結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biochemistry
 

Summary

バイオパニング細菌の表示ライブラリは、抗体に堅牢な代替ペプチド親和性試薬の発見の実績のある手法です。半自動ソーティング法を本書は誤検知の発生を減らすバイオパニングを合理化します。ここでは、思考プロセスと候補者を評価し、下流の解析を最小限に適用される技術を示しています。

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Sarkes, D. A., Jahnke, J. P., Stratis-Cullum, D. N. Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates. J. Vis. Exp. (130), e56061, doi:10.3791/56061 (2017).

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Abstract

バイオパニング細菌表示ライブラリは、生物的・非生物的ターゲットの認識ペプチドの親和性試薬発見のため実績のある手法です。ペプチド親和性試薬は抗体検出と治療法などを含む、類似したアプリケーションの使用できますより堅牢なより多くの極端な環境で実行することができます。興味の蛋白質ターゲットにペプチド捕獲のエージェントの特定の濃縮は、結合を改良し、洗浄ステップ、したがって偽のポジティブなバインダーの発生を減少させる半自動の並べ替え方法を使用して強化されています。半自動並べ替えメソッドは、制約のない細菌ディスプレイ表現ランダム 15 mer ペプチド ライブラリの並べ替えと選別装置商業自動磁気活性化の細胞の使用のためにここに記載されているです。わずかな変更を加えると、これらのメソッドは他に拡張可能なデバイス、その他の並べ替えのライブラリ、および他の生物を自動化します。この作品の主な目的は、包括的な方法論を提供し、分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを解説です。これらの技術は、個々 の候補者の比較、並べ替え中に親和性と特異性を評価するために蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用してセルにバインドの解析と傾向を特定するシーケンスのペプチドの解析とコンセンサス シーケンスの理解と潜在的興味のターゲット特異性と親和性を改善します。

Introduction

バイオパニング親和性試薬発見のため実績のある手法、細菌を表示ライブラリ ペプチド親和性試薬1,2,3,4,5、便利なソース 6,7,8,9,1011,12,13,14 15,16,17,18,19,20,21,22,23 24。同様にバクテリオファージ表示25,26酵母表示27,28ペプチドは細胞表面にさらされている、これらの相互作用がある、生物的・非生物的ターゲットをバインドできます。ペプチッド バックボーンとアミノ酸側鎖29のユニークな特性によって駆動。バクテリオファージの表示と対照をなして、菌自体は自己複製、バインドされたバクテリオファージの溶出と細胞の再感染なし表示に必要なすべての遺伝物質を含んでいます。酵母ディスプレイと対照をなして細菌表示は快速 (約 20 分30)エシェリヒア属大腸菌のダブルタイムのため高速です。結果として得られるペプチド親和性試薬を作り出すことができる様々 なプラットフォーム16,17,26をセンシング用セルをオフ、生活材料表示セル2使用の可能性があります。,31,32. と比較して、特定のターゲットの認識のためのモノクローナル抗体、ペプチドは、はるかに小さくより柔軟なペプチドの表示ライブラリは特定のアミノ酸、システイン33 などを避けるために DNA レベルで簡単に操作できます。.ペプチドがますます治療34,35,36と他の抗体は、検出、再現性のある合成 (セルを容易にするため利用すると通常のアプリケーションの利用) 生産・冷凍37,38せず長期保存や高温にさらされた後でも機能性試薬を提供する他の極限環境でのパフォーマンスの優れたメンテナンス。試薬の保管のためのコールド チェーンを克服する機能は、極端な環境で動作する必要があります特定の関心は、国防省、例えばのです。熱安定性は、従ってこの原稿の例として与えられる選ばれたターゲットを認識し親和性試薬の望ましい機能だった。

最近では、バイオパニング細菌表示ライブラリも簡単で並べ替え (MAC または MCS) メソッド9,14,39半自動磁気活性化細胞を用いて信頼性の高いになりました。これらのメソッドは、磁気活性化細胞 (autoMACS または autoMCS) の楽器を並べ替えを自動市販などのさまざまな利点を持つプラットフォームを並べ替えいくつかの類似を使用して生物学的ターゲットの実証されている (表を参照してください。材料) 1,14,15と使い捨てカートリッジ7,9またはチップ39、貴重な仕様でサンプルを囲むより専門的なデバイスを使用し生物やバイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) またはより高い7毒素。これらの半自動化されたメソッドは、ペプチド材料磁気や磁気ビーズにし (嫌気性菌) などの異なる生物を使用するコーティングもする能力を持っている場合、非生物材料にバインドすることができるの並べ替えに拡張すること、並べ替え成長条件が変更されます。細菌表示ライブラリを並べ替えるだけでなくここで使用される商業 autoMCS 楽器も使用されています一部それ以上の分離に続いて、酵母の表面に表示される人間の単鎖抗体フラグメントの発見の初期の手順について蛍光活性化セルの並べ替え (FACS) 40を使用しています。並べ替えの時間と労力より堅牢かつ再現可能な除去磁気ビーズから非連結の細胞の洗浄手順、偽陽性の削減につながる、少数の必要な並べ替えラウンド中になり、半自動化する主な利点は減少します。複雑なダウン ストリーム分析9,14。商業 autoMCS 楽器の場合は、別のアプリケーションに最適、負事前並べ替え (枯渇) など純度の優先順位付け、最後のサンプル ボリュームを最小限に抑え、増加される複数のプリロード プログラムまたは希少な細胞41の隔離のための感度を減少しています。

この作品の焦点は、市販の autoMCS 装置を用いて細菌表示ライブラリ バイオパニングの方法論を実証して分析し、候補者の結果として得られるプールを最小限に適用される思考プロセスを詳しく説明するには他のアプリケーションへの拡張を容易にするため。ここで使用される表示ライブラリ (材料の表参照) 12,13を含む約 109- 1011ユニークな 15 mer ペプチド細菌外膜タンパク質 OmpX の修正版を介して表示で、できれば無料のペプチドは溶液中の代表が期待されている細胞表面で制約のない性質は合成的に生産。この蛋白質の足場には、C 末端 YPet Mona にバインディングによって式を監視するための肯定的な制御 P2X ペプチドさらに含まれています。ただし、適切な多様性と必要な特定のアプリケーションに必要なその他の特性購入または新規ライブラリでは、このバイオパニング手順をいくつかのマイナーな変更が必要になることがありますは同様に動作をする必要があります。このバイオパニング プロトコルの概略図を図 1に示します。さらに、プロトコルに合わせることができる他の自動磁気並べ替えプラットフォームおよびその他の並べ替えの戦略。正常に、実証されているために必要なより複雑な時間のかかるストリーム分析増加偽陽性14、とはいえベンチトップ磁石手動磁気並べ替えとそれにもかかわらずに代わりのオプションを提供します、autoMCS 手順なしの自動磁気細胞選別装置、使用できます。

Protocol

1. バイオパニング細菌表示ライブラリの使用 autoMCS

注: この autoMCS ベースの並べ替えプロトコルは、前述の14をされているしより徹底した拡張プロトコル新しい「ユーザーの」は本稿では潜在的な説明を含む詳細の補足資料で利用可能な変更があります。AutoMCS デバイスは並べ替えが可能な仕事14Sarkes2015 でプロトコルをソート マニュアルを述べるのでから補足のプロトコルを参照してください。AutoMCS プロトコル提供ここでさらにされている改良された特異性1,15追加負の並べ替え手順を含めるに適応。このバイオパニング プロトコルの概略図を図 1に示します。

  1. 負の磁気ビーズと交差反応する可能性が高いバインダーを削除する並べ替え
    1. 500 mL のルリア スープ ミラー (LB) を含む適切な並べ替えライブラリに表示約 1 × 10 と抗生物質多様な細菌の細胞を接種する (資料の表を参照)。
      注: 使用される細菌の表示ペプチッド ライブラリここ約 10 が含まれています (材料の表参照)9- 1011ユニークなメンバー 8,12 25 μ g/mL クロラムフェニ コール (LB Cm25) を含む LB で栽培します。このプロトコルの残りの部分は、このライブラリを使用することと仮定します。
    2. 文化に達する 0.5 の外径 φ600まで 225 RPM で振とうしながら, 37 ° C で 0.55 -。希釈、4% 在庫 1: 100、37 ° C で 45 分 225 RPM で振とうことによって 0.04 w/v L アラビノースとペプチドの発現を誘導します。
    3. 場所は、氷の上文化を誘発しました。遠心分離機の約 4 ° C で 20 分間 6000 x g で 2 x 10 の11セル上清を除去し、軽く旋回で 1.5 mL の PBS に細胞を再懸濁します。
      注: 1.0 の OD600エシェリヒア属大腸菌の 1 x 10 の9セル/mL に相当します。
      注: は、溶解がボルテックスにかけないでくださいはこのように細胞;225 RPM、4 ° C 手や ≤ で簡単に揺れによって再懸濁します
    4. 細胞を遠心尿管と 6,000 x g 常温 5 分または 4 ° C でのスピンに転送します。上清を除去します。1 mL リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) を含む 0.5% ウシ血清アルブミン (BSA; で細胞ペレットを再懸濁しますPBS-B)。
    5. 1 mL の PBS B と 5 分 ≥5, 000 x g (RT) で遠心分離機で 300 μ L (約 3 × 109ビーズは、材料の表を参照) ストレプトアビジン コーティング ビーズを洗ってください。ベンチ上の磁性粒子の区切りにチューブを置きます。ペレットを避け、上澄みを慎重に取り外します。
    6. 電池プラス上記 PBS B 混合でビーズを再懸濁します。氷で 45 分の場所のサンプルを回転台に 4 ° C で孵化させなさい。
    7. システムを初期化する autoMCS 楽器を入れます。「分離」メニューでは、画面の下部に「今すぐ洗う」を選択して製造元の実行や洗浄バッファー (材料の表を参照) を使用して線を首相、"すすぎ"と"実行"。
    8. プライム PBS b、洗浄バッファーとバッファーの実行している PBS-B を使用して次の手順でシステム。上部ナビゲーションバーから「分離」メニューを選択し、「今すぐ洗う」選択します。「リンス」とプライム新鮮な PBS b でシステムを「実行する」を選択します。
    9. 15 mL の円錐管に潜伏ステップからセルとビーズの混合物を転送します。サンプル スロットにこのチューブを置き、あらかじめ冷蔵 (4 ° C) ラックの正と負の選択のスロットで 15 mL の円錐管を空 (材料の表を参照)。計測器プラットフォームでラックを配置します。
    10. ラックの各サンプルの分離プログラムを割り当てる (5 サンプルまでを 1 つの実行で並べ替えることができます)。各サンプル間と最後のサンプルの後の「リンス」ステップを追加します。細胞分離を開始する「実行」を選択します。十分なバッファーが利用できることを確認して「OK」を選択します。
      注:"Posselds"分離プログラム否定的なソートのためによく動作し、ラウンド 2-4 を並べ替えの最寄りはラウンド 1 と"Posseld"の並べ替えが、これらのプログラムの両方が正常に使用されている肯定的なすべての否定と肯定的な並べ替えラウンド14 ,15および他のプログラムは、特定のアプリケーションのためのより良いかもしれない (「さらに議論).
    11. プログラムが完了したら、ラックを削除し、適切な割合を保持します。ここでは、否定的な種の負の分数 (ビーズなしのセルを含む) を保持します。氷の上を配置します。
    12. そのままの状態で LB Cm25 0.2 %w/v D-グルコースの 1 L を接種するのに否定の種類の割合を使用します。225 RPM で揺れ、37 ° C で一晩成長します。
    13. AutoMCS 楽器をオフする前に製造元の実行および洗浄バッファー (材料の表を参照) を実行し、洗浄バッファーを変更します。選択「今洗う」、そして「すすぎ」と「実行」。完了したら、除染ラインである 70% エタノールを確認する、画面の右上隅に「電源アイコン」を押して「はい」を選択。
    14. システムのシャット ダウンが完了したとき (ボトルは紫になる)、マシンをオフにします。
    15. 次の日は、一晩かけて培養を使用して、冷凍庫で約 1 × 10 株は 15% のグリセロールに対する LB のバイアルあたり11セル。さらに、または代わりに、次の手順でこの文化を使用して: その他否定的な並べ替え (1.2 節) または肯定的な並べ替え (セクション 1.3 より) の最初のラウンド。
  2. 興味の他のターゲットと交差反応する可能性が高いバインダーを削除する並べ替えを負します。
    注: 必要がないさらなる負の並べ替えまたは望まれる場合は、セクション 1.2 をスキップできます。その場合は、セクション 1.3 に進みます。セクション 2 のように FACS によって評価される任意の望ましくないターゲットに残留バインディング: 並べ替えのラウンドの FACS 解析。
    1. 発見されたペプチド1,15バインドも可能性のある類似タンパク質などの特定の蛋白質ターゲットに対して否定的な並べ替えの成長誘導ステップで 1.1.1 - の冷凍ストックをはじめ、1.1.3 を繰り返します1.1.15 のステップやステップ 1.1. 12 (1 x 1011細胞に接種して推定する外径600を使用して) から一晩かけて培養からストレプトアビジン枯渇のライブラリ。
    2. 細胞を遠心尿管と 6,000 x g 常温 5 分または 4 ° C でのスピンに転送します。上清を除去します。1 ml の PBS 600 nM ビオチン化交差反応性蛋白質ターゲットを含む細胞ペレットを再懸濁します。回転プラットフォーム上で 45 分間の 4 ° C で孵化させなさい。
      注: 600 nM は指摘した利益が発生した場合に変更することができます提案された開始の集中。蛋白質ターゲットのビオチン化を実現でき、定量化された試薬を使用して材料の表に示されます。
    3. 一方、(常温) ≥ 5,000 × g で 100 μ L 1 mL の PBS B にストレプトアビジン コーティング ビーズ (約 1 × 109ビーズ) の 5 分間遠心を洗います。ベンチ上の磁性粒子の区切りと慎重に削除清、ペレットを回避にチューブを置きます。
    4. (RT または 4 ° C) 5 分間 6,000 x g でバインド ターゲット細胞を遠心、上清を削除、1 ml の PBS B 細胞ペレットを再懸濁します交差反応性蛋白質ターゲットにバインドされている洗浄セルのボリューム全体にビーズを再懸濁します。4 ° C で 30 分間回転プラットフォームで孵化させなさい。
    5. 氷と完全な手順 1.1.7 - 1.1.15 負の並べ替えは、適切な冷凍庫の在庫を作るためにサンプルを配置します。否定的なソート目的はすべて達成されている場合、肯定的な種のセクション 1.3 または別の潜在的な交差反応性蛋白質に対する否定的な種にセクション 1.2 を繰り返し続けます。
  3. ラウンド 1 肯定的な種
    注: 特定のタンパク質に対して肯定的な並べ替えの 1 ラウンド、ターゲットは特定のソート対象に対して負の並べ替えに似ていますがビードを含む、正の分数が保持されることを除いて (1.2 を参照してください)。
    1. ポンド25多様な細菌の約 1 × 10 の11のセル表示並べ替えライブラリされているまたはストレプトアビジン枯渇をされており、氷の上 (ステップ 1.1. 12) から一晩 (ステップ 1.1.15) から冷凍や解凍を栽培する Cm の 500 mL を接種します。さらに必要に応じて (ステップ 1.2.5) から他の交差反応性タンパク質のターゲットにバインダーの劣化。
    2. 文化に達する 0.5 の外径 φ600まで 225 RPM で振とうしながら, 37 ° C で 0.55 -。希釈、4% 在庫 1: 100、37 ° C で 45 分 225 RPM で振とうことによって 0.04 w/v L アラビノースとペプチドの発現を誘導します。
    3. 場所は、氷の上文化を誘発しました。遠心分離機の約 4 ° C で 20 分間 6,000 x g で 2 x 10 の11セル上清を除去し、そっと渦巻くこと (手や簡単に 225 RPM、4 ° C ≤ で揺れによって) 1.5 mL の PBS に細胞を再懸濁します。
    4. 細胞を遠心尿管と 6,000 x g 常温 5 分または 4 ° C でのスピンに転送します。上清を除去します。
    5. 1 ml の PBS の関心の 600 nM ビオチン化タンパク質ターゲットを含む細胞ペレットを再懸濁します。回転プラットフォーム上で 45 分間の 4 ° C で孵化させなさい。
      注: 600 nM は指摘した利益が発生した場合に変更することができます提案された開始の集中。蛋白質ターゲットのビオチン化を実現でき、定量化された試薬を使用して材料の表に示されます。
    6. 一方、(常温) ≥ 5,000 × g で 100 μ L 1 mL の PBS B にストレプトアビジン コーティング ビーズ (約 1 × 109ビーズ) の 5 分間遠心を洗います。ベンチの上の磁性粒子の区切り記号にチューブを置き、ペレットを避け、上澄みを慎重に取り外します。
    7. ターゲットの孵化が完了したら、RT (4 ° C) 任意の非バインド ターゲット蛋白質を削除する 5 分間 6,000 x g でバインド ターゲット細胞を遠心します。上清を除去し、1 ml の PBS B 細胞ペレットを再懸濁します洗浄細胞蛋白質ターゲットにバインドされているボリューム全体にビーズを再懸濁します。4 ° C で 30 分氷の上の場所のための回転台で孵化させなさい。
    8. システムを初期化する autoMCS 楽器を入れます。[分離] メニューで画面の下部に「今すぐ洗う」を選択して製造元の実行や洗浄バッファー (材料の表を参照) を使用して線を首相、「すすぎ」と「実行」。
    9. プライム PBS b、洗浄バッファーとバッファーの実行している PBS-B を使用して次の手順でシステム。上部ナビゲーション バーから、[分離] メニューを選択し、洗浄今します。プライム新鮮な PBS B とシステムにリンスして実行を選択します。
    10. 15 mL の円錐管、PBS B の追加の 500 μ l でチューブを洗浄とサンプルを洗うをプールに上記の培養ステップからセルとビーズの混合物を転送します。サンプル スロットにこのチューブを置き、あらかじめ冷蔵 (4 ° C) ラックの正と負の選択のスロットで 15 mL の円錐管を空 (材料の表を参照)。計測器プラットフォームでラックを配置します。
    11. ラックの各サンプルの分離プログラムを割り当てる (5 サンプルまでを 1 つの実行で並べ替えることができます)。各サンプル間と最後のサンプルの後の「リンス」ステップを追加します。細胞分離を開始する「実行」を選択します。"OK"または「継続」十分なバッファーが利用できることを確認するを選択します。
      注: 否定的なソートのためによく動作する"Posselds"分離プログラムとラウンド 2-4 を並べ替えの最寄りはラウンド 1 と"Posseld"の並べ替えが、これらのプログラムの両方が正常に使用されている肯定的なすべての否定と肯定的な並べ替えラウンド14,15他のプログラムは、特定のアプリケーションのより良いかもしれない (「さらに議論).
    12. プログラムが完了したら、ラックを削除し、適切な割合を保持します。ここでは、肯定的な種正の分数 (セルとビーズを含む) を保持します。氷の上を配置します。
    13. AutoMCS 楽器をオフする前に製造元の実行および洗浄バッファー (材料の表を参照) を実行し、洗浄バッファーを変更します。選択「今洗う」、そして「すすぎ」と「実行」。完了したら、除染ラインである 70% エタノールを確認する、画面の右上隅に「電源アイコン」を押して「はい」を選択。
    14. システムのシャット ダウンが完了したとき (ボトルは紫になる)、マシンをオフにします。
    15. そのままの状態で LB Cm25 0.2 %w/v D-グルコースの 1 L を接種するのに肯定的な種の割合を使用します。225 RPM で揺れ、37 ° C で一晩成長します。
    16. 次の日、一晩の文化を使用して 15% グリセロールを含む LB 内冷凍庫株式および/または並べ替えセクション 1.4 でラウンド 2 肯定的に続けます。
  4. その後の肯定的な並べ替えラウンド
    注: 通常、4 つの並べ替えラウンドお勧めします、3 回の並べ替えが一般的に十分な14,15。並べ替えるを停止するを援用は並べ替えのラウンドの FACS 解析はセクション 2 で説明します。各後続の肯定的な並べ替えラウンド ターゲットと磁気ビーズ量の濃度が減少します。
    1. 5 mL LB Cm25 100 μ l 細胞を接種する前の並べ替えラウンド (またはそのラウンドから凍結細胞の在庫) から一晩のカルチャを使用して (1:50 希釈)。文化に達する 0.5 の外径 φ600まで 225 RPM で振とうしながら, 37 ° C で 0.55 -。
    2. 0.04 %w/v L アラビノース、37 ° C で 45 分 225 RPM で振とうでペプチドの発現を誘導します。場所は、氷の上の細胞を誘導されます。
      注: この引き起こされた文化は、次項で説明するよう結合親和性と元の並べ替えのラウンドの特異性を評価するために使用もできます。
    3. 遠心分離機の 6,000 x g 常温 5 分または 4 ° C で 1 x 10 の8セル上清を除去し、並べ替えの前のラウンドに使用する利息のビオチン化タンパク質ターゲットの半分の濃度を含む 50 μ L の PBS で細胞ペレットを再懸濁します (したがって 300 nM 第 2 ラウンドの 150 のラウンド 3、75 nM nM ラウンドご提案から 4開始点)。氷の上 (または 4 ° c 回転プラットフォーム) 45 分間インキュベートします。
    4. 一方、ストレプトアビジンをコートしたビーズを洗浄 (15 μ L の 2 ラウンド、8 μ L のラウンド第 4 戦、3、および 4 μ L) 1 mL PBS B と (常温) ≥ 5,000 × g で 5 分間遠心します。ベンチ上の磁性粒子の区切りと慎重に削除清、ペレットを回避にチューブを置きます。50 μ L のビードを再停止しなさい PBS B
    5. 1.4.3 の手順でターゲットと 45 分間インキュベーションは、6,000 x g 常温 5 分または 4 ° C で細胞を遠心分離機後、上清を除去し、1.4.4 からビーズを洗浄 50 μ L で細胞を再懸濁します。氷と手順 1.3.7 - 1.3.13 肯定的な種のためのサンプルを保ちます。
    6. LB Cm25 0.2 %w/v 並べ替えから全体の肯定的なビーズを含む分数の D-グルコースを添加した 5 mL 文化を接種します。
    7. 次の日、冷凍庫の在庫は、15% のグリセロールを含む LB および/またはラウンド次の肯定的な並べ替えを続行する一晩カルチャを使用、1.4.1 の手順に戻って。
      注: 結合親和性と特異性を評価する 1.4.2 から誘導されたカルチャを使用してセクション 2 の下で説明するよう助けることができる並べ替えるを停止するタイミングを決定します。行の 2 つの並べ替えのラウンド表示同様の結合親和性、またはその後のラウンドを示しています関心の対象に対する結合親和性を減少、この望ましい場所の並べ替えを停止します。最終ラウンド後ステップ 1.4.1 へのリターンは、1.4.2 で停止します。

2 ラウンドを並べ替えの FACS 解析

  1. 評価をバインドするためのソリューションを準備、次の各項目を 25 μ l 添加に 5 μ L 誘発細胞を追加並べ替えのラウンド、または同一文化ごとにステップ 1.4.2 から誘導された細胞を使用して (材料の表を参照してください): PBS 単独で;PBS 150 nM YPet モナ (YPet 12,13; 式の肯定的な制御)、可能な場合900 nM 蛋白質ターゲット放出/励起 493 nm⁄518 nm (ターゲット-488); でアミン反応性染料などの蛍光色素の共役900 nM 交差反応性蛋白質ターゲット (Cross-Reactive タンパク質-488); 同じ蛍光色素ラベルの付いた負の並べ替えに使用されます。900 nM ストレプトアビジン-R-フィコエ リスリン (SAPE)。45 分間氷の上を孵化させなさい。
    注: ステップ 1.4.2、このステップは、常にから直接継続される場合ダウン選択ライブラリは一晩育ったのでそのラウンドのバイオパニングが完了した後の日継代し、次の日を誘発しました。成長し、凍結する並べ替えラウンド在庫から同様に誘導される文化も使用できます。その場合は、すべてのラウンドをテストおよび単一の実験で比較が可能します。
  2. 常温 5 分または 4 ° C の 6,000 × g で遠心分離細胞上清を除去し、氷の上のサンプルを格納します。
    注: すべてのサンプルは分析のため準備ができているまで、細胞ペレットは氷に格納できます。
  3. FACS 装置をオンに、スタートアップ、システム ソフトウェアを開き、製造元の指示43,44次の楽器を調整します。
  4. FACS ソフトウェア内で「管理者」をクリックして、目的のフォルダーをクリックしてまたは"新しいフォルダー"を作成「新しい実験」をクリックして画面の左上のアイコン。実験の「名前を変更」アイコンを右クリックしてします。その実験の中で「グローバル ワークシート」をクリックしてします。
  5. 「ドット プロット」アイコンをクリックして、この散布図を作成するグローバル ワークシート ワークシートをクリックします。ドット プロット グラフ自体をクリックし、上部に選択の「監査官」アイコンが画面の左し開いているウィンドウで"Y 軸"と「X 軸」横にあるボックスをオンにして biexponential 表示する軸を調整。X をクリックして biexponential の表示ウィンドウを閉じます。
  6. 作成上部のアイコンをクリックして「新しいチューブ」画面の左、「グローバル ワークシート」の下で標本のアイコンを右クリックし、「名前変更」を選択する適切な情報をもつ試料の名前を変更します。(+) をクリックして試料を展開記号、それからチューブのアイコンをダブルクリックして右、それをクリックして、再度選択"rename"サンプルを記述します。
  7. このドット プロット グラフを使用して、既定 SSC A vs FSC の二重そのチューブをクリックするか、横の矢印を選択するだけで PBS でネガティブ コントロール サンプルを実行します。サンプルを実行する前にちょうど 500 μ L 氷冷 FACS、FACS にバッファーと転送のサンプルを実行するのに細胞ペレットを再懸濁しますチューブ (材料の表を参照)、ピペッティングおよびチューブをフリックによってよく混合します。楽器のサンプル注入管 (SIT) に再懸濁細胞を配置します。プレスを取得の「データ」30,000-50,000 で「表示するイベント」との 10,000 台"イベントにレコード"低流量 (; を開始する必要な場合を高める)、「座る」フラッシュを選択し。
    注: 適切な速度 (低、中、または高) はイベント/秒の数が約 200 と 2000 の間で速度です。 すべてのステップは、この範囲を使用します。
  8. 取得中の「しきい値」タブをクリックしてを選択することによって必要な場合、光電子増倍管 (PMT) 電圧しきい値を調整し、「値」を変更します。PBS だけで否定的な制御の細胞はわずか中央下に落ちるような前方および側面の散布 (FSC と SSC) の電圧を調整します。
    注:「追加」アイコンを使用して、「しきい値」タブで (SSC) などの追加パラメーターを追加できます。 されます通常、約 700 V 1000 v SSC の FSC の PMT 電圧はエシェリヒア属大腸菌のためによく働きます。
  9. サンプルを正しく読んでいる場合、は、200-2000 イベント/秒を表示し、「記録データ」を押しますへ流量を調整します。終了したら記録、正座からチューブを削除し、氷の場所します。 「多角形ゲート」アイコンを選択し、散布図のセル人口大半門を描画するマウスを使用してください。ドット プロット上で右クリックし、「人口の階層を表示」を選択します。
  10. 親としてこの"P1"ゲートを使用するには、人口階層の"P1"をクリックします。次のステップ 2.5 新しいドット プロットを作成します。各軸を右クリックし、FSC A に FITC に y 軸と x 軸を変更ゲート ネガティブ コントロール (PBS だけ) は、人口の上部と左側の側面のまわりでできるだけタイトのゲートで「多角形ゲート」アイコンを使用して。
    注: ダブル人口階層 P1 ゲートが P2 ゲートの親であることを確認するを確認します。そうでない場合 P1 ゲートに沿って表示され、「すべてのイベント」は、親になりますゲートを削除し、次のステップ 2.10 を再作成します。
  11. 人口階層の"P2"、右クリックし、「ゲートを反転」を選択します。P2 ゲートとドット プロット上で右クリックし、「を示す個体群」を選択します。表示する集団"P2"と"ない P2"を選択 (人口の 1% 未満は門の外秋する必要があります)。
  12. P2 ゲートとドット プロットを右クリックし、「統計ビューの作成」を選択します。統計ビュー ウィンドウを右クリックし、「統計ビューの編集」を選択します。「集団」タブをクリックを追加または親人口、P1 を含む必要に応じての集団を削除 (P2、およびない P2 には表示する必要があります既に)。「統計」タブをクリックしてし、"FITC-A 中央"と興味の他の統計情報を追加。Ok ボタンを押してウィンドウを閉じます。
  13. PE A 対 FSC に類似したドット プロット グラフを作成-A と PBS 単独でサンプルを用いたゲート (前のプロットを複製して変更することができます)。このように、それぞれの約 10,000 のイベントを記録 (各蛍光分類されたターゲットと培養陰性対照セルを含む) のすべてのサンプルを実行するのにには、このスプレッドシートを使用します。
    注: セルのターゲット 488 蛋白質、コントロール等がその蛋白質にバインダーと"ない PX"(X はそのグラフのゲートの人口数) の値は、バインド % として記録すべき肯定的な YPet の孵化後ゲート外です。ネガティブ コントロールとして SAPE を使用する場合は、PE A 対 FSC のプロットを使用します。% バインディング、相対的な用語でバインドの範囲を示す以外に情報を与えるし、より堅牢な外れ値45の存在下では、P1 の平均蛍光強度 (MFI) を記録も必要があります。中央の蛍光強度は培養後足場の唯一のマイナス コントロール (付けないの N 末端ペプチド) または、関心の対象をバインドしませんペプチド配列を含むクローンの MFI による各ペプチドの MFI を割ることによって正規化 (nMFI) をすることができます。同じターゲットに対して同じ fluorophore 14共役。これらの否定的な制御の細胞が利用できない場合、未誘導細胞培養を同一のターゲットと同じ蛍光体にラベル付けは正規化の使用もできます。

3. 潜在的な候補者との結合親和性の評価解析

  1. ペプチド配列決定
    1. 選択し、シーケンス数十または何百ものバイオパニングの最終的な隔たりから細菌のコロニー (通常 3 または 4 ラウンドが十分な14)。
    2. シーケンスの分析特に ("Sub eCPX_Sequencing"、コードのサポート情報を参照してください) を開発したマクロ ファイルを使用したデータ分析 15mer 細菌表示ライブラリのテーブルで表示されますバイオパニングから生成される系列材料。材料、または他の好みの互換性のあるソフトウェアの表に表計算ソフトを使用します。
      注: ツールの数、利用可能なオンライン DNA シーケンス解析47にも役立つことができます。優先、シーケンス解析のため別の確立された方法を使用し、3.1.3 の手順に進みます。
      1. シーケンス ファイル (.seq ファイル、テキスト文書も仕事) のセットをダウンロードし、それらを新しいフォルダーに抽出します。必要に応じて、移動または速度の向上のため (ネットワーク フォルダーなど) ではなくコンピューターのハード ドライブにフォルダーをコピーします。
      2. 新しいスプレッドシート ウィンドウを開きます。それらのメッセージがポップアップ表示される場合マクロを有効にして、すべての機能を有効にしてください。
        注: 3-6 以下の手順を実行する必要がありますのみマクロを使用する最初の時間を実行する必要があります。その後の分析では、単に「はマクロの実行」ステップ 7 から始まります。
      3. 「サブ eCPX_Sequencing」ファイルは、マクロの内容全体をコピーします。
        注: 現在のバージョン並ぶ材料の表に記載されている 15 mer ライブラリのシーケンスで構成されて、それらの間のアミノ酸に変換されます。追加のシーケンスは、5' 列 A と 3' まで 10 シーケンスごとに、マクロを実行する前に、スプレッドシートの列 B 内のシーケンスにシーケンスをコピーして入力できます。
      4. 空白のスプレッドシート ファイルの「表示」タブを選択し、「マクロ」をダブルクリックします。Personal.xlb フォルダーを選択します。使用できない場合は、表示する最初のマクロを記録します。
      5. 「ステップに」、かに応じてすることができます強調表示または「作成」をクリックします。マクロ全体をモジュールに貼り付けます。
      6. 保存をクリックしてアイコンまたはファイルへ保存します。モジュールを終了します。ウィンドウがポップアップすると、[ok] を押します。
      7. マクロを実行: desired.seq ファイルがあるフォルダーに移動します。フォルダーの場所を表示するのには上部のフォルダーのアイコンの横にあるバーをクリックします。それをコピーします。
      8. 新しいスプレッドシート ウィンドウに移動します。[表示] タブを選択し、マクロをダブルクリックします。リストから"eCPX_Sequencing"を選択し、「実行」をクリックしてください
      9. ステップ 7 でコピーしたファイルの場所をポップアップに貼り付けボックスで、ヒットを入力してください。シーケンスを通過し、様々 なシート上のテーブルに整理する、マクロが起動します。
      10. それは手動で (場合シーケンスは、"X"が含まれてまたは変換できませんでした) トレース ファイルでエラーを確認し、修正するのに必要があるかどうかは、「テーブルの概要」シートを使用します。
        注:「概要表」翻訳されたペプチド シーケンス、シーケンス エラー禁止翻訳されていなければ (A ~ Z) からアミノ酸配列順を表示します。"X"は、できなかった個々 のアミノ酸を示します。
    3. 一度シーケンスは、編成、変換され、任意のシーケンス エラーを修正、任意の繰り返しシーケンスの「概要表」シートで並べ替えられたペプチッド シーケンス] 一覧を確認します。
    4. 5 mL LB Cm25 225 RPM で揺れ、37 ° c に (繰り返しおよび/または最低限の顕著な動向とペプチドを含む) 興味のシーケンスされたコロニーのための一晩の文化を育てるし、ステップのように、15% のグリセロールを含む LB の冷凍庫株式次の日を保存1.4.7 ペプチド結合親和性のシーケンスを繰り返すのをテストし、FACS で説明する方法を使用して特異性セクション 3.3、最寄りの配置を使用してシーケンスを配置するシーケンスのリスト (完全なリストおよび繰り返しのみ) の FASTA 形式を使用し、。解析プログラム、セクション 3.2 のように。
  2. Clustal オメガ、Kalign は、同様のプログラムを使用して配列アラインメント
    1. マクロの FASTA スプレッドシートから FASTA 形式でシーケンスをコピーまたはそれ以外の場合 (ステップ 3.1.3 など) 整列するシーケンスから FASTA ファイルの一覧を作成します。
      注: 列 A を含む数値順で FASTA ファイル"Seq #"、列 B が「AA シーケンス」「概要表」シートから順に表示されます。ペプチド配列をアミノ酸配列順のリスト (「# 空」) として空のベクターなどどちらも 5' または 3' の検索条件 ("# 値") として発見されたそれらのシーケンスの上部に使用不能シーケンスが表示されます。この機能は、簡単な更新の分析からそれらのシーケンスの削除できます。
    2. ウェブサイト50,51, に行くことによって Clustal オメガ48または Kalign49ソフトウェアを開くかアラインメントの他の好みのソフトウェアを使用します。コピーして FASTA 順序リストを貼り付け、「任意のサポートされている形式でシーケンス」の下のボックスに入力します。30 Kalign は、(これは Clustal オメガで可能ではない) で「詳細オプション」の下に「ギャップ オープン ペナルティ」を変更が、それ以外の場合"submit"をクリックする前に既定の設定を維持します。
    3. 配置上の「結果の概要」タブを選択し「Jalview」アイコンをクリック Clustal オメガと Kalign オンライン ソフトウェア内で直接 Jalview 52,53ソフトウェアを使用して配列アラインメントを分析します。
      注: 優先された場合、または別のプログラムによって生成された配列アラインメントの解析は、 54ソフトウェアを個別にダウンロードし、コピー、「入力の整列」,「ファイル」をクリックして開く [解析] ウィンドウに配置を貼り付けると」テキスト ボックス"。これはコンセンサス配列は入力配列アラインメントに存在かどうかを容易に判断するための手段を提供します。
  3. 結合親和性と FACS を用いた特異性の比較
    1. 5 mL LB Cm25 0.2 %w/v D グルコース興味のそれぞれの個々 の分離株を (ステップ 3.1.4 および/またはセクション 3.2 等でさらにシーケンス分析からの興味の植民地) からと適切なネガティブ コントロール (表示補完を接種します。足場だけまたは 2.13 の注意で説明されているようにターゲットをバインドしませんペプチド)。225 RPM で揺れ、37 ° C で一晩成長します。
    2. 一晩文化を使って、3 mL LB Cm25 60 μ l 細胞を接種する (1:50 希釈)。文化に達する 0.5 の外径 φ600まで 225 RPM で振とうしながら, 37 ° C で 0.55 -。0.04 w/v L アラビノースとペプチドの発現を誘導する 37 ° C で 45 分 225 RPM で振とう用ペプチド ディスプレイ42の円滑化)、2 ミリメートルの EDTA プラス
    3. 場所は、氷の上文化を誘発しました。各分離だけで 25 μ L PBS または PBS を含む 5 μ L のセルを追加: 150 nM YPet 12,13 (式の肯定的な制御)、可能な場合250 nM ターゲット-488;250 nM 交差反応性蛋白-488;250 nM SAPE (詳細については、2.1 を参照してください)。45 分間氷の上を孵化させなさい。
    4. 常温 5 分または 4 ° C の 6,000 × g で遠心分離細胞ペレットの反対側から液体を描画することによって上澄みを慎重に取り外します。すべてのサンプルと分析の準備ができているまで氷の上細胞ペレットを格納します。
    5. 500 μ L 氷冷 FACS 連続したバッファー、ピペッティングおよび流れの cytometer を使用して読書の直前に、チューブにフリックによってよく混合で各細胞ペレットを再懸濁します (材料の表を参照)。
      注: を参照してくださいステップ 2.13 結合親和性と特異性を比較するゲートの詳細な説明と nMFI の計算に注意します。非バインダーまたは非特異的バインダー今さらなる分析から削除して、最高の親和性バインダーは、次のセクションを最初のシーケンスで見落としている傾向さらに探して 3.2 配列アラインメントによる再査定されるべき人口。セクション 3.2 と 3.3 は、新たなトレンドとして必要に応じて繰り返すことができるし、コンセンサス シーケンスが記載されています。傾向が見られない場合、この分析よりランダムなシーケンスを含めることができます。

Representative Results

手動による磁気細胞選別ではなく (autoMCS) を並べ替え自動化された磁気活性化細胞を使って、偽否定的な候補者が細菌表示ライブラリ9,14のバイオパニング中に大幅に削減します。負の並べ替えの手順は追加することもできます興味のターゲットに非特異的バインダーを減らすために必要に応じて、フロントまで彼ら自身をビーズ磁気に対して否定的な並べ替えを追加する、少なくとも勧め。バイオパニング細菌の選択の 4 つのラウンドは、他の否定的な選択の前に、図 2に示すように防御抗原 (PA) バインダーのライブラリを表示する前にこの磁気ビーズ自体に対して負の淘汰が完了しました。rivax と abrax、図 3に示すように正の選択の 4 つのラウンド。ここで使用されるビーズは鎖共役型ビオチン化タンパク質のキャプチャのストレプトアビジン自体ストレプトアビジン結合性ペプチドの分離を意図しない状態で FACS を使用して監視、フィコエ リスリン (図 3 にストレプトアビジン共役 、SAPE)。最低限、ストレプトアビジンへのバインドはターゲット蛋白質を評価する際、有望な個々 の候補者テスト必要があります。パーセント バインディングと SAPE の nMFI の両方は、並べ替えのすべてのラウンドで低値をする必要があります。人口は各並べ替えのラウンドの後、ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズに繰り返し公開されるため、図 3で発生したストレプトアビジンへのバインディングのレベルを幾分各並べ替えのラウンドで増やせます。ストレプトアビジン結合人口が増加した肯定的な並べ替えのラウンドに続いてさらなる負磁気ビーズに対して並べ替えを実行でした背景ストレプトアビジン結合のレベルによって下流の分析に問題が発生する場合偽陽性の下流のスクリーニングを削減するため。ペプチドの特定のアプリケーション用下流を妨害可能性があります具体的にはまたは構造のためのターゲットおよび/または配列の類似性、親和性試薬とは交差反応が見込まれる蛋白質または材料が利用できる場合さらに並べ替え負それに対してタンパク質や素材を推奨します。例としては、構造の類似性とこれら二つの蛋白質1,15の配列相同性のための abrax 結合ペプチドの分離前に rivax に対して否定的な並べ替え。再び、交差反応性蛋白質の負の使用へのバインド並べ替えの手順を監視できます (図 3、Rivax-488) FACS を使用してラウンドを並べ替えの分析中に。最高のケース シナリオではパーセントのバインディングと nMFI は、この例のように、低。

ここでは、代表的な結果に使用される細菌の表示ライブラリによって生成される表示足場の C 末端 P2X ペプチドなどの固定の肯定的な制御ペプチドが FACS アッセイでの結合親和性の欠如は、かどうかを決定するを助けることができる場合は、ディスプレイの表現の不足のため、peptide(s) のターゲットに対する親和性の欠如ではなく足場自体の。図 2図 3YPet モナこの P2X に結合ペプチドは監視され、並べ替えの初期のラウンドが不十分な足場を表現を示します。これは足場自体が生産されなかったことを意味するランダム ライブラリにおける N 末端ペプチドの終止コドンの高周波による主に可能性が高いです。その他の効果はエシェリヒア属大腸菌、予期しない毒性を有するペプチドの存在など、貢献がさらにまたは (バクテリアのゲノムに突然変異) など他の理由のための成長やペプチドの表示率を減少します。誘導中に EDTA の添加42、並べ替えのこれらの早い段階の間に表現を向上させる可能性がありますが、まだテストされていません。各バイオパニング内 YPet モナにバインド人口はラウンド 3 で大幅に改善です。図 2 図 3を比較すると、だも発現レベルを 45 分 (図 3、モナ ・ YPet)、ようにではなく (図 2、YPet モナ) のように 90 分に誘導時間を増やすことによって改善できることが明らか45 分は、通常十分ですが。1.0 に近い値は典型的な表現レベルが許容される場合に、陰性対照セルの YPet モナ バインディング レベルに YPet モナの nMFI を正規化するに注意してください。同じサンプルから PBS 単独で mfi YPet モナ MFI の正規化も相対発現レベルを比較する有効な方法がはるかに高い値を与える (比較図 2 図 3 Sarkesからの結果ら。2015年15)。

興味の特定のターゲットに結合性ペプチド ライブラリの濃縮が可能です通常 3 つの肯定的な並べ替えのラウンドが、図 2に示すように、有益にすることができます並べ替えの第 4 ラウンドを続けて図 3.ここでは、バインドされている細胞の割合と nMFI は、両方の例のターゲット、PA と abrax、図 2の赤で箱入り、4 戦のラウンド 3 から増加し続ける図 3、それぞれ。最高の親和性ペプチド配列がすでにある場合で第 3 ラウンドですがラウンド 4 同様に、潜在的な候補者14のダウン選択の補助でさらに豊かにする可能性が高い。ラウンド 4 から配列の解析を繰り返しシーケンスを明らかにする傾向がある、シーケンスを繰り返しこれらの親和性と特異性解析とコンセンサス シーケンスを決定するための優れた出発点です。この原稿を補完するものとして提供されている eCPX_Sequencing マクロは、図 4に示すように、この最初の分析を合理化するのに役立ちます。.Seq またはテキスト ファイル、選択した 5' と 3' シーケンスの間に dna のフォルダーで始まるが変換され、アミノ酸、主催、各ペプチドのアミノ酸残基の数を分析します。分離ペプチド配列の並べ替えられた一覧図 4に要約表シートのスクリーン ショットで示すように、簡単に繰り返し、どの周波数でどのシーケンスを決定する使用できます。繰り返しシーケンスを含んでいるこのワークシートのセルの分析を容易に別の色のとおりです。コンセンサス シーケンスと他の傾向のためのこれらの繰り返しシーケンスを確認することをお勧めします。Kalign など Clustal オメガ シーケンス アライメント ソフトウェアによって助けられるこれとのダウン選択一覧 (彼らは登場頻度で繰り返しと非繰り返しシーケンスを含む) 全体のシーケンスの出力に解析を行うことが(相対頻度の有無にかかわらず) のシーケンスを繰り返します。PA と考慮し、周波数を取ることがなく、シーケンスを繰り返し abrax の代表的な結果を図 5 aに示す5 b、それぞれ。図 5 aの個々 の繰り返しシーケンス自体のいくつか PA ターゲットはコンセンサス配列 WFCFTC (または同様のシーケンス) を含む、赤い下線が表示、Kalign に Jalview ソフトウェア解析を適用することによって決定された注意してください。繰り返しシーケンスのシーケンス配置です。このコンセンサスとして WXCFTC、以前した PA バインディング コンセンサスは、並べ替え方法9で安心を提供します。図 5 b、同じ方法で解析していた abrax ターゲットの繰り返しシーケンスの結果はかなり異なっていた。最初に、(44% 以上のコロニーも PA のシークエンスが決定された) が、PA のバインダーのバイオパニングのラウンド 4 から分離された 15 の繰り返しシーケンスではなく、abrax バインダーのバイオパニングのラウンド 4 で繰り返される唯一の 5 つのシーケンスがあった。第二に、最も有望な「コンセンサス」シーケンス (FWAWF、紫色で下線付き) に含まれている 5 つの繰り返しのシーケンスのいずれも、候補者 AX A15 含まれている最高のシーケンス一致 (FWDTWF)。さらに分析は、下記のとおり FWDTWF図 5で abrax バインドの上の 5 人の候補から決定の一致を提供するために助けたバインディング親和性と特異性の決定を含みます。

各繰り返しのシーケンスから代表的なコロニーは、細胞の親和性と特異性図 6A abrax 結合ペプチドのバイオパニングから繰り返しシーケンスのように facs のためさらに分析できます。ここですべての 5 つの繰り返しのシーケンスが abrax、目的と目標を rivax、負の並べ替え、またはストレプトアビジン、用磁気ビーズによる並べ替えの間に現在であるため構造的に類似のタンパク質よりも高い親和性を有することは明らかです。バイオパニング。これは、アフィニティのため既に有望な結果を一貫と abrax、意図したターゲットにバインドするため、濃縮図 3でそれが明確に示すように並べ替えのラウンドの特異性は、バイオパニングの各ラウンドで増加しています。類似蛋白質、rivax のための親和性ではありません。ただし、満足のいく合意シーケンスを特定できませんでした繰り返し使用して abrax ソート シーケンス ラウンド 4 だけからの (図 5 bと議論の上)。ラウンド 4 から 100 のシーケンスされた植民地に戻ると、いたただし、目で AX A15 を分離その 1 つ追加候補、AX A12 に認められた FWDTWF シーケンスに含まれる予測コンセンサスのベストマッチと同様のシーケンスを検索、シーケンスの別の候補者、AX A14 が似たような含まれていると、DWNTWF。これらは、繰り返しシーケンスに類似性を含まれている、他の非繰り返しのシーケンスとの類似点を示したか、ランダムに選ばれた他のシーケンスは、結合親和性と特異性の FACS によって分析されました。これらのテストは Sarkes2016 1でランク付けされて、この分析からトップ 5 のバインダーが図 6B一致シーケンスを図 5に示すように、FWDTWF であると判断一物します。

結合親和性 PA ターゲットを認識ペプチドのペプチド配列バイオパニングの 4 ラウンドを繰り返すための同様の分析を明らかにした、最高のバインダー PA 488 nMFI:SAPE nMFI の比率によって選ばれた含まれている WXCFTC コンセンサスまたは類似シーケンス (表 1)。シーケンスこの比率を使用して、コンセンサスを含まれるそれらとそうしなかった者に自己組織化。トップの候補者、すべてを含む、コンセンサスに関連するシーケンスを行った同様に図 6abrax の上記の方法を Sarkes2015 14に示されるようにこれらの結果を示すいくつかのターゲットのシーケンスを繰り返すとペプチドの解析が不十分であること重要な親和性と特異性選ばれたターゲットのバインダーを取得し、可能性があります一致シーケンスを決定するが、それ自体、十分なバインディング。ただし、繰り返しの数が必ずしも関心 (表 1) のターゲットの相対結合親和性を反映しないことに注意してください。シーケンスだけを繰り返しの分析がパターンを決定するのに十分ではない場合はシーケンス分析と候補者のプールを絞り込むし、高い親和性を持つそれらの候補者の間でトレンドを再検討する結合解析を交互に便利です。.単独で繰り返し配列の分析から傾向を観察すると、たとえ同じ傾向やその他のトレンドは、詳しい調査の結果追加非繰り返し配列を発揮します。

Figure 1
図 1: 細菌表示ライブラリ用のバイオパニング プロトコルのスケマティック。ここで示すように、バイオパニングの細菌の表示ライブラリは循環的なプロセスです。細菌表示ライブラリの各セルには (材料の表参照) セルは抵抗性遺伝子 (この場合 choloramphenicol)、プラスミドに含まれる抗生物質の存在下で栽培されている限り保持され、プラスミド DNA が含まれます。各プラスミドもセルの外観にランダムなペプチドを公開する表示足場タンパク質をエンコードします。各セルは、単一のプラスミド DNA シーケンスを含める必要がありますのみ、以来各セルが細胞膜中の複数の場所で単一ペプチドをのみ表示されます。DNA シーケンスはバイオパニング前後各並べ替えラウンド開始時のライブラリの多様性のレベルに応じて、できない場合があります固有のセルに。バイオパニングには成長と外膜に個々 のペプチッドを表示するセル ・ ライブラリの誘導が始まります。これらのペプチドは、標的タンパク質 (これがビオチン化またはキャプチャのタグ付きのそれ以外の場合) を操作できます。磁気活性化細胞 (MCS) を並べ替えの自由な蛋白質が削除され、セルはキャプチャ蛋白質 (この例では、ビオチンと強い相互作用を持つストレプトアビジン) がコーティングされた磁気ビーズと孵化させます。全体の文化は、非連結の細胞からバインドされた細胞を分離する磁石に、公開されます。自動磁気分別装置を使用しては、偽陽性を減らすために細胞分離に適しています。ここで示したセルにバインドされて、共同磁気ビーズの溶出が保持されます、肯定的な種です。通常フロントまで行い、否定の種類のプロセスは細胞磁気ビーズから洗っているが代わりに保持されることを除いて同じです。金利、バインド (肯定的な種) または非連結 (否定的な並べ替え) のライブラリ分数が一晩成長し、並べ替えの次のラウンドで使用されます。肯定的なバイオパニングの各後続のラウンドには、逼迫を改善するためにターゲットの濃度およびビーズの量の減少が必要です。バイオパニングの各ラウンドの後蛋白質ターゲットのペプチドの特異性と親和はバイオパニングを停止し、個々 の候補者の調査を開始するタイミングを決定するため蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを使用して評価されます。必要に応じて、DNA 塩基配列およびペプチドの配列解析が実行されます。特にバイオパニングの最終ラウンド後に個々 の分離株の動向を明らかにするための循環的なプロセス自体の解析手順があります。この時点で、ペプチッド シーケンス動向やコンセンサスが親和性や特異性結合に関連付けられます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 2
図 2: ラウンドを並べ替えの FACS 解析のサンプル データ: PA ターゲット。バイオパニング (肯定的な種) 選ばれた細菌防御抗原 (PA) ターゲットに結合性ペプチドのライブラリに表示の 4 ラウンドの後の結合親和性 FACS によって決定されるが表示されます。最初ストレプトアビジンをコートした磁気ビーズに対して否定的な並べ替えを実行した後が実施されました。バインド評価のため細胞は 0.4% と誘導された l-アラビノース FACS 解析及びターゲットおよび制御ソリューションの孵化前に 90 分。バインド対象の親和性分析は赤で箱入りです。FITC A 対 FSC のスキャター プロットをここに示した-A と (単独で PBS を添加してゲート ネガティブ コントロール) と比較するとバインド パーセント セルの値正規化平均蛍光強度 (nMFI、インキュベートをペプチド無料陰性対照と比較して、同じ蛍光標識タンパク質) と 45 分のため培養細胞の: PBS バッファーだけでも、150 nM YPet モナ (ペプチド発現陽性コントロール)、または 250 nM PA-488 (ターゲット ラベル)。バイオパニングの各ラウンドの後の結合親和性の興味のために豊かな増加に注意してください。図 3と対照をなしてプログラム Posselds を使用してすべての autoMCS セル版が完成しました。このデータの一部は、FITC H vs FSC H Sarkes2015 14比較で FITC A 対示す FSC のプロットの散布で視覚化できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 3
図 3: ラウンドを並べ替えの FACS 解析のサンプル データ: abrax ターゲット。同様に図 2、ここでは完全なバイオパニングの実験、比較の結合親和性、FACS によって決まります。細菌表示ライブラリ ストレプトアビジン コーティング磁気ビーズ、図 2のようにに対して否定的な選別を受けたが、類似構造の相同タンパク質に対する否定的な並べ替えの追加ラウンドを受けたし、関数は、rivax、目的と目標を abrax 結合性ペプチドの肯定的なバイオパニングの 4 ラウンドを実行する前に。バインド評価のため細胞は 0.4% と誘導された l-アラビノース ターゲット、肯定的な制御、および否定的なコントロールにバインドおよび FACS で読む前に 45 分間。結合対象の親和性は赤で箱入りです。FITC A 対のスキャター プロットをここに示した FSC A (または PE A 対 SAPE 場合 FSC A)、パーセント セルの値が (単独で PBS を添加してゲート ネガティブ コントロール) と比較するとバインドし、nMFI の誘導と 45 分のため培養細胞: PBS バッファーだけでも、150 nM YPet モナ (ペプチド発現の肯定的な制御)、250 nM Abrax-488 (分類された蛋白質ターゲット)、250 nM Rivax 488 (ラベルの付いた潜在的な交差反応性蛋白質ターゲット) または 250 nM SAPE (ネガティブ コントロールに直接バインドするためストレプトアビジンをコートした磁気ビーズ)。Abrax、バイオパニングの各ラウンドの後、興味の対象の結合親和性と構造が似ているタンパク質、rivax の最小限の結合親和性豊かな増加に注意してください。図 2と対照をなして 1 ラウンド バイオパニングを用いて行った肯定的な autoMCS Posselds プログラム間のラウンドを並べ替え後竣工として本稿ではバイオパニングのために提案されるプログラム、Posseld を使用してこのデータは、FITC H vs FSC H Sarkes2016 15比較のための FITC A 対示す FSC のプロットの散布で視覚化できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 4
図 4:"eCPX_Sequencing"マクロを使用して出力シーケンス分析の例です。Posselds 法を用いた PA バインダーのバイオパニングのラウンド 4 から 48 シーケンスされたコロニーのスクリーン ショット選ばれた細菌表示ライブラリは、示されています。「概要表」シート次に示します。植民地がシーケンス処理中に指定されたファイル名のアルファベット順に番号を少なくとも一度繰り返すシーケンスを囲むボックスが簡単にデータ解析のための異なる色で記載されて注意してください。ECPX_Sequencing マクロは、補足コード ファイルとして提供されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 5
図 5: 2 つの異なる蛋白質ターゲットの配置と合意決定をシーケンスします。ここで示されているすべての画像は、Kalign オンライン解析ソフトウェア51を使用してシーケンスを整列した後 Clustal_X 着色 Jalview ソフトウェアを使用して生成されました。A) PA バイオパニングからシーケンス ラウンド 4 繰り返しの配置 (表 1に対応)。B) 繰り返し abrax バイオパニングからシーケンス ラウンド 4 の配置 (図 6Aに対応)。C) abrax バイオパニングから上位 5 つの候補者の配置ラウンド 4、個々 の候補者の FACS 解析によって決定される (図 6 bに対応)。A と C、B で紫色の線を強調して可能性を強調コンセンサスシークエンス abrax 繰り返しシーケンスのみを調べる場合は、バインディングを決定する前駆体結合親和性をテストする必要があります一致シーケンスに下線を引く赤線facs を合意することができますいくつかのケースで決定する前に。異なる解析ソフトウェアで生成された類似の線形は、Sarkes2015 14と Sarkes2016 1で見ることができます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Figure 6
図 6: 例の結合親和性と特異性 FACS を用いて個々 の候補者です。A) 繰り返しシーケンスとバイオパニングのラウンド 4 から abrax、ターゲットの比較結合親和性によって決定される、B) のトップ 5 候補の FACS を用いて正規化された平均蛍光強度 (nMFI) は、ここに示します。平均 (バー) と標準偏差 (誤差) を 3 つの独立した複製の実験データを表します。構造が似ているタンパク質、rivax (Rivax 488、赤い棒) とストレプトアビジン ネガティブ コントロール (SAPE、黒いバー)、示されているすべての候補者がかなり abrax (abrax 488、緑色のバー) の固有であるに注意してください。(AX 07 と AX 15) で繰り返しシーケンスの 2 つは B の上位 5 つの候補者間にまたあったが A と B に示します系列単独での繰り返しの分析結果の比較可能性があります最高の親和性ペプチドを分離するため十分ではないです。ここで表示されるデータは、Sarkes et al. 2016 1から適応されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください

Table 1
表 1: 個々 の繰り返し候補者非特異的結合特異的結合の比率。この例では、繰り返しシーケンスの数、SAPE (マイナス コントロール) nMFI に PA (ターゲット) nMFI の比は PA バイオパニング第 4 戦から繰り返し候補シーケンスに表示されます。このデータは PA nMFI:SAPE nMFI 比で並べ替えられ、知られている WXCFTC コンセンサスまたは同様のシーケンスで太字のフォントで表示され下線の有無を分析します。シーケンスはコンセンサスとそれらの候補者最高の PA nMFI:SAPE nMFI 比を持っているターゲットに具体的やり取りしたがって、自己組織化に注意してください。表示される結果は、単一の FACS 実験からです。ターゲットの最も低い親和性ペプチドは、追加の複製と Sarkes2015 14の分析から除外しました。

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Discussion

バイオパニング細菌の表示ライブラリは親和性試薬の分離に成功したアプローチをされており、ペプチド抗体認識のために有用な代替を提供は、特定の条件が必要な場合、極端な環境での安定性など。これらのライブラリのバイオパニングは、ここで説明されている autoMCS メソッドを使用して簡素化されていて、市販 autoMCS プラットフォームより多くの人にこのテクノロジを拡張します。伝統的な交互 MCS/FACS と比較して細菌の並べ替え方法表示ライブラリ、autoMCS メソッドは、並べ替えとの連結の細胞を分離することができるより高価な FACS 装置への投資が不要で安価ここで使用される流れの cytometer の型ではなくであるのみ分析14のことができます。AutoMCS によって成功したバイオパニングのための重要なステップがあります分離プログラム選択、FACS を使用して、バイオパニングを停止するタイミングを決定するライブラリ濃縮を監視、偽陽性を減らすために潜在的な交差反応に対して並べ替え負と候補者の何百もの面倒なスクリーニングを避けるために候補者プールのスマートな分析。

記載例のプールごとにペプチド配列の違いにより若干異なる分析戦略とが PA と abrax、2 つの独立したターゲットのための選ばれた細菌表示ライブラリの成功バイオパニングを示すバイオパニングの 4 つのラウンド後の候補者。PA の 144 植民地で少なくとも一度繰り返されるペプチド配列から明確な傾向を示すシーケンス分析より簡単なケースだった。今回は単独でコンセンサスを含まれている PA ターゲットのコンセンサス シーケンスを判別するのに十分なそれらのコロニーまたは同様のシーケンス ストレプトアビジン ネガティブ コントロールへのバインドと PA へのバインドの比率の面で最適な候補。しかし、この常になる場合。Abrax ターゲット 5 繰り返しシーケンスにシーケンス 100 コロニーを導いたが、これらのシーケンスで傾向があまりすっきりした芳香族アミノ酸残基とアスパラギン酸やアスパラギンが含まれてする傾向以外。シーケンスされたコロニーのリストに戻って、観察親シーケンスにその正確な一致シーケンスが含まれていませんので、繰り返しシーケンスから予測「コンセンサス」のみが生産・ abrax への親和性のためにテストその他候補者であり、互いに共通のより多くの傾向があった。実際には、2 つのコロニーには、繰り返しだけで、(FWAWF ではなく FWDTWF)、アスパラギン酸、フェニルアラニン、トリプトファン残基が異なる間隔で同様の傾向があったから「コンセンサス」同様シーケンスが含まれています。これらのペプチドの 1 つは、繰り返しシーケンス、1 つではなかった。似たような変種を含む 3 番目のシーケンスと共に、これらの 2 つのシーケンス abrax の親和性の観点でテスト トップ 5 のバインダーの中にあった。全体のトップ バインダー AX-A05 によっても同様の傾向が表示されます。Abrax の結果は、シーケンス分析との親和性と特異性の解析間に数回のアプローチを交互に選ばれたターゲットに応じて、必要あることを示します。Abrax ターゲットの結果も非常によく似た蛋白質 (rivax 1,15) に達成することができる特異性のレベルを示します。

私たちの研究に選ばれる autoMCS プログラムされた初期の人口の 5% 未満の低周波を用いたラベル付き標的細胞の正の選択の両方は、Posselds と Posseld。どちらの場合も、セルは 2 つの磁気列を通過します。Posselds プログラムの場合ただし、セル通過よりゆっくりと露出時間41を増加する最初の列。商業 autoMCS デバイスの製造元によって与えられたプログラム説明に加えて (を材料表参照) 41、これらのプログラムは、いくつかの潜在的なプログラムの最初の比較の後選ばれました。陰性対照セルの均質な文化からの偽陽性を抜くようにと正常に興味のターゲットに陰性対照細胞減少とスパイクを含む混合文化から知られているバインダーを分離する各プログラムの能力知られているバインダーの割合を比較しました。ここで説明したアプリケーションから著しく逸脱、同様の比較は新しいアプリケーションのプログラムの選択に役立つと。ただし、以前類似のペプチドの分離に導いたバイオパニングのすべての 4 つのラウンドのためにこれらのプログラムのいずれかを使用することを示した PA のペプチド親和性試薬の隔離のためこれら 2 つのプログラム (Posseld と Posselds) の比較結果を公開アフィニティと PA の特異性と WXCFTC コンセンサスの決意。高速流動度より迅速にソートのその Posseld でされ、バインディング ターゲットへの親和性が高かったしたがってバイオパニングの唯一の 2 つのラウンドの後バイオパニングの 4 つのラウンドの後のより多くのユニークなシーケンスにつながった Posselds を使用している間の主な違い14. これから学習、戦略を若干変更したとき両方の利点を組み込む abrax 結合ペプチドのバイオパニング: Posselds は、ラウンド 1 の多様性が、その後最高、この重要なステップの間に露出時間が使用された、プログラムはラウンド 2-4 1,15中最高の親和性バインダーの高速分離のため Posseld しました。特に以来、nMFI とパーセントのバインドされたともに abrax 並べ替え並べ替えいずれかのプログラムでラウンド 4 PA と比べてラウンド 4、abrax に最適なように (図 2 図 3と Sarkes201514) が同じターゲットに対して他の対 1 つの戦略を使用して直接比較がより決定的な比較に必要となります。個々 のターゲット、使用されている並べ替えライブラリとは、ここで説明した条件の変更で実現ペプチド発現のレベルに依存可能性がありますプログラムが特定のアプリケーションに最適です。

説明しませんここでは非生物的材料とバイオパニングからの潜在的な結果が、一括アルミ2に対してバイオパニングの同じ細菌表示ライブラリを用いても。本研究では、autoMCS を使用しては実行されませんでしたが、同様の研究は、材料は、可能性があります上にコーティングまたは、磁気ビードに共役 autoMCS を使用して行うことができます。一括アルミニウム研究では個々 のアミノ酸分析と二次構造モデリングだった分離ペプチドの結合親和性を運転していたもの、コンセンサス配列決定2はなかったので理解する上で役に立つ。生物学的目標ともこれは何が運転して"eCPX_Sequencing"マクロから生成されたスプレッドシートに個々 の残留周波数分析のタブが含まれています理由はいくつかのターゲットのための結合親和性を理解する必要があります。しかし、合意の欠如に加えて、繰り返しシーケンスは表示されない残留周波数パターンを示さない場合、他の種類の分析は要求されるかもしれない。また、さらなる並べ替えラウンド ダウン選択目的のターゲットに十分な親和性とのそれらのための候補者のはるかに大きい数をスクリーニングを避けるために必要かもしれません。

次世代シークエンシングの増加する供給、アフィニティのテスト前に最も有望な候補者を確認してバイオパニングの各ラウンド後の濃縮の程度を調べるためより徹底的な調査を実行でした。しかし、彼らは簡単にルーチン コロニー ゲノ ム配列数十または何百ものコロニーの分離に十分に高い周波数ではない場合シーケンス結合分析手順に進むは複製、再作成する必要があります。この技術の進歩より安価なより日常的になるとコロニーの分離のために、特にそれが可能性が高いバイオパニング データを分析する最もよい方法であります。それは個々 のシーケンス、およびライブラリ全体の解明につながる可能性があります、進化。高速の成長率やノザン ゲノム蛋白質の表示の足場およびペプチドの式がなくても素材をバインドできない細菌のセルに向かって並べ替えバイアスが時間をかけて並べ替えライブラリで細菌が変異はさらに、インスタンス。そのため、一度有望な候補が出てくるだプラスミド DNA を分離する、新鮮なエシェリヒア属大腸菌を retransforming、FACS によるペプチド結合を確認する価値があります。セルなしの形式で、ペプチドを使用する場合、アフィニティは、無料ペプチドも評価されなければなりません。たとえば、ターゲット SEB の細菌のディスプレイを介して発見されたペプチド親和性試薬総合的作り出されたセルをオフと immunosorbant の酵素抗体法 (ELISA) と (FACS) 経由でセルとセル オフなどのより伝統的な方法によって分析(ELISA) 経由で、親和性は Kds 7は両方の方法で決定を用いて比較した.

ストレプトアビジン-ビオチンの相互作用の強さはターゲット蛋白質とペプチド結合の捕獲のための理想的な戦略になって、この手順は他のキャプチャの方法で変更できます。エポキシやカルボン酸ビーズなどの磁性ビーズにタンパク質の直接結合は成功しているし、バインド ステップを削除します。ただし、直接添付ファイルは添付ファイル戦略によって、特定または不特定の方法で潜在的な結合部位を妨げます。ストレプトアビジン ビーズを使用する付加的な利点は安定したタンパク質少ない目標たて 30 分でビオチン化をすることができますまたは保存凍結、彼ら自身ビーズ架橋用蛋白質と長い潜伏を要求する傾向がある一方、必要な場合一般的に 2-8 ° C で保存ビオチン化タンパク質の提案された開始濃度目標ここでは、600 nM は複数のターゲットに成功しているが、この濃度は減る場合と高親和性ペプチド キャプチャ試薬を分離することが可能かもしれません。さらに、このメソッドを拡張するおよび他細菌表示ライブラリおよび他の有機体の変更できます。たとえば、用嫌気性菌、酸素がない場合または一意のプロパティを持つペプチドを分離する極限環境で使用するための他の環境では、これらの手順を実行することができます。ペプチドおよび/または興味の特定のターゲットは潜在的にすることができますを決定するコンセンサスは、生体材料、又は総合的作り出されたセルをセル上を使用しました。さらに高い親和性とより堅牢なタンパク質触媒をキャプチャ (PCC) エージェント用センサー、または抗体は、バインディングに使用される、通常他のアプリケーションの開発で総合的作り出されたペプチドがさらに熟成させますか認識38,55図 5 1に掲げる abrax 結合ペプチドとコンセンサスの最近行われたように、ペプチドは、ターゲットの場所をバインディングを決定するために、分子モデリングを使用もできます。全体的に、ペプチドのアフィニ ティーの試薬のためのバイオパニング細菌表示ライブラリは認識のための抗体の生産と蛋白質ターゲットの検出とこの半自動バイオパニングに高速、簡単、かつ強力な代替アプローチ広範囲にわたるアプリケーションに信頼性の高い結果を生産しています。

Disclosures

著者がある何も開示するには

Acknowledgments

著者は、米国陸軍研究所 (ARL) ポスドク ・ フェローシップ プログラムの博士ジャスティン ・ p. ヤンキーの選任による ARL と契約をオーク リッジ関連の大学によって管理サポートを認めたいと思います。残りの資金は、センサーと ARL で電子デバイス本部によって提供されました。著者も感謝したいドーリィ ティー ラボ UCSB で細菌表示ライブラリと YPet モナ試薬、ARL、博士ジョシュア Kogot 彼の初期の仕事のために YPet モナ試薬をクローンとサポートのブリン アダムス博士のクローン作成のための情報を共有するため、細菌のバイオパニングの訓練表示ライブラリ、エッジウッド化学とプラスミドのエクスプレスし、abrax を浄化するために使用を共有するための生物センターのアリーナで穏やかなおよび rivax タンパク質ブランディ ドーシー PA 結合ペプチド、秦 Guo の隔離のためのテクニカル サポートabrax 結合ペプチドの単離の実験、この原稿についての議論が参考のため博士ジェシカ テレルのテクニカル サポート。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec 130-092-545 Automated cell separator for use with magnetic beads
Luria Broth, Miller (LB) Fisher Scientific BP1426-500 Growth medium
Chloramphenicol Fisher BioReagents BP904-100 Antibiotic
Agar Fisher Scientific BP2641-500 Thickening/geling agent
eCPX 3.0 Bacterial Display Peptide Library Cytomx Therapeutics N/A; http://cytomx.com/contact/ On-cell peptide display library. Provided by collaborators at USCB.
L-arabinose Sigma A3256-500G Sugar, for induction of protein expression
Phosphate Buffered Saline pH 7.4 (PBS) Amresco 0780-10L Buffer
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin, No-Weigh Thermo Scientific PI21327 Adds biotin molecule to primary amines
Pierce Biotin Quantitation Kit Thermo Scientific PI28005 Ensures biotin molecule is covalently bound to protein
Dynabeads MyOne Strepavidin T1 Beads Invitrogen 65601 Magnetic beads for capture of biotin-congugated proteins
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma A9647-100G Protein, used as blocking agent for non-specific binding
D-glucose Sigma G8270-1KG Sugar, for growth and impeding inducible protein expression
Ypet Mona UCSB and ARL N/A Positive control for monitoring expression of eCPX 3.0. Produced by authors and collaborators; see references 12 and 13.
Dylight 488 NHS Ester Thermo Scientific 46403 For conjugating protein target to fluorophore
Streptavidin, R-Phycoerythrin conjugate (SAPE) Thermo Scientific S866 Negative control for monitoring non-specific binding to streptavidin
BD FACSFlow Becton, Dickinson, and Company 342003 Buffer for running FACS instrument
autoMACS Columns Miltenyi Biotech 130-021-101 For MACS Separation
autoMACS Running Buffer – MACS Separation Buffer Miltenyi Biotech 130-091-221 For autoMACS instrument maintenance. Hazard: contains 0.09% azide.
autoMACS Pro Washing Solution Miltenyi Biotech 130-092-987 For autoMACS instrument maintenance
70% Ethanol VWR E505-4L Decontamination of autoMACS
Glycerol Sigma G6279-1L For bacterial freezer stocks
Chill 15 rack Miltenyi Biotec 130-092-952 For MACS Separation
BD FACSCanto II Becton, Dickinson, and Company 744810; http://www.bdbiosciences.com/us/instruments/research/cell-analyzers/bd-facscanto-ii/m/744810/overview For assessment of peptide binding to target
BD FACSDiva Software Becton, Dickinson, and Company 659523 For assessment of peptide binding to target
Dynabeads MPC-S magnetic particle concentrator Thermo Scientific A13346 Bench top cell separator for use with magnetic beads
Colony Sequencing Genewiz N/A; https://www.genewiz.com/ DNA and Colony Sequencing Services
Excel Microsoft 323021400; https://www.microsoftstore.com/store/msusa/en_US/pdp/Excel-2016/productID.323021400 For use with sequence analysis macro
Anthrax Protective Antigen (PA) List Biological Laboratories, Inc. 171 Target protein used as example for representative results.
Abrax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.
Rivax ECBC and ARL N/A Target protein used as example for representative results. Produced by authors and collaborators; see references 1 and 15.

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