सी. एलिगेंस आंत एक मॉडल के रूप में एक सेलुलर लुमेन Morphogenesis के लिए और Vivo में एक-कोशिका स्तर पर ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति: लेबलिंग द्वारा एंटीबॉडी धुंधला, RNAi के नुकसान का-समारोह विश्लेषण और इमेजिंग

Developmental Biology

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Summary

पारदर्शी सी एलिगेंस आंत कोशिकीय tubulogenesis के दौरान एकल सेल और उपसेलुलर स्तर पर apicobasal झिल्ली और लुमेन के अध्ययन के लिए एक "vivo में ऊतक चैंबर" के रूप में सेवा कर सकते हैं । इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानक लेबलिंग, नुकसान की-समारोह आनुवंशिक/RNAi और सूक्ष्म दृष्टिकोण गठबंधन करने के लिए एक आणविक स्तर पर इन प्रक्रियाओं टुकड़े ।

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Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

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Abstract

कोशिकीय ट्यूबों, सभी आंतरिक अंगों की बुनियादी इकाइयों, एक दूसरे और/या extracellular मैट्रिक्स से संपर्क लुमेन और basolateral झिल्ली अस्तर शिखर झिल्ली के साथ, ध्रुवीकरण उपकला या endothelial कोशिकाओं से बना रहे हैं. कैसे इस विशिष्ट झिल्ली विषमता स्थापित है और अंग morphogenesis के दौरान बनाए रखा है अभी भी सेल जीवविज्ञान का एक अनसुलझे सवाल है । इस प्रोटोकॉल का वर्णन करता है C. एलिगेंस आंत ट्यूब morphogenesis के दौरान ध्रुवीय झिल्ली के विश्लेषण के लिए एक मॉडल के रूप में, शिखर झिल्ली और लुमेन पर जोर के साथ उत्पत्ति । C. एलिगेंस बीस सेल एकल-स्तरित आंत्र उपकला एक सरल द्विपक्षीय सममित ट्यूब में व्यवस्थित है, एक एकल सेल स्तर पर विश्लेषण की अनुमति । झिल्ली ध्रुवीकरण जल्दी embryogenesis के दौरान ध्रुवीकरण सेल विभाजन और प्रवास के साथ concomitantly होता है, लेकिन de नोवो ध्रुवीकरण लार्वा विकास भर में जारी है, जब कोशिकाओं अब पैदा और कदम नहीं है । बाद सेटिंग एक अलग उपसेलुलर परिवर्तन है कि एक साथ इन अलग ध्रुवीकरण प्रक्रियाओं, मुश्किल सबसे ध्रुवीयता मॉडल में भेद करने के लिए मध्यस्थता करने के लिए अनुमति देता है । शिखर-, basolateral झिल्ली-, जंक्शन-, cytoskeletal-और endomembrane घटकों लेबल और GFP फ्यूजन प्रोटीन द्वारा विकास भर में ट्रैक किया जा सकता है, या सीटू एंटीबॉडी धुंधला में द्वारा मूल्यांकन । जीव आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा के साथ साथ, C. एलिगेंस आंत इस प्रकार दृश्य, विकास के लिए vivo मॉडल में एक अनूठा प्रदान करता है, और ध्रुवीय झिल्ली और ट्यूब की उत्पत्ति के आणविक आनुवंशिक विश्लेषण. विशिष्ट विधियों (सभी मानक) यहां वर्णित कैसे करने के लिए: लेबल आंतों एंटीबॉडी धुंधला द्वारा सेलुलर अवयव; विश्लेषण के नुकसान-समारोह आम तौर पर आवश्यक tubulogenesis जीन के लिए अनुकूलित अध्ययन द्वारा ध्रुवीकरण झिल्ली में शामिल जीन श्लेष; विभिन्न विकासात्मक चरणों के दौरान ध्रुवीकरण दोषों का आकलन करें; epifluorescence द्वारा phenotypes व्याख्या, विभेदक हस्तक्षेप कंट्रास्ट (उद्योग) और फोकल माइक्रोस्कोपी; दृश्य दोष यों तो । इस प्रोटोकॉल अक्सर अत्यधिक संरक्षित उपकला ध्रुवीयता, झिल्ली में शामिल अणुओं में से किसी का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है उत्पत्ति, ट्यूब और लुमेन morphogenesis.

Introduction

सेलुलर और सेलुलर असीमितता की पीढ़ी, जैसे कि ध्रुवीय झिल्ली डोमेन के गठन, morphogenesis और कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों के समारोह के लिए महत्वपूर्ण है1। epithelia में ध्रुवीकरण झिल्ली पर अध्ययन एक तकनीकी चुनौती बने रहते हैं, के बाद से उपसेलुलर घटकों के आवंटन में दिशात्मक परिवर्तन कई लगातार और संयोग extracellular और intracellular संकेत है कि कर रहे है पर निर्भर मुश्किल सबसे मॉडलों में अलग करने के लिए और दृढ़ता से मॉडल प्रणाली पर निर्भर हैं । यहां प्रस्तुत मॉडल-एकल स्तरित Caenorhabditis एलिगेंस आंत-अति सुंदर सादगी के एक ऊतक है । एकल सेल c. एलिगेंस निकालनेवाला नहर के साथ ( सी. एलिगेंस निकालनेवाला नहर में ध्रुवीय झिल्ली के साथ2, यह पहचान के लिए कई अनूठे लाभ प्रदान करता है और ध्रुवीय झिल्ली की उत्पत्ति के लिए आवश्यक अणुओं का लक्षण वर्णन । खमीर से आणविक ध्रुवीकरण cues के संरक्षण आदमी को इस सरल invertebrate अंग एक उत्कृष्ट "vivo ऊतक चैंबरमें " बनाने के लिए उपकला ध्रुवीयता कि प्रत्यक्ष प्रासंगिकता के मानव प्रणाली है, जो अभी भी दूर है के लिए कर रहे है पर सवाल का पता vivo मेंसिंगल सेल लेवल पर इन इवेंट्स के विजुअल विच्छेदन की अनुमति देने के लिए कॉम्पलेक्स ।

हालांकि एकाधिक (1) extracelluar मैट्रिक्स, (2) प्लाज्मा झिल्ली और उसके जंक्शनों से, और (3) intracellular vesicular ्े पहचान की गई है3, उनके एकीकरण के अंतर्निहित सिद्धांतों की प्रक्रिया में से ध्रुवीय संकेतों को संरक्षित ध्रुवीकरण उपकला झिल्ली और ऊतक की उत्पत्ति खराब समझ4है । शास्त्रीय एकल vivo मॉडल में सेल (e.g.S. cerevisiae और सी. एलिगेंस युग्मनज) है ध्रुवीकरण कोशिका विभाजन और पूर्वकाल पीछे ध्रुवीयता के सिद्धांतों को परिभाषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है और गंभीर की पहचान की है झिल्ली-जुड़े ध्रुवीकरण निर्धारकों (छोटे GTPases/सीडीसी-42, विभाजन दोषपूर्ण पार्स)5,6, लेकिन वे संकेत (कली निशान, शुक्राणु प्रविष्टि) और कमी जंक्शन को तोड़ने अद्वितीय समरूपता पर निर्भर सुरक्षित apicobasal झिल्ली डोमेन और, संभवतः, इसी intracellular apicobasal छंटाई मशीनरी । epithelia में ध्रुवीकरण की तस्करी के संगठन के बारे में हमारे वर्तमान ज्ञान, तथापि, मुख्य रूप से स्तनधारी 2d monocultures पर निर्भर करता है7, जो शारीरिक extracellular और विकास cues कि झिल्ली के पदों को बदल सकते है कमी डोमेन और तस्करी पथ के दिशा-निर्देश (2d से 3 डी के लिए एक स्विच इन विट्रो संस्कृति प्रणालियों अकेले MDCK में झिल्ली ध्रुवीकरण (मडि़हान-डार्बी कुत्ते गुर्दे) कोशिकाओं पलटना करने के लिए पर्याप्त है)8। invertebrate मॉडल जीवों में उपकला ध्रुवीयता पर vivo विकासात्मक अध्ययनों में शुरू में फ्लैट epithelia में आयोजित किया गया, उदाहरण के लिए Drosophila melanogaster एपिडर्मिस में, जहां वे महत्वपूर्ण योगदान की पहचान के लिए जंक्शन गतिशीलता के ध्रुवीकरण सेल प्रवासन और सेल शीट आंदोलन9, और endocytic के लिए ध्रुवीकरण की तस्करी रखरखाव10। 3d इन विट्रो में और vivo विश्लेषण में MDCK कोशिकाओं में ट्यूबलर epithelia में लुमेन morphogenesis और सी. एलिगेंस आंत में क्रमशः, हाल ही में की पहचान की आवश्यकता है intracellular के लिए तस्करी के लिए de नोवो (शिखर) डोमेन और लुमेन और11,12,13पोजिशनिंग । ट्यूबलर की मोटाई (फ्लैट बनाम) उपकला कोशिकाओं उपसेलुलर असीमितता के 3 डी विश्लेषण के लिए एक लाभ के बाद से यह शिखर-लुमेन झिल्ली, apico पार्श्व जंक्शनों के एक बेहतर दृश्य भेद परमिट, पार्श्व झिल्ली, और intracellular organelles के पद । इन दृश्य लाभ के लिए, C. एलिगेंस मॉडल vivo में सेटिंग, विकासात्मक अक्ष, पारदर्शिता, शरीर की योजना की सादगी, अपरिवर्तनीय और परिभाषित सेल वंश, विश्लेषणात्मक (आनुवंशिक) और नीचे वर्णित अतिरिक्त लाभ जोड़ता है ।

C. एलिगेंस ही ट्यूबलर संरचना का एक निमेटोड है जिसकी पारदर्शिता और सरल वास्तुकला अपने यांसारखे ट्यूबलर आंतरिक अंगों को सीधे ट्यूब और लुमेन morphogenesis के दृश्य विश्लेषण के लिए सुलभ बनाते हैं. इसकी आंत के बीस कोशिकाओं (इस अवसर पर 21 या 22 कोशिकाओं)14 एक एकल जनक सेल से प्राप्त कर रहे हैं (ई) और एक intercalation कदम से एक दोहरी स्तरित उपकला से विकसित नौ INT के छल्ले के एक द्विपक्षीय सममित ट्यूब में (चार कोशिकाओं पहली अंगूठी; चित्रा 1 योजनाबद्ध)14,15,16. आंत के वंश और ऊतक विश्लेषण, शुरू में परमाणु पहचान17और बाद में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा लेबल झिल्ली के माध्यम से Nomarski प्रकाशिकी द्वारा निर्धारित, अपने morphogenesis में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है, में विशेष सेल-स्वायत्त और सेल-गैर अपने दिशात्मक सेल डिवीजनों और आंदोलनों के लिए स्वायत्त आवश्यकताओं (उदा, intercalation, दाएं-बाएं असीमितता, पूर्वकाल और पीछे ट्यूब रोटेशन)14,18 . अर्ली endodermal सेल विनिर्देश और जीन विनियामक नेटवर्क इस क्लोनल मॉडल अंग के विकास को नियंत्रित अच्छी तरह से19,20की विशेषता है । यहां ध्यान केंद्रित है, तथापि, एक ट्यूबलर कोशिकाओं में ध्रुवीय झिल्ली और लुमेन की उत्पत्ति के विश्लेषण पर है, और endomembranes, cytoskeletal संरचनाओं और organelles के intracellular असीमितता की है कि इस प्रक्रिया के साथ । विश्लेषण इस ट्यूब की सादगी, जहां सभी शिखर झिल्ली (microvilli द्वारा प्रतिष्ठित ultrastructural स्तर पर) लुमेन चेहरा और सभी बेसल झिल्ली बाहरी ट्यूब सतह का सामना, पार्श्व झिल्ली एक दूसरे से संपर्क के साथ की सुविधा है, जंक्शनों द्वारा शिखर झिल्ली से अलग (चित्र 1 योजनाबद्ध; देखें संदर्भ (16,21) के लिए C. एलिगेंस-तंग और adherens जंक्शन घटकों के विशिष्ट संगठन) । शिखर झिल्ली की उत्पत्ति इस प्रकार लुमेन morphogenesis के साथ संपाती है । इसके अलावा, वयस्क आंत्र कोशिकाओं के आकार-इस छोटे जानवर की सबसे बड़ी कोशिकाओं (निकालनेवाला सेल के अपवाद के साथ)-अनुमानित एक स्तनधारी कोशिका का आकार, vivo में दृश्य ट्रैकिंग की अनुमति सेलुलर तत्वों, उदा. पुटिका पथ, कि आम तौर पर एक संस्कृति पकवान में इन विट्रो में की कोशिश की है ।

इस सेलुलर और सेलुलर विश्लेषण के प्रयोजन के लिए, उचित लेबलिंग महत्वपूर्ण है । आंतों इंडो-या प्लाज्मा-झिल्ली डोमेन, जंक्शनों, cytoskeletalसंरचनाओं, नाभिक और अंय उपसेलुलर organelles उनके विशिष्ट आणविक घटकों लेबलिंग द्वारा visualized किया जा सकता है । कई ऐसे घटकों की विशेषता है और जारी की खोज की जा रही है (तालिका 1 कुछ उदाहरण देता है और संसाधनों को संदर्भित करता है) । मसलन, विभिन्न अणुओं को अलग ट्यूबलर और/या आंतों endomembrane प्रणाली के vesicular डिब्बों, एर से Golgi के माध्यम से प्लाज्मा झिल्ली के लिए Golgi बुलबुले, की पहचान की गई है22। विशिष्ट प्रोटीन (साथ ही लिपिड और शर्करा) या तो सीधे लेबल किया जा सकता है, या परोक्ष रूप से बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से । इस प्रोटोकॉल सीटू एंटीबॉडी निश्चित नमूनों की धुंधलान में पर केंद्रित है, दो मानक लेबलिंग तकनीक में से एक (निकालनेवाला नहर tubulogenesis पर अन्य तकनीक2 का विवरण के लिए साथ कागज देखें- vivo में लेबलिंग फ्लोरोसेंट प्रोटीन फ्यूजन के माध्यम से-जो सीधे आंत के लिए लागू है; तालिका 2 आंत के लिए इस तरह के फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि आंतों विशिष्ट प्रवर्तकों के उदाहरण प्रदान करता है) । या तो दृष्टिकोण, या दोनों से अधिक अतिरिक्त रासायनिक धुंधला के संयोजन के साथ डबल या एकाधिक लेबलिंग, में अधिक से अधिक गहराई से दृश्य संकल्प और सह में स्थानिक और लौकिक परिवर्तन की परीक्षा की अनुमति देता है स्थानीयकरण और विशिष्ट की भर्ती अणुओं या सेलुलर घटकों के (चित्रा 2) । निर्धारण और धुंधला इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का समर्थन संरक्षण (GFP) immunostaining प्रक्रियाओं के दौरान लेबलिंग । इमेजिंग के लिए, मानक सूक्ष्म प्रक्रियाओं (प्रतिदीप्ति विदारक और फोकल माइक्रोस्कोपी) के माध्यम से पता लगाने और tubulogenesis phenotypes के लक्षण वर्णन के मुख्य बिंदुओं का वर्णन किया गया है (चित्रा 3, 4) । इन उच्च संकल्प इमेजिंग दृष्टिकोण को बढ़ाया जा सकता है, उदाहरण के लिए superresolution माइक्रोस्कोपी और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (यहां वर्णित नहीं) ।

इस प्रणाली की एक प्रमुख शक्ति embryogenesis से वयस्कता के माध्यम से अलग विकास के चरणों में व्यक्तिगत कोशिकाओं में ध्रुवीयता का विश्लेषण करने की क्षमता है । उदाहरण के लिए, शिखर झिल्ली डोमेन और लुमेन एर्म-1 के साथ लेबलिंग के माध्यम से एकल सेल स्तर पर विकास भर में ट्रैक किया जा सकता है, एक अत्यधिक संरक्षित झिल्ली-actin Ezrin के लिंक-Radixin-Moesin परिवार23,24 . एर्म-1 visualizes शिखर झिल्ली की उत्पत्ति (1) के दौरान भ्रूण ट्यूब morphogenesis, जब यह होता है concomitantly के साथ ध्रुवीय कोशिका विभाजन और प्रवास (कोशिकाओं apically के दौरान लुमेन के चारों ओर ले जाने के intercalation)15; (2) देर से भ्रूण और लार्वा ट्यूब विस्तार है कि सेल प्रभाग या प्रवास के अभाव में आय के दौरान; और (3) वयस्क आंत में, जहां ध्रुवीकरण झिल्ली डोमेन (चित्रा 1) बनाए रखा है । mitotic लार्वा उपकला के विस्तार में, de नोवो ध्रुवीय झिल्ली इस प्रकार के ध्रुवीय ऊतक morphogenesis, जो vivo में सबसे में संभव नहीं है और इन विट्रो उपकला ध्रुवता मॉडल में से अलग किया जा सकता है, एक सेल संकल्प के साथ उन सहित (उदा 3 डी MDCK पुटी मॉडल8) । अन्य घटकों के लिए लेबलिंग के साथ, इस सेटिंग का अवसर प्रदान करता है (विशेष रूप से L1 लार्वा अवस्था में जब कोशिकाओं को एक उच्च कोशिका/नाभिक अनुपात है) उन intracellular परिवर्तन है कि ध्रुवीय झिल्ली के लिए विशिष्ट है अंतर उत्पत्ति (भेद करने के लिए जैसे कि उन concomitantly से, जो कि ध्रुवीय कोशिका विभाजन और प्रवास के लिए आवश्यक हैं

सी. एलिगेंस के आनुवंशिक बहुमुखी प्रतिभा को अच्छी तरह से25जाना जाता है और यह किसी भी जैविक प्रश्न के आणविक विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली बनाता है । morphogenesis पर एक अध्ययन, उदाहरण के लिए, एक जंगली प्रकार के तनाव के साथ शुरू कर सकते हैं, एक ट्रांसजेनिक तनाव जहां ब्याज की संरचना (जैसे एक झिल्ली) एक फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल, या एक नुकसान के साथ-या लाभ के इस में एक दोष के साथ समारोह उत्परिवर्ती संरचना. एक ठेठ रिवर्स आनुवंशिक अध्ययन एक उत्परिवर्ती जहां ब्याज की जीन germline में नष्ट कर दिया है उत्पंन कर सकते है (जैसे एक लक्षित विलोपन द्वारा), mutagenesis द्वारा संशोधित (आमतौर पर फलस्वरूप हानि, कमी, या समारोह में लाभ के साथ बिंदु उत्परिवर्तन का उत्पादन जीन की), या जहां इसकी प्रतिलिपि RNAi द्वारा कम है । C. एलिगेंस26 में खिलाने से RNAi की आसानी भी खुद को लक्षित स्क्रीन है कि ब्याज की जीन के एक बड़े समूह की जांच के डिजाइन के लिए उधार देता है । एक आनुवंशिक मॉडल जीव यकीनन सबसे बड़ी ताकत है vivo आगे स्क्रीन में (जैसे mutagenesis, व्यवस्थित या जीनोम चौड़ा RNAi स्क्रीन) है कि एक phenotype के लिए आणविक कारण में एक निष्पक्ष जांच की अनुमति आचरण करने की क्षमता है ब्याज. उदाहरण के लिए, एक निष्पक्ष दृश्य सी. एलिगेंस RNAi tubulogenesis स्क्रीन, एर्म-1-लेबल शिखर झिल्ली के साथ एक ट्रांसजेनिक जानवर के साथ शुरू, एक पेचीदा प्रतिवर्ती आंत्र ध्रुवीकरण रूपांतरण और अस्थानिक लुमेन phenotype की खोज की, इस्तेमाल किया यहां इस प्रकार के विश्लेषण के लिए एक उदाहरण के रूप में । इस स्क्रीन glycosphingolipids की कमी की पहचान (GSLs; बाध्य झिल्ली लिपिड, उनके GLS-सिंथेटिक एंजाइमों के माध्यम से की पहचान) और पुटिका कोट clathrin और इसकी एपी-1 अनुकूलक के घटकों के रूप में विशिष्ट आणविक इस ध्रुवता के कारण दोष रूपांतरण phenotype, जिससे शिखर झिल्ली ध्रुवीकरण और लुमेन पोजीशनिंग12,13के लिए vivo cues में के रूप में इन तस्करी अणुओं निस्र्पक । जब एक विशिष्ट आनुवंशिक उत्परिवर्तन के साथ शुरू/morphogenesis phenotype, ऐसी स्क्रीन (या एक आनुवंशिक/RNAi बातचीत प्रयोगों) भी ब्याज की दो या कई जीन के बीच कार्यात्मक बातचीत की जांच कर सकते है (निकालनेवाला पर कागज के साथ देखें इस तरह के एक विश्लेषण का एक उदाहरण के लिए नहर)2। इस प्रोटोकॉल RNAi पर केंद्रित है, जो अपनी क्षमता के अलावा सीधे जीन जिसका नुकसान की पहचान के लिए आगे स्क्रीन में phenotype का कारण बनता है, morphogenesis के विश्लेषण के लिए विशिष्ट लाभ प्रदान करता है । के बाद से जीन उत्पाद प्रत्यक्ष morphogenesis अक्सर एक खुराक पर निर्भर फैशन में काम करते हैं, RNAi आमतौर पर phenotypes की एक स्पेक्ट्रम पैदा करने में सफल रहा है । के लिए जानकारीपूर्ण आंशिक-हानि-समारोह phenotypes उत्पंन करने की क्षमता भी समस्या है कि महत्वपूर्ण tubulogenesis जीन के बहुमत आवश्यक है और है कि उनके नुकसान के कारण बांझपन और जल्दी भ्रूण मृत्यु दर का पता करने में मदद करता है । इस प्रोटोकॉल इस कठिनाई को दूर करने के लिए सशर्त RNAi रणनीतियों में शामिल है और इस तरह के एक allelic mutagenesis द्वारा उत्पादित श्रृंखला के रूप में phenotypes की एक व्यापक स्पेक्ट्रम की पीढ़ी को अनुकूलित करने के तरीके का सुझाव ।

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Protocol

< p class = "jove_title" > 1. लेबलिंग C. एलिगेंस आंत

< p class = "jove_content" > नोट: निकालनेवाला नहर के विश्लेषण पर लेखकों द्वारा संलग्न कागज देखें tubulogenesis < सुप वर्ग = "xref" > 2 ऊतक विशिष्ट फ्लोरोसेंट मार्कर के निर्माण के लिए plasmids और ट्रांसजेनिक पशुओं की पीढ़ी, transcriptional और शोधों फ्यूजन प्रोटीन पर विचार विमर्श सहित (बाद ब्याज की एक अणु के उपसेलुलर स्थानीयकरण के लिए आवश्यक) । इन प्रक्रियाओं विशिष्ट प्रवर्तकों का उपयोग करने के लिए आंत के लिए ब्याज की अणु ड्राइव द्वारा अनुकूलित किया जा सकता है । C. एलिगेंस आंत्र इंडो visualizing के लिए उपयोगी सिद्ध अणुओं के उदाहरण के लिए तालिका 1 देखें-और प्लाज्मा झिल्ली और उनके जंक्शनों, तालिका 2 आंत को अभिव्यक्ति ड्राइविंग के लिए प्रवर्तकों के उदाहरण के लिए, और तालिका 3 आंत्र मार्करों और प्रवर्तकों के अधिक व्यापक संग्रह के लिए संसाधनों के लिए ।

  1. एंटीबॉडी दाग के ग. एलिगेंस आंत < सुप वर्ग = "xref" > 27 , < सुप वर्ग = "xref" > 28
    1. निर्धारण
      1. एक साफ गिलास स्लाइड ले लो और उपयोग पाली-L-lysine करने के लिए कीड़े के लिए एक पतली फिल्म उत्पंन पर छड़ी । जगह 30 & #181; l 0.1-0.2% पाली-l-lysine स्लाइड पर और एक दूसरी स्लाइड को पाली-l-lysine ड्रॉप पर एक & #34 बनाने के लिए; सैंडविच & #34;. फिर दोनों की पूरी सतहों गीला करने के लिए और उन्हें 30 मिनट के लिए शुष्क हवा के लिए एक कई बार धीरे स्लाइड रगड़ पेंसिल के साथ स्लाइड की फ्रॉस्टेड साइड लेबल.
        नोट: ०.२% पाली-l-lysine aliquots of २०० & #181; L डीएच में पाउडर को भंग करके बनाया गया 2 हे; इस पर संग्रहित किया जा सकता है-20 & #176; ग. कीड़े के बेहतर चिपके के लिए उच्च आणविक वजन पाली-एल-lysine का प्रयोग करें । पाली-एल-lysine की एकाग्रता भी विचारणीय है । बहुत कम सांद्रता कीड़े छड़ी करने की अनुमति नहीं है, लेकिन बहुत उच्च सांद्रता प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि संकेत उत्पन्न हो सकता है । एक बहुत मोटी फिल्म अपनी संपूर्णता में ढीला हो सकता है ।
      2. एक फ्लैट धातु ब्लॉक मजबूती से एक कंटेनर के तल पर जगह ( जैसे एक polystyrene कंटेनर) तरल नाइट्रोजन से भरा.
        नोट: एक सूखी बर्फ के बजाय उपयोग कर सकते हैं, लेकिन तरल नाइट्रोजन एक धातु ब्लॉक कंटेनर तल पर अधिक स्थिर रहता है और अच्छी तरह से ठंडा ।
      3. M9 < सुप वर्ग = "xref" > 29 के साथ उनकी प्लेटों को धोने से या तो कीड़े एकत्र करें या प्रत्येक स्लाइड पर विभिन्न स्टेज कीड़े (या तो अंडे, L1, L2, L3, या L4 लार्वा स्टेज कीड़े) उठाओ । सामान्यतया, उठाओ ~ १०० लार्वा & #160; और भ्रूण या ~ 20 वयस्कों प्रत्येक स्लाइड करने के लिए । जगह 10 & #181; l को स्लाइड के मध्य पर कीड़े से धोया जाता है या 10 & #181 में अंडे/कीड़े लेने के लिए, l M9 या 10 & #181; l 1x पंजाबस < सुप वर्ग = "xref" > 27 (फास्फेट बफर खारा).
        1. एक पिपेट का उपयोग करने के लिए कीड़ों की बड़ी संख्या में फैल बाहर का झुरमुट से बचने के लिए ।
          नोट: बंद कीड़े धोया की मिश्रित आबादी, भीड़ और चरणों के विभिन्न मोटाई के कारण, अच्छी तरह से छड़ी नहीं है और कम प्रभावी ढंग से फ्रीज कर रहे हैं-फटा (नीचे देखें), इसलिए चरण-विशिष्ट कीड़े उठा (या सिंक्रनाइज़ आबादी) बेहतर परिणाम देता है. लार्वा वयस्कों से बेहतर छड़ी और अधिक जानवरों स्लाइड प्रति रखा जा सकता है ।
        2. स्लाइड पर कीड़े चुनने से पहले, उन्हें एक निमेटोड ग्रोथ मीडियम (NGM) प्लेट में ट्रांसफर < सुप क्लास = "xref" > 29 बिना OP50 बैक्टीरिया । अतिरिक्त बैक्टीरिया कीड़े को अनुयाई भी चिपक के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । ध्यान रखें कि कीड़े बाहर सूखी नहीं है ।
      4. लिएर फलस्वरुप (ड्रॉप) एक २२ एमएम & #215; 22 मिमी coverslip पार-तरीके एकत्र कीड़े के शीर्ष पर इस तरह है कि इसके किनारों स्लाइड के कम से एक तरफ पर लटका । सीधे नीचे लेकिन दृढ़ता से coverslip पर एक या दो उंगलियों के साथ प्रेस । बाल काटना कि ऊतक अखंडता को नुकसान होगा से बचें ।
      5. तुरंत
      6. और धीरे से तरल नाइट्रोजन में धातु ब्लॉक करने के लिए स्लाइड हस्तांतरण और इसे फ्रीज करने के बारे में 5 मिनट के लिए बैठते हैं । तब & #34; फ़्लिक ऑफ़ & #34; coverslip एक स्विफ्ट में एक तेज चाल का उपयोग करके इस पर लटका धार ।
        नोट: यह चरण निर्णायक रूप से किया जाना चाहिए और जबकि स्लाइड को हासिल करने के लिए जम जाता है & #34; खुर & #34; छल्ली की. चेतावनी: तरल नाइट्रोजन के साथ काम करते समय पीपीई (व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण) दिशा निर्देशों का पालन करें ।
      7. विसर्जित कर दिया-फटा स्लाइड में एक मेथनॉल -भरे ग् Coplin जार के लिए 5 min at-20 & #176; C. फिर एक एसीटोन -भरे ग् Coplin जार को एक और 5 मिनट के लिए अंतरण पर-20 & #176; ग.
        नोट: मेथनॉल और एसीटोन में संग्रहित किया जाना चाहिए-20 & #176; C उपयोग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए । निर्धारण के बाद, स्लाइड पर संग्रहित किया जा सकता है-20 & #176; C. सावधानी: मेथनॉल और एसीटोन विषाक्त हैं ।
      8. जार से स्लाइड निकालें और उन्हें उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान (RT) पर शुष्क हवा दें.
    2. धुंधला
      1. स्लाइड पर पेट्रोलियम जेली की एक पतली परत के साथ फिक्स्ड कीड़े के क्षेत्र घेरते हैं । स्थान चिह्नित करने के लिए स्लाइड के नीचे इस क्षेत्र के आस-पास एक वृत्त आरेखित करें ।
        नोट: यह महत्वपूर्ण है कि जेली सर्कल धुंधला समाधान के रिसाव को रोकने के लिए दाग प्रक्रिया भर में बरकरार रहता है ।
      2. तैयार एक & #34; गीले चेंबर & #34; में गीले कागज तौलिए रखकर ढक्कन के साथ एक प्लास्टिक बिन में. इस & #34 में एक रैक पर स्लाइड रखें; गीले चेंबर & #34; सना के दौरान स्लाइडों के सूखने से रोकने के लिए ।
        नोट: स्लाइड पानी के साथ या एक दूसरे के साथ संपर्क में नहीं होना चाहिए ।
      3. लिएर पिपेट लगभग ५० & #181; एल 1x पंजाबियों जेली सर्कल में, पर्याप्त क्षेत्र को कवर करने के लिए । बंद करें & #34; गीले चेंबर & #34; ढक्कन के साथ । 5 min.
        के लिए आरटी पर मशीन नोट: इस कदम पर कीड़े खोने से बचने के लिए, पंजाबियों कीड़े पर सीधे पिपेट नहीं है । धीरे सर्कल के किनारे पर पिपेट टिप जगह और तरल पदार्थ को सुचारू रूप से कीड़े पर फैलाने के लिए अनुमति देते हैं ।
      4. ने स्लाइड को झुकाया और धीरे से पंजाबियों को एक पिपेट से महाप्राण । स्लाइड वापस रैक पर फ्लैट प्लेस और ५० & #181 जोड़ने के लिए, (या आवश्यक राशि के लिए जगह कवर) अवरुद्ध समाधान ध्यान से । 15 मिनट के लिए आर टी पर गीला कक्ष में इस मशीन । प्रतीक्षा करते हुए, समाधान अवरुद्ध में प्राथमिक एंटीबॉडी पतला (प्राथमिक एंटीबॉडी और सांद्रता के उदाहरण के लिए सामग्री के तालिका देखें).
        नोट: हाल ही में 1x पंजाबियों (10 मिलीलीटर), 10% के बीच (५० & #181; L), और पाउडर दूध (०.२ ग्राम) का उपयोग कर समाधान अवरुद्ध तैयार करें । डिटर्जेंट और दूध की एकाग्रता की मात्रा इस्तेमाल किया एंटीबॉडी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं और empirically निर्धारित किया जा करने की आवश्यकता हो सकती. स्लाइड से द्रव की आकांक्षा आसानी से कीड़े खोने के लिए एक और कदम है । विच्छेदन क्षेत्र के अंतर्गत स्लाइड जांच कर प्रगति की जांच करें, लेकिन ध्यान रखें कि स्लाइड बाहर नहीं सूखी है ।
      5. स्लाइड झुकाव और अवरुद्ध समाधान दूर महाप्राण, एक ही सावधानियों का उपयोग कर के रूप में ऊपर वर्णित है । स्लाइड वापस रैक पर फ्लैट प्लेस और धीरे जोड़ें ५० & #181; L पतला प्राथमिक एंटीबॉडी, एक ही सावधानियों का उपयोग कर. बं द & #34; गीले चेम्बर & #34; र 4 & #176; ग रात भर या भ.
        पर कम अवधि के लिए नोट: एक विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए empirically निर्धारित करने के लिए मशीनिंग समय की आवश्यकता हो सकती है ।
      6. महाप्राण बंद प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के रूप में अंय समाधान के लिए किया । फिर 10 मिनट, 3 बार के लिए समाधान अवरुद्ध के साथ स्लाइड धो जोड़ने और एक ही फैशन में समाधान को हटाने के रूप में ऊपर वर्णित है ।
      7. जोड़ें माध्यमिक (फ्लोरोसेंट-लेबल) एंटीबॉडी समाधान अवरुद्ध में पतला, आरटी पर 1 एच के लिए मशीन । माध्यमिक एंटीबॉडी और सांद्रता के उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें.
      8. माध्यमिक एंटीबॉडी और धोने को हटा दें, के रूप में ऊपर, समाधान 2 बार अवरुद्ध के साथ और, अवरुद्ध समाधान स्पष्ट करने के लिए, 1x पंजाबियों के साथ, 10 मिनट के लिए प्रत्येक.
      9. महाप्राण दूर सूख और ध्यान से नमूना चारों ओर जेली हटाने के लिए नमूने की अनुमति के बिना संभव के रूप में बहुत पंजाबियों के रूप में ।
      10. एक बूंद नमूना पर मध्यम बढ़ते जोड़ें, और एक coverslip धीरे शीर्ष पर रखें । नेल पॉलिश के साथ coverslip के किनारों को सील कर दीजिये । 4 & #176; C.
        में दाग और संग्रह को रक्षित करने के लिए स्लाइड को किसी गहरे स्लाइड बॉक्स में रखें नोट: प्रकाश संवेदनशीलता (प्रतिदीप्ति समय के साथ फीका हो सकता है) की वजह से अंधेरे में स्लाइड्स रखें और उन्हें सील रखने के द्वारा हवा जोखिम को रोकने के लिए, एक ही कारण के लिए. स्लाइड्स में समय की विस्तारित अवधि के लिए संग्रहित किया जा सकता है 4 & #176; c या-20 & #176; c.
< p class = "jove_title" > 2. C. एलिगेंस आंत में आवश्यक tubulogenesis जीन के समारोह के साथ हस्तक्षेप । उदाहरण: RNAi.

< p class = "jove_content" > Note: C. एलिगेंस उपभेदों पर कल्चर्ड हैं OP50 प्लेट्स पर सीडिंग NGM मानक के अनुसार प्रोटोकॉल < सुप class = "" > 29 xref. RNAi के लिए, ग. एलिगेंस फीड पर HT115 RNAi बैक्टीरिया के साथ पूरक RNAi प्लेटों पर 25 & #181; जी/एमएल कार्बेनिसिलिन और 2 मिमी IPTG (isopropyl बीटा-डी-1-thiogalactopyranoside) बैक्टीरिया प्रवर्तक के प्रेरण के लिए उत्पन्न करता है कि पेश सी. एलिगेंस जीन से डबल कतरा आरएनए (dsRNA). एंटीबायोटिक्स और IPTG एकाग्रता RNAi क्लोन/पुस्तकालय और वांछित RNAi शक्ति के अनुसार भिन्न हो सकते हैं, resp. विशिष्ट RNAi क्लोन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोम-वाइड RNAi खिला पुस्तकालयों से प्राप्त किया जा सकता है (देखें (< सुप वर्ग = "xref" > २६ , < सुप वर्ग = "xref" > ३० , < सुप क्लास = "xref" > 31 ) C. एलिगेंस और टेबल सामग्री के सामग्री के लिए RNAi में खिलाने पर पृष्ठभूमि के लिए)/

  1. मानक RNAi खिलाकर < सुप class = "xref" > 26 , < सुप class = "xref" > 31
    1. बाहर ले RNAi लाइब्रेरी की थाली से-८० & #176; ग और सूखी बर्फ पर रखो । सील टेप निकालें और बाँझ पिपेट टिप का उपयोग करने के लिए ब्याज की क्लोन के अनुयाई बैक्टीरिया हस्तांतरण करने के लिए पौंड (Luria शोरबा) आगर प्लेट्स < सुप वर्ग = "xref" > 29 सप्लीमेंट विथ १०० & #181; जी/एमएल एम्पीसिलीन और 15 & #181; जी/एमएल टेट्रासाइक्लिन. प्लेट आगर पर बैक्टीरिया बाहर लकीर । एक नया सील टेप के साथ RNAi लाइब्रेरी प्लेट सील । बढ़ने पर रात भर बैक्टीरिया ३७ & #176; C.
      नोट: ये आगार प्लेटें कई हफ्तों के लिए 4 & #176; C पर संग्रहित की जा सकती हैं । नए बैक्टीरिया सीधे उंहें से संस्कृति को मूल RNAi पुस्तकालय की रक्षा कर सकते हैं ।
    2. अगले दिन, पौंड आगर प्लेट से लगाना RNAi बैक्टीरिया 1 मिलीलीटर पौंड तरल मीडियम < सुप क्लास = "xref" > 29 युक्त ५० & #181; जी/एमएल एम्पीसिलीन प्रत्येक और शेक के लिए 14 (8-18) एच या रातोंरात पर ३७ & #176; C.
      नोट: इष्टतम परिणामों के लिए हर बार ताजा बैक्टीरिया का उपयोग करें । संदर्भ देखें (< सुप वर्ग = "xref" > 30 ) विभिन्न कल्चरल स्थितियों ( जैसे संस्कृति के समय) की तुलना के लिए.
    3. अगले दिन, बीज २०० & #181; अलग RNAi प्लेट्स पर कल्चर्ड RNAi बैक्टीरिया का क्लोन प्रति एल. प्लेटें सूखी और आर टी पर रात भर के जीवाणु प्रमोटर की प्रेरण के लिए छोड़ दें ।
    4. हस्तांतरण 4-6 L4-स्टेज लार्वा प्रत्येक RNAi प्लेट पर । भ या 22 & #176 पर सीड RNAi प्लेट्स की मशीन, 3-5 दिनों के लिए सी.
      नोट: बैक्टीरिया के बिना एक NGM प्लेट पर L4 लार्वा पहले उठाओ अनुयाई OP50 कि RNAi के साथ हस्तक्षेप करेंगे, या प्रश्नपत्र उंहें तीन बार NGM बिना एक नई OP50 प्लेट को हस्तांतरण । सुनिश्चित करें कि उपभेदों दूषित नहीं कर रहे हैं, के रूप में दूषित बैक्टीरिया-कीड़े के लिए OP50 पसंदीदा भोजन की तरह-भी RNAi के साथ हस्तक्षेप करेंगे । आवश्यकतानुसार तापमान समायोजित करें: जैसे विकास उच्च तापमान के साथ बढ़ौतरी; उपभेदों तापमान संवेदनशील हो सकता है ।
    5. विकासात्मक अध्ययन के लिए
    6. , 2 बाद के दिन से F1 संतान की phenotypes जांच ।
      नोट: यह जानवरों की जांच करने के लिए अक्सर उपस्थिति या एक phenotype ( जैसे मार्कर विस्थापन) की प्रगति लापता से बचने के लिए जब विकास के दौरान ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति का आकलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । मजबूत phenotypes के लिए F2 जनसंख्या के संवर्धन ( जैसे 2 दिन पर एक नई RNAi प्लेट के लिए माता पिता hermaphrodites उठा द्वारा अपनी संतान के सबसे जोरदार प्रभावित मध्य भाग के लिए चयन करने के लिए) शायद ही कभी आवश्यक है, हल्के से मजबूत करने के लिए एक स्पेक्ट्रम के बाद से phenotypes वांछनीय है ।
  2. सशर्त RNAi
    नोट: RNAi स्थितियों को गंभीर कम करने के लिए संशोधित किया जा सकता, या हल्के प्रभाव बढ़ाने के लिए, या चरण-विशेष रूप से हस्तक्षेप करने के लिए; संशोधनों के phenotypic प्रभाव के पूर्ण मूल्यांकन के लिए उपयोगी होते है अक्सर घातक tubulogenesis जीन ।
    1. लार्वा RNAi-एक ही पीढ़ी में RNAi प्रभाव का मूल्यांकन (हल्का, चरण-विशिष्ट RNAi)
      नोट: बांझपन या भ्रूण की मृत्यु दर को दूर करने के लिए, या एक विशिष्ट स्तर पोस्ट embryogenesis में जीन समारोह को बाधित करने के लिए, RNAi में प्रेरित है लार्वा, भ्रूण के बाद । या तो अनुपचारित अंडे (2.2.1.1), gravid वयस्कों (2.2.1.2) या सिंक्रनाइज़ L1 जगह (या, यदि वांछित, बाद में चरण) 2.2.1.3 प्लेटों पर लार्वा (RNAi); एक ही पीढ़ी में RNAi प्रभाव का मूल्यांकन, जैसे दो दिन बाद और बाद में, लार्वा और/
      1. उठाओ 30-50 gravid वयस्कों एक ड्रॉप ब्लीचिंग समाधान (एक 1:4 समाधान की 10 मीटर NaOH और घरेलू सोडियम हाइपोक्लोराइट) एक RNAi प्लेट के किनारे करने के लिए रखा. सूखी और L1s हैच और बैक्टीरियल लॉन में ले जाने के लिए अनुमति देते हैं ।
        नोट: ब्लीचिंग समाधान, आम तौर पर संदूषण के लिए इस्तेमाल किया, अपने अंडे के गोले में सब कुछ है लेकिन भ्रूण को मार देंगे । इसलिए, RNAi बैक्टीरिया पर या बंद ब्लीचिंग समाधान जगह नहीं है ।
      2. उठाओ या बीज ~ 20 RNAi प्लेट पर युवा gravid वयस्कों और उंहें 2-3 घंटे के लिए अंडे देना, या जब तक वहां थाली पर लगभग ३०० अंडे हैं, तो बंद वयस्कों उठाओ ।
        नोट: इस विधि OP50 द्वारा RNAi बैक्टीरिया के संक्रमण का कारण हो सकता है । इस जोखिम को कम करने के लिए, पहले एक NGM प्लेट पर वयस्कों के जीवाणुओं के बिना हस्तांतरण करने के लिए OP50 अनुयाई कीड़े को दूर. ध्यान रखें कि वयस्कों RNAi प्लेटों पर भी लंबे समय तक रहने के लिए भ्रूण पर RNAi प्रभाव से बचने नहीं है ।
      3. उठाओ या जगह L1 स्टेज कीड़े RNAi प्लेटों पर सीधे (संदर्भ देखें (< सुप वर्ग = "xref" > 29 )-तुल्यकालन प्रोटोकॉल के लिए).
        नोट: एक मामूली बड़े पैमाने पर सेट अप के लिए एक संक्षिप्त तुल्यकालित प्रोटोकॉल ( जैसे ) का उपयोग कर सकते है घनी आबादी वाले प्लेटों से कई बार के लिए M9 के साथ कीड़े धोने से केवल अंडे रहते हैं । 2 के बाद 3h सेने L1s तो इन प्लेटों से M9 में एकत्र किया जा सकता है, अतिरिक्त बहाकर द्वारा साफ करने के लिए बैक्टीरिया (M9 में 3x) को हटाने, और RNAi प्लेटों पर वरीयता प्राप्त ।
    2. RNAi बैक्टीरिया की खाली वेक्टर RNAi बैक्टीरिया (हल्के RNAi) के साथ
      नोट: dsRNA की मात्रा कमजोर बैक्टीरिया की मात्रा में कमी मामूली प्रभाव पैदा करने के लिए पर्याप्त हो सकता है और भी भ्रूण की मृत्यु दर को कम कर सकते हैं सभी भ्रूण प्रभाव को समाप्त किए बिना । RNAi बैक्टीरिया के कमजोर पड़ने से भी दोहरे RNAi प्रयोगों के लिए और आनुवंशिक संपर्क प्रयोगों के लिए अनुमापन शर्तों ( जैसे को बढ़ाने और दमन के आकलन के लिए मजबूत प्रभाव के आकलन के लिए हल्के प्रभाव उत्पन्न करने के लिए) का उपयोग किया जाता है.
      1. ग्रो अप RNAi और empty वेक्टर HT115 RNAi बैक्टीरिया के साथ 1 मिलीलीटर पौंड मध्यम में ५० & #181; g/एमएल एम्पीसिलीन, के रूप में मानक RNAi शर्तों के लिए किया ।
      2. खाली वेक्टर RNAi बैक्टीरिया के साथ RNAi बैक्टीरिया को पतला अलग सांद्रता की एक सीमा को प्राप्त करने के लिए, उदाहरण के लिए, 5%, 15%, 30%, ५०%, ७०% । बैक्टीरिया को अच्छी तरह से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा मिश्रण । पिपेट २०० & #181; एक RNAi प्लेट पर एल मिश्रित बैक्टीरिया.
      3. उठाओ 4-6 प्रत्येक RNAi प्लेट पर L4 लार्वा । 2 दिन से phenotype की जांच करें आगे.
    3. RNAi संवेदनशील संवेदनहीन (सबल RNAi)
      1. उपयोग उपलब्ध RNAi संवेदनशील उपभेदों, मसलन, ऐरी-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) या ऐरी-1 (mg366) लिन-15B (n744) (उत्तरार्द्ध supersensitive), और पालन 2.1 में वर्णित मानक RNAi कार्यविधियां < सुप वर्ग = "xref" > 31 , < सुप वर्ग = "xref" > ३२ , < सुप क्लास = "xref" > ३३ .
        नोट: RNAi संवेदनशील उपभेदों ( जैसे rrf-3 और ऐरी-1 ) जंगली प्रकार जानवरों की तुलना में कम चिंता आकार हो सकता है और 25 & #176 पर बाँझ हो; सी. वे भी अपने phenotypes की एक कम पृष्ठभूमि हो सकता है, जैसे कम व्याप्ति भ्रूण घातकता, जो खाते में लिया जाना है जब विशिष्ट RNAi प्रभाव का मूल्यांकन ।
< p class = "jove_title" > 3. में vivo इमेजिंग ऑफ सी. एलिगेंस आंत द्वारा प्रतिदीप्ति विदारक माइक्रोस्कोपी

  1. प्रतिदीप्ति प्रकाश के तहत पशुओं की कल्पना करने से पहले, किसी भी विदारक माइक्रोस्कोप पर चमकदार रोशनी के तहत RNAi प्लेटों की जांच करें । आकलन (और संभावित रिकॉर्ड) phenotypes चमकदार प्रकाश के तहत दिखाई देता है जो विश्लेषण को प्रभावित कर सकता है, जैसे कि घातकता, बांझपन (संतति की कम संख्या), विकासात्मक ( जैसे & #160; लार्वा गिरफ्तारी) और अन्य दृश्यमान phenotypes जो मदद कर सकता है एक जीन के समारोह में शामिल एक ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति और लुमेन morphogenesis.
    नोट: केवल स्कोर प्लेटें कि मूल्यांकन के लिए पर्याप्त संतति है (कम से ५०), अंयथा वैकल्पिक RNAi शर्तों का प्रयास करें । मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए सुनिश्चित करें कि प्लेट दूषित या OP50 विकसित नहीं कर रहे हैं (जो RNAi के साथ हस्तक्षेप).
  2. फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत जानवरों की कल्पना करने के लिए, ढक्कन हटा दें और RNAi प्लेट को सीधे विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के नीचे रखें ।
    नोट: सूक्ष्म आंत्र phenotypes का पता लगाने के लिए एक उच्च शक्ति स्टीरियो प्रतिदीप्ति लगाव है कि आवर्धन के लिए पर्याप्त रेंज के लिए अनुमति देता है के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होगी । यह प्रोटोकॉल एक १.५ और 10 x उद्देश्य और ३.५ से ४५ के लिए एक ज़ूम रेंज के साथ एक गुंजाइश के उपयोग का वर्णन करता है ।
  3. पहले उज्ज्वल प्रकाश के तहत पशुओं को खोजने के लिए ध्यान केंद्रित । अगले, कम आवर्धन पर फ्लोरोसेंट लाइट के तहत पशुओं की जांच (1.5 x उद्देश्य के तहत उदा ), उपयुक्त फिल्टर का उपयोग कर । प्लेट व्यवस्थित ऊपरी बाएं से कम सही phenotypes.
  4. के लिए पूरी थाली स्कैन करने के लिए की जांच करें
  5. का चयन पशु ब्याज और 10x उद्देश्य के लिए बदल जाते हैं । आंत पर ध्यान केंद्रित करने और tubulogenesis/लुमेन morphogenesis phenotype का आकलन करने के लिए ज़ूम का उपयोग करें । phenotypes के स्कोरिंग के लिए अनुभाग 5 देखें । सबसे पहले, कम आवर्धन पर चित्र ले लो । तब उच्च आवर्धन पर स्विच करें ।
    नोट: के बाद से स्वस्थ पशुओं को तेजी से कदम है, तेजी से काम करते हैं, छवि अधिग्रहण के लिए कंप्यूटर माउस पर एक हाथ से जबकि दूसरे हाथ से माइक्रोस्कोप ध्यान केंद्रित । जानवरों को धीमा करना ( जैसे प्लेट्स के क्षणिक प्लेसमेंट द्वारा 4 & #176; सी) ज्यादातर गिरफ्तार भ्रूण और जल्दी लार्वा में tubulogenesis phenotypes के साथ काम करते समय की आवश्यकता नहीं हो सकती. छवियों एक खुर्दबीन-घुड़सवार सीसीडी कैमरा और छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर द्वारा कब्जा कर लिया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 4. इमेजिंग C. एलिगेंस आंत लेजर स्कैनिंग द्वारा उच्च संकल्प पर फोकल माइक्रोस्कोपी < सुप वर्ग = "xref" > 34 , < सुप क्लास = "xref" > 35

  1. बढ़ते और स्थिरीकरण
    1. उपयोग उंगलियों को पतले एक सर्कल में तेल या पेट्रोलियम जेली की एक छोटी राशि एक गिलास स्लाइड (~ व्यास में 6-8 मिमी) पर फैला है ।
      नोट: तेल सर्कल की मोटाई बढ़ते के लिए महत्वपूर्ण है । सर्वश्रेष्ठ इमेजिंग परिणाम के लिए, एक समय में केवल एक या कई लार्वा छवि और एक ultrathin तेल सर्कल के रूप में संभव के रूप में छोटे तरल के साथ उपयोग करें कि पशु सीधे कांच स्लाइड और कवर स्लिप के बीच अटक गया है (यदि पूरी तरह से किया है, पशु बिना मैटीरियल हो जाएगा संवेदनाहारी) । अंडे के बढ़ते और पुराने जानवरों के एक कुछ हद तक मोटा सर्कल जब कवर स्लिप जोड़ने के नमूने के विनाश से बचने की आवश्यकता है ।
    2. की एक बूंद जोड़ें आम तौर पर ३.५ & #181; एल 10 मिमी सोडियम azide समाधान सर्कल के बीच में और यह विदारक माइक्रोस्कोप के तहत में कीड़े उठाओ ।
      नोट: 1 M सोडियम azide शेयर समाधान को भंग करके तैयार करें ६५.०१ mg NaN3 को १ & #160; मब डीएच हे; add २०० & #181; इस 1m & #160 के एल; 20 एमएल M9 बफर में समाधान । कीड़े उठाओ सोडियम azide समाधान की बूंद में तेजी से बाहर सूखी समाधान से बचने के लिए । इष्टतम बढ़ते, स्लाइड प्रति ५० भ्रूण और के बारे में 20 लार्वा जब बड़ी आबादी की जांच पर लक्ष्य के लिए अलग से चरणों उठाओ । एक का उपयोग कर सकते है M9 के बजाय सोडियम azide समाधान जब उठा भ्रूण । सोडियम azide का उपयोग करते हैं, तो जानवरों इस जहरीले रसायन के ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए 30 मिनट के भीतर imaged किया जाना चाहिए ।
      चेतावनी: सोडियम azide विषाक्त है ।
    3. लिएर एक २२ एमएम & #215; 22 एमएम coverslip स्लाइड पर रखें । कीड़े को कुचलने के लिए नहीं सावधान रहना । यह सुनिश्चित करने के लिए कि कीड़े स्लाइड और कवर स्लिप के बीच अच्छी तरह से तय कर रहे हैं हल्के दबाव और जांच के तहत विदारक माइक्रोस्कोप का प्रयोग करें । स्लाइड लेबल.
      नोट: दबाव की सही मात्रा के लिए नमूना हानिकारक (बहुत अधिक दबाव) और यह अच्छी तरह से फिक्सिंग नहीं (बहुत कम दबाव: पशु स्लाइड करने के लिए चिपके के बजाय नाव) से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । फ्लोटिंग जानवरों मूलतः उचित इमेजिंग बाधा.
  2. इमेजिंग
    1. फोकल माइक्रोस्कोप के तहत जगह स्लाइड । 10x उद्देश्य और ध्यान के साथ कीड़े के लिए खोज.
      नोट: photobleaching से बचने के लिए जहां संभव हो ध्यान केंद्रित करने के लिए उज्ज्वल प्रकाश का उपयोग करें ।
    2. 60x या 100x उद्देश्य और आंत पर ध्यान केंद्रित करने के लिए बदल जाते हैं ।
      नोट: आंत आसानी से अपने लुमेन के तहत पशु के बीच के माध्यम से चल रहा है, ग्रसनी से पूंछ की नोक के पास गुदा के लिए द्वारा उज्ज्वल प्रकाश के तहत पहचाना जा सकता है । 60x या 100x तेल उद्देश्य के लिए तेल लागू करते समय सावधान रहें । तेलों के विभिंन प्रकार के मिश्रण आगे इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं । स्लाइड पर तेल की छोटी बूंद प्लेस जब एक ईमानदार माइक्रोस्कोप का उपयोग कर या उद्देश्य पर जब एक औंधा गुंजाइश का उपयोग कर, अंय उद्देश्यों या माइक्रोस्कोप के कुछ हिस्सों को दूषित करने के लिए ध्यान नहीं ले रही ।
    3. < सुप वर्ग = "xref" > ३६ स्कैनिंग के लिए उपयोग में लिए जाने वाले उद्देश्य के लिए
    4. की स्थापना कोल-उद्योग/Nomarski उचित चैनल के साथ फ्लोरोसेंट रोशनी के तहत पशु का निरीक्षण करने के लिए आंत के लेबल की जांच करें और/phenotype जांच करने के लिए, ताकि इमेजिंग के लिए उपयुक्त नमूना का चयन करने के लिए । ब्लीचिंग से बचने के लिए तेजी से काम करें ।
    5. अपने पृष्ठीय और ventral पक्ष में स्कैनिंग सीमाओं की स्थापना के द्वारा आंत के लिए भावी छवि को सीमित करने के लिए स्कैनिंग लेजर करने के लिए स्विच.
      नोट: इस तरह से आंत ब्रैकेटिंग महत्वपूर्ण अगर fluorophore भी आंत के बाहर संरचनाओं लेबल है । इस पायलट स्कैन के दौरान, ए वी के लिए तेजी से स्कैनिंग शर्तों के साथ कामoid photobleaching
    6. प्रयोग के लिए स्कैनिंग पैरामीटर का चयन करने के लिए स्कैनिंग बंद
    7. । सेट 6-20 z अक्ष के साथ आंतों स्कैनिंग के लिए वर्गों, जैसे पर ०.२ & #181; m अंतराल, जांच के आधार पर, पशु की अवस्था और/ सेट फ्रेम लेबल और शोर को कम करने के लिए आवश्यक संकल्प की जटिलता के आधार पर छवि प्रति औसत ।
      नोट: सेट विवरण माइक्रोस्कोप और प्रयोग के आधार पर बदलती हैं । एक को यदि तीन अलग fluorophores की अनुक्रमिक स्कैनिंग प्रदर्शन ब्लीचिंग से बचने के लिए वर्गों की मात्रा को कम करने की आवश्यकता हो सकती है । अनुभागों की संख्या के लिए फ़्रेम की संख्या समायोजित करें (छवि विरूपण से बचने के लिए अनुभागों की संख्या से कम होना चाहिए; इसके अलावा photobleaching में वृद्धि में तौलना). 4-6 फ्रेम आमतौर पर पर्याप्त हैं ।
    8. निश्चित (धीमी गति से) लेजर स्कैनिंग की स्थिति के साथ स्कैनिंग के लिए वापस जाओ और समायोजित: चमक (पृष्ठभूमि कम करने के लिए न्यूनतम लाभ का उपयोग करें); लेजर शक्ति (उच्च के रूप में की आवश्यकता के रूप में संभव के रूप में कम-बढ़ photobleaching; आमतौर पर न्यूनतम सेटिंग पर्याप्त है); pinhole (यदि आवश्यक नहीं खोलने से बचें, संकल्प बनाए रखने के लिए).
      नोट: स्कैनिंग शर्तों नमूना पर निर्भर करता है और स्कैनिंग सत्र की शुरुआत में निर्धारित empirically होने की जरूरत है. सुनिश्चित करें कि चमक संतृप्ति से अधिक नहीं है (इमेजिंग सॉफ्टवेयर द्वारा छवि को संशोधित करने की क्षमता को सीमित करेगा) । स्कैनिंग की स्थिति सेट करते हैं, तो भी समान शर्तों नियंत्रण के साथ प्रयोगात्मक जानवरों की तुलना प्रयोगों में सभी इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए कि विचार.
    9. छवि श्रृंखला पर कब्जा
    10. । चित्र को एकल प्रोजेक्शन छवि में मर्ज करें ।
      ध्यान दें: हो सकता है प्रक्षेपण छवियों को बचाने के लिए और/
    11. जब मल्टी चैनल छवियों लेने अनुक्रमिक का उपयोग करने के लिए खून से बचने के माध्यम से चैनलों के बीच (सह स्थानीयकरण अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण) ।
      नोट: छवि सेटिंग को समय की स्कैनिंग से अधिक बढ़ी हुई photobleaching को परिवर्तित करने की आवश्यकता हो सकती है.
    12. हमेशा Nomarski छवियों (वर्गों) स्थलों और स्कैन पशु की आकृति विज्ञान के समग्र राज्य के लिए प्राप्त.
< p class = "jove_title" > 5 . ठहराव में ध्रुवीकरण की झिल्ली सी में दोष एलिगेंस आंत

< p class = "jove_content" > ध्यान दें: उदाहरण: Basolateral शिखर के एर्म विस्थापन-1:: GFP और अस्थानिक पार्श्व लुमेन गठन प्रेरित द्वारा चलो-७६७ और अनुप-1 RNAi.

  1. स्कोरिंग phenotypes के तहत विदारक माइक्रोस्कोप (< सबल वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 ए, डी, ई)
    1. स्कोरिंग के लिए श्रेणियां निर्धारित करें । उदाहरण: (i) जंगली-प्रकार (WT), (ii) basolateral विस्थापन एर्म-1:: GFP (ध्रुवीकरण दोष), और (iii) अस्थानिक लुमेन गठन (basolateral विस्थापन के बाद विकसित करता है).
      नोट: एक कम आवर्धन दृश्य विश्लेषण अपने आप को एक विशिष्ट phenotype के साथ या बिना जानवरों की स्कोरिंग संख्या के लिए उधार देता है । यहां, हम तीन गुणात्मक विभिंन phenotypic श्रेणियों का एक उदाहरण है कि एक ही समय में कर रहे है का चयन का संकेत एक बिगड़ती के ध्रुवीकरण phenotype है कि विश्लेषण किया है । तथापि, विभिंन गुणात्मक और मात्रात्मक phenotypes की एक किस्म है, ऐसे लुमेन morphogenesis दोष, अनुपस्थिति/उपस्थिति (या संख्या) GFP सकारात्मक cytoplasmic vacuoles, लुमेन व्यास और आकार या intralumenal अल्सर की संख्या के रूप में बनाए जा सकते हैं (देखें < सशक्त वर्ग = "xfig" > चित्र 3 उदाहरण के लिए).
    2. की अपेक्षा मतभेदों के परिमाण के आधार पर, एक डुप्लिकेट या प्रयोगों के सेट तपसिल में विदारक माइक्रोस्कोप के तहत उनके आगर प्लेटों पर लगभग १०० लाइव कीड़े स्कोर.
      नोट: एक हर जानवर है कि दृश्य में आता है जब प्लेटें व्यवस्थित स्कैनिंग, उदाहरण के ऊपरी बाएं से थाली के निचले सही करने के लिए (यकीन है कि कीड़े प्लेटें समान रूप से आबाद है) में आ जाता है स्कोर चाहिए ।
    3. प्रयोगों के 3 स्वतंत्र सेट के लिए यह दोहराएं । बार ग्राफ उत्पन्न और परिणामों के महत्व का मूल्यांकन.
  2. स्कोरिंग phenotypes के तहत फोकल माइक्रोस्कोप (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 5 बी)
    1. स्कोरिंग के लिए श्रेणियां निर्धारित करें, उदा अस्थानिक लुमेन प्रति पशु
      नोट: एक उच्च आवर्धन दृश्य विश्लेषण एक quantifiable मार्कर या phenotype प्रति पशु स्कोरिंग करने के लिए ही उधार देता है और उपसेलुलर मार्करों कि विदारक माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रत्यक्ष नहीं किया जा सकता है की स्कोरिंग की अनुमति देती है । एक ही प्रयोग के कीड़े के एक सबसेट में प्रति पशु अस्थानिक लुमेन गिनती का वर्तमान उदाहरण पहले विदारक माइक्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन (5.1.1, श्रेणी 3) बिगड़ती ध्रुवीकरण phenotype है कि यहां की जांच की है के मूल्यांकन को परिष्कृत । हालांकि, अंय phenotypes या मापदंडों की एक किस्म है, बनाए जा सकते है जैसे बुलबुले के संख्या, उपस्थिति/अनुपस्थिति या उपसेलुलर घटकों की संख्या है कि सह स्थानीयकरण, प्रतिदीप्ति तीव्रता (मात्रा द्वारा उत्तरार्द्ध ImageJ; पर कागज के साथ देखें निकालनेवाला नहर) < सुप वर्ग = "xref" > 2 .
    2. की संभावना मतभेदों के आधार पर, phenotypic मार्कर यों तो (यहां, अस्थानिक लुमेन) में लगभग 20 पशुओं में एक डुप्लिकेट या फोकल माइक्रोस्कोप के तहत प्रयोगों की तपसिल सेट.
    3. प्रयोगों के 3 स्वतंत्र सेट के लिए दोहराएँ. बार रेखांकन उत्पंन और परिणामों के महत्व का मूल्यांकन करें ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे आणविक विश्लेषण और एक कोशिका और सेलुलर स्तर पर सी. एलिगेंस आंत में, ध्रुवीय झिल्ली की उत्पत्ति और लुमेन morphogenesis कल्पना । बीस सेल एकल स्तरित सी. एलिगेंस आंत के मध्य embryogenesis के दौरान निर्देशित सेल प्रभाग और प्रवास द्वारा गठित है । इस समय, ध्रुवीकरण झिल्ली डोमेन स्थापित हो जाते हैं, अभी तक de नोवो ध्रुवीय झिल्ली की उत्पत्ति परिपक्व, लेकिन चार लार्वा चरणों भर में वयस्कता तक विस्तार उपकला में जारी है, पर विश्लेषण पर ध्यान केंद्रित करने की अनुमति झिल्ली की उत्पत्ति (आंकड़ा 1a) ।

C. एलिगेंस सेलुलर और सेलुलर घटकों कल्पना करने के लिए, दो रणनीतियों सामांयतः उपयोग किया जाता है: इम्यूनोफ्लोरेसेंस (इस प्रोटोकॉल, 1 खंड में विस्तृत; चित्र 2 , चित्र 4d -च) और प्रतिदीप्ति फ्यूजन प्रोटीन की अभिव्यक्ति (निकालनेवाला नहर पर साथ कागज में विस्तृत झिल्ली की उत्पत्ति2ध्रुवीकरण; आंकड़ा 1b, चित्रा 2, चित्रा 4, चित्रा 5C) । डबल और एकाधिक लेबलिंग, प्रत्येक या दोनों तरीकों के विभिंन लेबल के संयोजन, झिल्ली असीमितता जैसे शिखर और basolateral झिल्ली डोमेन, और एक दूसरे के लिए अलग उपसेलुलर घटकों के संबंध को हल कर सकते है (चित्र 2, चित्रा 4d-ए) । झिल्ली-cytoskeleton linker एर्म-1:: GFP इस एकल स्तरित उपकला में लुमेन morphogenesis के साथ मेल खाती है कि शिखर झिल्ली के एक संकेतक के रूप में यहाँ दिखाया गया है. इस मार्कर का उपयोग करके, आंतों शिखर झिल्ली की एक सरणी/लुमेन उत्पत्ति दोषों और उनके प्रेरणात्मक जीन दोष की हानि द्वारा पहचाना जा सकता है-समारोह अध्ययन, उदाहरण के लिए निष्पक्ष जीनोम चौड़ा RNAi का उपयोग कर स्क्रीन (RNAi दृष्टिकोण को अपनाया द्वारा ऐसी phenotypes की पीढ़ी इस प्रोटोकॉल के खंड 2 में वर्णित हैं) । चित्रा 3 और चित्रा 4 शिखर झिल्ली के कम से मध्यम आवर्धन छवियों के उदाहरण दिखाने के लिए/लुमेन phenotypes एक उच्च शक्ति उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत; और उच्च आवर्धन एक फोकल लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत छवियों के (इन सूक्ष्म दृष्टिकोण 3 वर्गों और 4 में वर्णित हैं) । एक उदाहरण के रूप में ध्रुवीकरण झिल्ली की उत्पत्ति दोष को बढ़ाता है, चलो-७६७ के साथ RNAi के प्रभाव (एक स्टेरॉयड डिहाइड्रोजनेज एंकोडिंग-ketoacyl-CoA रिडक्टेस) और अनुप-1 (एंकोडिंग के सिग्मा उपइकाई clathrin एपी-1 एडेप्टर) एर्म पर-1:: GFP स्थानीयकरण और लुमेन पोजीशनिंग चित्रा 5में दिखाए जाते हैं ।

Figure 1
चित्रा 1 : सेलुलर और सेलुलर संरचना और वंय प्रकार के morphogenesis C. एलिगेंस आंत. () C. एलिगेंस आंत्र विकास, सेलुलर संरचना, और इंडो-और प्लाज्मा झिल्ली की योजनाबद्ध । C. एलिगेंस आंत 8 सेल स्टेज पर पैदा हुए ई blastomere से क्लोनिंग से उत्पन्न होता है । सेल विभाजन के चार दौर के बाद, अपने 16 कोशिकाओं (E16 चरण) एक रेडियल सममित दोगुनी स्तरित उपकला15फार्म । इस चरण में प्रत्येक कोशिका के कोशिका ध्रुवीकरण, नाभिक भविष्य शिखर करने के लिए ले जाने के साथ, और cytoplasmic घटकों के विपरीत की ओर बढ़ (भविष्य बेसल), झिल्ली डोमेन. एक intercalation कदम बाएं और दाएं ventral कोशिकाओं में (समानांतर में) कदम पृष्ठीय कोशिका परत में 9 INT छल्ले के द्विपक्षीय सममित ट्यूब के रूप में । प्रत्येक कोशिका के चेहरे और अपने शिखर/लुमेन झिल्ली के साथ लुमेन बनाता है (ग्रीन; संरचनात्मक रूप से विशिष्ट झिल्ली microdomains, microvilli द्वारा प्रतिष्ठित) और संपर्क पड़ोसी कोशिकाओं या शरीर गुहा के साथ अपनी basolateral झिल्ली (नीला), सिवाय पहले INT अंगूठी है कि चार कोशिकाओं द्वारा बनाई गई है । शिखर जंक्शन्स (red) अलग शिखर र basolateral झिल्ली गरिन्छ । intercalation के बाद, de नोवो झिल्ली की उत्पत्ति देर embryogenesis और वयस्कता में चार लार्वा चरणों के दौरान आंत के विकास के साथ जारी है, जहां केवल न्यूनतम आगे वृद्धि होती है (ध्रुवीकरण झिल्ली रखरखाव के चरण ). बढ़ाया एकल सेल एर और नाभिक (N) और endosomal बुलबुले के ऊपर Golgi के साथ endomembrane प्रणाली को इंगित करता है । () Nomarski और फोकल ओवरलैप माइक्रोग्राफ विकासशील सी. एलिगेंस आंत के शिखर झिल्ली के साथ लेबल-cytoskeleton मार्कर एर्म-1:: GFP । आंत अल्पविराम चरण में एक सफेद रेखा द्वारा रेखांकित किया है (एर्म-1:: GFP पहले से ही बेहोशी intercalation की शुरुआत में शिखर झिल्ली पर व्यक्त की है, लेकिन इस छवि में सराहना नहीं की जा सकती है) । यहां और नीचे पशु पूर्वकाल (सिर), बाएं पीछे (पूंछ) सही, ऊपर पृष्ठीय, नीचे ventral के साथ दिखाया गया है । स्केल बार: 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2 : विकासशील वंय-प्रकार के दोहरे और ट्रिपल लेबलिंग के उदाहरण C. एलिगेंस आंत एंटीबॉडी और फ्यूजन प्रोटीन का उपयोग कर । (A, B) भ्रूण. (A) अल्पविराम अवस्था । PAR-6:: GFP (हरे; शिखर सममूल्य ध्रुवीयता परिसर के घटक), विरोधी सममूल्य-3 एंटीबॉडी (लाल/TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate); शिखर सममूल्य ध्रुवीयता परिसर का एक अंय घटक), और MH33 (नीला/Cy5 (Cyanine5); विरोधी IFB-2 मध्यवर्ती/ रेशा). par-6:: GFP और बराबर-3 एंटीबॉडी लेबल की शिखर झिल्ली की सी. एलिगेंस आंत (ब्रैकेट) । IFB-2, बाद के चरणों में एक और शिखर मार्कर, panmembraneously इस प्रारंभिक चरण में स्थानीयकृत है । par-6:: GFP और विरोधी सममूल्य-3 भी ग्रसनी (बाएं) लेबल; आंतों लुमेन IFB-2 (फ़िरोज़ा) के साथ उनके ओवरलैप द्वारा संकेत दिया है और आंत्र ट्यूब नीले विरोधी IFB-2 (दाएँ) द्वारा उल्लिखित है । (B) 2-फ़ोल्ड अवस्था । AJM-1:: GFP (हरा; जंक्शन घटक), ICB4 एंटीबॉडी (लाल/Alexa, ICB4 एक अज्ञात झिल्ली आंत्र प्रतिजन का पता लगाता है) । AJM-1:: GFP लेबल के शिखर जंक्शनों के सी. एलिगेंस आंत, पेरि-लुमेन सीढ़ी पैटर्न के रूप में दिखाई (यह भी hypodermal जंक्शनों लेबल; दिखाई नहीं है क्योंकि छवि आंत पर केंद्रित है; अनुभाग 4, फोकल इमेजिंग) देखें । ICB4 सी. एलिगेंस आंत के सभी झिल्ली दाग । तीर विरोधी ICB4 द्वारा दाग basolateral झिल्ली को इंगित करते हैं । (C, D) L2 लार्वा । (C) आईए-413:: GFP (हरा), phalloidin (red/टेक्सास-red, a phallotoxin bind to F-actin) और MH33 (नीला/Cyanine5, anti-IFB-2) । चलो-413/घसीटना बेसल ध्रुवीयता परिसर का एक घटक है और सी. एलिगेंस आंत (ब्रैकेट) की basolateral झिल्ली के लिए informations । Phalloidin और IFB-2 एंटीबॉडी लेबल के शिखर उपझिल्ली cytoskeleton की ग. एलिगेंस आंत (बैंगनी) । Phalloidin भी जोरदार दाग शरीर की दीवार की मांसपेशियों, भारी आंत्र धुंधला । इनसेट बॉक्सिंग क्षेत्र के उच्च आवर्धन दिखाता है । () L3 लार्वा । SLCF-1:: GFP (हरा; अभिन्न मेंबराणे घटक/शुगर ट्रांसपोर्टर), एर्म-1:: mCherry (लाल) और MH27 एंटीबॉडी (blue/Cyanine5, एंटी AJM-1) । SLCF-1:: GFP लेबल basolateral झिल्ली, जबकि एर्म-1:: mCherry लेबल की शिखर झिल्ली की ग. एलिगेंस आंत (ब्रैकेट); AJM-1 लेबल इसके शिखर जंक्शनों । (एफ-एफ' ' ') L2 लार्वा । (च, च') एकल रंग छवियां । SLCF-1:: GFP (हरा) basolateral झिल्ली (पार्श्व झिल्ली पतली सफेद तीर द्वारा इंगित) लेबल । MH27 (blue/Cyanine5) लेबल शिखर जंक्शनों (छोटे पीले तीर) । ('', च'') actin के साथ और बिना छवियां ओवरले करें । प्रीसेट्स बॉक्स्ड क्षेत्रों का अधिक आवर्धन दिखाते हैं । नोट एकल रंग छवियों (एफ, एफ) में सतही तौर पर दिखाई देते हैं कि इन अलग झिल्ली/जंक्शन मार्करों द्वारा आंतों की कोशिकाओं के apicolateral कोण का स्पष्ट भेद । F' ' ' बिंदु में मोटी सफेद तीर शिखर/लुमेन actin cytoskeleton phalloidin द्वारा लेबल (अंयथा मांसपेशी actin से अभिभूत) । सभी छवियां है फोकल अनुमानों (z-०.२ µm के ढेर), अनुक्रमिक स्कैनिंग से प्राप्त करने के लिए खून से बचने के माध्यम से चैनलों के बीच । स्केल बार्स (एक-E, f-f ' ' और सभी presets के लिए): 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3 : के उदाहरण C. एलिगेंस आंत्र ध्रुवीय झिल्ली और लुमेन morphogenesis दोषों पर कम करने वाली मध्यम आवर्धन (विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोग्राफ) । सभी छवियों को एक कस्टम निर्मित उच्च शक्ति स्टीरियो प्रतिदीप्ति लगाव (सामग्री की तालिका) के साथ सुसज्जित एक विदारक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप द्वारा अधिग्रहीत कर रहे हैं । विभिन्न आवर्धन दिखाए जाते हैं । सभी phenotypes RNAi द्वारा एर्म के साथ लेबल एक तनाव में अलग जीन के साथ प्राप्त किया गया-1:: GFP (आंतों और निकालनेवाला नहर शिखर में स्थानीयकृत/भ्रूण और जल्दी लार्वा चरणों में लुमेन, यहां दिखाया गया है) । आंतों लुमेन और ध्रुवीकरण phenotypes हैं: (a, B) जंगली प्रकार भ्रूण (a) और लार्वा (B); (ग, घ) एर्म के basolateral विस्थापन-1:: GFP; आंतों की कोशिकाओं में वृद्धि हुई है और इस भ्रूण में फूला हुआ दिखाई देते हैं (सी, तीर एक आंत्र कोशिकाओं को इंगित), लेकिन इन लार्वा में जंगली प्रकार के आकार और व्यवस्था के हैं (डी, तीर अंक INT द्वितीय और तृतीय के बीच पार्श्व झिल्ली के लिए); () चौड़ी और जटिल तीन भ्रूणों में लुमेन; () एर्म-1:: GFP पार्श्व जंक्शन क्षेत्र (लुमेन वक्र) में और आंत्र कोशिका है कि GFP-नकारात्मक vacuoles (तीर) शामिल में व्यापक; () intralumenal आसंजन के बीच लुमेन अल्सर (दो अल्सर के लिए तीर बिंदु) । (H) Cytoplasmic और basolateral एर्म-1:: अस्थानिक लुमेन (तीरों) के साथ GFP विस्थापन; (I) एर्म-1:: GFP विस्थापन को GFP-सकारात्मक puncta (तीरों) को कोशिका में । निकालनेवाला नहरों और निकालनेवाला नहर phenotypes यहां वर्णित नहीं है (नहर के बाईं ओर दिखाया गया है, आंत सभी छवियों में सही करने के लिए) । स्केल बार्स: 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4 : के उदाहरण C. एलिगेंस आंतों उच्च आवर्धन (फोकल छवियां) पर झिल्ली और लुमेन morphogenesis दोषों का ध्रुवीकरण । (A, C, E, G, I, K) भ्रूण. (B, D, F, H, J, L) लार्वा. सभी phenotypes RNAi द्वारा एर्म के साथ लेबल एक तनाव में अलग जीन के साथ प्राप्त किया गया-1:: GFP (सभी छवियों में हरा) । इमेजिंग आंत पर केंद्रित है । भ्रूण की छवियां भी निकालनेवाला नहरों (छवि की बाईं ओर), नहर phenotypes (वर्णित नहीं) सहित दिखा । (A, B) जंगली प्रकार भ्रूण (एक) और लार्वा (बी) । () शिखर एर्म के Basolateral विस्थापन-1:: GFP (अल्पविराम अवस्था; स्वर्गीय intercalation) । () ध्रुवीयता रूपांतरण: शिखर एर्म के basolateral विस्थापन-1:: GFP और शिखर basolateral के संचय, डबल लेबलिंग से पता चला । एफ-actin (phalloidin-TRITC द्वारा लेबल) अनुदैर्ध्य मांसपेशी बंडलों (पशु है ट्रिपल लेबल) धुंधला द्वारा जानवरों की रूपरेखा । () एर्म-१ की Basolateral विस्थापन:: GFP में देर से ३ गुना भ्रूण. शिखर IFB-2 एंटीबॉडी (blue/Cyanine5) बरकरार लुमेन और पेरि-लुमेन मध्यवर्ती रेशा इंगित करता है । () एंटी-IFB-2 (ब्लू/Cyanine5) द्वारा लेबल किए गए अस्थानिक लुमेन । (G) एर्म-1:: आंत्र कोशिका में GFP निगेटिव vacuoles । (H) एर्म-1:: आंतों कोशिका में GFP पॉजिटिव vacuoles । (I, J) भ्रूण और लार्वा में लुमेन के अभाव, क्रमशः । () चौड़ी आंत । (L) सिस्टिक और जटिल आंत । (A, D, H, I, J, K, L) फोकल अनुमानों हैं । (B, C, E, F) फोकल खंड हैं । चमक cytoplasmic GFP-ऋणात्मक vacuoles को हाइलाइट करने के लिए G में बढ़ गई थी । स्केल सलाखों: 10 µm (सभी भ्रूण और लार्वा के लिए एक ही, क्रमशः) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5 : आंत्र ध्रुवीयता रूपांतरण और reversion: एक उदाहरण के ठहराव के लिए ध्रुवीकरण और लुमेन के लिए एक उत्पत्ति दोष । (A, B, C) आईए-७६७और अनुप-1RNAi दोनों कारण एर्म-1:: GFP basolateral विस्थापन (बीएल) और अस्थानिक लुमेन गठन (EL), लेकिन विभिंन विकासात्मक चरणों में । () विदारक सूक्ष्मदर्शी द्वारा ठहराव: RNAi प्लेटों पर कीड़े बोने के बाद भ्रूण की गिनती (बाएँ) और लार्वा (दाएँ) को ध्रुवीयता के साथ phenotypes २ दिन. नोट: सभी नकली और चलो-767 (RNAi) जानवरों इस समय में रचा है (इस प्रकार वहाँ कोई भ्रूण है, जो था, तथापि, सभी जंगली प्रकार के ध्रुवीकरण; टूटी हुई पंक्ति स्तंभ). अनुप-1 RNAi भ्रूण में पहले से ही ध्रुवीयता दोषों लाती है, जबकि चलो-७६७RNAi लार्वा में उंहें लाती है । ए पी एस-1RNAi भ्रूण बनाम लार्वा में अस्थानिक लुमेन (बनाम basolateral विस्थापन) का उच्चतर प्रतिशत अस्थानिक लुमेन के साथ भ्रूण की गिरफ्तारी के कारण है । () ठहराव द्वारा फोकल माइक्रोस्कोपी: लार्वा में अस्थानिक लुमेन विकास के प्रारंभ में प्रति पशु अस्थानिक लुमेन की गणना. आईए-७६७ RNAi से लार्वा में अधिक अस्थानिक लुमेन लाती है ए पी एस-1RNAi (अनुप-1RNAi लार्वा "पलायनवादी" हैं जो arres नहीं हैभ्रूण के रूप में टेड) । () एर्म-1 के साथ वाइल्ड-टाइप लार्वा और लार्वा के लिए फोकल छवियां:: GFP basolateral विस्थापन (बीएल) और अस्थानिक लुमेन (एल); स्केल बार: 5 µm. (डी, ई) चलो-७६७RNAi पशु (के साथ और ध्रुवीकरण दोष [बीएल/एल] के साथ जानवरों की गिनती में ध्रुवीकरण पुनः विच्छेदन माइक्रोस्कोप) । 20 चलो-767 (RNAi) जानवरों हल्के अस्थानिक लुमेन phenotypes के साथ एक RNAi प्लेट से 4 दिन पर एक OP50 प्लेट के लिए स्थानांतरित किया गया और ४० घंटे के बाद मूल्यांकन. (D) ५०% से अधिक लार्वा जंगली-प्रकार की ध्रुवीयता (एर्म-1 पर शिखर झिल्ली) में वापस आ गए हैं । () 20% जानवरों के L1 लार्वा चरण ( let-767 (RNAi) परिणाम में L1 गिरफ्तारी से परे बढ़ रहे हैं । सभी डेटा के रूप में दिखाया जाता है +/SEM, n = 3 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

तालिका 1: C. एलिगेंस लार्वा और वयस्क आंत्र झिल्ली सिस्टम 1 के लिए मार्करों के उदाहरण
प्रोटीन का नाम उपसेलुलर स्थानीयकरण प्रोटीन संरचना/ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध C. एलिगेंस विशिष्ट एंटीबॉडी (DSHB2) CGC पर उपलब्ध उपभेदों के उदाहरण
ऑप्ट-2/PEPT-1 शिखर transmembrane प्रोटीन oligopeptide ट्रांसपोर्टर KWN246 (्ह्-1 (e2123) III, rnyEx133 [ऑप् शन-2 (aa1-412)::
GFP) + के ्ह्-1 (+)]
)
AQP-4 शिखर transmembrane प्रोटीन पानी चैनल
एर्म-1 शिखर brushborder झिल्ली-cytoskeleton लिंकर ERM1
अधिनियम-5 शिखर brushborder cytoplasmic actin (3)
IFB-2 शिखर brushborder मध्यवर्ती रेशा घटक MH33
ईपीएस-8 शिखर brushborder मानव-एपिडर्मल-वृद्धि-कारक-रिसेप्टर-कळेनासे-सब्सट्रेट-8 ortholog
PAR-6 शिखर झिल्ली शिखर ध्रुवीयता जटिल घटक
SLCF-1 basolateral transmembrane प्रोटीन monocarboxylate ट्रांसपोर्टर
AQP-1 basolateral transmembrane प्रोटीन पानी चैनल
आईए-४१३ basolateral झिल्ली घसीटना homologue, अनुकूलक और ध्रुवीकरण निर्धारक LET413
HMP-1 शिखर जंक्शन (सीसीसी4) α-catenin, cadherin-catenin जटिल घटक FT1609 (unc-119 (ed3) III; xnIs528 [hmp-1p:: hmp-1::
GFP + unc-119 (+)]
)
HMR-1 शिखर जंक्शन (सीसीसी) ई-cadherin, cadherin-catenin जटिल घटक HMR1
AJM-1 शिखर जंक्शन (डैक) जंक्शन वफ़ादारी अणु, संवाद-1/AJM-1complex घटक MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1:: GFP + rol-6 (su1006)])
संवाद-1 शिखर जंक्शन (डैक) डिस्क-बड़े homologue, MAGUK प्रोटीन, संवाद-1/AJM-1complex घटक DLG1
ऄब-11 endosomal बुलबुले ्े6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p:: gfp:: ऄब-11, Cbunc-119 (+)])
ऄब-5 endosomal बुलबुले ्े RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6:: gfp:: ऄब-5, Cbunc-119 (+)])
ऄब-7 endosomal बुलबुले ्े RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p:: gfp:: ऄब-7, Cbunc-119 (+)])
ऄब-10 endosomal बुलबुले ्े RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6:: gfp:: ऄब-10 Cbunc-119 (+))
मैंस Golgi α-mannosidase द्वितीय RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6:: मैंस:: gfp Cbunc-119 (+)])
1 उदाहरण Table3 में सूचीबद्ध संसाधनों से चयनित हैं ।
2 विकासात्मक अध्ययन Hybridoma बैंक ।
3 हड्डीवाला actin क्रॉस-प्रतिक्रिया के खिलाफ एंटीबॉडी ।
4 सीसीसी: cadherin-catenin परिसर; शिखर जंक्शन के शिखर भाग को information; adherens जंक्शन (अज) को संगत ।
5 डैक: संवाद-1/AJM-1complex; शिखर जंक्शन के बेसल भाग के लिए information; तंग जंक्शन (टी जे) के लिए इसी ।
अतिरिक्त पुटिका-आंतों में व्यक्त अणुओं के लिए रेफरी (22) देखें ।
नोट: नहीं सभी अणुओं अपने स्वयं के प्रवर्तकों के तहत या एंटीबॉडी द्वारा फ्यूजन प्रोटीन के रूप में परीक्षण किया गया है ।
तालिका 2 : के उदाहरण C. एलिगेंस आंत-विशिष्ट प्रवर्तकों और अभिव्यक्ति का समय1.
प्रवर्तकों अभिव्यक्ति अवस्था
elt-2 अभिव्यक्ति 2 ई सेल चरण के दौरान शुरू होता है और वयस्कता में बनी हुई है
vha-6 अभिव्यक्ति देर भ्रूण में शुरू होता है और वयस्कता में बनी हुई है
ges-1 अभिव्यक्ति लगभग 4E सेल स्टेज पर शुरू होता है और वयस्कता में बनी हुई है
समा-1 व्यंजक 1E कक्ष चरण के बाद शुरू होता है और बाद में embryogenesis के दौरान अस्वीकृत
1 उदाहरण तालिका 3 में सूचीबद्ध संसाधनों से चयनित हैं ।
तालिका 3: खोजने के लिए संसाधन C. एलिगेंस आंत-विशिष्ट अणुओं, लेबल िंग रिएजेंट्स/
1. Caenorhabditis जेनेटिक्स केंद्र (CGC) उपलब्ध रिएजेंट और उपभेदों के लिए४२
2. Wormbase आंत के बारे में जानकारी के लिए४३ -विशिष्ट अणुओं, उपभेदों और एंटीबॉडी
3. प्रोफार्मा
आंत के बारे में tion-विशिष्ट अणुओं20,४४ ४. Transgeneome वेबसाईट४५ for शोधों GFP फ्यूजन गावातील 5. C. एलिगेंस अभिव्यक्ति प्रतिमान४६ for transcriptional GFP फ्यूजन गावातील 6. राष्ट्रीय गैर-संसाधन परियोजना (NBRP)::C. एलिगेंस४७ आंत के विशिष्ट प्रवर्तकों के बारे में जानकारी के लिए 7. विकासात्मक अध् Hybridoma बैंक (DSHB)४८ C. एलिगेंस एंटीबॉडी के लिए 8. माध्यमिक एंटीबॉडी और रंजक के लिए संदर्भ देखें27,28

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Discussion

इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे मानक हानि का गठबंधन करने के लिए समारोह आनुवंशिक/RNAi और इमेजिंग (लेबलिंग और सूक्ष्म) को vivo में दृश्य और आणविक विच्छेदन के लिए एक मॉडल के रूप में सी. एलिगेंस आंत्र उपकला का लाभ लेने के लिए दृष्टिकोण झिल्ली और लुमेन-उत्पत्ति का ध्रुवीकरण ।

लेबलिंग

इस प्रोटोकॉल एंटीबॉडी धुंधला पर केंद्रित है । सीटू में एंटीबॉडी द्वारा लेबलिंग फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन द्वारा लेबलिंग के लिए एक अति विशिष्ट वैकल्पिक दृष्टिकोण है (निकालनेवाला नहर झिल्ली पर साथ कागज में वर्णित है, उत्पत्ति)2। हालांकि एंटीबॉडी धुंधला रहते इमेजिंग की अनुमति नहीं है, यह ब्याज की एक प्रोटीन के स्थानीयकरण के लिए पुष्टि प्रदान कर सकते है (न तो लेबलिंग विधि विफल के बिना है) । इसके अलावा, morphogenesis और/या एक प्रोटीन के उपसेलुलर स्थानीयकरण के बारे में सवाल अक्सर तय पशुओं में मूल्यांकन किया जा सकता है । Immunostaining डबल और एकाधिक लेबलिंग के लिए उपयोगी है और यह फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन द्वारा लेबलिंग के साथ संयुक्त किया जा सकता है अगर इन आवश्यक निर्धारण और permeabilization प्रक्रियाओं के माध्यम से संरक्षित किया जा सकता है । यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल सामांयतया इस (आरेख 2) को अनुमति देता है । एंटीबॉडी या रासायनिक दाग द्वारा तय पशुओं के लेबलिंग में सीटू भी superresolution जैसे तूफान (stochastic ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी) के रूप में सूक्ष्म तकनीक के लिए लाभ प्रदान कर सकते हैं । इम्यूनोफ्लोरेसेंस अंतर्जात प्रतिजन का पता लगाता है, और अनुकूलित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, विशिष्ट posttranslational प्रोटीन संशोधनों भेद । यह तेजी से परिणाम उत्पादन कर सकते है अगर एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, एक बार सीटू धुंधला तकनीक में -के रूप में सेल संस्कृति के रूप में सी एलिगेंस नमूनों में सीधी नहीं-स्थापित किया गया है ।

एक नई एंटीबॉडी की पीढ़ी (यहां वर्णित नहीं) है, तथापि, समय लेने वाली । दुर्भाग्य से, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सी एलिगेंस प्राथमिक एंटीबॉडी के चयन के बजाय छोटे रहता है, और नहीं सभी को सीटू में प्रतिजन का पता लगाने में सक्षम है (एंटीबॉडी के उदाहरण के लिए 1 टेबल देखें प्रदर्शित करने के लिए सीटू मेंआंतों एंटीजन का पता लगाने, और अतिरिक्त संसाधनों के लिए तालिका 3 ). अधिकांश एंटीबॉडी हड्डीवाला एंटीजन के खिलाफ उत्पन्न अपने ग. एलिगेंस homologs के साथ पार प्रतिक्रिया नहीं होगा. माध्यमिक एंटीबॉडी के चयन के पहले एंटीबॉडी की प्रजातियों को ध्यान में रखना चाहिए (सामांय इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल में चर्चा की27,28) । बड़े चयन लगातार फ्लोरोसेंट रंजक (जैसे Alexa-Fluor रंजक) में सुधार के साथ व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं । अनुकूलित धुंधला के लिए, रंजक उनके लिए "पलक"३७की क्षमता के लिए, इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया माइक्रोस्कोप, फोकल माइक्रोस्कोप, या, के लेजर उदा , अगर सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी की योजना बनाई है, से मेल करने की क्षमता के लिए चुना जा सकता है । सीधे प्राथमिक एंटीबॉडी या रासायनिक दाग लेबल (जैसे फ्लोरोसेंट लेबल phalloidin) भी उपलब्ध है और डबल धुंधला के लिए विशेष रूप से उपयोगी होते हैं ।

सी. एलिगेंस में सीटू एंटीबॉडी दाग के लिए मुश्किल है भ्रूण के अंडे के खोल और लार्वा/वयस्क छल्ली कि दोनों रासायनिक और/या यांत्रिक व्यवधान ऊतक के लिए एंटीबॉडी के उपयोग की अनुमति देने के लिए की आवश्यकता है । हालांकि जटिल तरल एंटीबॉडी धुंधला प्रोटोकॉल इस समस्या को दूर करने के लिए विकसित किया गया है27,28, सबसे permeabilization के लिए collagenase शामिल हैं, जो लक्ष्य ऊतक को नुकसान करने के लिए जाता है. इसके विपरीत, फ्रीज-क्रैक विधि यहां वर्णित है कीड़ा cuticles या हुए खोलने के लिए एक सरल तरीका है । यह सीधे कांच स्लाइड जहां नमूनों एकत्र कर रहे है पर प्रदर्शन किया है (और जहां धुंधला के आराम भी किया जाता है), और अंडे और लार्वा के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम करता है कि कांच स्लाइड के लिए सबसे अच्छा छड़ी (यानी चरणों मुख्य रूप से जांच में tubulogenesis स्टडीज) । यह भी fluorophore-लेबल फ्यूजन प्रोटीन के संरक्षण के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है । तकनीक कुछ मैनुअल निपुणता की आवश्यकता है, coverslip पर सही दबाव के रूप में (झटका से पहले) और कतरनी दबाव के परिहार नमूना के संरक्षण के लिए महत्वपूर्ण है (के रूप में पूरी धुंधला प्रक्रिया के दौरान कोमल हैंडलिंग और pipetting है) ।

निर्धारण शर्तों को empirically निर्धारित किया जा सकता है और संरचना/प्रतिजन के लिए है कि दाग (27में चर्चा की) के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है । मामूली (जैसे formaldehyde आधारित) निर्धारण तकनीक बेहतर antigenicity संरक्षित कर सकते हैं, हालांकि इस ऊतक आकृति विज्ञान, morphogenesis के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण बनाए रखने की आवश्यकता के साथ संतुलित किया जाना चाहिए । मामूली निर्धारण की स्थिति भी डबल लेबलिंग प्रयोगों में फ्लोरोसेंट फ्यूजन प्रोटीन के संरक्षण में मदद करते हैं । इसी तरह, अवरुद्ध एजेंट की राशि (जैसे दूध या गोजातीय सीरम एल्ब्युमिन/BSA) और धोने के समाधान में डिटर्जेंट विशिष्ट धुंधला के साथ संतुलन पृष्ठभूमि के लिए अनुभवजंय समायोजन की आवश्यकता है । इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के सामांय पहलुओं पर विवरण, विभिंन धुंधला तकनीक, उचित नियंत्रण के डिजाइन, और कृमि आंतों (उदा आंत्र के लिए इन प्रक्रियाओं के अनुकूलन के लिए सुझावों की चर्चा उदा autofluorescence) सामांय में पाया जा सकता है और C. एलिगेंस विशिष्ट इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल, के रूप में संदर्भित भर में ।

जीन समारोह और tubulogenesis phenotypes के मूल्यांकन के साथ हस्तक्षेप

इस प्रोटोकॉल विशिष्ट RNAi दृष्टिकोण है कि उपयोगी होते है जब जल्दी, आवश्यक और सर्वव्यापी कार्यों, जिसका आंशिक (बजाय पूरा) हानि के साथ जीन का मूल्यांकन पर प्रकाश डाला गया है सबसे जानकारीपूर्ण, के रूप में सबसे tubulogenesis जीन के लिए मामला है (हमारे जीनोम चौड़ा एर्म पर स्क्रीन-1:: GFP-लेबल आंतों का सुझाव दिया है कि ऐसे जीन के साथ हस्तक्षेप का कारण बनता है & #62; इस विशेष सेटिंग में सभी जानकारीपूर्ण tubulogenesis phenotypes का ९०%12) । कई फायदे है कि सी एलिगेंस आनुवंशिक जोड़तोड़ के लिए प्रदान करता है (अपनी छोटी पीढ़ी के समयउदा ) और perturb जीन समारोह के लिए अलग दृष्टिकोण आगे (समारोह के साथ शुरू/phenotype) और रिवर्स (के साथ शुरू जीन) आनुवंशिक दृष्टिकोण सामान्य सी. एलिगेंस साहित्य31,३८में चर्चा की जाती है । व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जीनोम-वाइड RNAi खिला पुस्तकालयों की उपलब्धता भी एक आगे आनुवंशिक जांच उपकरण के रूप में इस रिवर्स आनुवंशिक तकनीक का उपयोग करने की अनुमति देता है (देखें संसाधनों के लिए सामग्री की तालिका ) । tubulogenesis के विश्लेषण के लिए RNAi के विशिष्ट लाभ अपनी क्षमता शामिल हैं: एक उत्परिवर्ती allelic श्रृंखला के बराबर phenotypes की एक सीमा उत्पंन करने के लिए (यह आमतौर पर खुराक के लिए अच्छी तरह से निर्भर morphogenesis जीन काम करता है); मातृ RNAs को दूर करने के लिए (आमतौर पर प्रारंभिक morphogenesis/tubulogenesis में शामिल); स्टेज-विशेष रूप से हस्तक्षेप करने के लिए (postmitotic लार्वा वृद्धि के दौरान ध्रुवीकरण झिल्ली पर प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए उपयोगी).

RNAi प्रक्रियाओं के सामांय पहलुओं पर विवरण refs (26में चर्चा की है,s = "xref" > 31). घातक tubulogenesis phenotypes के विश्लेषण के लिए कुंजी phenotypes के स्पेक्ट्रम को बढ़ाने के लिए RNAi शर्तों को मिलाना करने की क्षमता है । जानकारीपूर्ण tubulogenesis phenotypes आमतौर पर आंत विशिष्ट RNAi उपभेदों३९की आवश्यकता के बिना एक जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि में उत्पंन किया जा सकता है । हालांकि, इस तरह के उपभेदों अगर यह विफल रहता है और यह भी गैर स्वायत्त प्रभाव से सेल-स्वायत्त भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता उपलब्ध हैं । RNAi की शक्ति का नियमन करने के लिए विभिन्न तरीकों की रिपोर्ट किया गया है, जैसे dsRNA के प्रेरण के लिए IPTG सांद्रता के अनुमापन, एक दृष्टिकोण है कि सबसे प्रतिलिपि परिणाम30उत्पादन कर सकते हैं. हालांकि, मात्रात्मक सटीक अनुमापन अलग phenotypes की एक स्पेक्ट्रम पैदा करने पर लक्ष्य जब आवश्यक नहीं हो सकता है । कुल मिलाकर, इस विश्लेषण की सफलता RNAi प्रभाव को अधिकतम करने पर इतना निर्भर नहीं है क्योंकि यह RNAi शर्तों कि phenotypes के एक जानकारीपूर्ण स्पेक्ट्रम उत्पंन निर्धारित करने पर है (जो अक्सर उपइष्टतम का परिणाम हो सकता है (जैसे मामूली) RNAi शर्तें) ।

RNAi द्वारा प्रेरित tubulogenesis phenotypes के दृश्य आकलन के लिए यह phenotypic मूल्यांकन के लिए इष्टतम खिड़की का निर्धारण करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह सबसे अच्छा है प्लेटों का मूल्यांकन शुरू करने के लिए (जैसे दो दिनों के मानक RNAi शर्तों के तहत उनके RNAi प्लेटों के लिए जानवरों को चुनने के बाद) और संभव देर प्रभाव के लिए उन्हें लंबे समय के लिए पर्याप्त का पालन करने के लिए. एक बिगड़ती ध्रुवता दोष के विकास के समय पाठ्यक्रम, उदाहरण के लिए, आम तौर पर गिरफ्तार लार्वा में 3-7 दिनों को कवर करना चाहिए । postmitotic गैर में ध्रुवीकरण झिल्ली के विश्लेषण के लिए शर्तें लार्वा आंत की कोशिकाओं को विभाजित करने के लिए आगे सुधार किया जा सकता है जब म्यूटेंट या RNAi जानवरों का उपयोग धीमा विकास के साथ (के रूप में, उदाहरण के लिए, चलो-767 (RNAi) या उत्परिवर्ती जानवरों 12, चित्रा 5). किसी भी समय पाठ्यक्रम को निरस्त किया जाना है यदि F2 जानवर दिखाई देते हैं (प्रयोगों में L4s निकाल सकते हैं, जहां लार्वा के रूप में सबसे अधिक नहीं बल्कि सभी जानवरों की गिरफ्तारी हो सकती है) । हर प्रयोग उचित सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के सहवर्ती मूल्यांकन की आवश्यकता है (जैसे बैक्टीरियल RNAi क्लोन है कि एक परिभाषित tubulogenesis phenotype और खाली वेक्टर या तले हुए RNAi क्लोन, क्रमशः) प्रेरित । मूल्यांकन के लिए एक और आवश्यकता एक पर्याप्त चिंता का आकार है (कम से ५०) । यदि नहीं मिले, तो अन्य (उदा. सशर्त) RNAi शर्तों का प्रयास किया जा सकता है । अंत में, कुछ विशेष रूप से दिलचस्प tubulogenesis phenotypes कम penetrance पर होते हैं, इस प्रकार जानवरों की एक पर्याप्त संख्या का मूल्यांकन किया जाना चाहिए ।

माइक्रोस्कोपी

कम करने के लिए उदारवादी फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और उच्च आवर्धन फोकल माइक्रोस्कोपी आवर्धन, दो मानक इमेजिंग प्रक्रियाओं यहां वर्णित है, आमतौर पर एक ट्यूब या में लुमेन phenotype के बुनियादी पहलुओं की विशेषताएं पर्याप्त है C. एलिगेंस आंत और भी नेत्रहीन आगे स्क्रीन में जानवरों की बड़ी सेट स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । विदारक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी परमिट: अपनी प्लेटों पर जानवरों के vivo में इमेजिंग (हालांकि, लाइव जानवरों, क्षणिक निश्चेतक द्वारा मैटीरियल, भी फोकल या केंद्र इमेजिंग के बाद mounts से बरामद किया जा सकता है); जानवरों के बड़े सेट स्क्रीनिंग; विकास की घटनाओं पर नज़र रखने (जैसे विस्थापन और झिल्ली विस्तार के दौरान एक ध्रुवीकरण मार्कर के प्रतिस्थापन); विशिष्ट अभिव्यक्ति पैटर्न की ट्रैकिंग (कुछ पैटर्न और असीमितता बेहतर कम आवर्धन पर प्रतिष्ठित हैं); चयन और फ्लोरोसेंट कीड़े आगे विश्लेषण (जैसे फोकल माइक्रोस्कोपी) के लिए उपयुक्त उठा या extrachromosomal transgenes के रखरखाव के लिए । फोकल माइक्रोस्कोपी परमिट द्वारा उच्च आवर्धन पर विज़ुअलाइज़ेशन एकल सेल और सेलुलर स्तर पर phenotype की विशेषताएं । इस प्रोटोकॉल एक लेजर के साथ इमेजिंग का वर्णन करता है फोकल माइक्रोस्कोप कि एक स्पिनिंग डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप के रूप में विकल्प पर सबसे अच्छा फोकल प्रदान करता है स्कैनिंग । एक कताई डिस्क फोकल माइक्रोस्कोप है, तथापि, गतिशील और समय चूक अध्ययन के लिए पसंद की माइक्रोस्कोप के बाद से यह कम phototoxicity लाती है (देखें refs (३४,३५) कम और उच्च आवर्धन के आगे चर्चा के लिए सी. एलिगेंसमें माइक्रोस्कोपी). उपंयास के रूप में अच्छी तरह के रूप में पारंपरिक सूक्ष्म तकनीक अतिरिक्त लाभ प्रदान करते है और उच्च संकल्प पर नेनो रेंज में इमेजिंग की अनुमति (जैसे संचरण इलेक्ट्रॉन और सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी;३७में चर्चा की, ४०).

जब इमेजिंग C. एलिगेंस एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत आंतों, बढ़ते और स्थिरीकरण महत्वपूर्ण है । स्थिरीकरण के लिए विभिंन रसायनों के अलावा, सोडियम azide-हालांकि विषाक्त-सबसे मज़बूती से काम करता है अगर स्कैनिंग तुरंत किया जाता है । Levamisole, हालांकि विषाक्त नहीं है, hypercontraction उत्पादन करता है कि कई बार morphogenesis phenotypes के मूल्यांकन के साथ हस्तक्षेप । कुछ निश्चेतक झिल्ली से जुड़े फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ हस्तक्षेप कर सकते है और कलाकृतियों कि ध्रुवीयता दोषों की तरह लग सकता है उत्पादन कर सकता है । C. एलिगेंस एक मोटी नमूना है और इस प्रकार 3 डी विश्लेषण (अनुभाग) शिखर जंक्शनों और पार्श्व झिल्ली के उत्कृष्ट दृश्य की अनुमति देता है कि ट्यूबलर आंत्र उपकला की विशिष्ट शक्ति का लाभ लेने के लिए आवश्यक है (आसानी से नहीं फ्लैट epithelia में सुलभ) । प्रत्येक स्लाइड के लिए फोकल सेटिंग्स समायोजित की जानी चाहिए और अच्छी गुणवत्ता छवियां प्राप्त करने के लिए उद्देश्य, ब्रैकेटिंग जैसे पैरामीटर्स सहित, औसत, लेज़र पावर, लाभ, pinhole और चमक । आंतों इमेजिंग की एक विशेष समस्या के इस अंग की सामग्री है हरे/पीली फ्लोरोसेंट granules (lysosome संबंधित organelles (LROs)) है कि परिणामों की व्याख्या के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, विशेष रूप से जब विस्थापन का आकलन GFP-लेबल इंडो-और प्लाज्मा-झिल्ली जुड़े घटकों । इस समस्या को अच्छी तरह से क्षेत्र में पहचाना जाता है और DAPI अपवर्जन, वर्णक्रमीय फिंगरप्रिंटिंग, और अनुभवजंय स्कैनर सेटिंग्स13,४१सहित विभिन्न दृष्टिकोण (माइक्रोस्कोप के आधार पर) से सुलझाया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

हम मारियो de नि । (MRC आणविक जीवविज्ञान, कैंब्रिज, ब्रिटेन की प्रयोगशाला), केनेथ जे Kemphues (कॉर्नेल विश्वविद्यालय, इथाका, संयुक्त राज्य अमरीका), मिशेल Labouesse (Institut de Biologie पेरिस महाजाल, विश्विद्यालय पियरे एट मैरी क्यूरी, पेरिस, फ्रांस) धंयवाद, Grégoire Michaux (विश्विद्यालय डेरेन 1, रेन, फ्रांस) और CGC, रिसर्च इन्फ्रास्ट्रक्चर प्रोग्राम (NIH P40) के OD010440 कार्यालय द्वारा वित्तपोषित, उपभेदों और एंटीबॉडी के लिए । यह काम पलाश NIH GM078653 द्वारा समर्थित था, MGH २२४५७० है और साे २२३८०९ को V.G.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibody staining
poly-L-lysine Sigma P5899
Methanol Fisher Scientific A452-4
Acetone Fisher Scientific A949SK-4
Tween Fisher Scientific 50-213-612
Permount Fisher Scientific SP15-100
Powdered milk Sigma MT409-1BTL
Primary antibodies
MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
Secondary antibodies
Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
Labeled chemicals
Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
Materials
Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
Microscope slides Fisher Scientific 4448
Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
LB Medium and plates see reference29 for protocols.
Tryptone Acros Organics 611845000
Yeast Extract BD Biosciences 212750
NaCl Sigma S7653
Bacto Agar BD Biosciences 214040
Ampicillin Sigma A0116
Tetracycline Fisher Scientific BP912
M9 Medium see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
KH2PO4 Sigma P0662
Na2HPO4 Sigma S7907
MgSO4 Sigma M2773
NGM plates see reference29 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
RNAi plates see reference30 for protocols.
NaCl Sigma S7653
Peptone BD Biosciences 211677
Tryptone Acros Organics 611845000
Bacto Agar BD Biosciences 214040
MgSO4 Sigma M2773
CaCl2 Sigma C3881
Cholesterol Sigma C8667
K2HPO4 Sigma P3786
KH2PO4 Sigma P0662
IPTG US Biological I8500
Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
NaOH Fisher Scientific SS266-1
Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
Bacteria
OP50 bacteria CGC
HT115 bacteria CGC
Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
Imaging related
Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
Equipment
dissecting microscope Nikon SMZ-U
dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

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