell'ecografia, abbiamo possiamo trarre vantaggio di questa tecnica per monitorare i cambiamenti nel tratto riproduttivo durante diverse fasi, anche all'inizio della gravidanza.

Future applicazioni dell'ultrasuono possono includere esplorazione del meccanismo di impianto dell'embrione e trattamento dell'endometrio sottile in modelli animali di ratto. Inoltre, monitorando le caratteristiche di sviluppo di follicoli, possiamo ottenere una conoscenza più completa sulla loro funzione in un modello di trapianto ovarico. Attualmente, ci sono poche indagini mediante imaging 3D e formazione immagine di ultrasuono molecolare del sistema riproduttivo di ratti10, e applicheremo questa tecnica su un modello sottile endometrio in futuro.

Possiamo trarre la conclusione che il ratto è un modello adatto per lo studio delle dinamiche di organo riproduttivo mediante ecografia transcutanea bio-microscopia, che non richiede sacrificio dell'animale.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgements

Questa ricerca è stata sostenuta da animale sperimentazione sezione dell'Università di Murcia e l'ostetricia e ginecologia dipartimento di Murcia Università. Ringraziamo tutti i tecnici che lavorano presso il CEIB (Centro sperimentale en Investigaciones Biomédicas), la sezione della sperimentazione animale dell'Università di Murcia, che hanno collaborato a questo progetto.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vevo3100 high-resolution in vivo micro-imaging system* Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo integrated rail system including physiological monitoring unit. Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
MX400 Transducter Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
Vevo Lab Software Visual Sonics, inc. www.visualsonics.com/products
HSD: Sprague Dawley SD Envigo, inc. Rat strain
Lubricating Gel General Supply
CIBERTEC CA-EAC20 Anesthesia Trolley System Cibertec S.A  Anesthesia Machine
Ecogel 100 ultrasound gel Eco-Med Pharmaceuticals Inc.
Hair removal lotion (Nair)  General Supply
Isoflurane Esteve Veterinaria Inhalatory anesthesia
* Required software is Vevo software including B-Mode application, pulse wave Doppler application, and vascular strain analysis tools package.

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References

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