بيوبانينج شبه الآلي المكتبات عرض البكتيريا الببتيد تقارب كاشف اكتشاف وتحليل يعزل الناتجة

Biochemistry
 

Summary

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات أسلوب ثبت لاكتشاف ببتيد تقارب الكواشف، بديلاً قويا للأجسام المضادة. وقد تبسيط أسلوب الفرز شبه الآلي هنا بيوبانينج لتقليل حدوث إيجابيات كاذبة. نحن هنا لتوضيح عملية التفكير والتقنيات المطبقة في تقييم المرشحين والتقليل من تحليل المتلقين للمعلومات.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات أسلوب ثبت لاكتشاف كاشف تقارب الببتيد للاعتراف بالأهداف الحيوية وغير الحيوية على حد سواء. الببتيد تقارب الكواشف يمكن استخدامها لتطبيقات مماثلة للأجسام المضادة، بما في ذلك الاستشعار والتداوي، ولكن أكثر قوة وقادرة على أداء في أكثر البيئات المتطرفة. تخصيب محددة من الببتيد القبض على عملاء لبروتين هدفا لمصلحة تعزيز استخدام أساليب الفرز شبه الآلية التي تحسين الربط وتغسل خطوات وبالتالي تقليل حدوث موثقات إيجابية كاذبة. أسلوب فرز شبه إليه الموصوفة هنا للاستخدام مع تجاري الآلي المغناطيسي تنشيط خلية الفرز الجهاز مع عرض بكتيرية غير مقيد الفرز مكتبة معربا عن الببتيدات عشوائية 15-مير. مع تعديلات طفيفة، هذه الأساليب قابلة للتمديد إلى الآخر الآلي الأجهزة وغيرها من المكتبات الفرز والكائنات الحية الأخرى. هدف أساسي من هذا العمل هو تقديم منهجية شاملة وشرح عملية التفكير تطبيقها في تحليل والتقليل إلى أدنى حد من مجموعة المرشحين الناتجة. هذه التقنيات تشمل تحليلاً للربط على الخلية باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية)، لتقييم تقارب وخصوصية أثناء الفرز، وفي المقارنة بين المرشحين الأفراد، وتحليل الببتيد تسلسل لتحديد الاتجاهات و توافق الآراء تسلسلات لفهم وتحسين يحتمل أن تكون النسب إلى وخصوصية لهدف الفائدة.

Introduction

بيوبانينج وأسلوب ثبت لتقارب كاشف الاكتشاف، مع البكتيريا عرض المكتبات مصدر مناسب الببتيد تقارب الكواشف 1،2،3،،من45، 6،،من78،9،10،11،،من1213،14، 15،16،17،،من1819،20،21،،من2223، 24. وعلى نحو مماثل بالعاثية عرض 25،26 والخميرة عرض 27،28، الببتيدات يتعرض على سطح الخلية، وهي متاحة لربط الأهداف الحيوية وغير الحيوية على حد سواء، مع هذه التفاعلات مدفوعا بالعمود الفقري الببتيد وخصائص فريدة من نوعها من جانب سلاسل الأحماض الأمينية 29. على عكس العرض بالعاثية، البكتيريا نفسها ذاتية وتحتوي على جميع المواد الوراثية اللازمة للعرض دون شطف بالعاثية منضم وتكرار الإصابة من الخلايا. على النقيض من الخميرة العرض، عرض البكتيرية أسرع بسبب السريع (20 دقيقة تقريبا 30) مضاعفة الوقت من الإشريكيّة القولونية. يمكن أن تنتج الكواشف تقارب الببتيد الناتجة خارج الخلية لاستخدامها في مجموعة متنوعة من الاستشعار منصات 16،،من1726 ولديها إمكانات لاستخدامها كمواد المعيشة عند عرضها في الخلية 2 , 31 , 32-بالمقارنة مع الأجسام المضادة للاعتراف بأهداف محددة، الببتيدات أصغر بكثير، وأكثر مرونة، ويمكن بسهولة التلاعب الببتيد عرض مكتبات على مستوى الحمض النووي لتجنب الأحماض الأمينية المحددة، مثل سيستين 33 . الببتيدات يستغلون متزايدة علاجات 34،،من3536 والتطبيقات الأخرى حيث عادة ما تستخدم الأجسام المضادة نظراً لسهولة اكتشاف، واستنساخه الاصطناعية (خارج الخلية ) إنتاج وصيانة فائقة الأداء في البيئات المتطرفة، توفير كاشف وظيفية حتى بعد التعرض لدرجة الحرارة العالية أو التخزين على المدى الطويل دون التبريد 37،38. القدرة على التغلب على سلسلة التبريد لتخزين المواد الكاشفة باهتمام خاص إلى وزارة الدفاع، على سبيل المثال، التي يجب أن تعمل في البيئات المتطرفة. وكان الثبات الحراري لذلك سمة مرغوب فيه الكاشفات تقارب الاعتراف بالأهداف المختارة التي تعطي كأمثلة في هذه المخطوطة.

في الآونة الأخيرة، أصبحت مكتبات العرض البكتيري بيوبانينج أكثر مباشرة وموثوق بها باستخدام الخلية شبه الآلي المغناطيسي المنشط الفرز (أجهزة ماكينتوش أو الإشراف) أساليب 9،،من1439. أثبتت هذه الأساليب للأهداف البيولوجية باستخدام عدة مماثلة الفرز منصات مع مزايا مختلفة، بما في ذلك متوفرة تجارياً الآلي المغناطيسي تنشيط الخلية فرز الصك (أوتوماكس أو أوتومكس) (انظر الجدول المواد) 1،،من1415 وأكثر تخصصا من الأجهزة الذي أرفق العينة في خرطوشة المتاح 7،9 أو رقاقة 39، مواصفات قيماً لاستخدامه مع الكائنات الحية أو السموم التي هي 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2) أو أعلى7. يمكن توسيع نطاق هذه الطرق شبه الآلية لفرز الببتيدات قادرة على ربط المواد الأحيائية واللااحيائيه إذا المواد المغناطيسية، أو لديها القدرة على أن تكون مغلفة على حبة مغناطيسية، و للاستخدام مع الكائنات المختلفة (مثل البكتريا اللاهوائية) إذا الفرز وتتغير ظروف النمو. بالإضافة إلى فرز مكتبات العرض البكتيرية، الصك أوتومكس التجارية المستخدمة هنا قد استخدمت أيضا في جزء منه للخطوات الأولى لاكتشاف أجزاء جسم واحد-السلسلة البشرية المعروضة على سطح الخميرة، متبوعاً بمزيد من العزلة استخدام الفلورية تنشيط الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) 40. المزايا الأساسية لأتمتة شبه انخفضت الفرز الوقت والجهد، وأكثر قوية واستنساخه بالقضاء على خلايا غير منضم من الخرز المغناطيسي أثناء خطوات الغسيل، مما يؤدي إلى الحد من إيجابيات كاذبة، وجولات الفرز المطلوبة أقل، وأقل تحليل تيار أسفل تعقيداً 9،14. في حالة الصك أوتومكس التجارية، وهناك العديد من البرامج المحملة مسبقاً الذي قد يكون الحل الأمثل لتطبيقات مختلفة، مثل السلبية قبل الفرز (استنزاف)، وإعطاء الأولوية للنقاء، والتقليل من حجم العينة النهائي، وزيادة أو تقليل الحساسية لعزل خلايا نادرة 41.

أن التركيز في هذا العمل هو لإثبات منهجية بيوبانينج مكتبة عرض البكتيريا باستخدام أداة أوتومكس المتاحة تجارياً، وأن يشرح عملية التفكير في تطبيقها في تحليل والتقليل إلى أدنى حد من مجموعة المرشحين في الناتج من أجل تسهيل تمديد لتطبيقات أخرى. عرض مكتبة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد) 12،13 يحتوي على حوالي 109-1011 15-مير فريدة الببتيدات عرضها عبر نسخة معدلة من البروتين البكتيري الغشاء الخارجي أومبكس في الطبيعة غير المقيد في سطح الخلية، التي من المتوقع أن يكون ممثل الببتيد مجاناً في الحل إذا المنتجة صناعيا. بالإضافة إلى ذلك تتضمن هذه السقالة البروتين ببتيد مراقبة إيجابية P2X في ج-المحطة لرصد التعبير عن طريق الربط إلى مني يبيت. بيد مكتبة تم شراؤه أو رواية مع تنوع مناسب وغيرها من الخصائص اللازمة للتطبيق المحدد المطلوب أن تعمل المثل مع هذا الإجراء بيوبانينج، على الرغم من بعض التغييرات الطفيفة قد تكون مطلوبة. ويتضح في الشكل 1تخطيطي لهذا البروتوكول بيوبانينج. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون البروتوكول يتكيف مع الآخر الآلي منصات الفرز المغناطيسي واستراتيجيات أخرى للفرز. الفرز المغناطيسي اليدوي مع مغناطيس benchtop تم بنجاح أثبت، أن كان ذلك مع تحليل المتلقين للمعلومات أكثر تعقيداً ومضيعة للوقت المطلوب نظراً لزيادة المغلوطة 14، ومع ذلك يوفر خياراً بديلاً تتوفر خطوات أوتومكس إذا لا خلية المغناطيسي الآلي الفرز الجهاز.

Protocol

1-بيوبانينج "البكتيرية عرض المكتبات استخدام" أوتومكس

ملاحظة: هذا البروتوكول الفرز على أساس أوتومكس قد تم وصفه سابقا 14، وأكثر شمولاً "توسيع البروتوكول للمستخدمين الجدد" تتوفر في المواد التكميلية لهذه المخطوطة لمزيد من التفصيل، بما في ذلك شرح لإمكانيات التعديلات. إذا لم يتوفر جهاز أوتومكس للفرز، انظر البروتوكول الإضافي من سركيس et al. عام 2015 حيث يرد دليل الفرز البروتوكول أيضا في هذا العمل 14. بروتوكول أوتومكس المقدمة هنا قد تم زيادة تكييف لتشمل خطوات الفرز سلبية إضافية لتحسين النوعية 1،15. ويتضح في الشكل 1تخطيطي لهذا البروتوكول بيوبانينج.

