L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Qui, presentiamo una nuova applicazione del dosaggio anello aortico dove prelabelled le cellule mesenchimali sono co-coltivate con reti endoteliali derivati dell'aorta di ratto. Questo metodo novello permette la visualizzazione di homing delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) e integrazione con le reti endoteliale, quantificazione delle proprietà della rete e la valutazione di MSC immunophenotypes ed espressione genica.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

L'angiogenesi è un processo complesso e altamente regolato, responsabile della fornitura e del mantenimento di aspersione sufficiente del tessuto. Manutenzione insufficiente vascolarizzazione e malformazioni patologiche possono provocare gravi malattie ischemiche, mentre eccessivamente abbondante sviluppo vascolare è associato con cancro e disordini infiammatori. Una promettente forma di terapia pro-angiogenica è l'uso di fonti di cellule angiogeniche, in grado di fornire fattori di regolazione, nonché supporto fisico per lo sviluppo recente di sistema vascolare.

Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono candidati estesamente esaminatori per rigenerazione vascolare a causa dei loro effetti paracrini e la loro capacità di rilevare e casa ai tessuti ischemici o infiammati. In particolare, primo acetonide del cordone ombelicale cellule perivascolari (FTM HUCPVCs) sono un candidato molto promettente dovuto loro pericyte-come proprietà, alto potenziale proliferativo e multilineare, proprietà immunitario privilegiato e robusta paracrine profilo. Per valutare efficacemente potenzialmente angiogenici rigenerativa cellule, è un requisito di testare loro in affidabile e "traducibile" analisi pre-clinica. L'analisi aortica dell'anello è un ex vivo modello di angiogenesi che consente facile quantificazione delle strutture endoteliali tubolari, fornisce accessorie supporto cellule e matrice extracellulare (ECM) dall'host, esclude le componenti infiammatorie ed è veloce e poco costoso per impostare. Questo è vantaggioso rispetto ai modelli in vivo (ad es., analisi cornea, analisi della spina di Matrigel); l'analisi aortica dell'anello può seguire le cellule amministrate e osservare interazioni intercellulari, evitando il rigetto immunitario xeno.

Vi presentiamo un protocollo per una nuova applicazione del test anello aortico, che comprende MSCs umane in co-colture con sviluppo delle reti endoteliali aortiche di ratto. Questo test permette l'analisi del contributo MSC alla formazione e sviluppo attraverso interazioni fisiche pericyte-come del tubo e della loro potenza per attivamente la migrazione ai siti dell'angiogenesi e per valutare la loro capacità di eseguire e mediare Elaborazione di ECM. Questo protocollo fornisce ulteriori informazioni sulle modifiche in MSC fenotipo ed espressione genica dopo co-coltura.

Introduction

Il complesso processo di angiogenesi migliora e mantiene perfusione tissutale, promuovendo lo sviluppo dei vasi sanguigni nuovi da preesistente sistema vascolare1. È un processo strettamente regolato, equilibrato di fattori pro-angiogenici e anti-angiogenici. Qualsiasi carenza in questo sistema può portare a insufficiente manutenzione o crescita, causando gravi malattie ischemiche, compreso la malattia del miocardio, ictus e malattie neurodegenerative. Tuttavia, esagerato sviluppo vascolare è caratteristico per le condizioni compreso cancro e disordini infiammatori2.

Lo sviluppo di terapie che mirano a controllare l'angiogenesi per ottenere la rigenerazione tissutale favorevole è di fondamentale importanza. Malgrado le vaste indagini precliniche e cliniche, di stimolare l'angiogenesi utilizzando microRNA e fattori pro-angiogenici hanno fallito raggiungere i risultati voluti3,4,5. I motivi possibili per gli effetti transitori includono: mirati limitata longevità di proteine angiogeniche e acidi nucleici e il numero limitato di fattori di crescita6,7. Sebbene fattori solubili angiogenici sono essenziali per l'avvio di angiogenesi, la manutenzione e la funzionalità del sistema vascolare dipendono dal supporto di tipi delle cellule compreso le cellule muscolari lisce e periciti8. Campo delle terapie pro-angiogenica sta ora valutando potenziali fonti sulle cellule staminali e progenitrici delle cellule che potrebbero fornire fattori angiogenici localmente, mentre fisicamente sostenere appena sviluppato il sistema vascolare, autorinnovanti o anche differenziarsi in cellule endoteliali9,10. Trovare l'ottimali angiogenici tipi delle cellule con la capacità di soddisfare questi requisiti funzionali detiene una grande promessa per la rigenerazione di tessuto ischemico.

Per tradurre correttamente potenziali terapie basate sulle cellule in studi clinici, studi pre-clinici devono dimostrare la loro efficacia ed evidenziare i meccanismi angiogenetici. Nonostante l'elevato numero di saggi di angiogenesi stabilito, il campo manca un'analisi "gold-standard" in vitro che in modo affidabile è in grado di valutare l'efficacia di potenziali candidati cella tipi11,12, 13. la maggior parte in vitro saggi di angiogenesi (compresi i saggi di formazione tubo, la migrazione e la proliferazione endoteliali) in genere valutare gli effetti delle cellule o composti su cellule endothelial modifiche fenotipiche o differenziazione in tubolari e strutture di rete14,15. Mentre queste caratteristiche sono fondamentali per l'angiogenesi, un'analisi "traducibile" dovrebbe anche valutare: 1) la incremento o la sostituzione dei giustificativi tipi cellulari tra cui periciti o cellule di muscolo liscio, 2) al trattamento di ECM e/o della membrana dello scantinato, e 3). l'efficienza per promuovere la formazione di microvasculature funzionale. In vivo l'angiogenesi modelli, tra cui l'analisi cornea e l'analisi di spina di Matrigel, ricapitolano il microambiente unico in vivo ma sono sfidati dalla difficoltà di rilevamento somministrato cellule per osservare le interazioni fisiche. Inoltre, in modelli in vivo , xeno-immunitario rifiuto può verificarsi durante il test i candidati potenziali terapia di trapianto allogeneic della cellula16. Ex vivo l'angiogenesi modelli, in particolare l'analisi aortica dell'anello può fornire: 1) facile osservazione e la quantificazione delle strutture tubolari, cellule di sostegno 2) accessorie, 3) ECM da ospitare e forniture artificiale, 4) esclusione di infiammatoria componenti e 5) installazione rapida ed economica17,18. In genere, l'analisi aortica dell'anello può testare il potenziale angiogenico di piccole proteine secretorie, agenti farmacologici e modelli di roditori transgenici19,20,21.

MSCs sono promettenti candidati per la rigenerazione vascolare principalmente attraverso i loro effetti paracrini mediati22,23,24. MSCs sono stati indicati a secernere fattori angiogenici chiave compreso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) e angiopoietina-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs può anche rilevare e tessuti sede ischemica o infiammato, tuttavia, i meccanismi esatti sono ancora sotto indagine. Sempre più, la letteratura sostiene l'ipotesi che la maggior parte delle MSCs derivano da cellule perivascolari, co-esprimono marcatori di periciti e possono comportarsi come periciti27. HUCPVCs sono una giovane fonte di cellule staminali mesenchimali derivate dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano. Essi rappresentano una popolazione di cellule staminali mesenchimali con pericyte-come le proprietà e sono state caratterizzate dal cordone ombelicale sia FTM e termine. FTM HUCPVCs dimostrano un'alta espressione di marcatori Pericita incluse le proprietà immunitario privilegi CD146 e NG2, alto potenziale proliferativo e multilineare e visualizzare un profilo di paracrine robusto28. FTM HUCPVCs sono un tipo di cellula del candidato ideale per promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato attraverso la promozione del nuovo sistema vascolare attraverso le loro proprietà pericyte-come.

Per testare il potenziale angiogenico e pericyte-come proprietà di cellule staminali mesenchimali umane, un numero molto limitato di saggi di angiogenesi è disponibili dove positivo angiotropic migrazione (in appresso denominato "homing"), ECM elaborazione e sviluppo della fisica interazioni tra tipi cellulari possono essere studiate, durante l'acquisizione di dati quantitativi sullo sviluppo del microcircolo.

Con la presente vi presentiamo un protocollo che descrive un'applicazione novella del dosaggio anello aortico. MSCs umane erano co-coltivate con reti endoteliale aortiche ratto-derivato in via di sviluppo per valutare il loro contributo per la formazione, la maturazione e l'omeostasi del tubo. Questa versione del test anello aortico valuta la capacità e la potenza dei candidati alla terapia cellulare casa ai siti dell'angiogenesi, eseguire e mediare l'elaborazione ECM, e per contribuire allo sviluppo endoteliale tubolare stabilendo pericyte-come fisico interazioni farmacologiche. Oltre a quantificare l'effetto netto di MSCs su in vitro formazione del reticolo endoteliale e osservando le interazioni intercellulari, abbiamo ottimizzato anche un protocollo per isolare MSCs da co-colture. Eseguendo qPCR e citometria a flusso, è possibile caratterizzare i cambiamenti nell'espressione di gene e fenotipo MSC dopo co-coltura. Come tipi di cellule del modello, abbiamo confrontato ontogeneticamente presto (prenatale) e fine (adulti) fonti di cellule staminali mesenchimali umane: FTM HUCPVCs e umane derivate da midollo osseo MSCs (BMSC), rispettivamente, nell'analisi della anello aortico. Vi proponiamo l'analisi aortica dell'anello può essere utilizzato per studiare il potenziale angiogenico di qualsiasi tipo di cellula fisicamente supporto quando si è sotto inchiesta per applicazioni rigenerativa angiogenici.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

tutti gli studi che coinvolgono animali sono stati condotti e segnalati secondo ARRIVE linee guida 29. Tutti gli studi sono stati effettuati con l'approvazione del Consiglio di etica ricerca istituzionale (numero di REB 4276). Tutte le procedure sono state approvate dal comitato di cura animale della rete di salute dell'Università (Toronto, Canada), e tutti gli animali hanno ricevuto un'assistenza umana in conformità con la Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, 8 th edizione ( Istituti nazionali di salute 2011).

1. installazione di dosaggio anello aortico

  1. isolare l'aorta di ratto.
    1. Euthanize 8 - 10-settimana-vecchi topi Sprague Dawley mediante asfissia di CO 2: sostituzione di gas CO Set 2 alloggiamenti al 20% (portata = 0.2 x camera volume/min). Confermare dall'assenza di pizzico reflex e cuore battiti di palpazione torace.
    2. Bagnato la pelliccia sulla zona del torace utilizzando garza sterilizzata con etanolo al 70%. Utilizzare sterilizzate pinze e le forbici per fare un'incisione sulla linea mediana del petto e tagliare attraverso strati di pelle e muscolo.
    3. Una volta che la gabbia toracica è esposto, tagliare la gabbia toracica su ogni lato e piegare verso l'alto di 5 mm dallo sterno su ogni lato. Qualche sanguinamento è previsto dalle arterie intercostali in cadaveri freschi.
    4. Spingere il tessuto polmonare e il cuore a destra anatomico per esporre l'aorta. L'aorta è il bianco colorato vaso situato adiacente alla colonna vertebrale.
    5. Uso forcipe di pizzicare l'aorta (dopo l'arco aortico) e utilizzare forbici chirurgiche per effettuare l'incisione prima mentre si tiene l'aorta con il forcipe. Al momento di tagliare l'aorta, la cavità toracica si riempirà rapidamente con sangue, pertanto è fondamentale per lavorare rapidamente per ottenere l'aorta prima della coagulazione del sangue.
    6. Pinze uso per tenere l'aorta e Sbucci delicatamente verso il basso, l'aorta dalla colonna vertebrale. Il tiro sarà recidere le arterie intercostali senza ulteriori incisioni. Ottenere circa 10 cm di tessuto e/o prima l'aorta si divide in due rami nella cavità addominale e tagliata l'aorta fuori della carcassa. Spingere il diaframma se necessario la direzione caudale per ottenere l'accesso per abbassare le sezioni dell'aorta.
      Nota: Sbucciare l'aorta delicatamente perché forza intensa può causare a strappare. Se le lacrime dell'aorta, permettono la coagulazione del sangue per pochi secondi e utilizzare un tovagliolo di carta per rimuovere il sangue coagulato, che permette la visibilità dell'aorta rimanente.
    7. Posto dell'aorta in un tubo da 15 mL con 10 mL di Hank ghiacciata ' s soluzione salina bilanciata (HBSS) completati con 1% di penicillina/streptomicina (P/S). Mantenere le provette su Ice.
      Nota: Il tessuto aortico può durare per 1-2 h su ghiaccio ma è meglio elaborare più velocemente possibile.
  2. Preparare terreni di coltura di dosaggio anello aortico in una sterile di biosicurezza (BSC).
    1. Preparare il mezzo di crescita endoteliale (EGM) utilizzando un'unità di filtraggio per filtrare 500 mL di Medium basale endoteliale (EBM) completati con 2% siero bovino fetale (FBS), 1% gentamicina e fattori di crescita (Vedi Tabella materiali). 50 mL di filtrato media inserire una perlina o bagnomaria a 37 ° C.
    2. Utilizzare un'altra unità di filtraggio per filtrare 100 mL di EBM completati con 2% FBS e 1% P/S a preparato EBM 2% FBS (EBM-FBS) e conservare a 4 ° C.
  3. Cappotto piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti con membrana basale estrarre (BME) mentre si lavora sul ghiaccio.
    1. Posto una piastra 12-pozzetti su una superficie fredda (grande impacco di ghiaccio o vassoio). Aggiungere 200 µ l/pozzetto di appena scongelati BME utilizzando refrigerati puntali e agitare il BME per garantire anche rivestimento. Lavoro rapidamente per evitare la polimerizzazione irregolare del BME.
      Nota: Un'asportazione dell'aorta tipico produce 20 anelli aortici. Per rappresentare la variabilità tra i saggi di anello aortico, è necessario configurare almeno tre saggi di anello aortico per gruppo di trattamento e includere un controllo. Se la fonte lo permette, 6 anelli per gruppo di trattamento è consigliato.
    2. Inserire le piastre rivestite in incubatrice umidificate (95% di umidità relativa, 37 ° C, 5% CO 2; queste condizioni si applicano a tutti i passaggi di incubatore d'ora in avanti) per 30 min. posto 1.000 puntali per pipette µ l nuovamente dentro da-20 ° C al punto 1.5.3.
      Nota: Mentre l'Estratto di membrana basale è utilizzato in concentrazione stock, la consistenza e la rigidità è strettamente controllato dal tempo di polimerizzazione. Assicurarsi di mantenere i tempi di polimerizzazione stessa esatta per tutti paralleli ed esperimenti indipendenti.
  4. Sezione dell'aorta in anelli uniformi.
    1. Prendere l'aorta dal tubo 15 mL e metterlo in un piatto di 10 cm con 10 mL di fresco HBSS completati con 1% P/S.
    2. Utilizzare due set di pinze per separare con cura l'eccesso di tessuto connettivo, tessuto adiposo e usare un bisturi per gli altri rami delle arterie intercostali connesso all'aorta. Questo riduce la variabilità tra unità anello basato su diversi livelli di tessuto residuo. Rimuovere qualsiasi residuo coagulato sangue all'interno dell'aorta.
    3. Mettere un righello o una griglia sotto il piatto di 10 cm per tagliare precisamente 1-2 mm sezioni larghe dell'aorta utilizzando pinze e bisturi sterile. Tagliare le sezioni esatte quanto possibile ridurre la variabilità tra unità.
  5. Incorporare gli anelli aortici BME.
    Nota: Se il sezionamento degli anelli aortici non viene completato prima dell'incubazione di polimerizzazione di BME, rimuovere le piastre rivestite dall'incubatrice umidificate e aggiungere 100 µ l di EBM in ciascun pozzetto per terminare la polimerizzazione. Esatta tempistica è fondamentale come over-polimerizzazione di BME può interferire con la migrazione di sviluppo e delle cellule endoteliali rete. Una volta gli anelli aortici sono preparati, rimuovere EBM dai pozzetti e continuare dal punto 1.5.2.
    1. Rimuovere i pozzi BME rivestito da incubatrici umidificate e tornare alla BSC.
    2. Attentamente pick up singoli anelli aortici con forcipe e posizionare una al centro di ciascun pozzetto rivestite su BME. Ripetere per i rimanenti anelli aortici.
      Nota: Media trasferito insieme con l'anello aortico dovrebbe essere tenuti minima in modo da evitare le irregolarità polimerizzazione.
    3. Uso raffreddato puntali per pipette per aggiungere 300 µ l di BME sopra ogni anello aortico e distribuire uniformemente il BME intorno al pozzo (-20 ° C) 1.000 µ l.
    4. Restituire gli anelli aortici incorporati per le incubatrici umidificate per 30 min.
    5. Rimuovere le piastre con l'anello aortico incorporato da incubatrici umidificate e lentamente aggiungere 1.000 µ l di EGM (preparato e scaldato al punto 1.2.1) inserendo la pipetta punta contro il muro della cultura ben.
      Nota: Pipettaggio direttamente i media sul BME può perturbare il BME polimerizzato e ostacolano lo sviluppo rete endoteliale continua. Utilizzare una pipetta multicanale appropriata, se disponibile.
    6. Dopo 24 h, 1.000 µ l di EGM di rimuovere e sostituire con 1.000 µ l di EBM-FBS preparata al punto 1.2.2, nuovamente pipettando lentamente contro il lato della cultura ben.
  6. Mantenere il dosaggio di anello aortico sostituendo 500 µ l di EBM-FBS con 500 µ l di fresco EBM-FBS (37 ° C) ogni 48 h.
    Nota: Vedi seczione 2 per avviare l'espansione di cultura MSC lo stesso giorno come istituzione saggio anello aortico. Questo assicurerà che MSCs sono pronti per la co-cultura quando le reti endoteliale sono pronte.
  7. Utilizzare la microscopia del campo luminoso per seguire sviluppo rete endoteliale di anello aortico analisi (vedere la Figura 1 come riferimento per lo sviluppo ottimale della rete). Una volta l'aspetto di reti endoteliale è come mostrato nella Figura 2, procedere con l'impostazione l'anello aortico dosaggio-MSC co-colture (sezione 3). Fare riferimento al punto 4.1 per ulteriori dettagli di imaging le reti endoteliale.

2. Coltura del tessuto

  1. preparare soluzioni di riserva di terreni di coltura del tessuto.
    1. HUCPVCs FTM cultura (precedentemente stabilito, n ≥ 3 linee indipendenti per ciascuna) 30 e commercialmente disponibili BMSCs in alfa-MEM completati con 10% FBS e 1% P/S.
    2. Sterilizzare il supporto utilizzando bottiglie di 0,2 µm poro dimensioni filtro.
    3. Conservare le soluzioni multimediali preparati a 4 ° C fino a 3 settimane.
  2. Culture mantenere HUCPVC FTM e BMSC in incubatrice umidificate e passaggio al confluency di 70-80% determinata dalla microscopia di contrasto di fase. Volumi appropriati di uso dei media per le dimensioni della piastra di coltura del tessuto utilizzato (cioè 10 mL in un piatto di 10 cm). Utilizzare queste condizioni di coltura per il mantenimento e passaggio MSCs.
  3. Dissociare i monostrati MSC per passaggio o anello aortico dosaggio-MSC co-culture utilizzando una soluzione di enzima di dissociazione (piatto di 4 mL/10 cm) e incubare nell'incubatrice umidificate per 3 min assicurarsi distacco delle cellule usando la microscopia luminosa del campo; Incubare per altri 1-2 minuti se necessario.
  4. Trasferire le cellule dissociate in una provetta da 15 mL e centrifugare a 400 x g per 5 min.
  5. Aspirare il supernatante senza disturbare il pellet cellulare e risospendere le cellule in 1 mL di un terreni di coltura appropriati (alfa-MEM multimediale completo per il passaggio di cellule o EBM-FBS per anello aortico dosaggio/MSC co-culture) per il conteggio utilizzando un contatore di cellule.

3. Preparazione di aortica anello dosaggio/MSC co-colture

  1. seme 10 4 MSCs su ciascuna incluso l'anello aortico (9.000 cellule/cm 2 / 12-pozzetti piastra). In base al numero di saggi di anello aortico, pre-macchia MSCs con colorante fluorescente valida, non trasferibile. Mantenere almeno tre pozzi degli anelli aortici senza MSCs per un gruppo di controllo.
    1. Macchia 10 5 MSCs/mL EBM-FBS media, aggiungere 2,5 µ l di vitali, non trasferibile colorante fluorescente/mL media (5 µM) in una provetta da 15 mL e posto nell'incubatrice umidificata per 30 min. mescolare delicatamente il tubo a metà strada attraverso l'incubazione.
    2. I seguenti 30 min di incubazione, aggiungere 1 volume di fresco EBM-FBS di cellule marcate e spin a 400 x g per 5 min.
    3. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di media EBM-FBS. Confermare il successo di macchiatura di MSCs utilizzando la microscopia a fluorescenza.
  2. Rimuovere le piastre contenenti anello aortiche dall'incubatrice umidificata e rimuovere 500 µ l di EBM-FBS da ogni pozzetto.
  3. Seme attentamente 10 4 MSCs in 500 µ l di EBM-FBS su ciascun anello aortico incorporato pipettando uniformemente intorno le reti endoteliale. Garantire la distribuzione uniforme agitando delicatamente la piastra di coltura.
    1. Aggiungere ulteriori EBM-FBS per assicurarsi che il volume totale dei media sulle co-culture analisi/MSC anello aortico è 1.000 µ l.
  4. Usare microscopia di fluorescenza per visualizzare le MSCs fluorescente etichettati nel dosaggio anello aortico.

4. microscopia

  1. microscopia campo chiaro uso all'immagine le reti endoteliale di ratto prima dell'anello aortico dosaggio/MSC co-culture per misurazioni di base (giorno 0) di proprietà di rete endoteliale (ad es., rete lunghezza, loop di rete). Immagine 4 quadranti per pozzetto dall'anello aortico alla sezione più lontana della rete all'interno di quello specifico quadrante endoteliale. Reti di ring
    1. immagine aortica seguendo l'anello aortico dosaggio/MSC co-culture ai giorni 3, 5 e 7. Utilizzare queste immagini per quantificare l'effetto MSC sullo sviluppo rete endoteliale.
  2. Utilizzare microscopia di fluorescenza per immagini pre-etichettate MSCs nel dosaggio anello aortico.
    1. Seguente 24 h dell'anello aortico dosaggio/MSC co-colture, usare microscopia di fluorescenza per visualizzare MSC homing, allungamento e integrazione con le reti endoteliale. Si sovrappongono le immagini fluorescenti di MSCs con le immagini del campo luminoso delle cellule endoteliali a osservare la colocalizzazione di entrambi i tipi cellulari.
    2. Immagine di MSCs localizzato all'interno delle reti endoteliale sviluppate prossimale al tessuto anello aortico e MSCs localizzato all'interno di recente lo sviluppo di reti distale al tessuto anello aortico ( Figura 2).

5. Citometria a flusso e qPCR

  1. un giorno prima di dissociare le reti endoteliale anello aortico, scongelare i surgelati dispase a 4 ° C O/N. sezione 5.3 è identica sia per citometria a flusso e qPCR.
  2. Caldo 50 mL di dispase e 50 mL di tripsina 0.5% a 37 ° C perlina o bagnomaria.
  3. Recuperare le cellule per l'analisi dall'anello aortico dosaggio/MSC co-culture.
    1. Dopo 1 settimana di dosaggio/MSC dell'anello aortico co-cultura, rimuovere il supporto di cultura e aggiungere 1 mL di Phosphate-Buffered salino (PBS) lentamente di ogni bene per 3 minuti e rimuovere. Ripetere questo lavaggio due volte più.
    2. Aggiungere 800 µ l di pre-riscaldati dispase ad ogni pozzetto e incubare nell'incubatrice umidificate per 15 min.
    3. Rimuovere le piastre da incubatrici umidificate e sospendere dispase pipettando (5-10x) per spezzare il BME e trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in tubi separati 15ml.
    4. Ripetere il punto 5.3.3 nuovo con fresco dispase pre-riscaldato fino a nessun residuo BME è osservato bene nella cultura. Aggiungere 1 volume di PBS supplementato con 3% FBS alla sospensione dispase-cellule per inattivare il dispase. Rimuovere gli anelli aortici galleggianti in una sospensione cellulare utilizzando puntali.
    5. Spin le sospensioni delle cellule a 400 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante con attenzione, lasciando 3 mL di sospensione cellulare nel tubo da 15 mL.
      Nota: Un pellet di ovvio, tinta potrebbe non essere visibile, ma sono presenti cellule e BME.
    6. Aggiungere 3 mL di tripsina 0.5% preriscaldata alla sospensione cellulare e vigorosamente risospendere (5-10 x pipettando) cellule. Incubare le soluzioni delle cellule tripsinizzate nell'incubatrice umidificate per 10 min.
    7. Rimuovere le sospensioni di cellule tripsinizzate dall'incubatrice umidificate e aggiungere 6 mL di PBS completati con 3% FBS e risospendere pochi times. Girare le sospensioni delle cellule a 400 x g per 5 min.
    8. Attentamente rimuovere tutto il supernatante, lasciando il pellet cellulare nel tubo e risospendere le cellule in 1 mL di PBS supplementato con 3% FBS in ciascun tubo.
    9. Filtrare il 1 mL di sospensione cellulare utilizzando un colino di cella 70 µm per rimuovere cellule aggregate e BME residua dalla sospensione delle cellule. Contare le celle in 1 mL di sospensione cellulare utilizzando un contatore di cell.
  4. Preparare le celle per citometria a flusso. Sospensioni
    1. Incubare la cella (10 5 celle in 200 µ l PBS supplementato con 3% FBS) con anticorpi primari coniugati fluoroforo (FITC o APC) (TRA-1 - 85-, CD146, CD31) concentrazione = 01:40) a 4 ° C per 30 min, al riparo dalla luce.
      Nota: Citometria a flusso per MSCs è stato ottimizzato da Hong et al., 2013 28. È richiesto un minimo di 10.000 cellule per letture accurate.
    2. Dopo l'incubazione di 30 min, risospendere le cellule in 2 mL di PBS completati con 3% FBS e centrifugare (400 x g, 5 min).
    3. Cellule di mantenere a 4 ° C al riparo dalla luce fino alle analisi di citometria a flusso (almeno 1 x 10 4 eventi) all'interno di 1 h. Per la strategia di gating, vedere complementare figura 1. Ordinare umano MSCs utilizzando anti-TRA-1-85 (APC) (concentrazione: 01:40 e a 0,5% FBS/PBS) e ordinare celle in 350 µ l di tampone di lisi delle cellule per l'analisi qPCR.
      Nota: Lisati di cellule possono essere memorizzate a-80 ° C fino a 3 mesi per l'analisi futura qPCR.
  5. Preparare le cellule per l'analisi qPCR.
    1. Isolare il RNA da cellule lisate usando kit di isolamento del RNA basata su colonne e determinare la concentrazione di RNA e la qualità.
    2. Reazione di
    3. preparare cDNA da fino a 5 µ g di RNA per 100 µ l della trascrittasi inversa. Eseguire un passaggio di pre-amplificazione se il rendimento di RNA è basso (< 10 ng / µ l). Uso di meno di 100 ng di RNA si tradurrà in un alto tasso di falsi negativi.
      Nota: I modelli di cDNA possono essere memorizzati a-20 ° C per un'ulteriore analisi per fino a 4 mesi.
    4. Eseguire la qPCR mediante angiogenesi espressione profiler matrici per rilevare i cambiamenti nell'espressione genica. Uso 5 ng di cDNA per reazione (40 cicli, 60 ° C, temperatura di ricottura/estensione). Express piega cambiamento dell'espressione rispetto ai campioni di cDNA MSC derivato indifferenziati. Eseguire gli opportuni controlli negativi (anello aortico senza umano MSCs).

6. Quantificazione seguente aortica anello dosaggio/MSC co-culture di rete

  1. scaricare il software di imaging quali ImageJ insieme l'angiogenesi Analyzer plugin 31.
  2. Importare le immagini di rete endoteliale scattate e aprire utilizzando il software.
  3. Convertire l'immagine scale sulla base delle specifiche del microscopio usato.
  4. Utilizzare uno strumento linea per misurare la crescita radiale rete.
  5. Contare i cicli di rete endoteliale utilizzando lo strumento di contatore di cella (loop con almeno 4 lati devono essere quantificati).
  6. Per ulteriori quantificazione delle proprietà della rete, utilizzare il plugin di angiogenesi Analyzer o altri plugin simili per analizzare i segmenti di master, totale lunghezza del segmento, aree di rete totale e il numero di giunzioni. Utilizzare lo strumento maschera sfocata per sfocare tessuto anello aortico e spazi vuoti per evitare falsi positivi calcoli.
  7. Trasferire i valori a un programma e grafico rete endoteliale proprietà statistiche seguendo l'anello aortico dosaggio/MSC co-culture.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Il flusso di lavoro schematico per stabilire il dosaggio di co-coltura aortica anello/MSC è illustrato nella Figura 1. I passaggi principali includono: ratto isolamento dell'aorta, sezionamento e l'incorporamento degli anelli aortici, monitoraggio endoteliale germinazione e sviluppo della rete e infine l'etichettatura e gestione MSCs. La sequenza temporale dell'analisi endoteliale rete delinea la finestra per le analisi fattibile per ogni periodo di co-coltura: giorno 1, 5 & 7. Note aggiuntive vengono evidenziate dalle caselle punteggiate.

L'identificazione di regioni strutturalmente distinte nelle culture delle cellule endoteliali aortiche anello viene eseguita mediante microscopia in campo chiaro, 3-5 p dopo gli anelli aortici sono incorporati nell'ECM (Figura 2). La zona non strutturata (Figura 2A) è caratterizzata come una regione di alta proliferazione ma basso organizzazione strutturale nelle immediate vicinanze del tessuto aortico. Le reti sviluppate endoteliale (Figura 2B) si riferiscono alle regioni con alta organizzazione strutturale, dove le reti sono completamente stabiliti e composto principalmente di circuiti chiusi, anche prima dell'aggiunta di MSCs. Le reti in via di sviluppo (Figura 2) si trovano presso le zone distali delle colture endoteliali. Questi sono i siti di migrazione delle cellule endoteliali e l'allungamento del nuovo modulo di strutture di rete. 3 regioni di cui sopra sono facilmente identificabili in tutto gli esperimenti e vengono utilizzate per fare riferimento a dove il MSCs ospita nelle co-culture. MSCs prelabelled dovrebbe essere co-coltivate con l'analisi aortica dell'anello quando hanno sviluppato tutti i tre segmenti di rete. La quantificazione delle reti endoteliale dopo MSC co-colture sono regioni in via di sviluppo rete (Figura 2, cornice bianca).

Microscopia a fluorescenza permette misurazioni qualitative di MSC migrazione, integrazione e morfologia in concomitanza con lo sviluppo di reti endoteliale nell'analisi di co-coltura della anello aortico-MSC (Figura 3). MSCs etichettati con fluoroforo valida, citoplasmico erano imaged 24 h dopo la somministrazione di co-colture. FTM HUCPVCs sono stati trovati alla periferia dello sviluppo delle reti di endoteliale, visualizzato cella allungata morfologie e contribuito all'ulteriore sviluppo delle reti endoteliale (Figura 3A, B). Per confronto, BMSC ospitati per le reti di sviluppo durante la visualizzazione di meno interazione con le cellule endoteliali (Figura 3, D). Alto ingrandimento immagini a 72 h hanno mostrato che FTM HUCPVCs mantenuta elevata copertura e stabilizzazione delle reti endoteliali mentre BMSCs in co-colture ha presentate con morfologie sferiche con limitata integrazione nelle reti endoteliale (Figura 3E , F). Osservato differenze dimostrano chiaramente le differenze qualitative, funzionali tra tipi umani di MSC. Un tipo di cella di candidato terapeutico che ha significative homing e proprietà di integrazione endoteliale (Figura 3A, B & E) si distingue rispetto a un tipo di cella con integrazione di rete limitata endoteliale e l'aumento del funzionalità (Figura 3, D & F).

Immagini di microscopia di fluorescenza ad alto ingrandimento sono stati acquisiti per sezionare ulteriori interazioni fisiche tra cellule endoteliali e FTM HUCPVCs nelle reti tubolari. Il pre-etichettate HUCPVCs FTM (Figura 4A, verde) sono mostrati aderendo con le cellule endoteliali non macchiate (Figura 4A, bianco frecce). FTM HUCPVCs sono stati trovati per fornire un sostegno strutturale alle cellule endoteliali servendo come superficie di asse e l'attaccamento tra i nodi. Le reti di endoteliale anello aortico possono anche essere pre-marcate con un fluoroforo valido allo stesso modo la MSC macchiatura (Figura 4B, rosso). In doppie macchiate co-colture, microscopia di fluorescenza ha rivelato allungate aderenze tra i due tipi cellulari, fortificando l'osservazione del comportamento cellulare solidale e cooperazione.

La quantificazione delle proprietà strutturali di rete endoteliale è stata eseguita al giorno 5 di co-colture MSC (Figura 5). Quadranti uniforme sono stati definiti per la misura su tutta la rete endoteliale intero anello aortico (Figura 2, cornice bianca). La crescita media di rete è stata calcolata come la distanza dai primi loop prossimale rete chiusa da anello aortico per l'ulteriore loop chiusi distale (dimensione del raggio) (Figura 5A). La crescita media rete dell'anello aortico-MSC co-colture erano come segue: HUCPVCs FTM (2,98 ± 0.3 mm) e BMSCs (1,5 ± 0.15 mm). Le reti endoteliale non trattate ha sviluppato un raggio medio di 1,9 ± 0,1 mm. Il confronto statistico tra i gruppi di trattamento di MSC ha dimostrato che FTM HUCPVCs hanno contribuito alla crescita della rete significativamente maggiore rispetto a BMSC e reti non trattati (p ≤0.001). Il reti endoteliale non trattati ha sviluppati significativamente più di BMSC contenenti co-colture (p ≤ 0,01) (figura 5B).

Il numero totale di cicli sono stato calcolato in ogni quadrante ed espressa come formazione di medio ciclo totale (Figura 5). Il numero medio di totale loop chiusi era come segue: FTM HUCPVC trattati co-colture (81 ± 7), BMSCs (26 ± 3) e non trattata di anelli (55 ± 7). HUCPVCs FTM ha contribuito alla formazione di ciclo endoteliale significativamente maggiore rispetto a BMSCs (p ≤ 0,01) e reti non trattati (p ≤ 0,01). Le BMSC co-culture provocato meno endoteliale loop rispetto alle reti non trattati (p ≤ 0,01) di rete. Questa quantificazione identifica un tipo di cellula che ha un effetto significativamente positivo sullo sviluppo rete endoteliale (FTM HUCPVC) e un tipo di cellula che può anche compromettere reti endoteliale. Deve essere notato che lo sviluppo di rete significativamente maggiore è stato osservato a correlano bene con la copertura MSC sulle reti endoteliale. Suggerisce che le interazioni dirette sono cruciali per il MSCs eseguire la loro funzione di sostegno.

Trabocchetti possibili degli stabilimenti di co-coltura anello aortico sono rappresentati nella Figura 6. Polimerizzazione insufficiente o irregolare di BME è un problema che può interferire con lo sviluppo rete endoteliale di successo. La polimerizzazione di BME per esattamente 30 minuti di sincronizzazione e trasferimento media senza interrompere il polimero garantirà una fase BME intatta, funzionale (Figura 6A). Macchiatura di MSCs per tempi di incubazione prolungata e permettendo il MSCs a pellet per lunghi periodi possono interferire con fenotipo su co-colture e morfologia delle cellule. Figura 5B Mostra HUCPVCs FTM macchiato per 1 h e ammessiper pellet per 1 h prima di co-coltura, essendo entrambi gli intervalli ottimali. HUCPVCs FTM non mostrano preferenza ai siti delle reti endoteliale e sono sparsi in tutta la rete. Confrontando correttamente trattato le cellule (Figura 3) per HUCPVCs FTM maltrattato, le cellule maltrattate visualizzano la morfologia delle cellule arrotondate e limitate interazioni cellula--cellula con le cellule endoteliali (Figura 6B). Infine, se l'analisi aortica dell'anello non è possibile stabilire il giorno della dissezione, aorte possono essere conservate a-80 ° C in media di EGM-C completati con 10% di dimetilsolfossido (DMSO) e 10% FBS. Lo sviluppo di rete endoteliale potrebbe richiedere 1-3 d più lungo quando si applica gli anelli aortici scongelati rispetto al tessuto fresco, ma le reti endoteliale saranno sufficienti per l'istituzione di co-coltura MSC (Figura 6).

Come un procedimento alternativo della valutazione di co-coltura dell'anello aortico, la frazione cellulare degli anelli aortici BME incorporato può essere estratto e analizzata da citometria a flusso (complementare figura 1). Il marcatore specifico umano TRA-1-85 (complementare figura 1A, B, y asse) popolazione di cellule positive da FTM HUCPVC contenenti co-colture è stato identificato come MSCs umane. Co-etichettatura ha mostrato bassa espressione del marcatore delle cellule endoteliali CD31 (complementare figura 1A) e alta espressione del marcatore Pericita CD146 (complementare figura 1B) all'interno della popolazione di cellule positive marker specifico umano. Tale valutazione può decifrare eventuali immunophenotypic e modifiche di impegno di lignaggio di MSCs indotta dalle interazioni con le cellule endoteliali e fornire ulteriori preziose informazioni sul tipo di testata delle cellule. Al fine di ottenere un numero sufficiente di cellule per l'analisi FC, le cellule estratte da pozzi paralleli dello stesso gruppo sperimentale possono essere combinate. È importante considerare l'utilizzo di MSC-pre-macchiate contenente gli anelli aortici per analisi di citometria a flusso, in modo che la fluorescenza che ricorda del colorante vitale non interferisce con il segnale di fluorophores anticorpo-correlati. In caso contrario il gating negativo dovrebbe prendere la fluorescenza delle cellule pre-macchiato in considerazione.

Abbiamo risolto MSCs forma estratta anello aortico co-culture umane (giorno 7 di co-coltura) utilizzando l'anticorpo specifico di indicatore della superficie delle cellule umane (TRA-1-85). HUCPVCs FTM e BMSCs recuperati dall'analisi aortica dell'anello sono stati elaborati per analisi qPCR testare l'espressione dei geni angiogenici. Utilizzando una matrice di qPCR commercialmente disponibili, tre anello aortico co-culture fornito una quantità sufficiente di materiale genetico per quantificare l'espressione di geni di fattore di crescita umano 84 (complementare figura 2A). I risultati preliminari indicano che HUCPVCs FTM e BMSCs esprimono fattori angiogenici secreti chiave a livelli comparabili (complementare figura 2B). Oltre a confrontando i livelli di espressione di diversi tipi di cellule nel dosaggio, l'effetto di trasferire cellule di EBM basato analisi media dai loro terreni di coltura di espansione dovrebbe essere considerato. Quando si utilizza cellule di maggiore plasticità fenotipica o genetica, un gruppo di controllo di comparatore di MSCs umano in media EBM - senza tessuto aortico - dovrebbe essere incluso nella valutazione.

Le somiglianze nell'espressione di fattore angiogenico di MSCs suggerisce che la differenza significativa nel loro aumento di rete non è un risultato di paracrine diverse attività. Questo è in concordanza con l'osservazione precedente che una maggiore interazione intercellulare diretto sembra promuovere sviluppo rete endoteliale.

Figure 1
Figura 1: Diagramma schematico di una nuova applicazione dell'anello aortico Assay installazione.
Le fasi principali dell'installazione e l'analisi di co-colture MSC con l'analisi aortica dell'anello sono delineati in solidi contenitori e note aggiuntive sono descritte nelle caselle punteggiate. Barra della scala = 1.000 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Immagine rappresentante dell'anello aortico rete analisi.
Reti endoteliale sono divisi in tre regioni concentriche, sulla base di differenze strutturali: zona non strutturato in prossimità di tessuto anello aortico (A), sviluppato/strutturato reti endoteliale (B) e sviluppo delle reti Situato nella periferia di ex vivo coltura tissutale (C). Crescita della rete radiale e quadrante uniforme per il conteggio dei cicli sono definiti all'interno della rete endoteliale sviluppata (B). x: chiusa endoteliale contato nel quadrante uniforme. Barra della scala = 250 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Fluorescente Imaging di rete regione-dipendente integrazione di umano MSCs nell'analisi dell'anello aortico seguendo 24 & h 72.
Precolorati (verde) FTM HUCPVCs e BMSCs sono stati aggiunti alle reti del tubo endoteliale anello aortico in via di sviluppo. Immagini di microscopia di fluorescenza presi 24 h dopo aver stabilito la MSC co-colture visualizzare HUCPVCs FTM che migrano attraverso la ECM e la casa di sviluppo periferico delle reti endoteliale (A). Immagini di ingrandimento superiore visualizzare allungate morfologie di FTM HUCPVCs mentre a stretto contatto con le reti endoteliale (B). Meno BMSCs processo ECM e sede di reti endoteliale con nessuna preferenza osservabile a sviluppo periferico delle reti (C). BMSC visualizzare morfologie delle cellule sferiche (D).
Immagini di microscopia di fluorescenza di alto ingrandimento di MSCs precolorati in analisi di anello aortico del ratto dopo 72 h di co-coltura (E, F). FTM HUCPVCS presentano morfologie allungate durante la visualizzazione di copertura endoteliale attraverso interazioni cellula--cellula dirette con le cellule endoteliali (frecce bianche tinta) sia in nodi di rete e tubuli (E). BMSC mantenere morfologie di celle sferiche in cluster nei nodi della rete endoteliale (F). Broken arrow rappresenta la direzione della crescita endoteliale rete dal tessuto anello aortico. A, c: Barra della scala = 1.000 µm B, d: scalabar = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4: Immagini di microscopia di fluorescenza di alto ingrandimento delle interazioni fisiche Pericyte-endothelial delle cellule.
Non macchiate le cellule endoteliali sono state trovate associati a sporgenze continui collegamento pre-macchiato FTM HUCPVCs nella rete tubolare (A). Immagini fluorescenti delle reti endoteliale pre-macchiati (CE, rosso) con pre-macchiato FTM HUCPVCs (FTM, verde) dimostrano interazioni ricapitolare delle cellule endoteliali, Pericita interazioni (B). R: scala bar = barra di scala b: 100 µm = 200 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5: Quantificazione della crescita della rete nel trattamento MSC gruppi 5 D dopo l'istituzione di co-coltura.
Basso ingrandimento fase contrasto microscopia immagini sono state scattate dai gruppi di trattamento aortica anello misura rete crescita e sviluppo (A). Sparsa freccia indica la direzione di crescita della rete. Barra della scala = 250 µm. microscopia immagini sono stati usati per quantificare le proprietà di rete, compresa la rete significa crescita e significa formazione di ciclo di rete nel quadrante di un saggio. HUCPVCs FTM ha contribuito alla crescita di rete maggiore rispetto a BMSC co-colture e reti non trattati (p ≤0.001) (B). Il valore di p è stato calcolato utilizzando un one-way ANOVA per essere p <0,0001 utilizzando di Tukey Post test (N = 3). Loop di rete con almeno quattro lati chiusi sono stati quantificati (C). FTM HUCPVC co-culture sviluppati loop di rete maggiore rispetto a BMSC co-culture (p ≤0.001) e reti non trattati (p ≤ 0,01). Il valore di p è stato calcolato usando un one-way ANOVA per essere p < 0.0001 utilizzando il test di Tukey Post (N = 3). La media dei 4 settori delle reti endoteliale sono stati quantificati. Barra della scala = 250 µm. Per confronto pairwise, * = p ≤ 0.05, * * = p ≤ 0,01, * * * = p ≤0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Possibili errori nell'anello aortico Assay istituzione.
Anelli aortici incorporati nella polimerizzazione di BME incompleta possono portare a reti endoteliale incoerente e rotte (A). FTM HUCPVCs macchiato per lunghi periodi con intervalli di tempo grande tra macchiatura e fissa co-colture, resa minima homing e le interazioni delle cellule endoteliali (B). La rete endoteliale dall'aorta di ratto conservati a-80 ° C e scongelati per analisi aortica dell'anello (C). R: scala bar = 250 µm B, c: scala bar = 400 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Complementare figura 1: Analisi di flusso Cytometry delle HUCPVCs FTM umani estratti da anello aortico co-culture.
Frazioni cellulari delle culture anello aortico sono sono isolate e trattate per analisi di citometria a flusso. Fluoroforo anticorpo coniugato contro la superficie dell'indicatore specifico sulle cellule umane (TRA-1-85, APC) è stato applicato in combinazione con indicatore endothelial (CD31, FITC, (A)) o gli anticorpi specifici di periciti marcatore (CD146, FITC, (B)). La popolazione delle cellule positiva per il marcatore umano (asse y) testata bassa positività per l'indicatore endothelial CD31 (A, Q2) e fortemente positivo per Pericita marcatore CD146 (B, Q6). Questo suggerisce che FTM HUCPVCs mantenuto la loro proprietà di cellule perivascolari nelle co-culture anello aortico e non hanno sviluppato un fenotipo endoteliale. I quadranti su appezzamenti sono stati definiti utilizzando i controlli di isotipo gli anticorpi primari applicati di corrispondenza. Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Complementare figura 2: Analisi PCR quantitativa dei geni chiave angiogenico.
L'espressione genica simile di geni chiave angiogenici da FTM HUCPVCs e BMSCs dopo 1 settimana co-coltura nell'analisi aortica dell'anello (A). Valori rappresentativi di CT sono riportati nella tabella (B). Per favore clicca qui per scaricare questo file.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ci sono diverse fasi critiche nella creazione di un successo analisi aortica dell'anello esperimento di co-coltura MSC. In primo luogo, i passaggi più importanti quando isolando e sezionamento dell'aorta sono: 1) ottenere esclusivamente il segmento toracico dell'aorta; 2) accuratamente rimuovendo ramificazione dei vasi sanguigni, tessuto connettivo e adiposo e; 3) taglio anche sezioni dell'aorta (~ 1 mm) per limitare la variabilità tra ogni dosaggio. In secondo luogo, il successo l'incorporamento degli anelli aortici in BME è fondamentale per questo test. Se il BME è non completamente polimerizzato o polimerizzato in modo non uniforme, anelli aortici incorporati nel BME non sarà in grado di avviare germogliare endoteliale o possono sviluppare reti endoteliale discontinui. Se la polimerizzazione di BME è insufficiente, le analisi non sono affidabili per la quantificazione. In terzo luogo, completo arricchita di fattore endothelial media è necessario fornire nutrimento per gli anelli aortici iniziare la germinazione. Una volta gli anelli anello aortico hanno avviato la nave che spuntano, i prossimi passaggi imminenti critici includono il tipo di cella per essere testato. A tal fine, MSCs devono essere correttamente pre-macchiato e somministrato per il germogliatura anelli aortici. Ci sono due procedure critiche per questa sezione. 1) selezionando il giorno appropriato per semina: le reti dovrebbero essere in fase di sviluppo e non essere portata elevata copertura della cultura bene. Se MSCs non è amministrato in modo tempestivo, diventa difficile quantificare gli effetti netti di MSCs su sviluppo della rete. 2) prestaining il MSCs prima aggiunta: se MSCs è sovra-macchiato o rimanga in pellet per un lungo periodo di tempo, che ragruppa verificherà che altera l'homing e integrazione all'interno di reti endoteliale. Infine, quantificare le reti può facilmente essere raggiunto se i controlli appropriati vengono preparati. Gli anelli aortici senza MSCs si svilupperanno endoteliale reti perché l'aorta stessa sostiene che spuntano, ma i MSCs possono promuovere maggiore sviluppo della rete con strutture di rete diversi, come descritto in questo manoscritto. La quantificazione delle reti endoteliale dovrebbe essere eseguite almeno 5 d seguente che stabilisce co-culture. Grazie al sistema chiuso, risposta angiogenica è transitoria e reti endoteliale avviare degenerando dopo circa 7 d. Se lo scopo dell'osservazione è quello di valutare l'effetto del tipo di cellula testata sullo sviluppo delle reti endoteliale, le immagini devono essere acquisite entro la prima settimana di co-coltura.

Un'eventuale modifica del dosaggio attuale può essere l'applicazione del tessuto umano primario. Come una sezione di 1 mm dell'aorta del ratto fa una unità per co-coltura, aorte umane possono fornire con un elevato numero di sezioni di misurazioni altamente coerente. Nonostante la disponibilità molto limitata di tessuto primario umano vitale, l'alto rendimento suggerisce potenziale fattibilità. Quando si sviluppa un'analisi per le valutazioni su larga scala, può essere considerati pre-formando il dosaggio e la memorizzazione suoi componenti fino a quando le cellule per il test diventano disponibili. Il rivestimento di BME può essere preparato sulle piastre di coltura del tessuto e memorizzato in forma disidratata, congelata per lunghi periodi di tempo. Inoltre, come abbiamo testato nel nostro laboratorio, tessuto aortico del ratto possa essere congelato e conservato per successive applicazioni, rendendo così il lavoro con l'elemento più importante del dosaggio più conveniente.

Nonostante i numerosi vantaggi del dosaggio anello aortico, ci sono alcune limitazioni per essere elencati. In primo luogo, l'istituzione delle culture dosaggio può essere impegnativo. Nella sua forma attuale, l'applicazione sistematica richiede manualità sufficiente. Gli errori dell'operatore possono introdurre una certa variabilità. E ' possibile eseguire il mirroring in crescita della rete e può rendere difficile valutare in modo affidabile l'effetto delle cellule amministrate e conseguenza le proprietà angiogeniche importante. Tuttavia, queste sfide sono simili se non più piccoli se paragonati a quelli di altri metodi disponibili, e il periodo di addestramento richiesto può essere convenientemente breve ed economica al contrario di esperimenti in vivo . In secondo luogo, un periodo di ritardo tra l'incorporamento del tessuto aortico ex vivo e lo sviluppo di rete iniziale che scandisce il tempo di somministrazione delle cellule deve essere contabilizzata dall'utente. In terzo luogo, la quantificazione delle proprietà della rete endoteliale può richiedere molto tempo ma può essere risolto assegnando hallmark parametri, tra cui la crescita radiale, tubo lunghezza e rete dimensioni di maglia. Questa operazione può essere eseguita utilizzando analisi assistita da elaboratore di immagini (Image J), che può ridurre notevolmente il tempo necessario per la quantificazione coerenza e affidabile. In quarto luogo, la variabilità tra ogni dosaggio può verificarsi come risultato di lievi incongruenze nella fonte di tessuto animale e manipolazione da parte dell'operatore. Abbiamo trovato che questa sfida può essere efficacemente superata e la quantificazione diventa statisticamente affidabile impostando triplici copie per ciascun gruppo di trattamento. Infine, l'estrazione e l'ordinamento la cellule dell'essere umano e l'origine del ratto per l'analisi post-test può essere impegnativo. Tuttavia, proteinasi specifici, tra cui dispase e soluzione di recupero di cella possono essere applicati per recuperare le cellule per l'analisi di espressione di gene o immunophenotypic.

Rispetto a metodi esistenti, che sia un tipo di cellula endoteliale della coltura o animale sistemi live, questo ha presentato analisi utilizza la combinazione di ex vivo tessuto aortico e BME. Questa configurazione consente all'utente di ottenere dati qualitativi e quantitativi, chiarire le proprietà angiogeniche dei candidati alla terapia cellulare. La combinazione di BME e multi-cellulare ex vivo tessuto fornisce proprietà che imita molto attentamente il microambiente che il tipo di cella terapeutiche può incontrare dopo amministrazione locale. A causa della possibilità di un numero elevato di parallels e stretto controllo delle condizioni di coltura, l'operatore è dotato di un sistema che contiene gli elementi necessari per una valutazione affidabile, mentre eliminando le variabili e le incongruenze trovate modelli animali. Inoltre, le valutazioni sono più fattibile perché riduce il costo e la necessità di procedure ripetute degli animali. Analisi delle singole cellule e modelli più animali mancano i fattori e le variabili introdotte dalla risposte immunitarie che altrimenti si verificherebbe nell'applicazione clinica dei candidati alla terapia cellulare. La risposta infiammatoria altera l'angiogenesi e conseguenza, l'effetto terapeutico di sostanze impiantati o le cellule non possono essere quantificate con precisione. Il dosaggio di anello aortico esclude molti componenti infiammatorie che disturberebbero analisi misurazioni. Tuttavia, esso contiene macrofagi residenti che sono giocatori importanti nel microvasculature sviluppo32. Con la facile identificazione della rete endoteliali e cellule umane precolorate, l'effetto delle citochine infiammatorie MSC secernuta ed elementi anche cellulari del sistema immunitario, possono essere facilmente osservati usando questa analisi.

Elevato controllo dell'utente sopra le condizioni di test e la natura riproducibile del setup sperimentale permette l'introduzione di ulteriori elementi al sistema. In primo luogo, l'analisi anello aortico può essere usata come un modello di lesione. Dopo l'incorporamento degli anelli aortici e germogliare endoteliale, saggi possono essere introdotti alla ferita ischemica, fattori infiammatori (TNF-α) o lipopolisaccaride batterico (LPS), seguita dalla aggiunta di MSC per determinare l'eventuale salvataggio di angiogenico risposta dopo la lesione. In secondo luogo, per delucidare i meccanismi possibili di come MSCs contribuisce alla risposta angiogenica, neutraliZing anticorpi possono essere utilizzati per mettere a tacere i potenziali recettori critici per le interazioni cellula--cellula. Infine, per studiare le proprietà di paracrine di MSCs, l'analisi aortica dell'anello può essere configurato in un sistema di transwell per escludere l'effetto delle interazioni cellula--cellula della risposta angiogenica ma messa a fuoco sulle proprietà di paracrine.

In sintesi, l'analisi aortica dell'anello in grado di valutare la capacità e la potenza dei candidati alla terapia cellulare per mediare ECM elaborazione, migrare in aree dell'angiogenesi e contribuire allo sviluppo della nave attraverso il contatto fisico. L'analisi dell'anello aortico ex vivo l'angiogenesi potrebbe essere sviluppato come uno strumento prezioso, quantitativo pre-screening per linee cellulari candidato per la terapia rigenerativa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Clifford L. Librach è contitolare del brevetto: metodi di isolamento e di uso di cellule derivate da tessuti di cordone ombelicale primo acetonide. Concesso in Canada e in Australia.

Acknowledgements

Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale di ricerca: Sarah Laronde, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Andrée Gauthier-Fisher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146, (6), 873-887 (2011).
  2. Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56, (4), 549-580 (2004).
  3. Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10, (4), 285-291 (2003).
  4. Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105, (8), 724-736 (2009).
  5. Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3, (6), 693-714 (2012).
  6. Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits? Discov Med. 9, (46), 179-184 (2010).
  7. Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50, (1), 35-35 (2013).
  8. Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7, (4), 452-464 (2005).
  9. Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122, (5), 517-526 (2010).
  10. Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14, (2), 153-166 (2009).
  11. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90, (3), 195-221 (2009).
  12. Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49, (1), 32-40 (2003).
  13. Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15, (6), 1110-1126 (2012).
  14. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12, (3), 267-274 (2009).
  15. Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5, (4), 628-635 (2010).
  16. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, (3), 588-612 (2006).
  17. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13, (10), 4113-4136 (2009).
  18. Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7, (1), 89-104 (2011).
  19. Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105, (3), 383-393 (2015).
  20. Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10, (7), e0131946 (2015).
  21. Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
  22. Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213, (2), 341-347 (2007).
  23. Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98, (5), 1076-1084 (2006).
  24. Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10, (6), 709-716 (2012).
  25. Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212, (3), 702-709 (2007).
  26. Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80, (1), 229-236 (2005).
  27. Caplan, A. I. All MSCs are pericytes? Cell Stem Cell. 3, (3), 229-230 (2008).
  28. Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22, (17), 2425-2439 (2013).
  29. Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1, (2), 94-99 (2010).
  30. Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
  31. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9, (7), 671-675 (2012).
  32. Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181, (8), 5711-5719 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics