대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구

Developmental Biology

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Summary

여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.

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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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Abstract

신생은 복잡 하 고, 높은 규제 프로세스를 제공 하 고 적절 한 조직 관류를 유지에 대 한 책임. 지나치게 풍부한 혈관 개발은 암 및 염증 성 질환 관련 된 부족 한 맥 관 구조 유지 보수 및 병 적인 기형 심한 허 혈 성 질환에서 발생할 수 있습니다. 프로-신생 치료의 유망한 형태 신생 셀 소스, 새로 개발 하는 맥 관 구조에 대 한 규제 요인으로 물리적 지원을 제공할 수 있는의 사용 이다.

Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)를 감지 하 여 허 혈 성 또는 염증 조직에 집 혈관 재생 paracrine 효과 및 그들의 능력에 대 한 광범위 하 게 조사 후보자 이다. 특히, 처음 3 달 동안 인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (FTM HUCPVCs)는 그들의 pericyte 같은 속성, 높은 증식 및 multilineage 잠재력, 면역 권한 속성, 및 강력한 paracrine 매우 유망한 후보 프로 파일입니다. 효과적으로 평가 하 고 잠재적으로 신생 재생 세포, 그것은 그들에 신뢰할 수 있는 및 "번역" 전 임상 분석 실험 테스트는 필수 이다. 대동맥 반지 분석 결과 비보 전 신생 모델입니다 관 내 피 구조의 쉬운 정량화를 허용, 액세서리 지원 세포와 세포 외 기질 (ECM) 호스트에서 염증 구성 요소를 제외 하며는 빠르고 저렴 한 설정. 이것은 (예를 들어, 각 막 분석 결과, Matrigel 플러그 분석 결과); vivo에서 모델에 비해 유리 대동맥 반지 분석 결과 관리 셀을 추적 하 고 이종 면역 거부를 피하고 있는 동안 세포 상호 작용을 관찰할 수 있습니다.

선물이 개발 쥐 대동맥 내 피 네트워크 공동 문화에서 인간의 MSCs를 포함 하는 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로토콜. 이 분석 결과 관 형성 및 물리적 pericyte 같은 상호 작용을 통해 개발에 MSC 기여와 신생의 사이트를 적극적으로 마이그레이션하기 위한 그리고 그들의 능력을 수행 하 고 중재를 평가 하기 위한 그들의 힘의 분석에 대 한 허용 ECM 처리입니다. 이 프로토콜은 MSC 표현 형 유전자 표현 공동 문화에 따라 변화에 추가 정보를 제공 합니다.

Introduction

신생의 복잡 한 프로세스 향상 하 고 기존 맥 관 구조1에서 새로운 선박 개발을 추진 하 여 조직 관류를 유지 합니다. 프로-신생 및 안티-신생 요인에 의해 단단히 규제, 공정한 과정 이다. 어떤 결핍이이 시스템에 부족 한 선박 유지 보수 또는 성장, 심근 질환, 뇌졸중, 신경 장애 등 심각한 허 혈 성 질환을 일으키는 발생할 수 있습니다. 그러나, 과장 된 혈관 개발 조건 암, 염증 성 질환2를 포함 하 여 특징입니다.

유리한 조직 재생을 달성 하기 위해 신생을 제어 하는 것을 목표로 하는 치료를 개발 하는 것은 중요입니다. 광범위 한 전 임상 및 임상 조사에도 불구 하 고 신생 프로 신생 요인과 microRNAs를 사용 하 여 자극 하려고 원하는 결과3,,45달성 못했다. 일시적 효과 대 한 가능한 이유: 신생 단백질 및 핵 산의 한정 된 수의 제한 된 장 수 대상 성장 요인6,7. 수용 성 신생 요소는 신생을 시작에 대 한 필수, 유지 보수 및 맥 관 구조의 기능 세포 유형 pericytes 및 평활 근 세포8을 포함 하 여 지원에 따라 다릅니다. 프로-신생 요법의 분야는 지금 잠재적인 줄기 세포 그리고 조상 세포 원 맥 관 구조, 자동 갱신 또는로 차별화 개발 물리적으로 새로 지 원하는 신생 요소를 로컬로 제공할 수 있습니다 탐험 내 피 같은 셀9,10. 찾는 최적의 신생 세포 유형 이러한 기능적 요구 사항을 충족 하는 기능으로 허 혈 성 조직 재생에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다.

임상으로 잠재적인 세포 기반 치료를 성공적으로 번역 하기 위해 전 임상 연구 하 그들의 효능을 입증 하 고 기본 신생 메커니즘을 강조 해야 합니다. 설립 된 신생 분석 실험의 높은 숫자에도 불구 하 고 필드 "금 표준" 생체 외에서 분석 결과 안정적으로 잠재적인 후보 셀 유형11,12, 의 효능을 평가할 수 있는 부족 13. 대부분 체 외에서 신생 분석 실험 (내 피 확산, 마이그레이션 및 관 형성 분석을 포함 하 여) 일반적으로 내 피 세포의 phenotypical 변화 나 감 별 법으로 셀 또는 화합물의 효과 평가 관 및 네트워크 구조14,15. 이러한 기능은 신생에 대 한 중요 한 동안, "번역" 분석 결과 또한 평가 해야 한다: 1) 확대 또는 pericytes 또는 평활 근 세포, ECM, 지하실 막의 2) 처리를 포함 하 여 지원 세포 유형의 교체 및 3) 기능 microvasculature의 형성을 촉진 하는 효율성. 각 막 분석 결과 및 Matrigel 플러그 분석 결과를 포함 하 여 신생 모델, vivo에서 독특한 vivo에서 microenvironment을 정리 하지만 추적 관리 셀의 어려움에 의해 도전 물리적 상호 작용을 관찰 하. 또한, vivo에서 모델 이종 면역 거부 잠재 수용자 세포 치료 후보16테스트 하는 동안 발생할 수 있습니다. 신생 모델 비보 전 특히 대동맥 반지 분석 결과 제공할 수 있습니다: 1) 쉽게 관찰과 3) ECM 호스트와 인공 공급에서의 염증 성 제외 4) 관 형 구조, 2) 액세서리 지원 셀의 정량화 구성 요소, 및 5) 신속 하 고 저렴 한 설치17,18. 일반적으로, 대동맥 반지 분석 결과 작은 분 비 단백질, 약리학 대리인, 및 유전자 변형 쥐 모델19,,2021의 신생 잠재력을 테스트할 수 있습니다.

MSCs는 주로 그들의 paracrine 중재 효과22,,2324통해 혈관 재생을 위한 유망한 후보자. 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), Hepatocyte 성장 인자 (HGF)를 포함 한 주요 신생 요인 분 비 MSCs 보였다 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 및 angiopoeitin-1 (중앙-1)25 ,26. 그러나 MSCs도 검색할 수 있습니다 그리고 집에 허 혈 성 또는 염증 조직, 조사를 받고 아직도, 정확한 메커니즘은. 점점, 문학 가설 대부분 MSCs 혈관 주위 세포에서 발생 하는 공동 pericyte 마커, 표현 그리고 pericytes27처럼 행동 수를 지원 합니다. HUCPVCs는 인간의 탯 줄의 혈관 주위 지역에서 파생 하는 MSCs의 젊은 소스입니다. 그들은 pericyte 같은 속성으로 MSCs의 인구를 대표 하 고 용어와 FTM 탯에서 특징. FTM HUCPVCs CD146 및 높은 증식 및 multilineage 잠재력 NG2 면역 권한 속성을 비롯 한 pericyte 마커의 높은 식 설명 하 고 강력한 paracrine 프로필28을 표시 합니다. FTM HUCPVCs pericyte 같은 속성을 통해 새로운 맥 관 구조의 프로 모션을 통해 손상 된 조직의 재생을 촉진 하는 이상적인 후보자 셀 유형입니다.

신생 잠재력과 인간의 MSCs의 pericyte 같은 속성을 테스트 하려면 신생 분석 실험의 매우 제한 된 수 있으며 사용할 수 있는 긍정적인 angiotropic 마이그레이션 ("추적" 라 함), ECM 처리, 물리의 개발 셀 형식 간의 상호 작용 microvasculature 개발에 양적 데이터를 가져오는 동안, 조사 될 수 있다.

이로써 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램을 설명 하는 프로토콜. 인간의 MSCs 공동 개발 쥐 파생 대동맥 내 피 네트워크 형성, 성숙, 및 항상성 튜브에 그들의 기여를 평가 하기 위해 경작 했다. 이 버전의 대동맥 반지 분석 결과 평가 능력과 집 신생의 사이트를 수행 하 고 ECM 처리를 중재 pericyte 같은 물리를 수립을 통해 내 피 관 개발을 세포 치료의 힘 상호 작용입니다. 생체 외에서 내 피 네트워크 형성에 MSCs의 그물 효과 측정 하 고 세포 상호 작용을 관찰, 뿐만 아니라 우리는 또한 공동 문화에서 MSCs를 분리 하는 프로토콜 최적화. Cytometry 및 정량 Pcr을 수행 하 여 특성화 MSC 표현 형 및 유전자 식 공동 문화에 따라 변화 가능 하다. 모델 셀 유형으로 우리 ontogenetically 일찍 비교 (태아)와 인간의 MSCs의 늦은 (성인) 소스: FTM HUCPVCs와 인간의 골 수 파생 된 MSCs (BMSC), 대동맥 반지 분석 결과에서 각각. 우리는 신생 재생 응용 프로그램에 대 한 조사를 받고 때 어떤 물리적으로 지 원하는 셀 형식의 신생 잠재력 연구 대동맥 반지 분석 결과 사용할 수 있습니다 제안 합니다.

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Protocol

동물 관련 된 모든 연구 실시 하 고 도착 지침 29에 따르면 보고 했다. 모든 연구 기관 연구 윤리 위원회 승인 (REB 수 4276) 수행 했다. 모든 절차는 대학 건강 네트워크 (토론토, 캐나다), 동물 관리 위원회에 의해 승인 되었다 동물과 모든 동물 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드, 8 번째 판 (준수 인도적인 치료 받은 2011 년 건강의 국가 학회).

1. 대동맥 반지 분석 결과 설치

  1. 분리 쥐 대동맥.
    1. Euthanize 8-10 주 된 Sprague-Dawley 쥐 CO 2 질을 사용 하 여: 20% 설정 CO 2 챔버 가스 교체 (유량 챔버 볼륨/분 x 0.2 =). Palpating 가슴 여 핀치 반사와 심장 박동의 부재에 의해 확인.
    2. 젖은 70% 에탄올으로 소독된 거 즈를 사용 하 여 가슴 지역에 모피. 소독된 집게와가 위를 사용 하 여 가슴 중간에 절 개 하 고 피부와 근육 레이어를 통해 잘라.
    3. 흉 곽을 노출 되 면 각 측에 흉 곽을 잘라 고 각 측에 흉 골에서 위쪽으로 약 5 mm. 신선한 시신에 있는 동맥에서 예상은 일부 출혈.
    4. 폐 조직과 심장 대동맥을 폭로 해 부 오른쪽으로 밀어. 대동맥은 백색 용기 있는 척추 열에 인접 한 색.
    5. (대동맥 아치) 후 대동맥을 공략 하 여 수술가 위 집게와 대동맥을 잡고 첫 번째 절 개를 사용 하 여 집게를 사용. 대동맥을 절단, 시 흉 혈액으로 신속 하 게 채울 것입니다, 따라서 그것은 혈액 응고 전에 대동맥을 신속 하 게 작업에 중요 한.
    6. 대동맥 그리고 척추에서 부드럽게 껍질을 아래쪽으로, 대동맥 겸 자 사용. 풀 추가 절 개 없이 있는 동맥 끊을 것 이다. 대동맥은 복 부 구멍에서 두 가지로 나누고 시체에서 대동맥을 잘라 전에 약 10 cm의 조직 및/또는 얻을. 꼬리 방향에 낮은 대동맥의 섹션에 액세스 하는 데 필요한 경우 횡 경 막 밀어.
      참고: 강렬한 힘 눈물을 일으킬 수 있기 때문에 대동맥을 부드럽게 껍질. 대동맥 눈물 몇 초 동안 혈액 응고를 허용 coagulated 혈액을 제거 하는 종이 타월을 사용 하는 경우 수 있도록 나머지 대동맥의 가시성.
    7. 차가운 행 크의 10 mL 15 mL 튜브에 대동맥을 배치 ' s 균형 소금 솔루션 (HBSS) 보충 1% 페니실린/스 (P/S). 얼음에 튜브를 계속
      참고: 대동맥 조직 얼음에 1-2 시간 지속 될 수 있습니다 하지만 최대한 신속 하 게 처리 하는 것이 좋습니다.
  2. 살 균 biosafety 내각 (BSC)에 대동맥 반지 분석 결과 문화 미디어 준비.
  3. 준비 2% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 %gentamicin 및 성장 요인 (재료의 표 참조)으로 보충 내 피 기저 매체 (EBM)의 500 mL를 필터링 하 여과 장치를 사용 하 여 내 피 성장 매체 (EGM)
      . 37에 구슬 또는 물 목욕으로 필터링 된 미디어의 50 mL을 배치 ° c.
    1. 다른 여과 장치를 사용 하 여 필터링 100 mL 2 %FBS 1% 보완 하는 EBM의 P/S는 EBM 준비 2 %FBS (EBM-FBS) 4에서 저장 ° c.
  4. 12 음 조직 문화 접시 기저 막 추출 (공학은)를 가진 얼음에 작업 하는 동안 코트.
  5. 장소 (대형 아이스 팩 또는 트레이) 차가운 표면에 12-잘 접시
      . 200 µ L/갓 해 동 공학은 사용 하 우물 피 펫 팁을 냉장 하 고 심지어 코팅 되도록 공학은 소용돌이 추가 합니다. 공학은의 불균일 중 합 방지를 신속 하 게 작업.
      참고: 전형적인 대동맥 절단 20 대동맥 고리를 생성합니다. 대동맥 반지 분석 실험 사이 가변성에 대 한 계정, 치료 그룹 당 최소한 3 개의 대동맥 반지 분석 실험을 설정 하 고 컨트롤 포함. 소스, 허용 하는 경우 치료 그룹 당 6 링 좋습니다.
    1. 습도 인큐베이터 (95% 상대 습도, 37 ° C, 5% CO 2;이 모든 습도 보육 단계에 적용이 조건)으로 코팅된 판 장소 30 분 장소 1000 µ L 피 펫 팁 다시 단계 1.5.3-20 ° C에.
      참고: 기저 막 추출 물 재고 농도에서 사용 하는 동안 그것의 일관성 및 강성은 엄격 하 게 제어 중 합 시간. 모든 패 러 랠 및 독립적인 실험에 대 한 정확한 동일한 중 합 시간을 지키는 것을 확인.
  6. 균일 한 반지로 대동맥을 섹션.
    1. 15 mL 튜브에서 대동맥 하 고 신선한 HBSS 보충 1%의 10 mL와 10 cm 접시에 배치 P/s.
    2. 집게의 두 세트를 사용 하 여 신중 하 게 초과 결합 조직, 지방 조직, 그리고 대동맥에 연결 되어 있는 동맥의 나머지 지점에 대 한 메스를 사용 하 여 분리. 이 잔여 조직의 다른 수준에 따라 링 장치 사이 가변성을 감소 시킨다. 어떤 잔여 대동맥 내부에서 혈액 응고 제거.
    3. 는 눈금자 나 눈금을 정확 하 게 1-2 m m 메 마른 메스와 집게를 사용 하 여 대동맥의 넓은 섹션 10 cm 접시 아래 놓습니다. 섹션을 단위 사이 가변성을 줄이기 위해 가능한 정확한 컷.
  7. 공학은에 대동맥 고리 포함.
    참고: 대동맥 링의 단면 공학은 합 부 화 하기 전에 완료 되지 않으면, 습도 인큐베이터에서 코팅된 접시를 제거 하 고는 중 합 종료 각 잘 하 EBM의 100 µ L를 추가. 정확한 타이밍은 공학은의 오버 합 내 피 네트워크 개발 및 셀 마이그레이션 방해 수 있습니다 중요 합니다. 일단 대동맥 고리 준비가 우물에서는 EBM을 제거 하 고 단계 1.5.2에서에서 계속.
    1. 습도 인큐베이터에서 공학은 코팅 웰 스를 제거 하 고 BSC 돌아갑니다.
    2. 는 신중 하 게 집게와 개별 대동맥 고리를 선택 하 고 각 공학은 코팅 잘 가운데 하나. 나머지 대동맥 반지에 대 한 반복.
      참고: 대동맥 반지 함께 전송 미디어 보관 해야 합 비리를 방지 하기 위해 최소한의.
    3. 사용 냉각 (-20 ° C) 1000 µ L 피 펫 팁 각 대동맥 고리 위에 공학은의 300 µ L을 추가 하 고 균등 하 게 배포 우물 주위 공학은.
    4. 30 분에 대 한 습도 인큐베이터에 포함 된 대동맥 반지 반환
    5. 습도 인큐베이터에서 포함 된 대동맥 링 플레이트를 제거 하 고 천천히 피펫으로 두어서 EGM (준비 및에서 예 열 단계 1.2.1)의 1000 µ L 문화의 벽에 잘 팁 추가.
      참고: 직접는 공학은에 미디어를 pipetting 수 polymerized 공학은 고 내 피 네트워크 지속적인 개발을 방해 됩니다. 적절 한 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 사용 가능한 경우.
    6. 24 h, EGM의 1000 µ L을 제거 하 고 준비 단계 1.2.2에서 다시 천천히 잘 문화의 측에 대하여 pipetting EBM FBS의 1000 µ L를 바꿉니다.
  8. 신선한 EBM-FBS (37 ° C)의 500 µ L 모든 48 h. EBM FBS의 500 µ L을 대체 하 여 대동맥 반지 분석 결과 유지
    참고: 참조 초MSC를 시작 하는 2 기 문화 대동맥 반지 분석 결과 설립으로 같은 날에 확장. 내 피 네트워크 준비가 MSCs 공동 문화에 대 한 준비는 이렇게 하면.
  9. 대동맥 반지 분석 결과 내 피 네트워크 개발에 따라 밝은 분야 현미경 검사 법 사용 (최적의 네트워크 개발에 대 한 참조로 그림 1 참조). 일단 내 피 네트워크 측면은 그림 2와 같이, 대동맥 반지 분석 결과-MSC 공동 문화 (제 3)를 설정으로 진행. 내 피 네트워크 이미징의 자세한 내용은 4.1 단계를 참조 하십시오.

2. 조직 문화

  1. 조직 문화 미디어의 준비 재고 솔루션.
    1. 문화 FTM HUCPVCs (이전 설립, n ≥ 각 3 독립 라인) 30과 알파-MEM 10 %FBS 1% 보충에 상용 BMSCs P/s.
    2. 0.2 µ m 기 공 크기 필터 병을 사용 하 여 미디어를 소독.
    3. 준비 미디어 솔루션 4 ° C에서 최대 3 주 동안 저장.
  2. 습도 incubators에 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 결정 하는 70-80 %confluency 통행 유지 FTM HUCPVC 및 BMSC 문화. 사용 하 여 적절 한 양의 조직 문화 접시의 크기에 대 한 미디어 사용 (즉, 10 cm 접시에 10 mL). 이러한 문화 조건을 유지 하 고 뿌리고 MSCs를 사용 하 여.
  3. 해리 뿌리고 위한 MSC monolayers 또는 대동맥 반지 분석 결과-MSC 분리 효소 솔루션 (요리 4 mL/10 cm)를 사용 하 여 공동 문화 및 3 분 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀의 확인 분리를 위한 습도 부 화기에서 품 어; 품 어 필요한 경우 추가 1-2 분.
  4. 15 mL 튜브를 5 분에 대 한 400 x g에서 원심 분리기로 해리 셀 전송
  5. 는 상쾌한 셀 펠 렛을 방해 하지 않고 발음 하 고 셀 카운터를 사용 하 여 계산에 대 한 적절 한 배양 (대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 대 한 셀 또는 EBM FBS를 뿌리고 대 한 완전 한 알파-MEM 미디어)의 1 mL에 셀 resuspend.

3. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화 준비

  1. 씨앗 10 4 MSCs 각 포함 대동맥 반지 (9000 셀/cm 2 / 12-잘 접시). 가능한, 함 형광 염료와 MSCs 얼룩 중 대동맥 반지 분석 실험의 수에 따라 달라 집니다. 컨트롤 그룹에 대 한 MSCs 없이 대동맥 고리의 적어도 3 개의 우물을 유지 합니다.
    1. 10 5 MSCs/mL EBM FBS 미디어 얼룩, 가능한의 2.5 µ L을 추가, 양도 형광 염료/mL 미디어 (5 µ M) 15 mL 튜브와 30 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 부드럽게 혼합 튜브는 인큐베이션을 통해 중간.
    2. 다음에 30 분 부 화, 스테인드 셀에 신선한 EBM FBS의 1 볼륨을 추가 하 고 5 분에 대 한 400 x g에서 회전
    3. 는 상쾌한을 제거 하 고 다시 EBM FBS 미디어의 1 mL에 셀 펠 릿을 중단. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 MSCs의 성공적인 얼룩 확인.
  2. 습도 인큐베이터에서 대동맥 반지-포함 된 번호판을 제거 하 고 각 우물에서 EBM-FBS의 500 µ L를 제거.
  3. 신중 하 게 고르게 내 피 네트워크 주위 pipetting으로 각 임베디드 대동맥 고리에 EBM FBS의 500 µ L에 10 4 MSCs 씨. 부드럽게 문화 접시를 떨고 하 여 분배를 확인 합니다.
    1. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 미디어의 총 볼륨 1000 µ L을 추가 EBM FBS 추가.
  4. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 시각화 대동맥 반지 분석 결과에 놓여있는지 이라는 MSCs.

4. 현미경

  1. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 전에 쥐 내 피 네트워크 이미지를 사용 하 여 밝은 분야 현미경 검사 법은 공동 내 피 네트워크 속성 (예:, 네트워크의 기준선 (0 일) 측정을 위한 문화 길이, 네트워크 루프)입니다. 해당 사분면 내 내 피 네트워크의 더 부분을 대동맥 링에서 잘 당 4 사분면 이미지. 다음 대동맥 반지
    1. 이미지는 대동맥 링 네트워크 분석 결과/MSC 공동 3, 5, 7 일에 문화. 이러한 이미지를 사용 하 여 내 피 네트워크 개발에 MSC 효과 계량.
  2. 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 사전 이라는 MSCs 대동맥 반지 분석 결과에.
    1. 다음 24 h 대동맥 반지 분석 결과/MSC의 공동 문화, MSC 추적, 신장 및 내 피 네트워크와 통합 시각화를 형광 현미경 검사 법을 사용 합니다. Colocalization 두 종류의 세포를 관찰 하는 내 피 세포의 밝은 필드 이미지와 MSCs의 형광 이미지를 오버랩.
    2. 이미지 대동맥 링 조직에 인접 개발된 내 피 네트워크 내에서 지역화 된 MSCs 및 새로 개발 원심 대동맥 링 조직 ( 그림 2)에 네트워크 내에서 지역화 된 MSCs.

5. Flow Cytometry 및 정량

  1. 대동맥 링 내 피 네트워크를 해리 한 전날 녹여 냉동된 dispase에서 4 ° C O/명. 섹션 5.3 cytometry 및 정량에 대 한 동일.
  2. Dispase의 고 37 ° C 구슬 또는 물 목욕 트립 신 0.5%의 50 mL 50 mL 따뜻한.
  3. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에서 분석에 대 한 셀을 검색합니다. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화의
    1. 후 1 주 문화 미디어를 제거 하 고 1 mL의 Phosphate-Buffered 염 분 (PBS) 천천히 하 각 3 분 잘 제거를 추가. 이 세척 두 번 더 반복.
    2. 추가 800 µ L의 사전 각 우물에 dispase를 예 열 하 고 15 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 품 어
    3. 습도 인큐베이터에서 플레이트를 제거 하 고 공학은, 헤어 (5-10 x)를 pipetting으로 dispase를 일시 중단 하 고 별도 15 mL 튜브 각의 내용을 전송.
    4. 반복 단계 5.3.3 다시 아니 잔여까지 신선한 미리 데워 진된 dispase 공학은 관찰 된다 문화에 잘. 1 볼륨 PBS 3%와 보충의 추가 dispase을 비활성화 하려면 dispase-세포 현 탁 액을 FBS. 피 펫 팁을 사용 하 여 세포 현 탁 액에 떠 있는 대동맥 고리 제거.
    5. 5 분은 상쾌한 신중 하 게 제거, 15 mL 튜브에 세포 현 탁 액 3 mL을 떠나는 대 한 400 x g에서 셀 정지 회전.
      참고:은 분명 하 고, 단단한 펠 릿 보이지 않을 수 있습니다 하지만 셀 및 공학은.
    6. 세포 현 탁 액 및 적극적으로 resuspend (5-10 x pipetting으로) 세포를 트립 신 0.5 %prewarmed의 3 mL를 추가합니다. 10 분에 대 한 습도 인큐베이터에서 trypsinized 셀 솔루션을 품 어
    7. 습도 인큐베이터에서 trypsinized 셀 정지를 제거 하 고 추가 3 %FBS resuspend 보충 PBS의 6 mL 몇 팀es입니다. 5 분에 대 한 400 x g에서 셀 정지 스핀
    8. 신중 하 게 튜브에 셀 펠 릿을 떠나 모든 상쾌한, 제거 하 고 1 ml PBS 3% 보충 셀 resuspend 각 관에서 FBS.
    9. 필터링 세포 현 탁 액에서 집계 된 셀 및 잔여 공학은 제거를 70 µ m 셀 스 트레이너를 사용 하 여 1ml 세포 현 탁 액. 셀 카운터를 사용 하 여 셀 서 스 펜 션의 1 mL에 셀.
  4. Cytometry 셀 준비.
  5. 품 셀
      정지 (3% 보충 200 µ L PBS에서 10 5 셀 FBS) fluorophore 활용 (FITC 또는 APC) 기본 항 체와 (TRA-1-85-CD146, CD31) 농도 = 1시 40분) 4 ° C에서 30 분, 빛 으로부터 보호.
      참고: cytometry MSCs에 대 한 홍 , 2013 28 최적화 했다. 최소 10000 셀은 정확한 판독에 필요한.
    1. 2 ml PBS 3 %FBS 원심 분리기 (400 x g, 5 분) 보충의 셀 resuspend 30 분 부 화 다음.
    2. Cytometry (적어도 1 x 10 4 이벤트)에 의해 분석까지 1 시간 이내 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 계속 셀. 제어 전략에 대 한 보충 그림 1을 참조 하십시오. 인간의 MSCs 안티-TRA-1-85 (APC)를 사용 하 여 정렬 (농도: 1시 40분 및 0.5 %FBS에서 / PBS) 및 정량 분석을 위한 세포 세포의 용 해 버퍼의 350 µ L로 셀 정렬.
      참고: Lysed 세포 수 저장 될-80 ° C에서 미래의 정량 분석에 대 한 최대 3 개월.
  6. 정량 분석에 대 한 셀을 준비.
    1. 열 기반 RNA 격리 키트를 사용 하 여 lysed 세포에서 RNA를 분리 하 고 RNA 농도 품질을 결정.
    2. 100 당 RNA의 최대 5 µ g에서 준비 cDNA µ L 역전사 반응. RNA 수익률이 낮은 경우에 사전 증폭 단계를 수행 (< 10 ng / µ L). 100의 사용 RNA의 ng false 네거티브의 높은 속도에서 발생 합니다.
      참고: cDNA 템플릿을 저장할 수 있습니다 추가 분석을 위해-20 ° C에서 최대 4 개월.
    3. 정량 유전자 발현에서 변화를 감지 하 신생 식 프로파일러 어레이 사용 하 여 수행 합니다. 반응 (40 주기, 어 닐 링/확장 온도 60 ° C) 당 cDNA의 사용 5 ng. 배 undifferentiated MSC 파생 된 cDNA 샘플에 비해 표현의 변화를 표현 한다. 적절 한 부정적인 컨트롤 (대동맥 반지 인간의 MSCs 없이) 실행.

6. 정량화 다음 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화 네트워크

  1. 신생 분석기 플러그인 31 함께 ImageJ 같은 이미징 소프트웨어 다운로드.
  2. 찍은 내 피 네트워크 이미지를 가져오고 소프트웨어를 사용 하 여 열기.
  3. 변환 사용 하는 현미경의 사양에 따라 이미지 비늘.
  4. 직선 도구를 사용 하 여 방사형 네트워크의 성장 측정.
  5. 계산 셀 카운터 도구를 사용 하 여 내 피 네트워크 루프 (루프 4 면으로 계량 한다).
  6. 네트워크 속성의 추가 정량화를 사용 하 여 신생 분석기 플러그인 또는 다른 유사한 플러그인 마스터 세그먼트 분석 대 한 총 세그먼트 길이, 총 네트워크 지역과 연결의 수. 흐리게 마스크 도구를 사용 하 여 대동맥 링 조직 및 거짓 긍정적인 계산을 피하기 위해 빈 공간을 흐림.
  7. 대동맥 반지 분석 결과/MSC 공동 문화에 따라 통계 프로그램 및 그래프 내 피 네트워크 속성에 값을 전송.

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Representative Results

대동맥 반지/MSC 공동 문화 분석 결과 설정에 대 한 구조 작업 흐름은 그림 1에 설명 했다. 주요 단계를 포함: 쥐 대동맥 절연, 단면 및 대동맥의 포함, 내 피 돋 아 및 네트워크 개발, 모니터링 및 마지막으로 라벨 및 MSCs를 관리. 내 피 네트워크 분석의 타임 라인 창 공동 경작의 각 기간에 대 한 가능한 분석에 대 한 설명: 5 일 1, & 7. 추가 참고 점선 상자로 강조 표시 됩니다.

대동맥 반지 내 피 세포 배양에서 구조적으로 뚜렷한 지역 식별 밝은 분야 현미경 검사 법, 대동맥 고리 ECM (그림 2)에 포함 된 후 3-5 d에 의해 수행 됩니다. 구조화 되지 않은 지역 (그림 2A) 높은 세포 증식 하지만 대동맥 조직의 직접 부근에서 낮은 구조 단체의 영역으로 특징입니다. 개발된 내 피 네트워크 (그림 2B) 영역 높은 구조 조직, 네트워크 완벽 하 게 설치 하 고 주로 MSCs의 추가 이전 닫힌된 루프의 구성를 참조 하십시오. 개발 네트워크 (그림 2C) 내 피 문화의 원심 영역에 있습니다. 이 내 피 세포 이동과 새로운 네트워크 구조 형태로 신장의 사이트. 위에서 언급 한 3 지구는 실험을 통해 쉽게 식별할 수 있으며 MSCs를 공동 문화에 홈을 참조할 때 사용 됩니다. 모든 3 개의 네트워크 세그먼트를 개발 하는 때 prelabelled MSCs 대동맥 반지 분석 결과와 공동 경작 되어야 합니다. MSC 공동 문화에 따라 내 피 네트워크의 정량화 개발 및 개발 네트워크 (그림 2, 화이트 프레임)의 영역을 포함 합니다.

형광 현미경 검사 법 MSC 마이그레이션, 통합 및 대동맥 반지-MSC 공동 문화 분석 결과 (그림 3)에서 내 피 네트워크 개발 함께에서 형태학의 질적 측정 할 수 있습니다. 가능한, 세포질 fluorophore와 표시 MSCs 공동 문화에 관리 후 24 h는 몇 군데 있었다. FTM HUCPVCs 개발 내 피 네트워크의 주변에서 발견 됐다, 길쭉한 세포 형태학, 표시 그리고 내 피 네트워크 (그림 3A, B)의 발전에 기여. 비교를 위해, BMSCs는 내 피 세포 (그림 3C, D)와 더 적은 상호 작용을 표시 하는 동안 개발 네트워크 홈. 고배율 이미지 72 h에 보여주었다 FTM HUCPVCs 높은 적용 및 내 피 네트워크 (그림 3E로 제한 된 통합 구형 형태학으로 제시 하는 공동 문화에 BMSCs 동안 내 피 네트워크의 안정화 유지 , F). 관찰 차이 명확 하 게 인간 MSC 형식 간의 질적, 기능적 차이 보여 줍니다. 중요 한 유도 및 내 피 통합 속성 치료 후보 세포 유형 (그림 3A, B & E) 제한 된 내 피 네트워크 통합 및 확대 셀 타입에 비해 눈에 띄는 기능 (그림 3C, D & F).

높은 확대 형광 현미경 이미지 추가 관 네트워크에 내 피 세포와 FTM HUCPVCs 간의 물리적 상호작용을 해 부를 인수 했다. 사전 이라는 FTM HUCPVCs (그림 4A, 녹색) 흠 없는 내 피 세포와 준수 표시 됩니다 (그림 4A, 흰색 화살표). FTM HUCPVCs 노드 사이의 축과 부착 표면으로 제공 하 여 내 피 세포에 구조적 지원을 제공을 발견 했다. 대동맥 링 내 피 네트워크 사전 이라는 얼룩 (그림 4B, 레드) MSC와 유사 하 게 실행 가능한 fluorophore를 사용 하 여 수 있습니다. 더블 스테인드 공동 문화, 형광 현미경 검사 법 강화 협력 및 지원 세포 행동의 관찰 두 세포 유형 사이의 길쭉한 유착을 공개 했다.

내 피 네트워크 구조 특성의 정량화는 MSC 공동 문화 (그림 5)의 5 일에서 수행 되었다. 균일 한 사분면 전체 대동맥 반지 내 피 네트워크 (그림 2, 화이트 프레임) 전체 측정을 위해 정의 되었다. 의미 네트워크의 성장 대동맥 반지를 더 원심 닫힌된 루프 (반지름 크기)에 의해 첫 번째 인접 폐쇄 네트워크 루프에서 거리로 계산 되었다 (그림 5A). 대동맥 반지-MSC 공동 문화의 의미 네트워크의 성장 했다 다음과 같습니다: FTM HUCPVCs (2.98 ± 0.3 m m) 및 BMSCs (1.5 ± 0.15 m m). 치료 내 피 네트워크는 1.9 ± 0.1 m m의 평균 반지름을 개발 했다. MSC 치료 그룹 간의 통계적 비교 시연 FTM HUCPVCs BMSCs와 치료 네트워크 (p ≤0.001)에 비해 상당히 큰 네트워크 성장에 기여. 공동 문화 (p ≤0.01)를 포함 하는 BMSC 보다는 더 크게 개발 치료 내 피 네트워크 (그림 5B).

루프의 총 숫자는 각 사분면에 계산 하 고 평균 총 루프 형성 (그림 5C)로 표현 했다. 총 닫힌된 루프의 평균 수는 다음과 같이 이었다: FTM HUCPVC 처리 공동 문화 (81 ±7), BMSCs (26 ± 3) 반지 (55 ±7) 치료. FTM HUCPVCs BMSCs (p ≤0.01)와 치료 네트워크 (p ≤0.01)에 비해 상당히 큰 내 피 루프 형성에 기여. BMSC 공동 문화 결과 적은 내 피 루프 치료 네트워크 (p ≤0.01)에 비해 네트워크. 이 정량화 내 피 네트워크 개발 (FTM HUCPVC)에 상당히 긍정적인 효과가 세포 유형 및도 내 피 네트워크를 손상 시킬 수 있습니다 있는 셀 형식을 식별 합니다. 그것은 크게 증가 네트워크 개발 내 피 네트워크에 MSC 범위와 잘 상관 관계를 관찰 했다 하는 것을 주의 될 것 이다. 그것은 직접적인 상호 작용은 그들의 지원 기능을 실행 하려면 MSCs에 대 한 중요 한 건의 한다.

대동맥 반지 공동 문화 설립의 가능한 함정 그림 6에 표시 됩니다. 공학은의 부적절 하거나 고르지 못한 중 합은 성공적인 내 피 네트워크 개발을 방해할 수 있는 문제 이다. 타이밍을 정확 하 게 30 분 동안 공학은 중 합 및 폴리머를 방해 하지 않고 미디어를 전송 그대로, 기능성 공학은 단계 (그림 6A)를 지킬 것 이다. 연장된 보육 시간 MSCs를 얼룩이 지 고 오랜된 시간 동안 펠 렛을 MSCs 수 있도록 방해할 수 있습니다 세포 형태학 및 공동 문화에 표현 형. 그림 5B 보여줍니다 FTM HUCPVCs 1 시간에 대 한 스테인드 및 허용공동 문화 전에 h 1에 대 한 작은, 둘 다 되 고 최적의 타이밍. FTM HUCPVCs 내 피 네트워크의 사이트 환경 설정을 표시 하지 않습니다 그리고는 네트워크 전체에 흩어져 있습니다. 분실된 FTM HUCPVCs 셀 (그림 3) 치료 제대로 비교, 분실된 셀 표시 둥근된 세포 형태학 및 제한 된 셀 상호작용 내 피 세포 (그림 6B). 마지막으로, 대동맥 반지 분석 결과 해 부의 날에 설정할 수 없는, 경우는 aortas에 저장 될 수-80 ° C 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 10% 보충 EGM C 미디어에서 FBS. 내 피 네트워크 개발 신선한 조직에 비해 해 동된 대동맥 고리를 적용 하는 경우 1-3 d 이상 걸릴 수 있습니다 하지만 내 피 네트워크 MSC 공동 문화 설립 (그림 6 c)에 대 한 충분 한 될 것입니다.

대동맥 반지 공동 문화 평가의 대체 절차로 공학은 포함 대동맥 반지 세포 일부 추출 고 cytometry (보충 그림 1)에 의해 분석 될 수 있습니다. 인간의 특정 마커 TRA-1-85 (보충 그림 1A, B, y 축) 긍정적인 세포 인구에서 FTM HUCPVC 공동 문화를 포함 하는 인간의 MSCs로 확인 되었다. 공동 라벨 낮은 식의 내 피 세포 마커 CD31 (보충 그림 1A)과 높은 식이 pericyte 마커 CD146의 (보충 그림 1B) 인간의 특정 마커 긍정적인 세포 인구 내 보였다. 이러한 평가 최종 immunophenotypic와 내 피 세포와 상호 작용에 의해 유도 된 MSCs의 혈통 지 변화 해독 하 고 추가 테스트 셀 형식에 대 한 유용한 정보를 제공할 수 있습니다. FC 분석에 대 한 셀의 충분 한 수를 얻기 위하여 동일한 실험적인 그룹의 병렬 우물에서 추출한 세포를 결합할 수 있습니다. 그것은 가능한 염료의 연상 형광 항 체 관련 fluorophores의 신호 방해 하지 않습니다 있도록 흐름 cytometry 분석에 대 한 대동맥 고리를 포함 하는 사전 얼룩이 진 MSC를 사용 해야 합니다. 그렇지 않으면 부정적인 게이팅 미리 스테인드 셀 형광을 고려 해야한다.

우리 인간의 MSCs 추출한 양식 대동맥 반지 공동 문화 (공동 문화 7 일) 정렬 인간 세포 표면 마커 특정 항 체 (TRA-1-85)를 사용 하 여. FTM HUCPVCs 및 BMSCs 대동맥 반지 분석 결과에서 발견 한 신생 유전자의 식을 테스트 하는 정량 분석에 대 한 처리 되었습니다. 상업적으로 사용할 수 있는 정량 배열을 사용 하 여, 3 대동맥 반지 공동 문화 84 인간 성장 인자 유전자 (보충 그림 2A)의 표현 척도를 유전 물질의 충분 한 양을 제공. 예비 결과 FTM HUCPVCs 및 BMSCs 익스프레스 키 분 비 신생 대 등 한 수준 (보충 그림 2B)에서 요소를 나타냅니다. 비교 분석 결과에서 다른 세포 유형의 식 수준, 게다가 EBM 셀 전송 효과 그들의 확장 문화 미디어에서 미디어를 고려해 야 하는 분석 결과 기반으로 합니다. 더 높은 phenotypic 또는 유전 소성의 셀을 사용 하면 EBM 미디어-대동맥 조직-없이 인간의 MSCs의 비교 컨트롤 그룹 평가에 포함 되어야 합니다.

MSCs의 신생 요소 표현에서 유사성 그들의 네트워크 확대에 상당한 차이가 다른 paracrine 활동의 결과가 아니다는 것을 건의 한다. 이것은 이전 관찰 증가 직접 세포 상호 나타나는 내 피 네트워크 개발을 촉진 하는 색인 이다.

Figure 1
그림 1: 대동맥 반지 분석 결과 설치의 새로운 응용 프로그램의 회로도.
설치의 주요 단계 및 MSC 공동 문화 대동맥 반지 분석 결과의 분석은 단단한 상자에 설명 하 고 추가 노트 점선된 상자에 설명 되어 있습니다. 눈금 막대 = 1000 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 대동맥 링 네트워크 분석의 대표 이미지.
내 피 네트워크 구조 차이에 따라 세 동심 지역으로 분할 된다: 대동맥 반지 (A), (B), 내 피 네트워크 개발/구조 조직과 개발 네트워크에 가까운 근접에서 구조화 되지 않은 영역 ex vivo 조직 문화 (C)의 주변에 위치 해 있습니다. 방사형 네트워크 성장 및 루프 카운트에 대 한 균일 한 사분면 개발된 내 피 네트워크 (B)에서 정의 됩니다. x: 내 피 폐루프 유니폼 사분면에 계산. 눈금 막대 = 250 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 형광 이미징의 네트워크 지역 종속 통합의 인간의 MSCs 대동맥 반지 분석 결과 24 다음에 & 72 h.
Prestained (녹색) FTM HUCPVCs 및 BMSCs 개발 대동맥 링 내 피 튜브 네트워크에 추가 되었습니다. 형광 현미경 이미지 MSC 공동 문화 표시는 ECM와 주변 개발 내 피 네트워크 (A)를 통해 마이그레이션하는 FTM HUCPVCs 설립 후 24 h를 찍은. 높은 확대 이미지 표시 내 피 네트워크 (B)와 긴밀 한 접촉에 (서) 동안 FTM HUCPVCs의 길쭉한 형태학. 적은 BMSCs 과정 ECM 및 내 피 네트워크에 홈 주변 개발 네트워크 (C)에 현저한 기본 설정이 없습니다. BMSCs 구형 세포 형태학 (D)를 표시합니다.
높은 확대 쥐 대동맥 반지 분석 결과 공동 문화 (E, F)의 72 h 다음에 prestained MSCs의 형광 현미경 이미지. FTM HUCPVCS 네트워크 노드 및 tubules (E) 모두에서 내 피 세포 (단단한 흰색 화살표)와 직접 셀 상호 작용을 통해 내 피 범위를 표시 하는 동안 길쭉한 형태학을 제시. BMSCs 내 피 네트워크 노드 (F)에 클러스터 된 하는 구형 세포 형태학을 유지 합니다. 브로 큰 애 대동맥 링 조직에서 내 피 네트워크 성장 방향을 나타냅니다. A, c: 눈금 막대 = 1000 µ m B, d: 규모바 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: Pericyte 내 피 세포 물리적 상호 작용의 높은 확대 형광 현미경 이미지.
흠 없는 내 피 세포는 연속 돌출 관 네트워크 (A)에서 미리 스테인드 FTM HUCPVCs 연결에 관련 된 발견 되었다. 미리 스테인드 FTM HUCPVCs (FTM, 녹색)으로 전 얼룩진된 내 피 네트워크 (EC, 빨간색)의 형광 이미지 상호 작용 내 피 세포, 업과 pericyte 상호 작용 (B)를 보여 줍니다. A: 눈금 막대 100 µ m b: 눈금 막대 = = 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: MSC 치료에서 네트워크 성장의 정량화 공동 문화 설립 후 5 D 그룹.
낮은 확대 단계 대조 현미경 이미지 측정 네트워크 성장 및 개발 (A)을 대동맥 링 치료 그룹에서 촬영 됐다. 흩어져 화살표 네트워크 성장 방향을 보여줍니다. 눈금 막대 = 250 µ m. 현미경 이미지 네트워크 속성, 의미 네트워크의 성장 등을 계량 하 고 분석 한 결과 사분면에 네트워크 루프 형성을 의미 하는 데 사용 했다. BMSC 공동 문화 및 치료 네트워크 (p ≤0.001)에 비해 더 큰 네트워크의 성장에 기여 하는 FTM HUCPVCs (B). P 값을 단방향 ANOVA를 사용 하 여 계산 된 p <0.0001 Tukey의를 사용 하 여 게시물 테스트 (N = 3). 적어도 4 개의 닫힌 측면과 네트워크 루프 계량 했다 (C). FTM HUCPVC 공동 개발된 큰 네트워크 루프 BMSC 공동 문화 (p ≤0.001)와 치료 네트워크 (p ≤0.01)에 비해 문화. P 값 p을 단방향 ANOVA를 사용 하 여 계산 된 < 0.0001 Tukey의 게시물 테스트를 사용 하 여 (N = 3). 내 피 네트워크의 4 분야의 평균 정량 했다. 눈금 막대 250 µ m =. 인덱스도 비교에 대 한 * = p 0.05 * * p ≤0.01 = * * * = p ≤0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 대동맥 반지 분석 결과 설립에서 가능한 오류.
대동맥 고리 불완전 공학은 중 합에는 일관성과 깨진 내 피 네트워크 (A)으로 이어질 수 있습니다. FTM HUCPVCs 얼룩이 얼룩 및 공동 문화, 수율 최소한의 유도 및 내 피 성장 세포 상호 작용 (B) 설정 사이 큰 시간 간격으로 오랜 기간 동안. 쥐 대동맥에서 내 피 네트워크-80 ° C에 저장 되며 대동맥 반지 분석 결과 (C)에 대 한 해 동. A: 눈금 막대 = 250 µ m B, c: 눈금 막대 = 400 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

보충 그림 1: 인간의 FTM HUCPVCs 대동맥 반지 공동 문화에서 추출의 Cytometry 분석 흐름.
대동맥 반지 문화의 셀룰러 분수 고립 되었고 흐름 cytometry 분석에 대 한 처리. 인간의 특정 세포 표면 마커 (TRA-1-85, APC)에 대하여 Fluorophore 활용 된 항 체 내 피 마커 (CD31, FITC, (A)) 또는 pericyte 마커 (CD146, FITC, (B)) 특정 항 체와 조합에 적용 되었다. 인간의 마커 (y 축)에 대 한 긍정적인 세포 인구는 낮은 양성 내 피 마커 CD31 (A, q 2) 및 (B, Q6) pericyte 마커 CD146에 대 한 높은 긍정적인 테스트. FTM HUCPVCs 대동맥 반지 공동 문화에 그들의 혈관 주위 셀 속성을 유지 하 고 내 피 형을 개발 하지 않았다 제안 합니다. 플롯에 사분면 일치 적용된 기본 항 체 isotype 컨트롤을 사용 하 여 정의 되었다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

주요 신생 유전자의 보충 그림 2: 양이 많은 PCR 분석.
FTM HUCPVCs와 BMSCs 1 주 공동 문화 대동맥 반지 분석 결과 (A)에서 다음과 같은 주요 신생 유전자의 유사한 유전자 식입니다. 대표 CT 값 테이블 (B)에 표시 됩니다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

성공적인 대동맥 반지 분석 결과 MSC 공동 문화 실험 설정에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 하 고 대동맥을 구분 하는 경우 가장 중요 한 단계는: 1) 대동맥;의 독점적으로 흉부 세그먼트를 취득 2) 신중 하 게 분기 혈관, 결합 및 지방 조직 제거 및; 각 분석 결과 사이 가변성을 제한 하는 대동맥 (~ 1 m m)의 3) 절단도 섹션입니다. 둘째, 공학은으로 대동맥의 성공적인 포함은이 분석 결과 대 한 중요 합니다. 경우는 공학은 완전히 생산 또는 균등 하 게 생산, 대동맥 고리는 공학은에 포함 내 피 돋 아를 시작할 수 없습니다 또는 그들은 불연속 내 피 네트워크를 개발할 수 있습니다. 공학은 합 충분 하지 않으면 분석 정량화에 대 한 신뢰할 수 없습니다. 셋째, 완전 한 요인 농축 내 피 미디어 돋 아 시작 하 대동맥 반지에 대 한 영양을 제공 하는 데 필요한입니다. 일단 대동맥 링 반지 선박 돋 아 시작, 다음 중요 한 곧 나오는 단계 테스트 셀 형식을 포함 한다. 이 위해 MSCs 성공적으로 미리 스테인드 하 고 돋 아 대동맥 고리를 관리 해야 합니다. 이 섹션에 대 한 두 가지 중요 한 절차가 있다. 1) 시드를 위한 적절 한 날 선택: 네트워크 개발 단계에 있어야 하 고 문화의 높은 적용 잘 도달 될. MSCs 하지 적시에는 관리 되는, 네트워크 개발에 있는 MSCs의 순 효과 계량 도전이 됩니다. 2) prestaining 추가 이전 MSCs: MSCs-스테인드 또는 펠 릿에는 광범위 한 시간 동안 유지, 응집 발생 합니다 손상 유도 및 내 피 네트워크 내에서 통합 하는. 마지막으로, 네트워크 측정 쉽게 얻을 수 있습니다 적절 한 컨트롤은 준비 하는 경우. MSCs 없이 대동맥 고리는 대동맥 자체 지원 돋 아, 하지만 MSCs는이 원고에 설명 된 대로 다른 네트워크 구조와 큰 네트워크 개발을 촉진 수 있기 때문에 내 피 네트워크를 개발할 것입니다. 내 피 네트워크의 정량화는 수행된 적어도 5 d 다음 설정 공동 문화 이어야 한다. 폐쇄 시스템으로 인해 신생 응답 일시적 이며 내 피 네트워크 시작 약 7 d에 따라 변질. 관측의 목적은 내 피 네트워크의 개발에 테스트 셀 종류 효과 평가 하는, 경우 공동 경작의 첫 주 내 이미지를 인수 한다.

현재 분석 결과의 가능한 수정 기본 인간 조직의 응용 프로그램 수 있습니다. 쥐 대동맥의 1 mm 섹션 공동 문화에 대 한 하나의 단위 하 게, 인간 aortas 높게 일관 된 측정의 섹션의 높은 숫자와 함께 제공할 수 있습니다. 가능한 인간 기본 조직의 매우 제한 된 가용성에도 불구 하 고 높은 출력 잠재적인 가능성을 제안합니다. 개발할 때 대규모 평가 대 한 분석 결과, 분석 결과 미리 형성 하 고 테스트에 대 한 셀을 사용할 수 있게 될 때까지 그 구성 요소를 저장 여겨질 수 있다. 공학은 코팅 조직 문화 접시에 준비 하 고 오랜 시간에 대 한 냉동, 탈수 형태로 저장 될 수 있습니다. 또한, 우리는 우리의 실험실에서 테스트, 쥐 대동맥 조직 냉동 고 나중에 응용 프로그램, 따라서 만드는 작업을 보다 편리 하 게 분석 결과의 가장 중요 한 요소에 대 한 저장.

대동맥 반지 분석 결과의 많은 장점에도 불구 하 고 나열 하는 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, 분석 결과 문화의 설립 전하실 수 있습니다. 그것의 현재 모양에서 일상적인 응용 프로그램에는 충분 한 수동 기술을 필요로 한다. 운영자 오류 가변성을 발생할 수 있습니다. 그것은 네트워크의 성장에서 미러링할 수 있습니다 하 고 안정적으로 관리 되 세포의 효과 및 따라서 중요 한 신생 속성을 평가 하기 어려울 수 있습니다. 그러나, 이러한 과제는 유사 하지 다른 방법 사용할 수 있는, 그에 비해 작은 경우 그리고 필요한 교육 기간 짧고 vivo에서 실험 반대 경제 편리 하 게 될 수 있습니다. 둘째, ex vivo 대동맥 조직 및 세포 관리의 시간을 표시 하는 초기 네트워크 개발의 포함 사이의 지연 기간 사용자에 의해 설명 될 필요가 있다. 셋째, 내 피 네트워크 속성의 정량화 시간이 소요 될 수 있습니다 하지만 방사형 성장을 포함 하 여 각 매개 변수를 지정 하 여 해결할 수 있습니다, 그리고 튜브 길이 및 네트워크 메쉬 크기. 이 이미지 (이미지 J), 일관 되 고 안정적인 정량화에 필요한 시간을 크게 단축할 수 있는 원조 컴퓨터 분석을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 넷째, 각 분석 결과 사이 가변성 동물 조직 소스 및 운영자에 의해 처리에 약간의 불일치의 결과로 발생할 수 있습니다. 우리는이 문제를 효과적으로 극복할 수 있다는 정량화 된다 각 치료 그룹에 대해 triplicates를 설정 하 여 통계적으로 신뢰할 수 있는 발견. 마지막으로, 추출 하 고 인간의 세포와 쥐 원산지 사후 분석 결과 분석에 대 한 정렬 전하실 수 있습니다. 그러나, 특정 proteinases, dispase, 및 세포 복구 솔루션을 포함 하 여 immunophenotypic 또는 유전자 표정 분석에 대 한 셀을 복구에 적용할 수 있습니다.

이 분석 결과 사용 하 여 비보 전 대동맥 조직 공학은 조합의 제시 문화 단일 내 피 세포 유형을 또는 동물 시스템 라이브는 기존의 방법에 비해. 이 설치에는 세포 치료 후보자의 신생 속성 elucidating 질적 및 양적 데이터를 얻을 사용자 수 있습니다. 공학 및 멀티 셀룰러 비보 전 조직 결합 밀접 하 게 치료 셀 형식을 로컬 관리 후 발생할 수 있습니다 microenvironment을 흉내 낸 하는 속성을 제공 합니다. 패 러 랠 및 문화 상태에 가까운 제어의 높은 숫자의 가능성 때문에 연산자 제공 하는 있는 변수 및 불일치를 제거 하는 동안 신뢰할 수 있는 평가 위해 필요한 요소를 포함 하는 시스템 동물 모델입니다. 게다가, 평가 더 가능한 비용 및 반복된 동물 절차의 필요성을 줄일 수 있기 때문에입니다. 단일 세포 분석 실험 및 가장 동물 모델 부족 그렇지 않으면 세포 치료의 임상 응용 프로그램에서 발생 하는 면역 반응에 의해 도입 된 변수와 요인. 염증 반응을 신생 및 따라서 이식된 물질의 치료 효과 변경 또는 세포는 정확 하 게 측정할 수 없습니다. 대동맥 반지 분석 결과 분석 결과 측정을 방해 하는 많은 염증 구성 요소를 제외 합니다. 그러나, 그것은32의 microvasculature 개발 중요 한 선수는 상주 대 식 세포를 포함 되어 있습니다. Prestained 인간 세포와 내 피 네트워크의 쉬운 id와 MSC 분 비 염증 성 cytokines의 효과 면역 시스템의 세포도 요소 수 있습니다 쉽게 관찰이 분석 결과 사용 하 여.

시험 조건 및 실험적인 체제의 재현 특성 사용자에 의해 높은 제어 시스템에 추가 요소 도입에 대 한 수 있습니다. 첫째, 대동맥 반지 분석 결과 부상 모델로 사용할 수 있습니다. 대동맥 고리와 내 피 돋 아의 포함에 따라 분석 실험 허 혈 성 손상, 염증 성 요인 (TNF-α) 또는 세균성 lipopolysaccharide (LPS), MSC 뿐만 아니라 신생의 가능한 구조를 결정 하 여 다음에 소개 될 수 있다 응답은 다음과 같은 부상입니다. 둘째,의 가능한 메커니즘을 명료 하 게 하는 MSCs에 어떻게 공헌 하는지 신생 응답, neutralizing 항 체는 잠재적인 수용 체 세포 세포 상호 작용에 대 한 중요 한 침묵을 활용할 수 있습니다. 마지막으로, MSCs의 paracrine 속성 조사, 대동맥 반지 분석 결과 수 있습니다 설치 paracrine 속성에 신생 응답 하지만 초점의 세포-세포 상호 작용의 효과 제외 하려면 transwell 시스템에서.

요약, 대동맥 반지 분석 결과 능력을 평가할 수 있습니다 그리고 중재 처리, ECM에 세포 치료의 힘, 신생의 영역을 마이그레이션할 신체 접촉을 통해 선박 개발을. 신생 분석 결과 비보 전 대동맥 반지 재생 치료 후보 세포 라인에 대 한 가치, 양적 사전 심사 도구로 개발 될 수 있습니다.

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Disclosures

닥터 클 리 포드 L. Librach는 특허의 공동 소유자: 격리의 첫 번째 임신 탯 조직에서 파생 된 셀의 사용 방법. 캐나다와 호주에 부여.

Acknowledgements

저자는 다음 직원을 감사 하 고 연구 인력: 앙드레 Gauthier 피셔, 매튜 Librach, 타 냐 Barretto, Tharsan Velauthapillai, 그리고 사라 Laronde.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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References

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