  1. السلبية الفرز لإزالة موثقات يحتمل أن كروسريكت مع حبات مغناطيسية
    1. تطعيم 500 مل ميلر مرق لوريا (رطل) التي تحتوي على المضادات الحيوية مع حوالي 1 × 1011الخلايا البكتيرية المتنوعة عرض مكتبة الفرز المناسبة (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: عرض البكتيريا الببتيد المكتبة المستخدمة هنا (انظر الجدول للمواد) يحتوي على حوالي 109- 8،أعضاء فريدة111012 ويزرع في رطل يحتوي على 25 ميكروغرام/مل كلورامفينيكول (25من سم رطل). ما تبقى من هذا البروتوكول سوف يفترض أن يتم استخدام هذه المكتبة.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الثقافة التطوير التنظيمي600 0.5-0.55. حمل التعبير الببتيد مع 0.04% w/v L-أرابينوز بإضعاف من 4% أسهم 1: 100، تهز 225 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. مكان فعل الثقافة على الجليد. الطرد المركزي حوالي 2 × 1011 الخلايا في 6000 x ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل برنامج تلفزيوني بدوامات بلطف.
      ملاحظة: التطوير التنظيمي600 من 1.0 يساوي تقريبا 1 × 109 خلايا/مل كولاي.
      ملاحظة: لا دوامة كهذا ربما الخلايا؛ ريسوسبيند باليد أو بالهز بإيجاز في ≤ 225 لفة في الدقيقة، 4 درجة مئوية.
    4. نقل الخلايا إلى tube(s) ميكروسينتريفوجي وتدور على 6,000 ز x لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) التي تحتوي على 0.5% ألبومين المصل البقري (جيش صرب البوسنة؛ ببسب).
    5. أغسل 300 ميليلتر من حبات المغلفة streptavidin (الخرز حوالي 3 × 109 ، انظر الجدول للمواد) 1 مل ب برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في إيه فايف، 000 x ز (في RT). ضع الأنبوبة في فاصل جسيمات مغناطيسية أعلى مقاعد البدلاء. بعناية إزالة المادة طافية، تجنب بيليه.
    6. ريسوسبيند الخرز في الخلية بالإضافة إلى خليط ب برنامج تلفزيوني أعد أعلاه. تبني في 4 درجات مئوية على منصة الدورية لعينات مكان 45 دقيقة على الجليد.
    7. قم بتشغيل أداة أوتومكس لتهيئة النظام. رئيس خطوط باستخدام تشغيل الشركة المصنعة ومخازن المياه والصرف الصحي (انظر الجدول للمواد) عن طريق تحديد "أغسل الآن" في الجزء السفلي من الشاشة في القائمة "الانفصال"، ثم "شطف" و "تشغيل".
    8. رئيس الوزراء في النظام مع برنامج تلفزيوني-ب، باستخدام برنامج تلفزيوني-ب على حد سواء من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وتشغيل المخزن المؤقت في الخطوات التالية. حدد من القائمة "فصل" من شريط التنقل العلوي وحدد "أغسل الآن". حدد "شطف" و "تشغيل" رئيس الوزراء في النظام مع برنامج تلفزيوني جديد-باء.
    9. نقل الخلية وحبه خليط من الخطوة حضانة لأنبوب مخروطي 15 مل. وضع هذا الأنبوب في فتحه عينة، وإفراغ 15 مل الأنابيب المخروطية في فتحات التحديد الإيجابية والسلبية، من رف مبردة مسبقاً (4 درجات مئوية) (انظر الجدول للمواد). وضع رف على منصة الصك.
    10. تعيين برنامج فصل لكل عينة على الرف (يمكن تخزين ما يصل إلى 5 عينات في تشغيل واحد). إضافة خطوة "شطف" الفترات الفاصلة بين كل عينة وبعد النموذج الأخير. حدد "تشغيل" لبدء فصل الخلية. حدد "موافق" لتأكيد أن يتوفر ما يكفي من المخزن المؤقت.
      ملاحظة: يعمل البرنامج فصل "بوسيلدس" جيدا لفرز السلبية والإيجابية فرز جولة 1 و "بوسيلد" المفضل لفرز جولات 2-4، ولكن كلا من هذه البرامج قد استخدمت بنجاح لجميع السلبية والإيجابية الفرز جولات 14 ،15 وبرامج أخرى قد تكون أفضل لتطبيق معين (وصف كذلك في المناقشة).
    11. عند الانتهاء من البرنامج، إزالة الرف والاحتفاظ بالكسر المناسب. هنا، لفرز سلبية، الاحتفاظ بكسور السلبية (التي تحتوي على الخلايا دون الخرز). ضع على الجليد.
    12. استخدام الكسر فرز سلبية في مجملها لتطعيم ل 1 سم رطل25 مع 0.2% w/v د-الجلوكوز. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تهز 225 لفة في الدقيقة.
    13. قبل إيقاف تشغيل أداة أوتومكس، تغيير في مخازن التشغيل وغسل لتشغيل الشركة المصنعة ومخازن المياه والصرف الصحي (انظر الجدول للمواد). حدد "أغسل الآن"، ثم "شطف" و "تشغيل". عند الانتهاء، يجب التأكد من أن هناك الإيثانول 70% في بند إزالة التلوث، ثم اضغط على "رمز القوة" في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة واختر "نعم".
    14. عندما يتم إيقاف تشغيل النظام الكامل (سوف تكون الزجاجات الأرجواني)، إيقاف تشغيل الجهاز.
    15. في اليوم التالي، استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لجعل الأرصدة المجمد مع حوالي 1 × 1011الخلايا كل قنينة في رطل مع والغليسيرول 15%. بالإضافة إلى ذلك، أو بدلاً من ذلك، استخدم هذه الثقافة في الخطوة التالية: فرز سلبية إضافية (القسم 1-2) أو الجولة الأولى من الفرز الإيجابية (القسم 1.3).
  2. الفرز لإزالة موثقات يحتمل أن كروسريكت مع الأهداف الأخرى للفائدة السلبية
    ملاحظة: يمكن تخطي 1.2 القسم إذا كان إجراء أي فرز السلبية اللازمة أو المرجوة. وفي هذه الحالة، تابع إلى القسم 1.3. يمكن تقييم الربط المتبقية لأي أهداف غير مرغوب فيها بنظام مراقبة الأصول الميدانية كما هو الحال في الجزء 2: تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية "جولات الفرز".
    1. لفرز السلبية ضد هدف محدد من بروتين، مثل بروتين مماثلة مع إمكانية الربط أيضا إلى 1،الببتيدات اكتشفت15، كرر الخطوات النمو واستحثاث 1.1.1-1-1-3، بدءاً أسهم مجمدة من مكتبة streptavidin المستنفد من الخطوة 1.1.15 أو الثقافة بين عشية وضحاها من الخطوة 1.1.12 (باستخدام OD600 لتقدير وتلقيح مع الخلايا 1 × 1011 ).
    2. نقل الخلايا إلى tube(s) ميكروسينتريفوجي وتدور على 6,000 ز x لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 600 نانومتر بيوتينيلاتيد البروتين تحسن المستهدفة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على منصة الدورية.
      ملاحظة: 600 نيوتن متر هو تركيز انطلاق مقترحة، التي يمكن أن تتغير إذا لوحظ فائدة ذكر. يمكن أن بيوتينيليشن من البروتين المستهدف وكمياً باستخدام الكواشف اقترحت في الجدول للمواد.
    3. وفي الوقت نفسه، يغسل 100 ميليلتر حبات المغلفة ستريبتافيدين (حوالي 1 × 109 حبات) في 1 مل ب برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ≥ 5,000 x ز (في RT). ضع الأنبوبة في مقاعد البدلاء الجسيمات المغناطيسية أعلى الفاصل وإزالة المادة طافية، تجنب بيليه بعناية.
    4. الطرد المركزي خلايا محددة الهدف على 6,000 ز x لمدة 5 دقائق (RT أو 4 درجة مئوية) وإزالة المادة طافية ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل برنامج تلفزيوني-باء. ريسوسبيند الخرز في كامل حجم الخلايا غسلها منضمة إلى تحسن البروتين الهدف. تبني في 4 درجات مئوية على منصة الدورية لمدة 30 دقيقة.
    5. وضع عينة على الجليد واستكمال خطوات 1.1.7-1.1.15 لفرز سلبية، مما يجعل مخزون الثلاجة المناسبة. يواصل الفرع 1.3 لفرز إيجابية إذا تحققت جميع الفرز السلبي المنشود، أو تكرار المقطع 1.2 لفرز السلبية ضد البروتين تحسن محتمل آخر.
  3. جولة الفرز الإيجابي 1
    ملاحظة: جولة الفرز الإيجابي 1 ضد بروتين معين الهدف مشابهة لنوع سلبي ضد هدف فرز محددة (انظر 1-2) باستثناء الإبقاء على الكسر المحتوية على حبة وإيجابية.
    1. تطعيم 500 مل رطل سم25 مع حوالي 1 × 1011الخلايا للبكتيريا المتنوعة عرض مكتبة الفرز التي تم ستريبتافيدين المنضب ونمت بين عشية وضحاها (من الخطوة 1.1.12) أو المجمدة (من الخطوة 1.1.15) والمذابة في الجليد، أو أنه قد تم كذلك نفدت من موثقات لأهداف أخرى تحسن البروتين (من الخطوة 1.2.5)، كما هو مطلوب.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الثقافة التطوير التنظيمي600 0.5-0.55. حمل التعبير الببتيد مع 0.04% w/v L-أرابينوز بإضعاف من 4% أسهم 1: 100، تهز 225 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. مكان فعل الثقافة على الجليد. الطرد المركزي حوالي 2 × 1011 الخلايا في 6,000 ز x لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 1.5 مل برنامج تلفزيوني بلطف يحوم (باليد أو بالهز بإيجاز في ≤ 225 لفة في الدقيقة، 4 درجة مئوية).
    4. نقل الخلايا إلى tube(s) ميكروسينتريفوجي وتدور على 6,000 ز x لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية.
    5. ريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل برنامج تلفزيوني يحتوي على 600 نانومتر بيوتينيلاتيد البروتين المستهدف للفائدة. احتضان عند 4 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة على منصة الدورية.
      ملاحظة: 600 نيوتن متر هو تركيز انطلاق مقترحة، التي يمكن أن تتغير إذا لوحظ فائدة ذكر. يمكن أن بيوتينيليشن من البروتين المستهدف وكمياً باستخدام الكواشف اقترحت في الجدول للمواد.
    6. وفي الوقت نفسه، يغسل 100 ميليلتر حبات المغلفة ستريبتافيدين (حوالي 1 × 109 حبات) في 1 مل ب برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ≥ 5,000 x ز (في RT). ضع الأنبوبة في فاصل جسيمات مغناطيسية أعلى مقاعد البدلاء، وإزالة المادة طافية، تجنب بيليه بعناية.
    7. عند الانتهاء من الحضانة مع الهدف، الطرد المركزي خلايا محددة الهدف على 6,000 ز x لمدة 5 دقائق (RT أو 4 درجات مئوية) لإزالة أي البروتين المستهدف غير منضم. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 1 مل برنامج تلفزيوني-باء. ريسوسبيند الخرز في كامل حجم الخلايا غسلها ملزمة للبروتين الهدف. تبني في 4 درجات مئوية على منصة الدورية عن 30 دقيقة على الجليد.
    8. قم بتشغيل أداة أوتومكس لتهيئة النظام. رئيس خطوط باستخدام تشغيل الشركة المصنعة ومخازن المياه والصرف الصحي (انظر الجدول للمواد) عن طريق تحديد "أغسل الآن" في الجزء السفلي من الشاشة في القائمة الفصل، ثم "شطف" و "تشغيل".
    9. رئيس الوزراء في النظام مع برنامج تلفزيوني-ب، باستخدام برنامج تلفزيوني-ب على حد سواء من المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي وتشغيل المخزن المؤقت في الخطوات التالية. حدد من القائمة فصل من شريط التنقل العلوي وحدد "أغسل الآن". حدد الشطف وتشغيل رئيس النظام مع برنامج تلفزيوني جديد-باء.
    10. نقل الخلية وحبه خليط من حضانة الخطوة أعلاه إلى أنبوب مخروطي 15 مل، الشطف الأنبوب مع ميليلتر 500 إضافية لبرنامج تلفزيوني-ب وتجميع المياه والصرف الصحي مع العينة. وضع هذا الأنبوب في فتحه عينة، وإفراغ 15 مل الأنابيب المخروطية في فتحات التحديد الإيجابية والسلبية، من رف مبردة مسبقاً (4 درجات مئوية) (انظر الجدول للمواد). وضع رف على منصة الصك.
    11. تعيين برنامج فصل لكل عينة على الرف (يمكن تخزين ما يصل إلى 5 عينات في تشغيل واحد). إضافة خطوة "شطف" الفترات الفاصلة بين كل عينة وبعد النموذج الأخير. حدد "تشغيل" لبدء فصل الخلية. حدد "موافق" أو "متابعة" لتأكيد أن يتوفر ما يكفي من المخزن المؤقت.
      ملاحظة: البرنامج فصل "بوسيلدس" يعمل بشكل جيد الفرز السلبية والإيجابية فرز جولة 1 و "بوسيلد" المفضل لفرز جولات 2-4، ولكن كلا من هذه البرامج قد استخدمت بنجاح لجميع السلبية والإيجابية الفرز تقريب 14 , 15 وبرامج أخرى قد تكون أفضل لتطبيق معين (وصف كذلك في المناقشة).
    12. عند الانتهاء من البرنامج، إزالة الرف والاحتفاظ بالكسر المناسب. هنا، لفرز إيجابية، الاحتفاظ بالكسور الموجبة (التي تحتوي على خلايا والخرز). ضع على الجليد.
    13. قبل إيقاف تشغيل أداة أوتومكس، تغيير في مخازن التشغيل وغسل لتشغيل الشركة المصنعة ومخازن المياه والصرف الصحي (انظر الجدول للمواد). حدد "أغسل الآن"، ثم "شطف" و "تشغيل". عند الانتهاء، يجب التأكد من أن هناك الإيثانول 70% في بند إزالة التلوث، ثم اضغط على "رمز القوة" في الزاوية اليمنى العليا من الشاشة واختر "نعم".
    14. عندما يتم إيقاف تشغيل النظام الكامل (سوف تكون الزجاجات الأرجواني)، إيقاف تشغيل الجهاز.
    15. استخدام الكسر فرز إيجابية في مجملها لتطعيم ل 1 سم رطل25 مع 0.2% w/v د-الجلوكوز. تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تهز 225 لفة في الدقيقة.
    16. وفي اليوم التالي استخدام الثقافة بين عشية وضحاها لجعل الأرصدة المجمدة في رطل المحتوية على الجلسرين 15%، و/أو تواصل إيجابية الفرز 2 جولة في الفرع 1-4.
  4. جولات الفرز الإيجابية اللاحقة
    ملاحظة: عادة، أربع جولات الفرز يوصي، على الرغم من أن ثلاث جولات الفرز هي كافية عموما 14،15. عندما وقف الفرز يساعده وصف تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية "جولات الفرز" في الباب 2. تقليل تركيزات المستهدفة وحجم حبة المغناطيسي مع كل جولة الفرز الإيجابية اللاحقة.
    1. استخدام الثقافة بين عشية وضحاها من الجولة الفرز السابقة (أو مخزون خلايا مجمدة من تلك الجولة)، تطعيم مل 5 رطل سم25 مع 100 ميليلتر الخلايا (01:50 إضعاف). احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الثقافة التطوير التنظيمي600 0.5-0.55.
    2. حمل التعبير الببتيد مع 0.04% w/v L-أرابينوز، تهز 225 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية. مكان فعل الخلايا على الجليد.
      ملاحظة: هذه الثقافة المستحث أيضا استخدامها لتقييم تقارب ملزم وخصوصية للجولة الفرز مصدرها، كما هو موضح في القسم 2 أدناه.
    3. الطرد المركزي 1 × 108 خلايا في 6,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وريسوسبيند بيليه الخلية في 50 ميليلتر PBS تحتوي على نصف تركيز بيوتينيلاتيد البروتين المستهدف للفائدة المستخدمة للجولة السابقة للفرز (ولذلك 300 نانومتر لجولة 2، 150 شمال البحر الأبيض المتوسط للجولة 3 و 75 شمال البحر الأبيض المتوسط للجولة 4 من أعمالنا المقترح نقطة انطلاق). احتضان لمدة 45 دقيقة على الجليد (أو عند 4 درجة مئوية منبر الدورية).
    4. وفي الوقت نفسه، تغسل حبات streptavidin المغلفة (15 ميليلتر للجولة 2, 8 ميليلتر للجولة 3 و 4 ميليلتر للجولة 4) في 1 مل ب برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في ≥ 5,000 x ز (في RT). ضع الأنبوبة في مقاعد البدلاء الجسيمات المغناطيسية أعلى الفاصل وإزالة المادة طافية، تجنب بيليه بعناية. ريسوسبيند الخرز في 50 ميليلتر PBS-باء.
    5. وبعد الحضانة 45 دقيقة مع الهدف في الخطوة 1.4.3، الطرد المركزي الخلايا في 6,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية، إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في ميليلتر 50 تغسل حبات من 1-4-4. الاحتفاظ بعينه على الجليد واستكمال خطوات 1.3.7-1.3.13 لفرز إيجابية.
    6. تلقيح ثقافة مل 5 سم رطل25 تستكمل مع 0.2% w/v د-الجلوكوز مع الكسر الإيجابية، التي تحتوي على حبة كاملة من هذا النوع.
    7. في اليوم التالي، استخدم ثقافة بين عشية وضحاها لجعل الأرصدة المجمدة في رطل المحتوية على الجلسرين 15% و/أو تواصل الفرز الإيجابي القادم جولة، والعودة إلى الخطوة 1.4.1.
      ملاحظة: استخدام ثقافة المستحث من 1.4.2 تقييم تقارب ملزم وخصوصية كما هو موضح في القسم 2 أدناه يمكن أن يساعد تحديد متى يتم إيقاف الفرز. إذا جولتين الفرز في صف إظهار مماثلة ملزمة تقارب، أو جولة لاحقة يظهر انخفاض تقارب ملزمة لهدف الفائدة، هذا مرغوب فيه مكان لإيقاف الفرز. بعد الجولة الأخيرة، لكن العودة إلى الخطوة 1.4.1 تتوقف عند 1.4.2.

2-نظام مراقبة الأصول الميدانية التحليل الفرز جولات

  1. باستخدام الخلايا المستحثة من الخطوة 1.4.2 لكل جولة الفرز، أو الثقافات متطابقة، إضافة 5 ميليلتر الناجمين عن الخلايا إلى 25 ميليلتر من كل مما يلي إعداد الحلول لربط التقييم (انظر أيضا الجدول للمواد): برنامج تلفزيوني وحدها؛ برنامج تلفزيوني مع 150 نانومتر مني يبيت (يبيت 12،13؛ مراقبة إيجابية للتعبير)، وإذا كانت متاحة؛ 900 نانومتر البروتين المستهدف مترافق بصبغة فلورسنت، مثل صبغ أمين المتفاعلة مع الانبعاثات/الإثارة في شمال البحر الأبيض المتوسط nm⁄518 493 (الهدف-488)؛ 900 نانومتر البروتين تحسن الهدف (ق) المستخدمة للفرز السلبية المسمى بصبغة الفلورسنت نفس (كروسريكتيفي البروتين-488)؛ و 900 نانومتر ستريبتافيدين-R-فيكوريثرين (ساب). تبني على الجليد لمدة 45 دقيقة.
    ملاحظة: إذا كان استمرار مباشرة من الخطوة 1.4.2، هذه الخطوة سيكون دائماً القيام به اليوم وبعد الانتهاء من بيوبانينج لتلك الجولة حيث يزرع المكتبة المحددة لأسفل بين عشية وضحاها ثم سوبكولتوريد والمستحث في اليوم التالي. ويمكن أيضا استخدام الثقافات نمت والناجم عن المثل من تجميد الأرصدة جولة الفرز؛ وفي هذه الحالة، يمكن اختبار جميع جولات والمقارنة في تجربة واحدة.
  2. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. إزالة المادة طافية وتخزين العينات في الثلج.
    ملاحظة: يمكن تخزين حبيبات الخلية على الجليد حتى على استعداد لتحليل جميع العينات.
  3. قم بتشغيل أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية وفتح البرنامج، بدء تشغيل النظام، ومعايرة صك اتباع إرشادات الشركة المصنعة 43،44.
  4. ضمن برنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية، انقر فوق "المسؤول"، وانقر فوق المجلد المطلوب أو إنشاء "مجلد جديد". انقر على "التجربة الجديدة" أيقونة في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة. الحق انقر فوق رمز "إعادة تسمية" التجربة. داخل تلك التجربة، انقر على "أوراق العمل العالمي".
  5. انقر على أيقونة "دوت الأرض"، ثم انقر فوق في جدول بيانات ورقة العمل العالمية لإنشاء هذا سكاتيربلوت. انقر فوق الرسم البياني مؤامرة دوت نفسها، ثم حدد "المفتش" أيقونة في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة وضبط المحاور لعرض بيكسبونينتيال بتحديد المربعات بجوار "Y" والمحور "س" في النافذة المفتوحة. قم بإغلاق نافذة عرض بيكسبونينتيال بواسطة النقر فوق علامة X.
  6. إنشاء أنبوب "جديدة" بواسطة النقر فوق الرمز في الجزء العلوي الأيسر من الشاشة، وإعادة تسمية العينة بالمعلومات المناسبة بالحق النقر على رمز العينة تحت "ورقة العمل العالمي" وتحديد "إعادة تسمية". قم بتوسيع العينة بواسطة النقر فوق (+) تسجيل الدخول، ثم النقر المزدوج على أيقونة الأنبوبة، انقر على الحق في ذلك، ومرة أخرى حدد "إعادة تسمية" لوصف العينة.
  7. استخدام هذا الرسم البياني مؤامرة دوت مع الافتراضية بالتعاون بين بلدان الجنوب مقابل منتدى التعاون الأمني-أ لتشغيل عينة مراقبة سلبية في برنامج تلفزيوني وحدها بالنقر على هذا الأنبوب المزدوج أو اختيار السهم بجانبه. قبل تشغيل العينة، ريسوسبيند بيليه الخلية في 500 ميليلتر الجليد الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية تشغيل المخزن المؤقت ونقل عينة إلى نظام مراقبة الأصول الميدانية أنبوب (انظر الجدول للمواد)، خلط جيدا من قبل بيبيتينج والتحريك الأنبوب. وضع الخلايا ريسوسبينديد على أنبوب حقن العينة (الجلوس) من الصك. الصحافة "اكتساب" مع "الأحداث لعرض" 30,000-50000 و "الأحداث إلى سجل" 10 آلاف، تدفق بيانات معدل منخفض (لبدء؛ زيادة إذا لزم الأمر)، و "الجلوس تدفق" المحدد.
    ملاحظة: سرعة مناسبة (منخفضة، متوسطة أو عالية) هي السرعة الذي عدد الأحداث/s تقريبا بين 200 و 2000.  استخدام هذا النطاق لجميع الخطوات.
  8. مع اكتساب، ضبط عتبة الجهد (PMT) أنبوب ضوئي إذا لزم الأمر عن طريق اختيار علامة التبويب "عتبة" انقر على وتغيير "قيمة". ضبط الجهد للتشتت الأمامية والجانبية (منتدى التعاون الأمني والتعاون بين بلدان الجنوب) مثل أن ينخفض قليلاً الوسط خلايا المراقبة السلبية في برنامج تلفزيوني وحدها.
    ملاحظة: يمكن إضافة معلمات إضافية (مثل التعاون بين بلدان الجنوب) في علامة التبويب "العتبة" باستخدام الرمز "إضافة". نموذجياً، تعمل الفولتية PMT لحوالي 700 الخامس إلى 1000V للتعاون بين بلدان الجنوب ومنتدى التعاون الأمني جيد كولاي.
  9. إذا كان يتم قراءة العينة بشكل صحيح، ضبط معدل تدفق لعرض الأحداث 200-2000/s واضغط على "بيانات التسجيل". عند الانتهاء من التسجيل، وإزالة أنبوب من الجلوس ووضعه على الجليد.  اختر رمز "بوابة مضلع" واستخدم الماوس لرسم بوابة حولها أغلبية سكان الخلية في سكاتيربلوت. انقر على الحق في الأرض دوت وحدد "إظهار التسلسل الهرمي السكان".
  10. استخدام هذه البوابة "P1" كأحد الوالدين عن طريق النقر على "P1" في التسلسل الهرمي للسكان. إنشاء مؤامرة نقطة جديدة بعد الخطوة 2، 5. الحق فوق كل محور وتغيير المحور س والمحور ص إلى فيتك-أ لمنتدى التعاون الأمني-ألف. بوابة التحكم السلبي (PBS وحدها) استخدام رمز "مضلع البوابة"، مع بوابة ضيقة قدر الإمكان حول الجانب العلوي الأيمن والأيسر من السكان.
    ملاحظة: التحقق من ضعف في التسلسل الهرمي للسكان لضمان أن البوابة P1 هو أحد الوالدين من بوابة P2. إذا لم يكن كذلك، سوف تظهر تمشيا مع بوابة P1 وسيكون "كافة الأحداث" الأصل؛ حذف البوابة وإعادة إنشائه بعد الخطوة 2، 10.
  11. حدد "P2" في التسلسل الهرمي للسكان، انقر بالزر الأيمن، واختر "عكس بوابة". انقر على الحق في الأرض دوت مع بوابة P2 وحدد "إظهار السكان". حدد السكان "P2" و "لا P2" لعرض (أقل من 1% السكان وينبغي أن تقع خارج البوابة).
  12. ارسم نقطة مع بوابة P2 انقر بالزر الأيمن وحدد "إنشاء طريقة عرض إحصائيات". نافذة عرض الإحصاءات انقر بالزر الأيمن وحدد "تحرير طريقة عرض إحصائيات". انقر فوق علامة التبويب "السكان"، وإضافة أو إزالة السكان، كما هو مطلوب، بما في ذلك السكان الأصل، P1 (ينبغي أن تظهر P2، وليس P2 فعلا). انقر فوق علامة التبويب "إحصائيات"، وإضافة "فيتكا الوسيط" وغيرها من الإحصاءات من المصلحة. قم بإغلاق النافذة بالضغط على "موافق".
  13. إنشاء رسم بياني ارسم نقطة مماثلة ل PE-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-A والبوابة باستخدام برنامج تلفزيوني وحدة العينة (المؤامرات السابقة يمكن أن تتكرر وتغييرها). استخدام جدول البيانات هذا لتشغيل جميع العينات (بما في ذلك مراقبة سلبية الخلايا المحتضنة مع كل هدف المسمى fluorophore) بهذه الطريقة، تسجيل الأحداث حوالي 10,000 لكل.
    ملاحظة: الخلايا التي تقع خارج البوابة بعد الحضانة مع البروتين المستهدف-488، يبيت إيجابية المراقبة، وما موثقات لهذا البروتين، وينبغي أن تسجل القيمة من "لا مقصف" (حيث X هو عدد السكان بوابات لهذا الرسم البياني) كنسبة مئوية ملزمة. عند استخدام ساب كعنصر سلبي، استخدام الأرض بمنتدى التعاون الأمني مقابل PE-أ. كما ينبغي أن تسجل الأسفار متوسط الكثافة (مؤسسة مونتانيار) P1 وهذا يعطي معلومات تتجاوز % ملزمة، لإظهار مدى ملزم من الناحية النسبية، وهو أقوى حضور القيم المتطرفة 45. يمكن fluorescence متوسط كثافة طبيعية (نمفي) بتقسيم مؤسسة مونتانيار ببتيد كل من مؤسسة مونتانيار عنصر تحكم سقالة سلبية فقط (مع لا الببتيد الطرفي ن)، أو استنساخ تحتوي على تسلسل ببتيد التي لا تربط هدفا للفائدة، بعد الاحتضان مع نفس الهدف مترافق fluorophore نفسه 14. إذا لم تتوفر هذه الخلايا المراقبة السلبية، يمكن استخدام خلايا أونيندوسيد المحتضنة مع نفس الهدف والمسمى مع فلوروفوري نفس أيضا للتطبيع.

3-تسلسل تحليل للمرشحين المحتملين وتقييم ملزمة تقارب

  1. تحديد تسلسل الببتيد
    1. تحديد وترتيب عشرات أو مئات من المستعمرات البكتيرية من دورة نهائية من بيوبانينج (عادة ما تكون جولات 3 أو 4 يكفي 14).
    2. تحليل التسلسل تحليل البيانات باستخدام الملف الماكرو الذي قمنا بتطوير (انظر المعلومات الداعمة للتعليمات البرمجية، "eCPX_Sequencing الفرعية") للتحديد في تسلسل المتولدة من بيوبانينج المكتبة عرض البكتيريا 15mer المدرجة في الجدول المواد. استخدم برنامج جداول البيانات المدرجة في الجدول للمواد، أو برامج أخرى متوافقة المفضل.
      ملاحظة: هناك عدد من الأدوات متاحة على الإنترنت التي يمكن أن تساعد أيضا في تحليل تسلسل الحمض النووي 47. إذا فضلت، استخدم طريقة مختلفة لتحليل تسلسل وقم بالتخطي إلى الخطوة 3.1.3.
      1. تحميل المجموعة من تسلسل ملفات (ملفات.seq، والوثائق والنصوص أيضا العمل) واستخراجها إلى مجلد جديد. إذا لزم الأمر، نقل أو نسخ المجلد إلى القرص الثابت بجهاز الكمبيوتر (بدلاً من مجلد شبكة اتصال) لتحسين سرعة.
      2. فتح نافذة جديدة في جدول بيانات. تأكد من تمكين وحدات الماكرو وتمكين كافة الميزات، إذا كان يطفو على تلك الرسائل.
        ملاحظة: الخطوات من 3 إلى 6 أدناه ينبغي أن تحتاج فقط إكمال أول مرة يستخدم الماكرو. للتحليل اللاحق، ببساطة "تشغيل ماكرو" بداية من الخطوة 7.
      3. نسخ كافة محتويات الماكرو الموجود في الملف "شبه eCPX_Sequencing".
        ملاحظة: الإصدار الحالي هو إعداد مع المرافقة تسلسلات للمكتبة 15-مير المسرودة في الجدول للمواد وسوف تترجم الأحماض الأمينية بينهما. يمكن إدخال تسلسل إضافية عن طريق نسخ 5 'المرافقة متواليات في العمود A و 3' المرافقة متواليات في العمود B في جدول البيانات، ما يصل إلى 10 تسلسل لكل منهما، قبل تشغيل الماكرو.
      4. في ملف جدول بيانات فارغ، قم بتحديد علامة التبويب "عرض"، ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق "وحدات الماكرو". حدد المجلد personal.xlb. إذا كان هذا غير متوفر، تسجيل ماكرو أولاً إظهار هذا.
      5. انقر فوق "إنشاء" أو "الخطوة إلى"، اعتماداً على ما يمكن إبرازها. قم بلصق الماكرو بأكمله داخل الوحدة النمطية.
      6. انقر فوق الحفظ رمز أو اذهب إلى ملف، حفظ. الخروج من الوحدة النمطية. إذا كانت نافذة للملوثات العضوية الثابتة، اضغط موافق.
      7. تشغيل الماكرو: انتقل إلى المجلد حيث توجد ملفات desired.seq. انقر فوق على شريط بجوار أيقونة المجلد في الجزء العلوي لعرض موقع المجلد. نسخة.
      8. انتقل إلى إطار جدول بيانات جديد. حدد علامة التبويب عرض، ثم انقر نقراً مزدوجاً فوق وحدات الماكرو. حدد "eCPX_Sequencing" من القائمة وانقر فوق "تشغيل".
      9. في المربع أن الملوثات العضوية الثابتة، لصق موقع الملف نسخ في الخطوة 7، وتصل إلى تدخل. يجب أن يبدأ الماكرو يمر في التسلسل وتنظيمها في جداول على أوراق مختلفة.
      10. استخدام صفحة "ملخص الجدول" لتحديد إذا كان سيكون ضروريا للتحقق من ملفات التتبع للأخطاء وإجراء التصحيحات يدوياً (إذا كان تسلسل تحتوي على "X" أو تعذر ترجمة).
        ملاحظة: "الجدول الموجز" يعرض تسلسل الببتيد المترجمة، مرتبة حسب تسلسل الأحماض الأمينية (من A إلى Z)، ما لم يمنع وجود خطأ في تسلسل الترجمة. "X" يشير إلى الأحماض الأمينية فردية التي لا يمكن تحديده.
    3. حالما يتم ترجمتها في التسلسل، نظمت، وتصحيح أية أخطاء التسلسل، تحقق من قائمة مفروزة الببتيد تسلسل على صفحة "ملخص الجدول" لأي تسلسلات مكررة.
    4. تنمو الثقافات بين عشية وضحاها للمستعمرات متسلسل للفائدة (بما في ذلك تكرار و/أو الببتيدات مع الاتجاهات الملحوظة كحد أدنى) في 5 مل رطل سم25 في 37 درجة مئوية، تهز 225 لفة في الدقيقة، وحفظ الأرصدة المجمدة في اليوم التالي في رطل المحتوية على الجلسرين 15%، كما هو الحال في الخطوة 1.4.7. اختبار الببتيدات مع تكرار تسلسل ملزمة تقارب وخصوصية استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية الأساليب الموضحة في القسم 3.3 واستخدام تنسيق FASTA تسلسل قائمة (قائمة كاملة ويكرر فقط) إلى محاذاة تسلسلات استخدام المحاذاة المفضل و تحليل البرامج، كما هو الحال في المقطع 3.2.
  2. تسلسل المحاذاة باستخدام برامج مماثلة وكالين أوميغا كلوستال
    1. نسخ تسلسل في تنسيق FASTA من جدول البيانات FASTA الماكرو، أو خلاف ذلك إنشاء قائمة ملفات فاستا من تسلسل محاذاة (مثل تلك الخطوة 3.1.3).
      ملاحظة: العمود A يحتوي على ملفات FASTA حسب الترتيب العددي "Seq #" بينما يعرض العمود ب لهم فرز حسب"تسلسل AA"من صفحة"ملخص الجدول". سيتم عرض قائمة تسلسلات الببتيد مفروزة حسب تسلسل الأحماض الأمينية تسلسل غير قابل للاستخدام أعلى، مثل موجه فارغ (بوصفها "# فارغة") وتسلسل تلك التي لا تم العثور على معايير البحث 5 'أو 3' (بوصفها "# القيمة"). تسمح هذه الميزة لتحديث سهلة أو إزالة تلك متواليات من التحليل.
    2. فتح أوميغا كلوستال48 أو49 كاليجن البرمجيات عن طريق الذهاب إلى 50،الموقع51، أو استخدام برامج أخرى المفضل لتسلسل المحاذاة. نسخ ولصق قائمة تسلسل فاستا وإدخال ذلك في المربع الموجود أسفل "تسلسل في أي تنسيق معتمد". تغيير "الفجوة عقوبة مفتوحة" إلى 30 تحت "خيارات إضافية" في كالين (هذا غير ممكن في أوميغا كلوستال)، ولكن خلاف ذلك الاحتفاظ بالإعدادات الافتراضية قبل النقر فوق "إرسال".
    3. تحليل تسلسل المحاذاة باستخدام البرمجيات53 52،جالفيو مباشرة ضمن برامج الإنترنت أوميغا كلوستال وكالين بتحديد علامة التبويب "النتيجة الموجزة" أعلاه المحاذاة ثم النقر فوق الرمز "جالفيو".
      ملاحظة: إذا فضلت، أو لتحليل تسلسل التحالفات التي تم إنشاؤها بواسطة برامج بديلة، تحميل 54 البرمجيات بشكل منفصل ونسخ ولصق المحاذاة في إطار التحليل، الذي يتم فتحه بواسطة النقر فوق "ملف"، "محاذاة الإدخال"، و " من مربع نص ". وهذا يوفر وسيلة سهولة تحديد ما إذا كان تسلسل توافق آراء الحالية في محاذاة تسلسل الإدخال.
  3. مقارنة تقارب ملزم وخصوصية استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. تلقيح 5 مل رطل سم25 تستكمل مع 0.2% w/v د-الجلوكوز مع كل عزل الفردية للفائدة (من الخطوة 3.1.4 و/أو المستعمرات من الفائدة من إجراء مزيد من التحليل التسلسل في المقطع 3.2، إلخ) وعنصر تحكم سلبية مناسب (عرض سقالة فقط أو ببتيد التي لا تربط الهدف، كما هو مبين في المذكرة لخطوة 2، 13). تنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، تهز 225 لفة في الدقيقة.
    2. استخدام الثقافات بين عشية وضحاها لتطعيم 3 مل رطل سم25 مع 60 ميليلتر الخلايا (01:50 إضعاف). احتضان عند 37 درجة مئوية مع الهز 225 لفة في الدقيقة حتى تصل إلى الثقافة التطوير التنظيمي600 0.5-0.55. حمل التعبير الببتيد مع 0.04% w/v L-أرابينوز بالإضافة إلى 2 مم يدتا (لتسهيل عرض الببتيد 42)، تهز 225 لفة في الدقيقة لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    3. مكان فعل الثقافات على الجليد. لكل عزل، إضافة 5 ميليلتر الخلايا إلى 25 ميليلتر برنامج تلفزيوني وحدها، أو التي تحتوي على برنامج تلفزيوني: 150 نانومتر يبيت 12،13 (المراقبة الإيجابية للتعبير)، وإذا كانت متاحة؛ 250 نانومتر المستهدفة-488؛ 250 نانومتر تحسن Protein(s)-488؛ و 250 نانومتر سابي (انظر 2.1 لمزيد من التفاصيل). تبني على الجليد لمدة 45 دقيقة.
    4. خلايا أجهزة الطرد المركزي في 6,000 س ز لمدة 5 دقائق في الرايت أو 4 درجات مئوية. بعناية إزالة المادة طافية بالرسم السائل من الجانب المعاكس لبيليه. تخزين حبيبات الخلية على الجليد حتى جميع العينات ونحن على استعداد لتحليل.
    5. ريسوسبيند بيليه كل خلية في 500 ميليلتر الجليد الباردة نظام مراقبة الأصول الميدانية تشغيل المخزن المؤقت، وخلط جيدا من قبل بيبيتينج والتحريك الأنبوب، قبل قراءة باستخدام سيتوميتير تدفق (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: انظر الخطوة 2.13 تلاحظ مزيدا من الإيضاح النابضة وحساب نمفي مقارنة تقارب ملزم وخصوصية. يمكن الآن إزالة عدم موثقات أو موثقات غير محددة من مزيد من التحليل، وينبغي إعادة تقييم موثقات تقارب أعلى بمحاذاة تسلسل الجزء 3.2 للبحث عن زيادة الاتجاهات التي قد ضاعت في الأولى التسلسل التالي السكان. أقسام 3.2 و 3.3 قد تتكرر حسب الحاجة في اتجاهات جديدة ويلاحظ تسلسل إلى توافق في الآراء. يمكن أن يتضمن هذا التحليل تسلسل عشوائي أكثر إذا لم ينظر إلى الاتجاهات.

Representative Results

باستخدام الخلية المغناطيسية تنشيط الآلي الفرز (أوتومكس) بدلاً من الفرز اليدوي الخلية المغناطيسية، هي المرشحين سلبية زائفة انخفضت انخفاضا كبيرا خلال بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات 9،14. خطوات الفرز السلبية يمكن أن يكون أيضا إضافة حسب الحاجة إلى تقليل موثقات غير محددة الهدف لمصلحة، ويقترح كحد أدنى لإضافة نوع سلبي ضد المغناطيسي الخرز أنفسهم مقدما. اكتمل هذا الانتقاء السلبي ضد الخرز المغناطيسي أنفسهم قبل أربع جولات من بيوبانينج المختار البكتيرية عرض مكتبة موثقات مستضد واقية (السلطة الفلسطينية)، كما هو مبين في الشكل 2، وقبل اختيار سلبية إضافية ضد ريف وأربع جولات من التحديد الإيجابي لعابر، كما هو مبين في الشكل 3. يتم مترافق الخرز المستخدمة هنا إلى ستريبتافيدين للقبض على بيوتينيلاتيد والبروتينات، حيث العزلة غير مقصودة من الببتيدات الملزم ل streptavidin نفسه هو مصدر قلق، ورصد استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية مع مترافق ستريبتافيدين إلى فيكوريثرين (رقم 3 ، ساب). كحد أدنى، ينبغي اختبار الربط إلى ستريبتافيدين لأي من المرشحين الأفراد واعدة عند تقييم ملزمة للبروتين الهدف. ينبغي أن تكون ملزمة المئة ونمفي لسابي قيم منخفضة في جميع جولات الفرز. يمكن زيادة مستوى الربط إلى ستريبتافيدين إلى حد ما مع كل جولة الفرز، كما حدث في الشكل 3، نظراً لأن السكان يتعرض مرارا وتكرارا الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين بعد كل جولة الفرز. إذا كان مستوى الربط streptavidin الخلفية يصبح مشكلة لتحليل المتلقين للمعلومات، كذلك فرز السلبية ضد الخرز المغناطيسي يمكن أن يقوم عقب الجولة الفرز الإيجابي الذي ازداد عدد السكان ملزمة ستريبتافيدين في من أجل الحد من فحص المتلقين للمعلومات المغلوطة. عندما تتوفر البروتينات أو المواد التي على وجه التحديد يمكن أن تتداخل مع استخدام المتلقين للمعلومات من الببتيد لتطبيق معين، أو التي من المتوقع أن كروسريكت مع الكواشف النسب المستهدفة بسبب هيكلية و/أو تسلسل تشابه، كذلك السلبية الفرز ضد هذا البروتين أو المواد المستحسن. على سبيل مثال يتم فرز السلبية ضد ريف قبل عزلة الببتيدات ملزمة عابر، بسبب الهيكلية التشابه والتماثل تسلسل هذه البروتينات هما 1،15. مرة أخرى، تحسن ملزمة للبروتينات المستخدمة للسلبية الفرز الخطوات يمكن رصدها أثناء تحليل الفرز جولات باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية (الشكل 3، وريف-488). في أحسن الأحوال، منخفضة نسبة الربط ونمفي، كما هو الحال في هذا المثال.

عندما تكون متاحة، ببتيد السيطرة إيجابية ثابتة، مثل الببتيد P2X في ج-محطة سقالة عرض تنتجها المكتبة عرض البكتيريا المستخدمة في نتائج الممثل هنا، يمكن أن تساعد في تحديد ما إذا كان الافتقار إلى ملزمة تقارب في تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية بسبب الافتقار إلى التعبير عن العرض سقالة نفسها، بدلاً من عدم وجود تقارب peptide(s) للهدف. في الشكل 2 و الرقم 3، مني يبيت ملزمة لهذا P2X الببتيد هو رصد ويوضح أن جولات المبكر لفرز يعربون عن السقالة سيئة. ومن المرجح غالباً بسبب تردد عال من stop codons في الببتيدات الطرفي ن في مكتبة عشوائي، مما يعني أن سقالة نفسها لم تنتج. تأثيرات أخرى قد تساهم بالإضافة إلى ذلك، مثل وجود الببتيدات مع التأثيرات السمية غير متوقع إلى كولاي، أو انخفاض معدلات النمو أو الببتيد في عرض لأسباب أخرى (مثل الطفرات في الجينوم البكتيري). إضافة يدتا خلال الاستقراء قد يحسن التعبير خلال هذه الجولات المبكرة لفرز 42، ولكن لم يتم اختباره بعد. الربط إلى مني يبيت في كل بيوبانينج السكان هو تحسن كبير بجولة 3. مقارنة الرقم 2 الرقم 3، من الواضح أيضا أنه يمكن تحسين مستوى التعبير عن طريق زيادة الوقت التعريفي إلى 90 دقيقة (كما هو الحال في الشكل 2، ومنى يبيت) بدلاً من 45 دقيقة (كما هو الحال في الشكل 3، مني يبيت)، ورغم أن 45 دقيقة كافية عادة. لاحظ أن نمفي لمنى يبيت هو تطبيع إلى مستوى الخلايا المراقبة السلبية، ملزمة مني يبيت حتى القيم قرب 1.0 نموذجية إذا كان مستوى التعبير مقبولة. تطبيع يبيت مني مؤسسة مونتانيار لمؤسسة مونتانيار وحدها برنامج تلفزيوني من نفس العينة هو أيضا وسيلة صالحة لمقارنة مستويات التعبير النسبي، ولكن يعطي الكثير من القيم العليا (مقارنة الرقم 2 و الرقم 3 مع نتائج من سركيس وآخرون. 2015 15).

ويتحقق إثراء المكتبة الببتيدات ملزمة محددة الهدف لمصلحة عادة ضمن ثلاث جولات الفرز إيجابية، ولكن استمرار جولة رابعة من الفرز يمكن أن تكون مفيدة، كما هو مبين في الشكل 2 و رقم 3 . هنا، في المئة ربط الخلايا ونمفي سيستمر في الزيادة من جولة من 3 4 لكل مثال على الأهداف والسلطة الفلسطينية وعابر، التي هي محاصر باللون الأحمر في الشكل 2 جولة و الرقم 3، على التوالي. قد تكون موجودة في جولة 3 تسلسل الببتيد تقارب أعلى لكن من المرجح أن زيادة إثراء في جولة 4 أيضا، مما يساعد في أسفل-انتقاء المرشحين المحتملين 14. تحليل تسلسل من 4 جولة يميل إلى تكشف عن تسلسلات مكررة، وتكرار تسلسل نقطة انطلاق ممتازة لتقارب وخصوصية تحديد تسلسل التحليل وتوافق الآراء. الماكرو eCPX_Sequencing المقدمة كملحق لهذه المخطوطة يساعد على تبسيط هذا التحليل الأولى، كما هو مبين في الشكل 4. بداية مع مجلد.seq أو ملفات نصية، وتسلسل الحمض النووي التي تقع بين المختار 5 '3' تسلسل ترجمة، تنظمها تسلسل الأحماض الأمينية، وتحليل لعدد من مخلفات الأحماض الأمينية الفردية في كل الببتيد. قائمة مفروزة من تسلسلات الببتيد معزولة، كما هو موضح في الصورة ورقة "جدول ملخص" في الشكل 4، يمكن بسهولة تحديد أي تسلسل تكرار وما تردد. ويرد الخلايا في جدول البيانات التي تحتوي على تسلسلات مكررة بألوان مختلفة لتحليل أسهل. من المستحسن للتحقق من هذه تسلسلات مكررة لتسلسل الآراء والاتجاهات الأخرى. هذا هو مساعدة تسلسل المحاذاة البرمجيات مثل كالين واوميغا كلوستال، ويمكن إجراء تحليل على إخراج تسلسل بأكمله (بما في ذلك تسلسل مكرر وغير مكرر في تواتر ويبدو أنهم) وعلى قائمة مختارة لأسفل تكرار تسلسل (مع أو بدون تواترها النسبي). يتم إظهار النتائج ممثلة للسلطة الفلسطينية وعابر تكرار تسلسل، دون أخذ التردد في الاعتبار، في الشكل 5A و 5B، على التوالي. لاحظ أن في الشكل 5A تسطير لهدف السلطة الفلسطينية، العديد من التسلسلات المكررة الفردية نفسها تحتوي على تسلسل توافق وفكفتك (أو تسلسل مماثلة)، في الحمراء، والتي تم تحديدها بواسطة تطبيق تحليل البرامج جالفيو كالين تسلسل محاذاة تسلسلات مكررة. هذا التوافق في الآراء، وكسكفتك، كان سابقا مصممة على توافق آراء السلطة الفلسطينية ملزمة، الذي يوفر الثقة في أسلوب فرز 9. في الشكل 5 (ب)، حيث تم تحليل تسلسلات مكررة لعابر للهدف بنفس الطريقة، وكانت النتيجة مختلفة تماما. أولاً، كانت هناك فقط خمسة تسلسلات التي تتكرر في الجولة 4 من بيوبانينج موثقات عابر، بدلاً من تسلسلات مكررة خمسة عشر معزولة عن الجولة 4 من بيوبانينج للسلطة الفلسطينية موثقات (على الرغم من أن 44% أكثر المستعمرات كانت متسلسلة أيضا للسلطة الفلسطينية). ثانيا، لم يتضمن أي من تسلسلات مكررة خمسة تسلسل الواعدة "توافق الآراء" (فواوف، وأكد في الأرجواني)، على الرغم من أن المرشح AX-A15 الواردة التسلسل الذي أفضل مطابقة (فودتوف). مزيد من التحليل، بما في ذلك قرار ملزم تقارب وخصوصية، ساعدت في توفير توافق آراء فودتوف العزم من المرشحين الخمسة العليا لربط عابر في الشكل 5، كما هو موضح أدناه.

يمكن تحليل مستعمرة ممثل من كل تسلسل مكرر كذلك لتقارب في الخلية وخصوصية استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، كما هو الحال في الشكل 6A لتسلسلات مكررة من بيوبانينج لعابر ربط الببتيدات. هنا أنه من الواضح أن جميع تسلسلات مكررة خمسة تقارب أعلى لعابر، الهدف المقصود، من ريف، البروتين هيكلياً مشابهة تستخدم لفرز السلبية، أو ستريبتافيدين، وحاضراً أثناء عملية الفرز بسبب الخرز المغناطيسية المستخدمة بيوبانينج. وهذا يتسق مع النتائج المبشرة بالخير فعلا لتقارب وخصوصية جولات الفرز هو موضح في الشكل 3، حيث من الواضح أن الإثراء لربط الهدف المقصود، عابر، يتزايد مع كل جولة من بيوبانينج بينما ألفه للبروتين مماثلة، ريف، لا. ومع ذلك، لم تحدد تسلسل توافق مرض للفرز عابر باستخدام تكرار تسلسل من جولة 4 وحدها (الشكل 5B والمناقشة أعلاه). تعود إلى المستعمرات التسلسل 100 من جولة 4، ومع ذلك، لوحظ بالعين عند البحث عن تسلسل مماثلة إلى أفضل تطابق من توافق الآراء الذي توقع أن مرشح إضافي واحد، AX-A12، يتضمن التسلسل فودتوف الذي لوحظ في عزل AX-A15 ، وأن مرشح آخر، AX-A14، يتضمن مماثلة التسلسل، دونتوف. هذه وغيرها تسلسل الذي يتضمن أوجه التشابه إلى تسلسل مكرر، أظهرت أوجه التشابه الأخرى تسلسلات غير مكرر أو تم اختيارها عشوائياً، حللت بنظام مراقبة الأصول الميدانية لملزمة تقارب وخصوصية. تلك التي اختبرت في المرتبة في سركيس et al. عام 2016 1 وموثقات 5 أعلى من هذا التحليل يبين الشكل 6B، مع تسلسل توافق مصممة على أن تكون فودتوف، هو مبين في الشكل 5.

وكشف تحليل مماثل ملزمة تقارب لتكرار تسلسل الببتيد في الجولة 4 من بيوبانينج الببتيدات التي تعترف بهدف السلطة الفلسطينية أن موثقات أفضل، كما في المرتبة بالنسبة للسلطة الفلسطينية-488 nMFI:SAPE نمفي، يتضمن توافق الآراء وكسكفتك أو مماثلة تسلسل (الجدول 1). استخدام هذه النسبة، نظمت التسلسل ذاتيا إلى تلك الواردة توافق الآراء وتلك التي لم. تسلسلات المتصلة بتوافق الآراء، تم تحليل المرشحين الأعلى، والتي تحتوي على جميع المثل إلى الأساليب المذكورة أعلاه لعابر في الشكل 6، كما عرضت في سركيس et al. عام 2015 14. وتبين هذه النتائج أن تحليل الببتيدات مع تكرار تسلسل لبعض الأهداف، قد تكون كافية للحصول على اضبارة مع تقارب كبير وخصوصية لهدف الذي تم اختياره، وتحديد تسلسل آراء التي قد تكون، في حد ذاتها، كافية للربط. نلاحظ، مع ذلك، أن عدد تكرار لا تعكس بالضرورة تقارب ملزم النسبية لهدف الفائدة (الجدول 1). عند تحليل تكرار تسلسل وحدها ليست كافية لتحديد نمط، يكون من المفيد أن التناوب بين تحليل تسلسل وتحليل ملزمة تضييق قائمة المرشحين وتعيد النظر في الاتجاهات بين هؤلاء المرشحين مع تقارب أعلى . حتى عندما يلاحظ اتجاها من تحليل تسلسل مكرر وحدها، قد تثبت إضافية تسلسلات غير مكرر نفس الاتجاهات، أو اتجاهات أخرى، على إجراء مزيد من التحقيقات.

Figure 1
رقم 1: التخطيطي لبروتوكول بيوبانينج للمكتبات عرض البكتيرية. كما هو موضح هنا، بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات عملية دورية. (انظر الجدول للمواد) يحتوي على كل خلية في مكتبة عرض البكتيريا بلازميد الحمض النووي التي يتم الاحتفاظ بها ما دامت الخلايا وتزرع في حضور المضادات الحيوية الذي يحتوي بلازميد جينات مقاومة (تشولورامفينيكول في هذه الحالة). كل بلازميد أيضا يشفر بروتين سقالة عرض الذي يكشف عن ببتيد عشوائي على السطح الخارجي للخلية. إذ ينبغي إلا تحتوي كل خلية على تسلسل الحمض النووي بلازميد واحد، ينبغي عرض كل خلية فقط ببتيد واحد، في مواقع متعددة في جميع أنحاء غشاء الخلية. اعتماداً على مستوى التنوع مكتبة في بداية بيوبانينج، وبعد كل جولة الفرز، تسلسل الحمض النووي قد تكون أو لا تكون فريدة من نوعها من خلية إلى خلية. بيوبانينج تبدأ بالنمو واستحثاث مكتبة الخلية لعرض الببتيدات الفردية على على الغشاء الخارجي. ثم يمكن أن تتفاعل هذه الببتيدات مع بروتين مستهدفة (وهو بيوتينيلاتيد أو خلاف ذلك معلم لالتقاط). للمغناطيسية تنشيط الخلية الفرز (MCS)، تتم إزالة البروتين غير منضم وهي المحتضنة الخلايا مع الخرز المغناطيسية التي هي مغلفة بروتين التقاط (ستريبتافيدين في هذا المثال، التي قد تفاعل القوى مع البيوتين). ثم تتعرض ثقافة كاملة لمغناطيس لفصل الخلايا منضم من الخلايا غير منضم. استخدام جهاز فرز الآلي مغناطيسي المفضل لفصل الخلايا الحد من إيجابيات كاذبة. يتضح هنا هو نوع إيجابية، التي يتم الاحتفاظ بالخلايا التي ترتبط والوت يشترك مع الخرز المغناطيسية. لفرز سلبية، التي نقوم عادة مقدما، هو العملية نفسه إلا أن الخلايا التي يتم غسلها الخروج من الخرز المغناطيسي يتم الاحتفاظ بدلاً من ذلك. نمت بين عشية وضحاها الكسر المكتبة للفائدة، ملزمة (فرز إيجابية) أو غير منضم (فرز السلبية)، والمستخدمة في الجولة المقبلة للفرز. ويتطلب كل جولة لاحقة من بيوبانينج إيجابية انخفاضا في تركيز وحبه وحدة التخزين الهدف لتحسين التقشف. بعد كل جولة من بيوبانينج، تقييم تقارب وخصوصية من الببتيدات للبروتين للهدف باستخدام خلية تنشيط fluorescence الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) للمساعدة على تحديد متى يتم التوقف عن بيوبانينج وبدء التحقيق في المرشحين الأفراد. حسب الحاجة، يتم إجراء تسلسل الحمض النووي وتحليل تسلسل الببتيد. قد تكون هذه الخطوات التحليل في حد ذاتها عملية دورية، وخاصة بالنسبة للكشف عن الاتجاهات في يعزل فردية بعد الجولة الأخيرة من بيوبانينج. عند هذه النقطة، ترتبط الببتيد تسلسل الاتجاهات و/أو توافق في الآراء مع ملزمة تقارب وخصوصية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: بيانات المثال لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لفرز جولات: السلطة الفلسطينية المستهدفة. ويرد ملزمة تقارب حسبما يقرره نظام مراقبة الأصول الميدانية بعد 4 جولات من بيوبانينج (فرز إيجابي) البكتيريا المختار عرض مكتبة الببتيدات ملزم بالهدف، مستضد واقية (السلطة الفلسطينية). وأجرى هذا بعد أول تنفيذ فرز سلبية ضد الخرز المغناطيسي المغلفة ستريبتافيدين. للتقدير الملزم، كانت الناجمين عن الخلايا مع 0.4% L-أرابينوز لمدة 90 دقيقة قبل الحضانة مع الحلول المستهدفة ومراقبة وتحليل حسب الأصول. ربط تحليل النسب للهدف المقصود هو محاصر باللون الأحمر. سيظهر إليك التبعثر مؤامرات فيتك-أ مقابل منتدى التعاون الأمني-A والقيم لنسبة الخلايا ملزمة (بالمقارنة مع سيطرة سلبية بوابات المحتضنة مع برنامج تلفزيوني وحدها) وتطبيع fluorescence متوسط الكثافة (نمفي، بالمقارنة مع التحكم خالية من الببتيد السلبية المحتضنة مع نفس البروتين المسمى fluorophore) من الخلايا المستحثة التي كانت المحتضنة لمدة 45 دقيقة مع: المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني وحدها، 150 نانومتر مني يبيت (مراقبة إيجابية للتعبير الببتيد)، أو 250 نانومتر السلطة الفلسطينية-488 (المسمى المستهدفة). ملاحظة في إثراء المتزايد في ملزمة تقارب لهدف الفائدة بعد كل جولة من بيوبانينج. على النقيض من الشكل 3، أنجزت كل الفواصل خلية أوتومكس باستخدام برنامج بوسيلدس. يمكن أيضا تصور جزء من هذه البيانات في التبعثر مؤامرات مقابل فيتك-ح ح منتدى التعاون الأمني في سركيس et al. عام 2015 14 للمقارنة إلى مقابل فيتك-أ قطع أ منتدى التعاون الأمني هو موضح هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: نموذج البيانات لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لفرز جولات: هدف عابر. وعلى نحو مماثل ل الشكل 2، سيظهر هنا تقارب ملزم النسبية لتجربة بيوبانينج كاملة، كما يحدده نظام مراقبة الأصول الميدانية. عرض البكتيرية المكتبة تعرضت لفرز السلبية ضد الخرز المغناطيسي المغلفة streptavidin، كما هو الحال في الشكل 2، ولكن ثم تعرض لجولة إضافية من الفرز السلبية ضد بروتين مثلى مع بنية مماثلة و دالة، ريف، قبل تنفيذ 4 جولات من بيوبانينج الإيجابية الببتيدات ملزمة للهدف المقصود، عابر. للتقدير الملزم، كانت الناجمين عن الخلايا مع 0.4% L-أرابينوز لمدة 45 دقيقة قبل ربط إلى الهدف ومراقبة إيجابية وعناصر سلبية والقراءة على نظام مراقبة الأصول الميدانية. ملزمة تقارب مع الهدف المقصود هو محاصر باللون الأحمر. سيظهر إليك التبعثر مؤامرات مقابل فيتك-أ منتدى التعاون الأمني-A (أو مقابل PE-أ A-منتدى التعاون الأمني في حالة ساب) وملزمة القيم للخلايا في المائة (مقارنة بمراقبة سلبية بوابات المحتضنة مع برنامج تلفزيوني وحدها) والتي يسببها نمفي من الخلايا التي تم المحتضنة لمدة 45 دقيقة مع : المخزن المؤقت برنامج تلفزيوني وحدها، 150 نانومتر مني يبيت (مراقبة إيجابية للتعبير الببتيد)، 250 نانومتر عابر-488 (البروتين المسمى المستهدفة)، 250 نانومتر ريف-488 (المسمى هدف البروتين تحسن محتمل)، أو 250 نانومتر ساب (مراقبة سلبية للربط المباشر ل المغلفة streptavidin المغناطيسي الخرز). ملاحظة في إثراء المتزايد في تقارب ملزمة لهدف الفائدة، أبراكس، بعد كل جولة من بيوبانينج، وتقارب الحد الأدنى الملزم للبروتين هيكلياً مشابهة، ريفاكس. خلافا الرقم 2، إيجابية بيوبانينج الجولة 1 أجرى باستخدام أوتومكس بوسيلدس البرنامج أثناء الفرز جولات لاحقة أنجزت باستخدام برنامج بوسيلد، كما اقترح بيوبانينج في هذه المخطوطة. يمكن أيضا تصور هذه البيانات في التبعثر مؤامرات مقابل فيتك-ح ح منتدى التعاون الأمني في سركيس et al. عام 2016 15 للمقارنة إلى مقابل فيتك-أ قطع أ منتدى التعاون الأمني هو موضح هنا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تحليل تسلسل المثال الإخراج باستخدام الماكرو "eCPX_Sequencing"- سيظهر هو لقطة مستعمرات متسلسلة 48 من الجولة 4 من بيوبانينج المكتبة عرض البكتيرية المختار للسلطة الفلسطينية موثقات باستخدام الأسلوب بوسيلدس. يتم عرض صفحة "ملخص الجدول" هنا. ملاحظة أن المستعمرات كانت معدودة في الترتيب الأبجدي لاسم الملف المعطى بهم أثناء عملية التسلسل وأن يرد المربعات المحيطة بتسلسلات التي تتكرر مرة واحدة على الأقل بألوان مختلفة لتحليل البيانات أسهل. يتوفر الماكرو eCPX_Sequencing كملف تعليمات برمجية إضافية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تسلسل تحديد المحاذاة وتوافق الآراء لهدفين البروتين متميزة. كل الصور المعروضة هنا تم إنشاؤها باستخدام برنامج جالفيو مع التلوين Clustal_X بعد محاذاة تسلسلات استخدام كالين التحليل على الإنترنت البرمجيات 51. A) المحاذاة لتكرار تسلسل من بيوبانينج السلطة الفلسطينية جولة 4 (يتوافق مع الجدول 1). ب) المحاذاة لتكرار تسلسل من بيوبانينج عابر الجولة 4 (يتوافق مع الشكل 6A). ج) محاذاة أعلى 5 مرشحين من بيوبانينج عابر الجولة 4، كما يحدده تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية للمرشحين الأفراد (يتوافق مع الشكل 6B). الخط الأحمر ويؤكد توافق التسلسل في ألف وجيم، في حين يؤكد الخط الأرجواني في ب تمهيدا لتسلسل توافق مصممة لعابر ملزم عند دراسة تسلسلات مكررة فقط، تسليط الضوء على الإمكانات تحتاج إلى اختبار تقارب ملزم باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية قبل أن يمكن تحديد توافق في آراء في بعض الحالات. يتبين سركيس et al. عام 2015 14 وسركيس et al. عام 2016 1التحالفات المماثلة التي تم إنشاؤها مع برامج التحليل المختلفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: مثال ملزمة تقارب وخصوصية للمرشحين الأفراد تحليلها باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية- يظهر هنا هو تطبيع fluorescence متوسط الكثافة (نمفي) تحدد باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتسلسل A) مكرر وب) أعلى 5 مرشحين، حسبما تقرره تقارب ملزم النسبية للهدف، أبراكس، من جولة 4 من بيوبانينج. وتمثل البيانات متوسط (الحانات) والانحراف المعياري (أشرطة الخطأ) من ثلاث تجارب نسخ متماثل مستقلة. لاحظ أن جميع المرشحين سيظهر محددة تماما لعابر (أشرطة عابر-488، أخضر) على بروتين هيكلياً مشابهة، ريف (أشرطة ريف-488، أحمر)، ومراقبة streptavidin السلبية (ساب، أشرطة سوداء). على الرغم من أن اثنين من تسلسلات مكررة في (AX-07 وفاس-15) كانت أيضا بين المرشحين أعلى 5 في ب، مقارنة النتائج في A و B يوضح أن تحليل تكرار تسلسل وحدة قد لا يكون كافياً لعزل الببتيدات تقارب أعلى. البيانات المعروضة هنا تم تكييفها من سركيس et al. عام 2016 1. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table 1
الجدول 1: نسبة محددة ملزمة لغير محددة ملزمة للأفراد المرشحين تكرار. في هذا المثال، يظهر عدد تكرار تسلسل ونسبة نمفي السلطة الفلسطينية (الهدف) إلى نمفي ساب (المراقبة السلبية) لمتواليات المرشح المكرر من بيوبانينج السلطة الفلسطينية الجولة 4. فرز حسب النسبية نسبة نمفي nMFI:SAPE السلطة الفلسطينية هذه البيانات وتحليلها لوجود توافق الآراء وكسكفتك المعروفة، أو تسلسل مماثلة، وهو يظهر بخط غامق وأكد. لاحظ أن التسلسل تنظيم ذاتي أن هؤلاء المرشحين مع توافق الآراء لديها أعلى نسبة نمفي nMFI:SAPE السلطة الفلسطينية، وذلك التفاعل أكثر تحديداً مع الهدف. أظهرت النتائج من تجربة واحدة من نظام مراقبة الأصول الميدانية. تم استبعاد الببتيدات مع تقارب أدنى للهدف من replicates إضافية والتحليل التي تم نشرها في سركيس et al. عام 2015 14.

ملف سوببليمينتال 1: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

ملف سوببليمينتال 2: اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Discussion

بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات نهجاً ناجحاً لعزل الكواشف تقارب، والببتيدات توفر بديلاً مفيداً للأجسام المضادة للاعتراف عندما تلزم معايير محددة، مثل الاستقرار في البيئات المتطرفة. تم تبسيط بيوبانينج من هذه المكتبات باستخدام الأساليب أوتومكس الموصوفة هنا، ومنصة أوتومكس متاحة تجارياً وتمتد هذه التكنولوجيا إلى جمهور أوسع نطاقا بكثير. بالمقارنة مع التقليدية التناوب MCS/نظام مراقبة الأصول الميدانية عرض أساليب الفرز للبكتيريا المكتبات، وأساليب أوتومكس أقل تكلفة نظراً لأنها لا تتطلب الاستثمار في أداة نظام مراقبة الأصول الميدانية أغلى قادرة على فرز وعزل الخلايا ملزمة، بدلاً من نوع سيتوميتير تدفق المستخدمة هنا، وهو قادر على تحليل 14فقط. وتشمل الخطوات الحاسمة لنجاح بيوبانينج من أوتومكس فصل البرنامج اختيار، السلبية الفرز ضد الصليب كواشف مختبر المحتملة الحد من إيجابيات كاذبة، رصد إثراء المكتبة باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية لتحديد متى يتم إيقاف بيوبانينج، و تحليل الذكية مجموعة المرشحين لتجنب الفحص مرهقة لمئات مرشحين.

تبين الأمثلة الموضحة هنا بيوبانينج نجاح المكتبة عرض البكتيرية المختار لهدفين منفصلين، السلطة الفلسطينية وعابر، على الرغم من أن مع استراتيجيات تحليل مختلف قليلاً بسبب الاختلافات في تسلسل الببتيد لكل تجمع من المرشحين بعد أربع جولات من بيوبانينج. السلطة الفلسطينية الأمر أكثر وضوحاً، مع تحليل تسلسل إظهار اتجاهات واضحة من تسلسل الببتيد التي تتكرر مرة واحدة على الأقل في المستعمرات 144. وكان هذا وحدة ما يكفي لتحديد تسلسل توافق آراء للسلطة الفلسطينية للهدف، وتلك المستعمرات التي توافق الآراء الواردة أو تسلسل مماثلة كانت أفضل المرشحين من حيث نسبة ملزمة للسلطة الفلسطينية مقابل ملزمة لمراقبة سلبية streptavidin. ومع ذلك، هذا لن تكون دائماً القضية. لهدف عابر، تسلسل 100 المستعمرات أدت إلى تسلسلات مكررة خمسة لكن الاتجاه السائد في هذه التسلسلات كان أقل وضوحاً، عدا ميل إلى تحتوي على بقايا الأحماض الأمينية العطرية وحامض الأسبارتيك أو الهليونين. توقع "توافق الآراء" من تسلسلات مكررة فقط يمكن أنتجت واختبرت لتقارب لعابر، ولكننا منذ أية تسلسلات للأصل الوارد هذا التسلسل الدقيق إلى توافق في الآراء، عاد إلى قائمة المستعمرات متسلسلة ولاحظ أن الأخرى المرشحين التي كانت أكثر اتجاهات مشتركة مع بعضها البعض. وفي الواقع، الوارد المستعمرات اثنين تسلسل مماثلة "توافق الآراء" من يكرر وحدها، (فودتوف بدلاً من فواوف)، الذي كان في نفس الاتجاه من بقايا التربتوفان، فينيلالاناين، وحمض الأسبارتيك ولكن مع تباعد مختلفة. وكان من هذه الببتيدات تسلسل مكرر، واحد لم يكن. هذه تسلسلين، جنبا إلى جنب مع تسلسل ثالث يحتوي على متغير مماثلة، كانت من بين الاضبارات أعلى 5 اختبارها من حيث تقارب لعابر. أعلى الموثق العام، A05 AX، كما عرض اتجاهات مماثلة. وتبين النتائج لعابر في بعض الأحيان أن نهج الذي التبديل عدة مرات بين تحليل تسلسل وتحليل النسب وخصوصية المطلوبة، وفقا للهدف الذي تم اختياره. وتبين النتائج لهدف عابر أيضا مستوى الخصوصية التي يمكن أن يتحقق عبر بروتين مشابهة جداً (ريف 1،،15).

وكانت البرامج أوتومكس التي اخترتها لدراساتنا بوسيلدس وبوسيلد، وهما على حد سواء لاختيار الخلايا الهدف المسمى بتردد منخفض، أقل من 5% السكان الأولية إيجابية. وفي كلتا الحالتين، تمرير الخلايا من خلال عمودين المغناطيسية. في حالة البرنامج بوسيلدس، ومع ذلك، الخلايا يمر ببطء أكثر العمود الأول زيادة التعرض الوقت 41. بالإضافة إلى وصف البرنامج المقدمة من الشركة المصنعة للجهاز التجاري أوتومكس (انظر الجدول المواد) 41، وقد تم اختيار هذه البرامج بعد إجراء مقارنة أولية للعديد من البرامج المحتملة. كل برنامج القدرة على تجنب سحب المغلوطة من ثقافة متجانسة من خلايا المراقبة السلبية، وعزل binder معروفة بنجاح إلى هدف لمصلحة من ثقافة مختلطة التي تحتوي على خلايا المراقبة السلبية ارتفعت مع تناقص وتمت مقارنة النسبة المئوية للموثّق المعروفة،. إذا كان الانحراف إلى حد كبير من التطبيقات الموضحة هنا، مقارنة مماثلة قد تكون مفيدة في اختيار البرنامج للتطبيق الجديد. ومع ذلك، سبق نشرها نتائج المقارنة بين هذه البرامج اثنين (بوسيلد وبوسيلدس) لعزل الكواشف تقارب الببتيد للسلطة الفلسطينية أظهرت أن استخدام أي من هذه البرامج لكل أربع جولات من بيوبانينج أدى إلى عزلة الببتيدات مع مماثلة تقارب وخصوصية للسلطة الفلسطينية، وتحديد توافق وكسكفتك. الاختلافات الرئيسية هي أن بوسيلد، بمعدل تدفق أسرع، فرز أكثر سرعة وملزمة تقارب للهدف ولذلك أعلى بعد جولتين اثنتين فقط من بيوبانينج، في حين تستخدم بوسيلدس أدى إلى تسلسل فريد أكثر بعد أربع جولات من بيوبانينج 14. التعلم من هذا، تم تغيير الاستراتيجية قليلاً عند بيوبانينج لعابر الببتيدات ملزمة لإدماج كل الفوائد: بوسيلدس كانت تستخدم للجولة 1 لإتاحة مزيد من الوقت التعرض خلال هذه الخطوة الحاسمة حيث التنوع أعلى، لكن بعد ذلك كان تحول البرنامج إلى بوسيلد للعزلة أسرع من موثقات تقارب أعلى خلال جولات 2-4 1،15. وبدأ هذا أن تكون مثالية لعابر، لا سيما وأن نمفي وربط نسبة كلاهما أعلى بالنسبة لعابر الفرز 4 جولة بالمقارنة مع السلطة الفلسطينية فرز 4 جولة مع البرنامج أما (الشكل 2 و الرقم 3 وسركيس et al. عام 2015 14)، ولكن سيلزم إجراء مقارنة مباشرة باستخدام استراتيجية واحدة مقابل أخرى مع نفس الهدف لمقارنة أكثر حسما. البرنامج الذي هو أفضل لتطبيق معين قد تعتمد على الهدف الفردي والمكتبة الفرز المستخدمة ومستوى التعبير الببتيد الذي يتحقق مع أي تغيير للشروط الموضحة هنا.

لم تناقش هنا النتائج المحتملة من بيوبانينج مع المواد الأحيائية واللااحيائيه، ولكن أيضا أننا استخدمنا نفس المكتبة عرض البكتيرية بيوبانينج ضد مجمع الألومنيوم 2. لم يتم تنفيذ هذه الدراسة باستخدام أوتومكس، ولكن يمكن إنجازه بدراسات مماثلة باستخدام أوتومكس إذا المواد متاحة، أو يمكن المغلفة على أو مترافق بحبه مغناطيسية. في معظم الدراسة الألومنيوم، وتحليل الأحماض الأمينية الفردية ونمذجة هيكل الثانوية كان مفيداً في فهم ما كان يقود تقارب ملزم من الببتيدات المعزولة، ﻷن أي تسلسل توافق العزم 2. حتى مع الأهداف البيولوجية، وهذا قد يكون المطلوبة لفهم ما هو يقود تقارب ملزمة لبعض الأهداف، ولهذا السبب يتضمن جدول البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة الماكرو "eCPX_Sequencing" علامة تبويب مع تحليل التردد بقايا الفردية. إذا تعتبر أية تسلسلات مكررة بالإضافة إلى عدم وجود توافق في الآراء، وبقايا التردد يظهر أي نمط، ومع ذلك، قد تكون أنواع أخرى من التحليل المطلوبة. بالإضافة إلى ذلك، فرز جولات أخرى قد تكون ضرورية لتجنب فحص عدد أكبر بكثير من المرشحين لأسفل-انتقاء أولئك مع تقارب كافية إلى الهدف المنشود.

مع زيادة توافر التسلسل الجيل القادم، يمكن إجراء دراسة أكثر دقة لتحديد المرشحين الأكثر تبشيرا بالنجاح قبل اختبار تقارب وتحديد مدى تخصيب اليورانيوم بعد كل جولة من بيوبانينج. لكن، تسلسل الانتقال إلى الخطوة تحليل ملزمة قد تحتاج إلى إعادة إنشاء بواسطة الاستنساخ، إذا لم تكن تردد عالية بما يكفي لعزل بسهولة مع تسلسل مستعمرة الروتينية لعشرات أو مئات من المستعمرات. كما تقدم هذه التكنولوجيا، أصبحت أقل تكلفة وأكثر روتينية، وخصوصا مع وجود خيار لعزل مستعمرة، من المرجح أن تكون أفضل طريقة لتحليل البيانات بيوبانينج. قد تؤدي إلى توضيح تسلسل الطريقة الفردية، ومكتبة بأكملها، وتتطور. بالإضافة إلى ذلك، قد تتحول البكتيريا في مكتبة الفرز مع مرور الوقت، الذي يمكن أن التحيز فرز نحو الخلايا مع أسرع معدلات النمو أو البكتيريا التي أوفيريكسبريس البروتينات الجينوم قادرة على ربط مادة حتى بدون عرض التعبير سقالة والببتيد، مثيل. ولهذا السبب، وبمجرد ظهور المرشحين الواعدين، أنها تستحق عزل بلازميد الحمض النووي، ريترانسفورمينج الطازجة كولاي، ويؤكد الببتيد الربط عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية. في حالة التخطيط لاستخدام الببتيد في تنسيق الخلية الحرة، ينبغي أيضا تقييم تقارب الببتيد مجاناً. على سبيل المثال، الببتيد تقارب الكواشف اكتشافها من خلال عرض البكتيرية للهدف سيب أنتجت صناعيا خارج الخلية وتم تحليلها بطرق أكثر تقليدية مثل الإنزيم إيمونوسوربانت المرتبط بالانزيم (ELISA)، وفي الخلية (عن طريق نظام مراقبة الأصول الميدانية) وخارج الخلية وقورنت تقارب (عن طريق أليسا) استخدام ال قدك يحدده كلا أساليب 7.

على الرغم من أن يجعل قوة التفاعل streptavidin البيوتين استراتيجية مثالية لالتقاط الهدف البروتين والببتيدات المنضم، يمكن تعديل هذا الإجراء لاستراتيجيات أخرى لالتقاط. نجحت اقتران مباشر من البروتين لحبات مغناطيسية، مثل الإيبوكسي وحمض الكربوكسيلية الخرز، ويزيل خطوة ملزمة. بيد الحجز المباشر قد يعيق إمكانية ربط المواقع بطريقة محددة أو غير محددة، اعتماداً على استراتيجية المرفق. ميزة إضافية لاستخدام الخرز ستريبتافيدين هو أن أهداف أقل بروتين مستقر يمكن أن تكون طازجة بيوتينيلاتيد في 30 دقيقة أو تخزينها مجمدة، إذا لزم الأمر، في حين تميل إلى تتطلب الحضانة أطول مع البروتين العابرة للربط الخرز أنفسهم وهي عموما المخزنة في 2-8 درجة مئوية. تستهدف تركيز البروتين بيوتينيلاتيد انطلاق المقترح هنا، 600 نانومتر، كانت ناجحة بالنسبة لأهداف متعددة، ولكن قد يكون من الممكن عزل الببتيد التقاط الكواشف مع زيادة تقارب إذا قل هذا التركيز. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تمتد إلى هذا الأسلوب وتعديل لمكتبات أخرى عرض البكتيريا والكائنات الحية الأخرى. على سبيل المثال، يمكن إجراء هذه الخطوات في غياب الأكسجين للاستخدام مع اللاهوائيات، أو في بيئات أخرى للاستخدام مع استخداماتها لعزل الببتيدات مع خصائص فريدة من نوعها. الببتيدات و/أو توافق الآراء مصممة لهدف محدد من الفائدة يمكن أن يحتمل أن تستخدم في الخلية كالعيش المادي، أو المنتجة صناعيا خارج الخلية. يمكن أن يكون كذلك نضجت الببتيدات المنتجة صناعيا لتطوير تقارب أكبر وأقوى عوامل التقاط حفزت البروتين (PCC) للاستخدام في أجهزة الاستشعار، أو لتطبيقات أخرى حيث عادة ما تستخدم الأجسام المضادة للربط أو الاعتراف 38،55. يمكن أيضا استخدام النمذجة الجزيئية للمساعدة في تحديد ملزم موقع الببتيد مع هدفه، كما أنجز مؤخرا الببتيدات ملزمة عابر وتوافق الآراء المذكورة في الشكل 5 1. عموما، بيوبانينج عرض البكتيرية المكتبات الكاشفات تقارب الببتيد بديل سريعة وواضحة وقوية لإنتاج أجسام مضادة للتعرف والكشف عن أهداف البروتين، وهذا بيوبانينج شبه الآلي النهج أسفر عن نتائج موثوق بها مع الآن الوصول إلى التطبيقات.

Disclosures

الكتاب لا تمت بصلة إلى الكشف عن

Acknowledgments

الكتاب يود أن ينوه الدعم من "برنامج زمالة ما بعد الدكتوراه في مختبر أبحاث الجيش الأمريكي" (ARL)، يديرها أوك ريدج المرتبطين بها الجامعات من خلال عقد مع ARL، من خلال تعيين الدكتور جوستين ص جانك. وقدم المتبقية التمويل من أجهزة الاستشعار ومديرية أجهزة إلكترون في ARL. الكتاب أيضا يود أن يشكر "المختبر دوتري" في UCSB لتقاسم العرض البكتيرية المكتبة والمعلومات لاستنساخ الكاشف مني يبيت، الدكتور برين آدامز لتقديم الدعم في مجال الاستنساخ الكاشف مني يبيت في ARL، الدكتور جوشوا كوجوت لعمله الأولى في و التدريب في بيوبانينج البكتيرية عرض المكتبات، الهدوء إلينا "اجوود الكيميائية" والبيولوجية في مركز لتقاسم والبلازميدات المستخدمة للتعبير عن وتنقية أبراكس والبروتينات ريفاكس، براندي دورسي للدعم التقني لعزل السلطة الفلسطينية ملزمة الببتيدات، "قو تشين" الحصول على الدعم الفني من تجارب أولية لعزل الببتيدات ملزمة أبراكس، والدكتور تيريل جيسيكا لإجراء مناقشات مفيدة بشأن هذه المخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sarkes, D. A., Hurley, M. M., Stratis-Cullum, D. N. Unraveling the Roots of Selectivity of Peptide Affinity Reagents for Structurally Similar Ribosomal Inactivating Protein Derivatives. Molecules. 21, (11), 1504 (2016).
  2. Adams, B. L., Finch, A. S., Hurley, M. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N. Genetically Engineered Peptides for Inorganics: Study of an Unconstrained Bacterial Display Technology and Bulk Aluminum Alloy. Adv. Mater. 25, (33), 4585-4591 (2013).
  3. Bessette, P. H., Rice, J. J., Daugherty, P. S. Rapid isolation of high-affinity protein binding peptides using bacterial display. Protein Eng. Des. Sel. 17, (10), 731-739 (2004).
  4. Daugherty, P. S. Protein engineering with bacterial display. Curr. Opin. Struct. Biol. 17, (4), 474-480 (2007).
  5. Getz, J. A., Schoep, T. D., Daugherty, P. S. Peptide Discovery Using Bacterial Display and Flow Cytometry. Methods Enzymol. 503, 75 (2012).
  6. Kenrick, S. A., Daugherty, P. S. Bacterial display enables efficient and quantitative peptide affinity maturation. Protein Eng. Des. Sel. 23, 9-17 (2010).
  7. Kogot, J. M., et al. Screening and characterization of anti-SEB peptides using a bacterial display library and microfluidic magnetic sorting. J. Mol. Recognit. 27, (12), 739-745 (2014).
  8. Kogot, J. M., Pennington, J. M., Sarkes, D. A., Stratis-Cullum, D. N., Pellegrino, P. M. Population Enrichment and Isolation with Magnetic Sorting, DTIC Document No. ARL-TN-0452. Report No. ARL-TN-0452. US Army Research Laboratory, Sensors and Electron Devices Directorate. Adelphi, MD. (2011).
  9. Kogot, J. M. Screening of peptide libraries against protective antigen of Bacillus anthracis in a disposable microfluidic cartridge. PLOS ONE. 6, (11), e26925 (2011).
  10. Little, L. E., Dane, K. Y., Daugherty, P. S., Healy, K. E., Schaffer, D. V. Exploiting bacterial peptide display technology to engineer biomaterials for neural stem cell culture. Biomaterials. 32, (6), 1484-1494 (2011).
  11. Pennington, J. M., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Pellegrino, P. M., Stratis-Cullum, D. N. Isolation and characterization of anti-SEB peptides using magnetic sorting and bacterial peptide display library technology. SPIE Defense, Security, and Sensing. 83581Z-1-83581Z-6 International Society for Optics and Photonics. (2012).
  12. Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Eng. Des. Sel. 21, (7), 435-442 (2008).
  13. Rice, J. J., Schohn, A., Bessette, P. H., Boulware, K. T., Daugherty, P. S. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Sci. 15, (4), 825-836 (2006).
  14. Sarkes, D. A., Dorsey, B. L., Finch, A. S., Stratis-Cullum, D. N. Method for Discovery of Peptide Reagents Using a Commercial Magnetic Separation Platform and Bacterial Cell Surface Display Technology. J. Anal. Bioanal. Tech. 6, (4), 1 (2015).
  15. Sarkes, D. A. Rapid discovery of peptide capture candidates with demonstrated specificity for structurally similar toxins. SPIE Commercial+ Scientific Sensing and Imaging. 986305-1-986305-10 International Society for Optics and Photonics. (2016).
  16. Stratis-Cullum, D., Kogot, J. M., Sarkes, D. A., Val-Addo, I., Pellegrino, P. M. Chapter 30, Bacterial display peptides for use in biosensing applications. On Biomimetics. Pramatarova, L. InTech. 629-642 (2011).
  17. Stratis-Cullum, D. N., Finch, A. S. Current Trends in Ubiquitous Biosensing. J. Anal. Bioanal. Tech. S7, (009), (2013).
  18. Rockberg, J., Löfblom, J., Hjelm, B., Uhlén, M., Ståhl, S. Epitope mapping of antibodies using bacterial surface display. Nature Methods. 5, (12), 1039-1045 (2008).
  19. Francisco, J. A., Campbell, R., Iverson, B. L., Georgiou, G. Production and fluorescence-activated cell sorting of Escherichia coli expressing a functional antibody fragment on the external surface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 90, (22), 10444-10448 (1993).
  20. Georgiou, G. Display of heterologous proteins on the surface of microorganisms: from the screening of combinatorial libraries to live recombinant vaccines. Nat. Biotechnol. 15, (1), 29-34 (1997).
  21. Löfblom, J., Wernérus, H., Ståhl, S. Fine affinity discrimination by normalized fluorescence activated cell sorting in staphylococcal surface display. FEMS Microbiol. Lett. 248, (2), 189-198 (2005).
  22. Kjærgaard, K., Sørensen, J. K., Schembri, M. A., Klemm, P. Sequestration of zinc oxide by fimbrial designer chelators. Appl. Environ. Microbiol. 66, (1), 10-14 (2000).
  23. Kishimoto, J., Fukuma, Y., Mizuno, A., Nemoto, T. K. Identification of the pentapeptide constituting a dominant epitope common to all eukaryotic heat shock protein 90 molecular chaperones. Cell stress & chaperones. 10, (4), 296-311 (2005).
  24. Westerlund-Wikström, B. Peptide display on bacterial flagella: principles and applications. International journal of medical microbiology. 290, (3), 223-230 (2000).
  25. Gaskin, D. J., Starck, K., Turner, N. A., Vulfson, E. N. Phage display combinatorial libraries of short peptides: ligand selection for protein purification. Enzyme Microb. Technol. 28, (9), 766-772 (2001).
  26. Goldman, E. R. Phage-displayed peptides as biosensor reagents. J. Mol. Recognit. 13, (6), 382-387 (2000).
  27. Boder, E. T., Wittrup, K. D. Yeast surface display for screening combinatorial polypeptide libraries. Nat. Biotechnol. 15, (6), 553-557 (1997).
  28. Cherf, G. M., Cochran, J. R. Applications of Yeast Surface Display for Protein Engineering. Yeast Surface Display: Methods, Protocols, and Applications. 155-175 (2015).
  29. London, N., Movshovitz-Attias, D., Schueler-Furman, O. The structural basis of peptide-protein binding strategies. Structure. 18, (2), 188-199 (2010).
  30. Sezonov, G., Joseleau-Petit, D., D'Ari, R. Escherichia coli physiology in Luria-Bertani broth. J. Bacteriol. 189, (23), 8746-8749 (2007).
  31. Jahnke, J. P., Terrell, J. L., Smith, A. M., Cheng, X., Stratis-Cullum, D. N. Influences of Adhesion Variability on the "Living" Dynamics of Filamentous Bacteria in Microfluidic Channels. Molecules. 21, (8), 985 (2016).
  32. Chen, A. Y., et al. Synthesis and patterning of tunable multiscale materials with engineered cells. Nature materials. 13, (5), 515-523 (2014).
  33. Löfblom, J., Frejd, F. Y., Ståhl, S. Non-immunoglobulin based protein scaffolds. Current opinion in biotechnology. 22, (6), 843-848 (2011).
  34. Ladner, R. C., Sato, A. K., Gorzelany, J., de Souza, M. Phage display-derived peptides as therapeutic alternatives to antibodies. Drug Discov. Today. 9, (12), 525-529 (2004).
  35. Pini, A., Falciani, C., Bracci, L. Branched peptides as therapeutics. Current Protein and Peptide Science. 9, (5), 468-477 (2008).
  36. Gongora-Benitez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. Multifaceted roles of disulfide bonds. Peptides as therapeutics. Chemical Reviews. 114, (2), 901-926 (2013).
  37. Coppock, M. B., et al. Peptide-based protein capture agents with high affinity, selectivity, and stability as antibody replacements in biodetection assays. SPIE Sensing Technology+ Applications. 910711-1-910711-6 International Society for Optics and Photonics. (2014).
  38. Coppock, M. B. Protein Catalyzed Capture Agents with Tailored Performance for In Vitro and In Vivo Applications. Peptide Science. (2016).
  39. Bessette, P. H., Hu, X., Soh, H. T., Daugherty, P. S. Microfluidic library screening for mapping antibody epitopes. Anal. Chem. 79, (5), 2174-2178 (2007).
  40. Chao, G. Isolating and engineering human antibodies using yeast surface display. Nat. Protoc. 1, (2), 755-768 (2006).
  41. Miltenyi Biotec GmbH. autoMACS™ Pro Separator User Manual, Version 1.1. Miltenyi Biotec GmbH. Bergisch Gladbach, Germany. (2007).
  42. Henriques, S. T., et al. A novel quantitative kinase assay using bacterial surface display and flow cytometry. PLOS ONE. 8, (11), e80474 (2013).
  43. BD FACSCanto II Operator Course Workbook. Becton, Dickinson and Company. (2007).
  44. BD FACSCanto II Instructions For Use. Becton, Dickinson and Company. (2007).
  45. Chan, L. Y., Yim, E. K., Choo, A. B. Normalized Median Fluorescence: An Alternative Flow Cytometry Analysis Method for Tracking Human Embryonic Stem Cell States During Differentiation. Tissue Eng. Part C Methods. 19, (2), 156-165 (2012).
  46. Genewiz. DNA Sequencing Services. Available from: https://www.genewiz.com/ (2017).
  47. Honegger, A., PluÈckthun, A. Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool. Journal of molecular biology. 309, (3), 657-670 (2001).
  48. Sievers, F., et al. Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal Omega. Mol. Syst. Biol. 7, (1), 539 (2011).
  49. Lassmann, T., Sonnhammer, E. L. Kalign-an accurate and fast multiple sequence alignment algorithm. BMC bioinformatics. 6, (1), 298 (2005).
  50. EMBL-EBI. Clutal Omega. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/ (2017).
  51. EMBL-EBI. Kalign. Available from: http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/kalign/ (2017).
  52. Clamp, M., Cuff, J., Searle, S. M., Barton, G. J. The jalview java alignment editor. Bioinformatics. 20, (3), 426-427 (2004).
  53. Waterhouse, A. M., Procter, J. B., Martin, D. M., Clamp, M., Barton, G. J. Jalview Version 2-a multiple sequence alignment editor and analysis workbench. Bioinformatics. 25, (9), 1189-1191 (2009).
  54. Jalview. Available from: http://www.jalview.org/Download (2017).
  55. Farrow, B., et al. A chemically synthesized capture agent enables the selective, sensitive, and robust electrochemical detection of anthrax protective antigen. ACS Nano. 7, (10), 9452-9460 (2013).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics