וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

כאן, אנו מציגים שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים איפה תרבותי משותף עם אבי העורקים, נגזר רשתות אנדותל עכברוש תאים mesenchymal prelabelled. שיטה חדשנית זו מאפשרת הדמיה של תאי סטרומה Mesenchymal (MSCs) יונת ושילוב עם רשתות אנדותל, כימות של מאפייני רשת, והערכה של הביטוי immunophenotypes וג'ין MSC.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

אנגיוגנזה הוא תהליך מורכב, בעלות רגולציה האחראי על מתן ותחזוקה נאותה רקמות זלוף. להערכת לא מספקת תחזוקה, מומים פתולוגי עלול לגרום מחלות איסכמיים חמורים, בזמן פיתוח כלי הדם יתר על המידה שופע קשורה עם סרטן והפרעות דלקתיות. טופס המבטיחים של pro-אנגיוגנזה טיפול הוא השימוש של מקורות תא האנגיוגנזה, אשר יכול לספק גורמים רגולטוריים, כמו גם תמיכה פיזית לפיתוח החדש להערכת.

Mesenchymal תאי סטרומה (MSCs) הם מועמדים ובדוקים בהרחבה עבור התחדשות כלי הדם עקב תופעות paracrine שלהם והיכולת שלהם ויוכל הביתה לרקמות איסכמי או מודלק. בפרט, בשליש הראשון הטבור האנושי perivascular תאים (FTM HUCPVCs) הם מועמד מבטיח מאוד בשל תכונות כמו pericyte, פוטנציאל גבוה המקדימות, multilineage, תכונותיהם החיסון-חסוי, ואת paracrine חזקים פרופיל. כדי להעריך באופן יעיל פוטנציאל תאים משובי האנגיוגנזה, זה נדרשת כדי לבדוק אותם אמין ואת מבחני פרה-קליניים "לתרגם". וזמינותו הטבעת אבי העורקים הוא שמחוץ אנגיוגנזה מודל זה מאפשר כימות קל של מבנים צינורי אנדותל, מספק מטריצה חוץ-תאית (ECM) והתאים תומכת אביזר מהמחשב המארח, אינה כוללת מרכיבים דלקתיים וכן מהיר ולא יקר להגדיר. זה יתרון בהשוואה ויוו מודלים (למשל, וזמינותו הקרנית, Matrigel תקע assay); וזמינותו הטבעת אבי העורקים באפשרותך לעקוב אחר התאים מנוהל ולצפות אינטראקציות המערכת תוך הימנעות דחייה קסנו-החיסון.

אנו מציגים פרוטוקול עבור שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים, אשר כוללת MSCs אנושי בתרבויות שיתוף עם עכברוש בפיתוח רשתות אנדותל אבי העורקים. Assay זו מאפשרת הניתוח של התרומה MSC צינור היווצרות והתפתחות דרך אינטראקציות pericyte דמוי הפיזי, עוצמה להעברת פעיל לאתרים של אנגיוגנזה, להערכת יכולתם לבצע ולסיים עיבוד ECM. פרוטוקול זה מספק מידע נוסף על השינויים פנוטיפ MSC ביטוי הגן בעקבות תרבות משותפת.

Introduction

תהליך מורכב של אנגיוגנזה משפר ושומר זלוף רקמות באמצעות קידום התפתחות כלי דם חדשים מראש קיימים להערכת1. זה תהליך מוסדר בחוזקה, מאוזנת על ידי גורמים פרו-אנגיוגנזה, אנטי-אנגיוגנזה. כל ליקוי במערכת זו עלולה להוביל לא מספקת כלי תחזוקה או צמיחה, גורמות למחלות איסכמי חמורות, לרבות מחלת שריר הלב, שבץ מוחי הפרעות ניווניות. אולם, פיתוח כלי הדם מוגזמת הוא מאפיין עבור תנאים לרבות סרטן, הפרעות דלקתיות2.

פיתוח טיפולים שמטרתם לשלוט אנגיוגנזה להשגת התחדשות רקמות חיובית יש חשיבות מפתח. למרות חקירות קליניות נרחב, ניסיונות לעורר אנגיוגנזה באמצעות גורמי אנגיוגנזה pro ומיקרו Rna נכשלו להשיג תוצאות3,4,5. הסיבות האפשריות ההשפעות ארעי כוללים: אריכות ימים מצומצם של אנגיוגנזה חלבונים, חומצות גרעין, מספר סופי של ממוקד גורמי גדילה6,7. למרות גורמי אנגיוגנזה מסיסים חיוני לאתחול אנגיוגנזה, תחזוקת והפונקציונליות של להערכת תלויים תמיכה סוגי תאים כולל תאים pericytes, שריר חלק8. בתחום של טיפולים pro-אנגיוגנזה בוחנת כעת והוא תא גזע קדמון תא מקורות פוטנציאליים היכולים לספק גורמי אנגיוגנזה באופן מקומי, תוך תמיכה פיזית לאחרונה פיתחה להערכת, חידוש עצמי או אפילו הבחנה לתוך תאי אנדותל-כמו9,10. מציאת אנגיוגנזה האופטימלית סוגי תאים עם היכולת למלא את דרישות פונקציונלי אלה מחזיקה הבטחה גדולה עבור התחדשות רקמות איסכמי.

על מנת בהצלחה לתרגם טיפולים מבוססי תאים פוטנציאליים ניסויים קליניים, מחקרים קליניים צריך להדגים את יעילותם וסמן את המנגנונים האנגיוגנזה הבסיסית. למרות המספר הגבוה של מבחני הוקמה אנגיוגנזה, השדה חסר "תקן הזהב" במבחנה assay אמין יכול להעריך את היעילות של פוטנציאל המועמד תא סוגי11,12, 13. רוב במבחנה אנגיוגנזה מבחני (כולל את מבחני היווצרות אנדותל של התפשטות, הגירה, צינור) בדרך כלל להעריך את ההשפעות של תאים או תרכובות על תאי אנדותל שינויים פנוטיפיות שהיו קיימות בעבר או בידול לתוך צינורי ומבנים רשת14,15. ואילו תכונות אלה הם קריטיים עבור אנגיוגנזה, וזמינותו "לתרגם" אמור להעריך גם: 1) הגדלת או החלפה של סוגי תאים התומכים כולל pericytes או תאי שריר חלק, 2) עיבוד של ה-ECM ו/או קרום המרתף, ו- 3). היעילות לקדם היווצרות של microvasculature תפקודית. In vivo אנגיוגנזה דגמים, כולל את assay הקרנית ואת וזמינותו הכנס Matrigel, לסכם את microenvironment ייחודי ויוו אך מאותגרים על ידי הקושי של תאים מעקב מנוהל להתבונן באינטראקציה גופנית. יתר על כן, אין ויוו דגמים, דחייה קסנו-החיסון יכול להתרחש תוך בדיקת פוטנציאל allogeneic התא טיפול מועמדים16. Ex-vivo מודלים אנגיוגנזה, במיוחד וזמינותו הטבעת אבי העורקים יכולה לספק: תצפית 1) קל, כימות של מבנים צינורי, תאים תומכים אביזר 2), 3) ECM של המארח ואספקה מלאכותי, 4) אי-הכללה של דלקתיות רכיבים, ו- 5) התקנה מהירה וזולה17,18. בדרך כלל, וזמינותו הטבעת אבי העורקים ניתן לבדוק את הפוטנציאל אנגיוגנזה של חלבונים הפרשה קטן, סוכנים תרופתי מודלים מהונדס מכרסמים19,20,21.

MSCs הם מועמדים מבטיחים עבור התחדשות כלי דם בעיקר דרך שלהם paracrine בתיווך ההשפעות22,23,24. MSCs הוכחו מפרישים גורמי אנגיוגנזה מפתח כולל כלי הדם אנדותל פקטורי גדילה (VEGF), גורם הגדילה Hepatocyte (דבורה שחר), דמויי אינסולין Growth Factor 1 (IGF-1) בסיסי פיברובלסט גורם גידול (bFGF), angiopoeitin-1 (אנג-1)25 ,26. MSCs יכול גם לזהות, רקמות הביתה איסכמי או מודלק, עם זאת, המנגנון המדויק עדיין בחקירה. יותר ויותר, הספרות תומך את ההשערה כי רוב MSCs נובעים perivascular תאים משותפת אקספרס סמנים pericyte, יכולה להתנהג כמו pericytes27. HUCPVCs הם המקור הצעיר של MSCs נגזר מאזור perivascular של הטבור אנושי. הם מייצגים אוכלוסיה של MSCs עם תכונות כמו pericyte, מאפינים של חוטי חבל הטבור FTM והן לטווח. FTM HUCPVCs להדגים ביטוי גבוהה של סמנים pericyte כולל המאפיינים החיסון-מורשה CD146 ו- NG2, פוטנציאל המקדימות, multilineage גבוה, ולהציג פרופיל28paracrine חזקים. FTM HUCPVCs הם מסוג תא המועמד האידיאלי כדי לקדם התחדשות של הרקמה הפצועים קידום חדש להערכת באמצעות תכונות כמו pericyte שלהם.

כדי לבדוק את הפוטנציאל האנגיוגנזה והמאפיינים pericyte כמו של MSCs האנושית, מספר מאוד מצומצם של מבחני אנגיוגנזה הם ההעברה angiotropic זמין שם חיובי (ןלהל "יונת"), ECM עיבוד ופיתוח גופניים האינטראקציות בין סוגי תאים יכול ייחקרו, תוך קבלת נתונים כמותיים על פיתוח microvasculature.

בזאת אנו מציגים פרוטוקול המתאר שימוש חדש וזמינותו הטבעת אבי העורקים. MSCs האנושי היו בתרבית במשותף עם פיתוח חולדה-derived אבי העורקים אנדותל רשתות כדי להעריך את תרומתם צינור היווצרות ההבשלה, הומאוסטזיס. גירסה זו של הטבעת אבי העורקים וזמינותו מעריך את היכולת ואת העוצמה המועמדים טיפול תא הביתה לאתרים של אנגיוגנזה, לבצע לתווך ECM עיבוד ושל תורמים להתפתחות צינורי אנדותל באמצעות הקמת פיזית כמו pericyte אינטראקציות. בנוסף לכימות ההשפעה נטו של MSCs על היווצרות רשת אנדותל במבחנה התבוננות אינטראקציות המערכת, אנחנו גם אופטימיזציה פרוטוקול כדי לבודד MSCs מתרבויות משותף. על ידי ביצוע cytometry זרימה, qPCR, זה אפשרי לאפיין שינויים פנוטיפ MSC ביטוי הגן בעקבות תרבות משותפת. בתור דגם סוגי תאים, השווינו ontogenetically מוקדם (טרום לידתי) ומקורות מאוחר (כמבוגר) של MSCs אנושי: FTM HUCPVCs ואת האדם הנגזרות מח עצם MSCs (BMSC), בהתאמה, בעוד וזמינותו הטבעת אבי העורקים. אנו מציעים כי וזמינותו הטבעת אבי העורקים ניתן ללמוד את הפוטנציאל האנגיוגנזה מכל סוג התא תמיכה פיזית כאשר תחת חקירה עבור יישומים משובי אנגיוגנזה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל מחקרים שכללו חיות היו שנערך ודיווח על פי הנחיות יגיעו 29. כל מחקרים בוצעו עם מוסדיים מחקרים אתיקה לאישור הדירקטוריון (ר' מספר 4276). חיה כל ההליכים אושרו על ידי ועדת טיפוח בעלי חיים של הרשת בריאות האוניברסיטה (טורונטו, קנדה), ובעלי כל קיבל טיפול אנושי בהתאם מדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה, (מהדורה th 8 המכונים הלאומיים לבריאות 2011)-

1-הגדרת Assay הטבעת אבי העורקים

  1. לנתק את העורקים חולדה.
    1. Euthanize 8 - בן שבוע-10 ספראג-Dawley חולדות באמצעות חנק 2 CO: החלפת גז CO קבוצת צ'יימברס 2 ל-20% (קצב הזרימה = 0.2 x תא אחסון/min). לאשר בהעדרה של קמצוץ רפלקס והלב פועם על-ידי palpating בחזה.
    2. רטוב הפרווה באזור החזה בעזרת גזה סטיריליים 70% אתנול. השתמש סטיריליים מלקחיים ומספריים כדי לבצע חתך האמצע החזה לחתוך דרך שכבות העור והשריר.
    3. פעם אחת הצלעות חשוף, לחתוך את כלוב הצלעות מכל צד וקפל כלפי מעלה כ 5 מ מ בעצם החזה בכל צד. דימום צפויה מן העורקים הבין-צלעי גופות טריים.
    4. לדחוף את רקמת הריאה והלב בצד הימני אנטומי לחשוף את העורקים. אבי העורקים הוא הלבן בצבע כלי השיט ממוקם בצמוד השדרה.
    5. להשתמש מלקחיים לצבוט אבי העורקים (לאחר הקשת אבי העורקים) ולהשתמש מספריים כירורגיים לבצע את החתך הראשון תוך החזקת העורקים עם מלקחיים. בעת גזירה אבי העורקים, בחלל החזה ימלא במהירות בדם, ולכן הוא קריטי לעבוד מהר כדי להשיג את העורקים לפני קרישת דם.
    6. להשתמש מלקחיים להחזיק העורקים ולהתקלף בעדינות כלפי מטה, העורקים מן השדרה. המשיכה ינתק את העורקים הבין-צלעי ללא חתכים נוספים. להשיג כ 10 ס מ של רקמות ו/או לפני אבי העורקים מחלק לשני ענפים בחלל הבטן ולחתוך את העורקים הגופה. לדחוף את הסרעפת במידת הצורך לכיוון סימטרית כדי לקבל גישה להורדת קטעים של אבי העורקים.
      הערה: לקלף העורקים בעדינות כי כוח אינטנסיבי עלולה לגרום לו דמעה. אם הדמעות אבי העורקים, לאפשר קרישת דם למשך כמה שניות תוך שימוש מגבת נייר כדי להסיר את דם קרוש, המאפשר ראות של אבי העורקים הנותרים.
    7. מקום העורקים בשפופרת 15 מ"ל עם 10 מ"ל של האנק כקרח ' s מאוזנת פתרון מלח (HBSS) בתוספת 1% פניצילין/סטרפטומיצין (P/S). תמשיך הצינורות קרח
      הערה: הרקמה אבי העורקים יכולים להימשך 1-2 h בקרח אבל עדיף לעבד את זה מהר ככל האפשר.
  2. להכין את המדיה תרבות assay הטבעת אבי העורקים סטרילי אבטחה cabinet (BSC).
    1. הכן מדיום הגידול (EGM) אנדותל באמצעות יחידת סינון כדי לסנן 500 מ"ל של אנדותל הבזליים בינוני (EBM) בתוספת 2% סרום שור עוברית (FBS), גנטמיצין 1% וגורמי גדילה (ראה טבלה של חומרים). במקום 50 מ של התקשורת מסוננים לתוך אמבט מים או חרוז-37 מעלות צלזיוס.
    2. להשתמש יחידה סינון נוספת לסינון 100 מ של EBM בתוספת 2% FBS ו 1% P/S כדי להכין מסצנת האלקטרו 2% FBS (EBM-FBS) ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
  3. מעיל תרביות רקמה. ובכן 12 צלחות עם הבסיס ממברנה לחלץ (BME) תוך כדי עבודה על קרח.
    1. מקום צלחת 12-טוב על משטח קר (שקית קרח גדולים או מגש). להוסיף 200 µL טוב של טרי המופשרים BME שימוש בקירור טיפים פיפטה ו מערבולת את BME כדי להבטיח אפילו ציפוי. עבודה במהירות כדי להימנע פלמור לא אחיד של BME.
      הערה: כריתה אבי העורקים טיפוסי התשואות 20 טבעות אבי העורקים. לקחת בחשבון השתנות בין מבחני הטבעת אבי העורקים, התקנה לפחות שלושה מבחני הטבעת אבי העורקים לכל קבוצה לטיפול, כוללים פקד. אם המקור מאפשר, 6 טבעות לכל קבוצה טיפול מומלץ.
    2. למקם את הלוחות מצופים חממות humidified (95% לחות יחסית, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2; תנאים אלה חלים על כל השלבים חממה humidified להלן) במשך 30 דקות במקום 1,000 טיפים פיפטה µL חזרה אל-20 ° C עבור שלב 1.5.3.
      הערה: בזמן תמצית קרום הבסיס משמש בריכוז מניות, עקביות וקשיחות שלה מבוקר בקפדנות בזמן הפילמור הקפד לשמור את זמני הפילמור באותו המדויק עבור כל הקבלות וניסויים עצמאיים.
  4. סעיף העורקים לטבעות אחיד.
    1. לקחת את העורקים מהצינור 15-mL ולמקם אותו לתוך תבשיל 10 ס מ עם 10 מ"ל של טרי HBSS בתוספת 1% P/S.
    2. להשתמש שתי ערכות של מלקחיים הפרד בזהירות את עודפי רקמת חיבור, רקמת שומן ושימוש אזמל על הענפים הנותרים של העורקים הבין-צלעי מחובר אבי העורקים. זה מפחית השתנות בין יחידות הטבעת המבוסס על רמות שונות של הרקמה שיורית. הסר כל ממסר התקרש דם בתוך העורקים.
    3. למקם את הסרגל או את הרשת מתחת לצלחת 10 ס מ לחתוך בדיוק 1-2 מ מ רחב קטעים של אבי העורקים באמצעות אזמל סטרילי וחדים. לחתוך את החלקים הכי מדויק ככל האפשר להפחית את השתנות בין יחידות-
  5. להטביע את הטבעות אבי העורקים לתוך BME.
    הערה: אם חלוקתה של אבי העורקים טבעות לא הושלם לפני BME הפילמור דגירה, להסיר את הלוחות מצופים של חממות humidified ולהוסיף µL 100 של EBM כל טוב לסיים את הפילמור. תזמון מדויק חיוני כמו יתר פלמור של BME עלולים להפריע ההעברה תא ופיתוח רשת אנדותל. ברגע הטבעות אבי העורקים מוכנים להסיר את EBM מן הבארות והמשך משלב 1.5.2.
    1. להסיר את הבארות BME מצופה וייצג humidified ולחזור BSC.
    2. בזהירות לאסוף טבעות אבי העורקים בודדים עם מלקחיים ומניחים באמצע מכל קידוח מצופים BME. חזור על הטבעות הנותרות של אבי העורקים.
      הערה: המדיה הועבר יחד עם הטבעת אבי העורקים יש לשמור מינימלית על מנת למנוע אי סדרים הפילמור.
    3. שימוש מקורר (-20 ° C) 1,000 µL פיפטה טיפים להוסיף 300 µL של BME מעל כל טבעת אבי העורקים ולהפיץ באופן שווה את BME סביב הבאר.
    4. להחזיר את הטבעות אבי העורקים מוטבע חממות humidified 30 דקות
    5. להסיר את הצלחות עם הטבעת אבי העורקים מוטבע חממות humidified ולהוסיף לאט 1,000 µL של EGM (מוכן, ומחוממת-שלב 1.2.1) על-ידי הצבת פיפטה של טיפים הקיר של התרבות טובים.
      הערה: ישירות pipetting התקשורת על גבי BME יכול לשבש את BME polymerized ומעכבים פיתוח רשת אנדותל רציפה. השתמש פיפטה רב-ערוצי המתאים אם הוא זמין.
    6. לאחר 24 שעות, להסיר 1,000 µL של EGM ולהחליף עם 1,000 µL של EBM-FBS שהכין בשלב 1.2.2, שוב לאט pipetting כנגד הצד של התרבות טוב.
  6. לשמור על הטבעת אבי העורקים וזמינותו על-ידי החלפת µL 500 של EBM FBS µL 500 של EBM טריים-(37 מעלות צלזיוס) FBS כל ה 48
    הערה: ראה שניהtion 2 כדי להפעיל את הרחבת תרבות MSC באותו יום כמו הטבעת אבי העורקים assay הקמתה. פעולה זו תבטיח כי MSCs מוכנים עבור תרבות משותפת כאשר הרשתות אנדותל מוכנים.
  7. השתמש של מיקרוסקופיית שדה בהיר לעקוב אחר התפתחות הרשת אנדותל assay הטבעת אבי העורקים (ראה איור 1 התייחסות לפיתוח רשת מיטביים). לאחר ההיבט רשתות אנדותל כמוצג באיור 2, להמשיך עם הגדרת את הטבעת אבי העורקים assay-MSC התרבויות שיתוף (סעיף 3). עיין שלב 4.1 לפרטים נוספים של הדמיה הרשתות אנדותל.

2. תרביות רקמה

  1. פתרונות מניות הכן של תרביות רקמה מדיה.
    1. HUCPVCs FTM תרבות (שנוצרו קודם לכן, n ≥ 3 שורות עצמאיים לכל אחד) 30 ו BMSCs זמינים מסחרית באלפא-מ בתוספת 10% FBS ו 1% P/S.
    2. לעקר את התקשורת באמצעות 0.2 µm גודל נקבובית מסנן בקבוקים.
    3. לאחסן את פתרונות מדיה מוכן ב 4 ° C עד 3 שבועות.
  2. HUCPVC FTM לשמור על תרבויות BMSC humidified חממות, במעבר confluency 70-80% נקבע על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. שימוש המתאים אמצעי אחסון של מדיה עבור הגודל של תרביות רקמה מאכל בשימוש (כלומר 10 מ"ל בקערה 10 ס מ). להשתמש אלה תנאים תרבות שמירה, passaging של MSCs.
  3. לבטל את monolayers MSC עבור passaging או הטבעת אבי העורקים assay-MSC משותפת תרבויות באמצעות פתרון אנזים דיסוציאציה (תבשיל מ ל 4/10 ס מ), דגירה של חממות humidified 3 מינימלית ודא ניתוק של התאים באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר; דגירה עבור מינימום 1-2 נוספים אם יש צורך.
  4. העבר את התאים dissociated לתוך צינור 15 מ"ל צנטריפוגה-400 g x עבור 5 דק.
  5. וארוקן את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר תא, resuspend תאי 1 מ"ל של המדיה המתאימה תרבות (אלפא-מ, מלאה מדיה עבור passaging תאים או EBM-FBS עבור הטבעת אבי העורקים assay/MSC תרבויות המשנה) עבור ספירה באמצעות מונה תא.

3. הכנה של תרבויות המשנה Assay/MSC הטבעת אבי העורקים

  1. 10 זרעים 4 MSCs בכל מוטבע הטבעת אבי העורקים (תאים/ס מ 9,000 2 / 12-ובכן צלחת). מראש על סמך מספר מבחני הטבעת אבי העורקים, כתם של MSCs עם תיוג הפלורסנט קיימא, להעברה. שמירה על בארות לפחות שלוש הטבעות אבי העורקים ללא MSCs בקבוצת הבקרה.
    1. כתם 10 5 MSCs/mL EBM-FBS מדיה, להוסיף 2.5 µL של קיימא, צבעי פלורסנט להעברה/mL מדיה (5 מיקרומטר) לתוך צינור 15 מ"ל מקום בחממה humidified במשך 30 דקות לערבב בעדינות את הצינור באמצע הדגירה.
    2. הבאים 30 דקות דגירה, להוסיף נפח 1 EBM טריים - FBS לתאים ויטראז'ים ו ספין-400 x g עבור 5 דק.
    3. להסיר את תגובת שיקוע והשהה מחדש בגדר תא ב 1 מ"ל של מדיה EBM FBS. לאשר מכתים מוצלח של MSCs באמצעות מיקרוסקופ קרינה פלואורסצנטית.
  2. להסיר את הלוחות המכילים טבעת אבי העורקים מן החממה humidified ולהסיר µL 500 של EBM-FBS מכל קידוח.
  3. זרע בקפידה MSCs 4 10 ב 500 µL של EBM-FBS על כל טבעת אבי העורקים מוטבע על-ידי pipetting באופן שווה סביב הרשתות אנדותל. ודא כתופיים ע י ניעור בעדינות לצלחת תרבות.
    1. להוסיף EBM-FBS נוספים כדי להבטיח הנפח הכולל של המדיה על תרבויות המשנה assay/MSC הטבעת אבי העורקים 1,000 µL-
  4. להשתמש פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי להמחיש את MSCs fluorescently שכותרתה ב וזמינותו הטבעת אבי העורקים.

4. מיקרוסקופ

  1. שימוש מיקרוסקופיית שדה בהיר לשיקוף הרשתות אנדותל חולדה לפני הטבעת אבי העורקים assay/MSC משותפת תרבויות למדידות בסיסית (יום 0) של מאפייני רשת אנדותל (למשל, רשת אורך, לולאות ברשת). תמונה 4 הגזרות לכל טוב מן הטבעת אבי העורקים למקטע הרחוקה ביותר של הרשת אנדותל בתוך המשולש הזה.
    1. התמונה אבי העורקים טבעת רשתות בעקבות הטבעת אבי העורקים assay/MSC תרבויות משותפת ימים 3, 5 ו-7. להשתמש בתמונות אלה כדי לכמת את האפקט MSC על פיתוח רשת אנדותל.
  2. להשתמש פלורסצנטיות מיקרוסקופ כדי תמונה שכותרתה מראש MSCs ב וזמינותו הטבעת אבי העורקים.
    1. h של הטבעת אבי העורקים assay/MSC הבאים 24 תרבויות המשנה, להשתמש פלורסצנטיות מיקרוסקופ להמחיש יונת MSC, התארכות ושילוב עם הרשתות אנדותל. חופפים תמונות פלורסנט של MSCs עם תמונות שדה בהיר של תאי אנדותל לבחון את colocalization של שני סוגי תאים-
    2. תמונה של MSCs לשפות אחרות בתוך הרשתות אנדותל מפותחת proximal לרקמת הטבעת אבי העורקים, של MSCs לשפות אחרות בתוך לאחרונה פיתוח רשתות דיסטלי לרקמת הטבעת אבי העורקים ( איור 2).

5. Flow Cytometry, qPCR

  1. יום אחד לפני בריא הרשתות אנדותל הטבעת אבי העורקים, להפשיר dispase קפוא ב 4 ° C O/ש בסעיף 5.3 הוא זהה עבור cytometry זרימה והן qPCR.
  2. חם 50 מ של dispase ו- 50 מ של 0.5% טריפסין באמבט מים או חרוז 37 ° C.
  3. לאחזר את התאים לניתוח מתרבויות שיתוף של assay/MSC הטבעת אבי העורקים.
    1. 1 לאחר שבוע של תרבות משותפת assay/MSC הטבעת אבי העורקים, להסיר את המדיה תרבות ולהוסיף 1 מ"ל של Phosphate-Buffered מלוחים (PBS) לאט לאט כדי אחד טוב למשך 3 דקות ולהסיר. חזור על זה לשטוף עוד פעמיים.
    2. להוסיף 800 µL של טרום חימם dispase כדי מכל קידוח, דגירה של חממות humidified 15 דקות
    3. להסיר את הצלחות חממות humidified להשעות את dispase על ידי pipetting (x 5-10) כדי לשבור את BME ואני להעביר את התוכן של כל טוב לתוך צינורות נפרדת 15 mL-
    4. חזור על שלב 5.3.3 שוב עם מתוקים ומחוממת מראש dispase עד אין ממסר BME הוא ציין בתרבות היטב. להוסיף נפח 1 ל- PBS בתוספת 3% FBS כדי התליה תא dispase כדי להשבית את dispase. להסיר הטבעות אבי העורקים צף ההשעיה התא באמצעות פיפטה טיפים.
    5. לסובב את המתלים תא ב 400 x g עבור 5 דק. להסיר את תגובת שיקוע בקפידה, עוזב 3 מ"ל של השעיה תא בצינור 15 mL-
      הערה: גלולה ברור, מוצק לא יכול להיות גלוי אבל תאים ו BME נוכחים.
    6. להוסיף 3 מ"ל של טריפסין 0.5% prewarmed תא ההשעיה, נמרצות תאים resuspend (x 5-10 על-ידי pipetting). דגירה של פתרונות תא trypsinized חממות humidified 10 דקות
    7. להסיר את המתלים תא trypsinized humidified חממות ולהוסיף 6 מ של PBS בתוספת 3% FBS ו resuspend טים כמהes. לסובב את המתלים תא ב 400 g x עבור 5 דק
    8. להסיר כל את תגובת שיקוע, עוזב בגדר תא בצינור ובזהירות resuspend תאים 1 מ"ל PBS בתוספת 3% FBS בצינור לכל.
    9. לסנן התליה תא 1 מ"ל באמצעות מסננת תא מיקרומטר 70 כדי להסיר תאים צבורים BME שיורית מן התליה תא. ספור תאי 1 מ"ל של השעיה התא באמצעות מונה תא.
  4. להכין את התאים עבור cytometry זרימה.
    1. Incubate התא המתלים (10 5 תאים ב- PBS µL 200 בתוספת 3% FBS) עם fluorophore מצומדת (FITC או APC) ראשי נוגדנים (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) ריכוז = 1:40) ב 4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
      הערה: cytometry זרימה עבור MSCs היה אופטימיזציה על ידי הונג. et al., 2013 28. למינימום של 10,000 תאים נדרש עבור קריאות מדויקות.
    2. בעקבות הדגירה 30 דקות, resuspend תאי 2 מ של PBS בתוספת 3% FBS ו צנטריפוגה (400 x גרם, 5 דקות).
    3. תאים לשמור על 4 ° C מוגן מפני אור עד ניתוח על ידי cytometry זרימה (לפחות עונה 1 פרק 10 4 אירועים) בתוך 1 h. ראו האסטרטגיה המגביל, משלים איור 1. מיון אנושי MSCs באמצעות אנטי-TRA-1-85 (APC) (ריכוז: 1:40 ב 0.5% FBS/PBS) ולמיין תאים לתוך µL 350 תא מאגר פירוק לניתוח qPCR.
      הערה: תאים Lysed שניתן לאחסן ב- 80 ° C עד 3 חודשים לצורך ניתוח עתידי qPCR.
  5. להכין את התאים לניתוח qPCR.
    1. לבודד את הרנ א מתאי lysed באמצעות ערכות בידוד של RNA מבוססי עמודה ולקבוע את ריכוז ה-RNA ואת איכות.
    2. הכן cDNA מ- µg עד 5 של RNA לכל 100 µL רוורס טרנסקריפטאז התגובה. לבצע צעד הגברה מראש אם התשואה RNA נמוכה (< 10 ng/µL). השימוש פחות ממאה ng של RNA, יחול שיעור גבוה של התשלילים שווא.
      הערה: התבניות cDNA שניתן לאחסן ב-20 ° C לצורך ניתוח נוסף עד 4 חודשים.
    3. לבצע את qPCR באמצעות אנגיוגנזה ביטוי profiler מערכים כדי לזהות שינויים בביטוי הגנים. שימוש 5 ננוגרם של cDNA לכל תגובה (מחזורים 40, 60 ° C חישול/הרחבת טמפרטורה). קיפול אקספרס שינוי הביטוי לעומת MSC מובחן נגזר cDNA דגימות. הפעלת הפקדים המתאימים שלילי (אבי העורקים הטבעת ללא אנושיים MSCs).

6. רשת כימות הבאים אבי העורקים טבעת Assay/MSC שיתוף תרבויות

  1. להוריד את תוכנת הדמיה כגון ImageJ יחד עם תוסף אנגיוגנזה מנתח 31.
  2. לייבא את התמונות ברשת אנדותל נלקח ולפתוח באמצעות התוכנה-
  3. להמיר את המאזניים התמונה בהתבסס על המפרט של המיקרוסקופ משמש.
  4. להשתמש בכלי קו ישר כדי למדוד את הצמיחה רדיאליים ברשת.
  5. נחשב ללולאות הרשת אנדותל באמצעות הכלי מונה תא (צריך ניתן לכמת לולאות עם פחות 4 צדדים).
  6. נוספים כימות של מאפייני רשת, להשתמש תוסף אנגיוגנזה מנתח או תוספים אחרים דומים כדי לנתח מקטעים ראשיים, סה כ אורך קטע, הכולל רשת אזורים ומספר צמתים. השתמש בכלי מסכת מטושטשת טשטוש הטבעת אבי העורקים רקמות ואת החללים הריקים כדי להימנע חישובים חיובי כוזב.
  7. להעביר את הערכים סטטיסטיקה תוכנית וגרף אנדותל מאפייני רשת בעקבות התרבויות שיתוף assay/MSC הטבעת אבי העורקים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

זרימת העבודה סכמטית להקמת וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים/MSC הוא הפגין באיור1. השלבים העיקריים כוללים: עכברוש בידוד אבי העורקים, חלוקתה, יציקת הטבעות אבי העורקים, ניטור של לבלוב אנדותל ופיתוח רשת, סוף סוף labelling ואת ניהול של MSCs. ציר הזמן של ניתוח הרשת אנדותל מתאר את החלון של הבדיקות ריאלי עבור כל תקופה של שיתוף culturing: יום 1, 5 & 7. הערות נוספות מודגש על ידי תיבות מנוקד.

זיהוי אזורים הנבדלים זה מזה מבחינה מבנית בתרבויות תא אנדותל הטבעת אבי העורקים מתבצע על ידי מיקרוסקופיית שדה בהיר, 3-5 d לאחר הטבעות אבי העורקים מוטבעים ב- ECM (איור 2). האזור לא מובנים (איור 2 א) מאופיין כאזור של התפשטות תאים גבוהה אבל נמוך מבני הארגון בסביבה הישירה של הרקמה אבי העורקים. הרשתות אנדותל מפותחת (איור 2B) מתייחסים לאזורים עם הארגון מבנית גבוהה, בהם רשתות שהקמתה של, מורכב ברובו לולאות סגורות, אפילו לפני התוספת של MSCs. הרשתות המתפתח (איור 2C) ממוקמים ב האזורים דיסטלי של התרבויות אנדותל. אלו הם האתרים של נדידת תאים אנדותל, התארכות כמו הטופס החדש של מבנים רשת. 3 האזורים שהוזכרו לעיל ניתנים לזיהוי בקלות במהלך הניסויים ומשמשים בעת הפניה איפה MSCs ביתו בתרבויות משותף. MSCs prelabelled צריך להיות משותף תרבותי עם הטבעת אבי העורקים וזמינותו כאשר כל שלושה מקטעי רשת פיתחו. כימות של רשתות אנדותל בעקבות תרבויות המשנה MSC כוללים אזורים מפותחות ומתפתחות הרשת (איור 2, מסגרת לבנה).

קרינה פלואורסצנטית במיקרוסקופ מאפשר מדידות איכותיות של ההעברה MSC, אינטגרציה מורפולוגיה יחד עם פיתוח רשתות אנדותל וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים-MSC (איור 3). MSCs בלוחיות הסבר fluorophore קיימא, cytoplasmic היו עם תמונה 24 שעות לאחר ניהול לתרבויות המשנה. FTM HUCPVCs נמצאו בפריפריה של הרשתות אנדותל המתפתח, מוצגים תאים מאורכים מורפולוגיות, תרם להמשך פיתוח רשתות אנדותל (איור 3 א, ב'). לשם השוואה, BMSCs שני חיבורים של רשתות המתפתח תוך הצגת פחות אינטראקציה עם תאי אנדותל (איור 3C, יח). בהגדלה תמונות ב- 72 h הראה כי FTM HUCPVCs שמר על כיסוי גבוה וייצוב של רשתות אנדותל תוך BMSCs בתרבויות שיתוף הציגו מורפולוגיות כדורית עם מוגבלות השתלבות אנדותל רשתות (איור 3E , F). ציין ההבדלים בבירור להדגים איכותי, פונקציונלי ההבדלים בין סוגי MSC אנושי. סוג תא טיפולית המועמד בעל יונת משמעותי ומאפיינים אינטגרציה אנדותל (איור 3 א, B & E) בולטת לעומת סוג התא עם שילוב רשת אנדותל מוגבל, הגדלת יכולות (איור 3C, ד & נ).

תמונות מיקרוסקופ פלורסצנטיות בהגדלה נרכשו לנתח נוסף האינטראקציות פיזי בין תאי אנדותל FTM HUCPVCs ברשתות צינורי. HUCPVCs FTM שכותרתה מראש (איור 4A, ירוק) מוצגים הקפדה עם תאי אנדותל וללא רבב (איור 4A, לבן חצים). FTM HUCPVCs נמצאו לספק תמיכה מבנית לתאי אנדותל על ידי הגשה פני ציר וקובץ מצורף בין צמתים. הרשתות אנדותל הטבעת אבי העורקים ניתן גם מראש עם תוויות ברורות באמצעות fluorophore קיימא באופן דומה MSC מכתים (איור 4B, אדום). בתרבויות זוגי מוכתם שיתוף, מיקרוסקופיה קרינה פלואורסצנטית חשף מוארך הידבקויות בין סוגי תא שני, ומחזק את ההתבוננות בהתנהגות התא תומכת ושיתוף.

כימות של מאפיינים מבניים רשת אנדותל בוצעה ביום 5 של תרבויות המשנה MSC (איור 5). הגזרות אחיד הוגדרו למדידה ברחבי הרשת אנדותל כל הטבעת אבי העורקים (איור 2, מסגרת לבנה). הגידול הרשת מתכוון מחושב כמו המרחק בין הלולאות ברשת סגורה proximal הראשון על ידי הטבעת אבי העורקים כדי שבקצה דיסטלי סגור לולאות (גודל הרדיוס) (איור 5A). הגידול כלומר רשת של תרבויות המשנה הטבעת אבי העורקים-MSC היו כדלקמן: HUCPVCs FTM (2.98 ±0.3 מ מ), BMSCs (±0.15 1.5 מ מ). הרשתות אנדותל לא מטופל פיתח רדיוס אכזרי של 1.9 מ מ ±0.1. השוואה סטטיסטית בין הקבוצות טיפול MSC הוכיח כי FTM HUCPVCs תרמו לצמיחה רשת גדול יותר באופן משמעותי בהשוואה BMSCs ורשתות לא מטופל (p ≤0.001). לא מטופלת ברשתות אנדותל פיתחה באופן משמעותי יותר BMSC המכילה תרבויות המשנה (p ≤0.01) (איור 5B).

כלל מספר לולאות היו מחושבים כל רביע, המבוטא היווצרות לולאה הכולל ממוצע (איור 5C). המספר הממוצע של לולאות סגורות סה כ היו כדלקמן: FTM HUCPVC מטופלים ושיתוף תרבויות (81 ±7), BMSCs (26 ±3) ואני מטופל טבעות (55 ±7). FTM HUCPVCs תרמו היווצרות לולאה אנדותל גדול יותר באופן משמעותי בהשוואה BMSCs (p ≤0.01) ורשתות לא מטופל (p ≤0.01). BMSC שיתוף תרבויות הביא כמה שפחות אנדותל רשת לולאות בהשוואה לרשתות ללא טיפול (p ≤0.01). כימות זה מזהה סוג התא יש השפעה חיובית משמעותית על פיתוח רשת אנדותל (FTM HUCPVC) ואת סוג התא עשוי לפגום אפילו רשתות אנדותל. זה כדי לציין כי פיתוח רשת ולעלייה משמעותית נצפתה לתאם עם כיסוי MSC ברשתות אנדותל. הוא מציע כי האינטראקציות ישירה מכריעים עבור MSCs לבצע את תפקידם תומכת.

מלכודות אפשריות של מוסדות תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים מיוצגים איור 6. פלמור לקוי או לא אחידה של BME היא בעיה כי יכול להתערב עם פיתוח רשת אנדותל מוצלחת. עיתוי את הפילמור BME בדיוק 30 דקות והעברת המדיה מבלי לשבש את פעולת הפולימר יבטיח ללא פגע, פונקציונלי BME שלב (איור 6A). מכתים את MSCs דגירה ממושך פעמים ומאפשר את MSCs הצניפה לתקופה ממושכת עלולים להפריע תא ומורפולוגיה פנוטיפ על תרבויות המשנה. איור 5B מראה HUCPVCs FTM מוכתם 1 h ואסורכדי גלולה 1 h לפני תרבות משותפת, שניהם להיות תזמונים תת אופטימלית. FTM HUCPVCs אינם מראים העדפות לאתרים של רשתות אנדותל, פזורים ברחבי הרשת. השוואת כמו שצריך להתייחס HUCPVCs FTM כושלת תאים (איור 3), התאים שמציקים לו להציג מורפולוגיה תאים מעוגלים ואינטראקציות מוגבל-לתא עם תאי אנדותל (איור 6B). לבסוף, אם אין אפשרות להקים וזמינותו הטבעת אבי העורקים ביום של הקרע, aortas שניתן לאחסן ב-80 מעלות צלזיוס בתקשורת EGM-C, בתוספת 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) ו-10% FBS. פיתוח רשת אנדותל יכול לקחת 1-3 d יותר בשעת החלת המופשרים טבעות אבי העורקים לעומת רקמות טריים, אך הרשתות אנדותל יהיה מספיק לביסוס תרבות משותפת MSC (איור 6C).

כמו הליך חלופי המבדק תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים, השבר הסלולר של טבעות אבי העורקים BME מוטבע יכול להיות חילוץ, נותחו על ידי cytometry זרימה (משלים איור 1). דה מרקר ספציפי האנושי TRA-1-85 (איור משלים 1A, B, ציר y) האוכלוסייה תא חיוביים מ- FTM HUCPVC המכילה תרבויות המשנה זוהה MSCs אנושי. Labelling במשותף הראה ביטוי נמוך של סמן תא אנדותל CD31 (איור משלים 1A) ביטוי גבוהה של סמן pericyte CD146 (איור משלים 1B) בתוך האוכלוסייה תא חיובי סמן אנושי ספציפי. הערכה כזו יכולה לפענח immunophenotypic בסופו של דבר ושינויים מחויבות שושלת היוחסין של MSCs שנגזרות את האינטראקציות עם תאי אנדותל, לספק מידע רב ערך על סוג התא שנבדקו נוסף. על מנת לקבל מספר מספיק של תאים לניתוח FC, ניתן לשלב את התאים הנשאבים מבארות מקבילות של אותה הקבוצה הניסיונית. חשוב לשקול שימוש MSC הלא-pre-צבעונית המכילה את הטבעות אבי העורקים לניתוח cytometry זרימה זריחה המזכיר של לצבוע קיימא לא יפריע האות של fluorophores נוגדנים הקשורים. אחרת gating שלילי צריך לקחת את פלורסצנטיות תא מוכתם מראש בחשבון.

שיישבנו MSCs טופס שחולצו הטבעת אבי העורקים שיתוף התרבויות האנושיות (יום 7 של תרבות משותפת) באמצעות נוגדן ספציפי סמן משטח (TRA-1-85) של תאים אנושיים. FTM HUCPVCs ו- BMSCs התאוששה וזמינותו הטבעת אבי העורקים עובדו לניתוח qPCR לבדוק הביטוי של גנים אנגיוגנזה. באמצעות מערך qPCR זמינים מסחרית, שלוש התרבויות שיתוף הטבעת אבי העורקים מספק כמויות מספיקות של חומר גנטי כדי לכמת את הביטוי של גנים פקטורי גדילה אנושי 84 (איור משלים 2A). תוצאות ראשוניות עולה כי FTM HUCPVCs ו- BMSCs express גורמי אנגיוגנזה המופרש מפתח ברמות דומות (איור משלים 2B). מלבד השוואת רמות הביטוי של סוגי תאים שונים ב וזמינותו, ההשפעה של העברת תאים EBM מבוסס assay מדיה מאמצעי התרבות הרחבה שלהם צריך להיחשב. בעת שימוש בתאים של פלסטיות פנוטיפי או גנטי גבוה יותר, וקבוצת ביקורת השוואה של MSCs האנושי בתקשורת EBM - ללא רקמה אבי העורקים - להיכלל ההערכה.

הדמיון בביטוי פקטור אנגיוגנזה של MSCs מרמז כי ההבדלים המשמעותיים הגדלת הרשת שלהם אינה תוצאה של פעילות paracrine שונים. זוהי קונקורדנציה עם התצפית קודמות המופיע מוגברת האינטראקציה הישירה המערכת כדי לקדם את פיתוח רשת אנדותל.

Figure 1
איור 1: תרשים סכמטי של יישום הרומן של ההתקנה Assay הטבעת אבי העורקים.
השלבים העיקריים של תוכנית ההתקנה וניתוח של תרבויות המשנה MSC עם הטבעת אבי העורקים וזמינותו יוקפו בקו אחיד תיבות, הערות נוספות יוקפו בקו מנוקד תיבות. סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: נציג תמונה של הניתוח רשת טבעת אבי העורקים.
רשתות אנדותל מחולקים לשלושה אזורים קונצנטריים בהתבסס על הבדלים מבניים: אזור לא מובנים בסמיכות רקמה הטבעת אבי העורקים (A), פיתח/מובנה רשתות אנדותל (B) ורשתות המתפתח ממוקם בפריפריה של ex-vivo התרבות רקמות (C). רביע אחיד עבור הרוזן לולאה וצמיחה של רשת מוקדי מוגדרים בתוך הרשת אנדותל מפותחת (B). x: סגור לולאה אנדותל נספרים ברביע אחיד. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: פלורסנט הדמיה של רשת תלויי-אזור אינטגרציה של האדם MSCs ב וזמינותו הטבעת אבי העורקים בעקבות 24 & 72 h.
HUCPVCs FTM (ירוק) prestained ו- BMSCs נוספו הרשתות המתפתח של שפופרת אנדותל הטבעת אבי העורקים. קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מתמונות שצולמו 24 שעות לאחר הקמת תרבויות המשנה MSC להציג HUCPVCs FTM זה להעביר באמצעות ECM והבית לרשתות היקפיים המתפתח אנדותל (A). תמונות הגדלה גבוהה יותר להציג מורפולוגיות מוארך של FTM HUCPVCs תוך כדי מגע קרוב עם הרשתות אנדותל (B). BMSCs פחות את תהליך ה-ECM של הבית לרשתות אנדותל עם אין העדפה הנצפה לרשתות המתפתח היקפיים (C). BMSCs להציג תא כדורית מורפולוגיות (D).
בהגדלה מיקרוסקופית פלורסצנטיות תמונות של MSCs prestained בשנת החולדה הטבעת אבי העורקים assay בעקבות 72 h של תרבות משותפת (E, F). FTM HUCPVCS מציגים מורפולוגיות מוארך תוך הצגת כיסוי אנדותל באמצעות אינטראקציות לתא ישיר עם תאי אנדותל (החצים הלבנים מוצק) הן צמתי הרשת והן בקוריאנית (E). BMSCs לשמור על התא כדורית מורפולוגיות מגובשים את צמתי רשת אנדותל (F). חץ שבור מייצג את הכיוון של צמיחה אנדותל רשת מתוך הרקמה הטבעת אבי העורקים. A, c: סרגל קנה מידה = 1,000 מיקרומטר B, מידה d:בר = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: בהגדלה פלורסצנטיות מיקרוסקופ תמונות של האינטראקציות פיזי תא אנדותל-Pericyte.
תאי אנדותל מוכתם נמצאו משויך רציפה בליטות חיבור HUCPVCs FTM מראש מוכתמים ברשת צינורי (A). פלורסנט תמונות של רשתות אנדותל מראש ויטראז'ים (EC, אדום) עם FTM מראש מוכתמים HUCPVCs (FTM, ירוק) מדגימים אינטראקציות recapitulating תא אנדותל, אינטראקציות pericyte (B). ת: בר סולם = 100 מיקרומטר בקנה מידה ב': בר = 200 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: כימות של רשת גדילה בטיפול MSC קבוצות 5 D לאחר הקמתה תרבות משותפת.
תמונות מיקרוסקופ הגדלה נמוכה שלב בניגודיות נלקחו מקבוצות הטיפול הטבעת אבי העורקים מידה רשת צמיחה והתפתחות (A). חץ פזורים מראה את הכיוון של רשת צמיחה. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. מיקרוסקופ תמונות שימשו כדי לכמת את מאפייני רשת, כולל בצמיחת הרשת מתכוון ואני מתכוון רשת היווצרות לולאה ברבע אחד וזמינותו. HUCPVCs FTM תרמו לצמיחה רשת גדולה יותר בהשוואה תרבויות המשנה BMSC ורשתות לא מטופל (p ≤0.001) (B). ערך p מחושב באמצעות ANOVA בכיוון אחד כדי להיות p <0.0001 באמצעות של Tukey פוסט מבחן (N = 3). לולאות ברשת לפחות ארבעה צדדים שנסגרו היו לכמת (C). FTM HUCPVC משותפת תרבויות מפותחות לולאות ברשת גדולה יותר בהשוואה BMSC תרבויות המשנה (p ≤0.001) ורשתות לא מטופל (p ≤0.01). ערך p מחושב באמצעות חד-כיווני אנובה להיות p < 0.0001 באמצעות בדיקת Post של Tukey (N = 3). הממוצע של 4 תחומים של רשתות אנדותל היו לכמת. סרגל קנה מידה = 250 מיקרומטר. לשם השוואה pairwise, * = p ≤0.05, * * = p ≤0.01, * * * = p ≤0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: שגיאות אפשריות בהקמת Assay הטבעת אבי העורקים.
אבי העורקים הטבעות המוטבעות הפילמור BME לא שלם עשוי להוביל רשתות אנדותל, לא עקביים, שבור (A). FTM HUCPVCs מוכתם לתקופות ארוכות עם פערי זמן גדול בין מכתים ויצירת שיתוף תרבויות, תשואה מינימלית יונת ואינטראקציות תא אנדותל (B). הרשת אנדותל של אבי העורקים עכברוש המאוחסן ב- 80 ° C, הקרת עבור הטבעת אבי העורקים assay (C). ת: בר סולם = 250 מיקרומטר B, c: סולם בר = 400 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

משלים איור 1: לזרום Cytometry ניתוח של HUCPVCs FTM אנושי המופק תרבויות המשנה הטבעת אבי העורקים.
שברים הסלולר של הטבעת אבי העורקים תרבויות היו מבודדים, מעובד לניתוח cytometry זרימה. Fluorophore מצומדת נוגדן נגד סמן משטח תאים מסוים אנושי (TRA-1-85, APC) הוחל בשילוב עם סמן אנדותל (CD31, FITC, (א)) או סמן (CD146, FITC, (B)) pericyte נוגדנים ספציפיים. האוכלוסייה תא חיובי עבור דה מרקר אנושי (ציר y) נבדק חיוביות נמוך עבור אנדותל סמן CD31 (A, Q2) ו חיובי גבוה עבור pericyte סמן CD146 (B, Q6). הדבר מצביע על כי FTM HUCPVCs שמר על תכונותיהם תא perivascular בתרבויות שיתוף הטבעת אבי העורקים, לא לפתח של פנוטיפ אנדותל. הגזרות על מגרשים הוגדרו באמצעות פקדי isotype התאמת הנוגדנים העיקרי יישומית. אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

משלים איור 2: ניתוח ה-PCR כמותי של אנגיוגנזה מפתח גנים.
ביטוי גנים דומים של גנים האנגיוגנזה מפתח על-ידי FTM HUCPVCs BMSCs לאחר שבוע אחד תרבות משותפת וזמינותו הטבעת אבי העורקים (A). נציג CT הערכים מוצגים בטבלה (B). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ישנם מספר שלבים קריטיים בהגדרת assay מוצלחת הטבעת אבי העורקים MSC תרבות משותפת הניסוי. ראשית, השלבים החשובים ביותר כאשר לבודד את חלוקתה אבי העורקים הם: 1) קבלת באופן בלעדי על קטע בית החזה של אבי העורקים; 2) הסרת בזהירות מסעף כלי הדם, החיבור, רקמת שומן ו; 3) חיתוך קטעים אפילו של אבי העורקים (~ 1 מ מ) כדי להגביל את השתנות בין כל וזמינותו. שנית, הטמעה מוצלחת של אבי העורקים טבעות לתוך BME הוא קריטי עבור זה וזמינותו. אם לא לגמרי, BME הוא polymerized, או polymerized לצר, הטבעות אבי העורקים שמוטבע על BME לא יוכלו ליזום הלבלוב אנדותל או שהם עלולים לפתח רשתות אנדותל מקוטע. אם הפילמור BME אינה מספיקה, מבחני אינם אמינים על כימות. שלישית, התקשורת מלאה אנדותל מועשרת גורם הכרחי לספק מזון עבור הטבעות אבי העורקים ליזום הלבלוב. ברגע הטבעות הטבעת אבי העורקים יזמו כלי הלבלוב, השלבים הבאים הקרובה קריטי לערב את סוג התא להיבדק. לשם כך, MSCs צריך להיות בהצלחה מראש צבעונית מנוהל על הטבעות אבי העורקים נבטי. ישנם שני ניתוחים קריטיים עבור מקטע זה. 1) בחירת היום המתאימה זריעה: הרשתות צריכה להיות בשלב פיתוח ועוד לא יהיו להגיע כיסוי גבוהה של התרבות היטב. אם MSCs לא ניתנת באופן מסודר, הוא הופך להיות מאתגר לכמת את ההשפעות נטו של MSCs על פיתוח רשת. 2) prestaining של MSCs לפני תוספת: אם MSCs יתר מוכתמים או נותרים ב גלולה עבור תקופה נרחב, הצליעה תתרחש זה פוגע יונת ואינטגרציה בתוך רשתות אנדותל. לבסוף, לכימות הרשתות יכול בקלות להיות מושגת אם הפקדים המתאימים מוכנים. אבי העורקים טבעות בלי MSCs יפתחו רשתות אנדותל כי העורקים עצמו תומך הלבלוב, אך MSCs עשוי לקדם את פיתוח רשת גדול עם מבנים שונים ברשת כמתואר בכתב היד. כימות של רשתות אנדותל צריך להיות בביצוע לפחות 5 d הבאים הקמת שיתוף תרבויות. בשל מערכת סגורה, האנגיוגנזה התגובה היא ארעית, רשתות אנדותל מתחיל להתנוון לאחר כ 7 d. אם מטרת התצפית היא להעריך את ההשפעה של סוג תא שנבדקו על ההתפתחות של רשתות אנדותל, כדאי לרכוש את התמונות בתוך השבוע הראשון של שיתוף culturing.

שינוי אפשרי של וזמינותו הנוכחי יכול להיות היישום של ראשי רקמה אנושית. קטע 1 מ"מ של עכברוש העורקים גורמת יחידה אחת עבור תרבות משותפת, aortas האנושי יכול לספק מספר רב של קטעים של מדידות מאוד עקבי. למרות הזמינות מוגבלת מאוד של קיימא מרקמות העיקרי, הפלט גבוהה מצביע על היתכנות פוטנציאליים. בעת פיתוח של assay עבור הערכות בקנה מידה גדול, מראש ויוצרים וזמינותו ואחסון מרכיביו עד תאי בדיקה הופכים לזמינים יכול להיחשב. הציפוי BME יכול להיות מוכן על תרביות רקמה צלחות ומאוחסנים בטופס קפואים, מיובש במשך תקופות זמן ארוכות יותר. בנוסף, כפי בדקנו במעבדה שלנו, רקמות אבי העורקים עכברוש יכול להיות קפוא ומאוחסנים ליישום מאוחר יותר, ובכך עושה עבודה עם יסוד וזמינותו נוחה יותר חיונית ביותר.

למרות היתרונות הרבים של הטבעת אבי העורקים וזמינותו, קיימות מגבלות כמה שיהיה רשום. ראשית, הקמת התרבויות assay יכול להיות מאתגר. במתכונתו הנוכחית, היישום שגרתי מחייב מיומנויות ידניות מספיקות. שגיאות מפעיל יכול להציג את השתנות. ניתנים לשיקוף בצמיחה רשת והוא יכול לעשות את זה קשה להעריך בצורה אמינה את ההשפעה של תאים מנוהל וכתוצאה מכך את המאפיינים החשובים אנגיוגנזה. עם זאת, אלה אתגרים דומים, אם לא קטן יותר בהשוואה לאלה של שיטות אחרות זמינים, תקופת ההכשרה הנדרשת וניתן בנוחות קצר וכלכליות בניגוד ויוו ניסויים. שנית, תקופת השהיה בין ההטמעה של הרקמה שמחוץ אבי העורקים ופיתוח רשת הראשונית המסמן הזמן מינהל התא צריך להיות אחראים על-ידי המשתמש. שלישית, כימות של מאפייני רשת אנדותל יכול להיות זמן רב אך יכולים להיפתר על-ידי הקצאת פרמטרים הולמרק, כולל גידול רדיאלי, צינור מידות רשת רשת לאורכה. זה יכול להתבצע באמצעות המחשב בעזרת ניתוח של תמונות (תמונה J), אשר יכול להפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש על כימות עקבית ומהימנה. רביעית, ההשתנות בין כל assay יכול להתרחש עקב חוסר עקביות קלה ב מקור ברקמות בעלי חיים וטיפול על ידי המפעיל. מצאנו כי האתגר הזה ניתן להתגבר ביעילות, כימות הופך להיות אמין מבחינה סטטיסטית על-ידי הגדרת triplicates עבור כל קבוצת הטיפול. לבסוף, חילוץ ומיון את התאים של האדם ואת מקורם עכברוש assay שלאחר ניתוח יכול להיות מאתגר. עם זאת, ניתן להחיל proteinases ספציפיים, כולל dispase, פתרון שחזור תא לשחזר תאים לניתוח ביטוי immunophenotypic או הגן.

לעומת שיטות קיימות תרבות סוג תא אנדותל בודד או לחיות מערכות בעלי חיים, זה הציג assay שימושים השילוב של ex-vivo רקמות אבי העורקים BME. תוכנית התקנה זו מאפשרת למשתמש לקבל נתונים הן כמותיים שחקרתי האנגיוגנזה מאפייני תא טיפול מועמדים. שילוב BME ורקמות רב תאית שמחוץ מספק מאפייני מקרוב מחקה את microenvironment סוג התא טיפולית עשוי להיתקל בהן לאחר המינהל המקומית. בגלל האפשרות של מספר גבוה של מקבילות והשליטה תנאים תרבות קרוב, המפעיל מסופק עם מערכת המכילה רכיבים הנדרשים להערכה אמינה, תוך ביטול משתנים וחוסר עקביות שנמצאו ב מודלים בבעלי חיים. יתר על כן, הערכות הן יותר ריאלי כיוון שהוא מפחית את עלות והצורך ההליכים בבעלי חיים חוזרים ונשנים. תא בודד מבחני ומודלים ביותר בבעלי חיים חסרי גורמים ומשתנים שהוצגו על ידי תגובות חיסוניות שיתרחשו אחרת ביישום קליני של התא טיפול מועמדים. התגובה דלקתית הפיצולים אנגיוגנזה ולכן האפקט הטיפולי של חומרים מושתל או תאים לא ניתן לכמת במדויק. וזמינותו הטבעת אבי העורקים אינו כולל רכיבים דלקתיים רבים זה להפריע assay מדידות. עם זאת, הוא מכיל מקרופאגים תושב כי הם שחקנים חשובים פיתוח microvasculature32. עם זיהוי קל רשת אנדותל והן תאים אנושיים prestained, ההשפעה של ציטוקינים דלקתיים MSC מופרש ורכיבים אפילו הסלולר של המערכת החיסונית, ניתן בקלות לצפות שימוש assay הזה.

שליטה גבוהה על-ידי המשתמש על התנאים assay ולאופי לשחזור הגדרת הניסוי מאפשר היכרות של רכיבים נוספים במערכת. ראשית, וזמינותו הטבעת אבי העורקים יכול לשמש כמודל פציעה. בעקבות ההטמעה של טבעות אבי העורקים, לבלוב אנדותל, מבחני יכול להיות מוצג בפני פגיעה איסכמי, גורמים דלקתיים (TNF-α) או חיידקי ליפופוליסכריד (LPS), ואחריו MSC תוספת כדי לקבוע הצלה אפשרי של אנגיוגנזה תגובה בעקבות פגיעה. שנית, להבהיר את מנגנונים אפשריים של כיצד MSCs לתרום התגובה האנגיוגנזה, neutraliיכול להיות מנוצל זינג נוגדנים להשתיק קריטי עבור אינטראקציות לתא פוטנציאליים קולטנים. לבסוף, כדי לחקור את המאפיינים paracrine של MSCs, ניתן וזמינותו הטבעת אבי העורקים ההתקנה במערכת transwell כדי לא לכלול את ההשפעה של אינטראקציות לתא של אנגיוגנזה התגובה אבל המוקד על מאפיינים paracrine.

לסיכום, וזמינותו הטבעת אבי העורקים ניתן להעריך את היכולת ואת העוצמה של מועמדים לטיפול תא לתווך ECM עיבוד, להעביר אל תחומי אנגיוגנזה, ולתרום כלי הפיתוח באמצעות מגע פיזי. ניתן לפתח כלי סינון מראש יקרי ערך, כמותיים המועמד שורות תאים לטיפול משובי הטבעת אבי העורקים שמחוץ אנגיוגנזה וזמינותו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ד ר קליפורד ל' Librach הוא מחזיק משותף של הפטנט: שיטות בידוד ושימוש של תאים שמקורם ברקמות חבל הטבור בשליש הראשון. העניק קנדה ואוסטרליה.

Acknowledgements

המחברים תודה חברי הצוות הבאה ומחקר אנשי צוות: אנדרה גותייה-פישר, מתיו Librach, טניה ברטו, Tharsan Velauthapillai, שרה Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56, (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10, (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105, (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3, (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9, (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50, (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7, (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122, (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14, (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5, (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13, (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7, (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105, (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10, (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98, (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10, (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80, (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3, (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22, (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1, (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181, (8), 5711-5719 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics