C. 선 충 장 한 모델으로 루멘 Morphogenesis 세포를 단일 세포 수준에서 Vivo에서 편광 막 속: 항 체 얼룩이 지기, RNAi 손실의 기능 분석 및 이미징 라벨

Developmental Biology

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Summary

투명 한 선 충 C. 소장"vivo에서 조직 챔버를" 다세포 tubulogenesis 동안 단일 세포 및 subcellular 수준 apicobasal 막과 루멘 속 공부에 대 한 될 수 있습니다. 이 프로토콜 표준 라벨을 결합 하는 방법을, RNAi/손실의 기능 유전자 및 분자 수준에서이 프로세스를 해 부 현미경 접근에 설명 합니다.

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Zhang, N., Khan, L. A., Membreno, E., Jafari, G., Yan, S., Zhang, H., Gobel, V. The C. elegans Intestine As a Model for Intercellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis at the Single-cell Level: Labeling by Antibody Staining, RNAi Loss-of-function Analysis and Imaging. J. Vis. Exp. (128), e56100, doi:10.3791/56100 (2017).

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Abstract

다세포 튜브, 모든 내부 장기의 기본 단위는 루멘과 basolateral 막 서로 또는 세포 외 매트릭스 연락 안 감 꼭대기 멤브레인과 편광 된 상피 또는 내 피 세포의 구성 됩니다. 이 독특한 막 비대칭 설립 되 고 기관 morphogenesis 동안 유지 하는 방법 아직도 세포 생물학의 미해결된 질문 이다. 이 프로토콜 꼭대기 막 및 루멘 속에 강조와 함께 튜브 morphogenesis 동안 편광된 막 속의 분석을 위한 모델 선 충 C. 소장을 설명합니다. C. 선 충 20 셀 단일 레이어 창 자 상피 간단한 양측 대칭 관, 허용 하는 단일 세포 수준에서 분석으로 배열 된다. 막 분극 발생 합니다 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 동안 초기 embryogenesis, 하지만 드 노 보 편광 막 속 세포 이상 증식 및 이동 하는 때 애벌레의 성장을 통해 계속. 후자의 설정을 동시에 이러한 서로 다른 편광 프로세스, 대부분 극성 모델에서 구분 하기 어려운 중재 subcellular 변경 분리 있습니다. 꼭대기-basolateral 막-, 접합-, cytoskeletal-endomembrane 구성 요소 또는 수 있습니다 분류 및 GFP 융해 단백질에 의해 개발을 통해 추적 제자리에서 얼룩이 지는 항 체에 의해 평가. 생물의 유전적 다양성, 함께 C. 선 충 장 따라서 독특한 vivo에서 발달, 시각 모델과 편광된 막과 튜브 속의 분자 유전 분석을 제공합니다. 여기에 설명 된 특정 방법 (모든 표준) 포함 하는 방법: 항 체 얼룩이 지기; 여 장 subcellular 구성 요소 레이블 일반적으로 필수 tubulogenesis 유전자;에 적응 하는 손실의 기능 연구에 의해 편광된 막 속에 관련 된 유전자 분석 다른 발달 단계; 극성 결함 평가 epifluorescence, 미분 간섭 콘트라스트 (DIC) 및 confocal 현미경 검사 법; 고기 해석 시각적 결함을 계량. 이 프로토콜 분석 관련 된 매우 자주 보존된 분자의 상피 극성, 막 속, 튜브 및 루멘 morphogenesis 적용할 수 있습니다.

Introduction

세포 및 subcellular asymmetries, 편광된 막 도메인의 형성 등의 세대 morphogenesis 및 셀, 조직 및 장기1의 기능에 결정적 이다. 여러 연속과 일치 extracellular 및 세포내 신호는 의존 subcellular 구성 요소 할당에 방향 변경 이후 epithelia에 편광된 막 속에 대 한 연구 기술 도전 남아 어려운 대부분의 모델에서 분리 하 고 강하게 모델 시스템에 따라 달라 집니다. 모델은 여기에 제시-단일 층 꼬마 선 충 장-절묘 한 단순의 조직 이다. 단일 셀과 함께 배설 C. 선 충 ( C. 선 충 배설 운하에 편광된 막 속에 종이 동반 참조)2운하, 식별에 대 한 여러 독특한 이점을 제공 하 고 편광된 막 속에 필요한 분자 특성 이 간단한 무척 추 동물 기관 효 모에서 남자에 분자 극성 단서의 보존에 게 훌륭한"vivo에서 조직 챔버" 상피의 극성에도 아직까지 인간의 시스템에 직접적인 관련성 주소 질문에 복잡 한 단일 이러한 이벤트의 시각적 해 부를 허용을 세포 수준 비보.

비록 extracelluar 매트릭스 (1), (2) 플라즈마 멤브레인 교차점, 및 (3) 세포내 기공을 매매에서 여러 보존된 극성 신호 왔다 발견된3, 그들의 통합의 과정의 기본 원리 편광 된 상피 막과 조직 속에는 불완전 하 게 이해4입니다. 클래식 단일 셀에 vivo에서 모델 (e.g.S. cerevisiae선 충 C. zygote) 편광된 세포 분열 및 이전 후부 극성의 원칙을 정의 수단이 고 중요 한 식별 멤브레인 관련 극성 (작은 GTPases/CDC-42, 분할 결함 동위) 결정 요인5,6, 하지만 그들은 신호 (버드 흉터, 정자 항목)을 깨는 독특한 대칭에 의존 하 고 접점 확보 부족 apicobasal 막 도메인 그리고, 아마도, 해당 세포내 apicobasal 기계를 정렬. 그러나 편광 epithelia, 매매의 조직에 대 한 우리의 현재 지식, 주로 의존 포유류 2D monocultures7는 막의 위치를 변경할 수 있는 세포 외 및 발달 생리 신호 부족 도메인 및 밀매 궤도의 방향 (혼자 문화 시스템 3 차원 생체 외에서 2D에서 스위치 MDCK (Madin-다 비 개 신장) 세포에서 막 극성 반전 충분)8. 무척 추 동물 모형 유기 체에서 상피 극성에 발달 학문 vivo에서 초파리 melanogaster 표 피, 그들은 중요 한 기여를 식별 하는 어디에 예를 들어 평면 epithelia에 처음 실시 했다 접합 역학 편광된 셀 마이그레이션 및 셀 시트 운동9, 그리고 극성 유지 보수10endocytic 인신 매매의. 3 차원 생체 외에서 및 MDCK 세포와 선 충 C. 소장 관 epithelia에 루멘 morphogenesis의 분석 vivo에서 각각 최근 확인 드에 대 한 세포내 매매의 요구 노 보 (꼭대기) 도메인 및 루멘 속11,,1213위치. 두께의 (평면) 대 관 상피 세포는 subcellular asymmetries의 3D 분석에 대 한 장점 꼭대기 lumenal 막, apico-측면 접합, 측면 막의 뛰어난 시각적 구별 허용 이후와 세포내 세포의 위치입니다. 이러한 시각적 장점에 선 충 C. 모델에 비보 설정, 개발 축, 투명도, 몸 계획, 고정 및 정의 된 세포 계보, 분석의 단순 추가 (유전) 및 아래에 설명 된 추가 장점.

C. 선 충 자체는 관 구조 그의 투명성 및 간단한 건축 마찬가지로 관 내부 장기는 직접에 액세스할 수 있도록 튜브와 루멘 morphogenesis의 시각적 분석의 거 위. 그것의 창 (21 또는 22 셀에 경우에)14 의 20 셀 단일 조상 셀 (E)에서 파생 된과 9 INT 반지의 양측 대칭 관으로 한 윤 단계 두 계층 상피에서 개발 (4 개의 세포는 첫 번째 링; 그림 1 도식)14,,1516. 내장의 계보 및 조직 분석, 처음 결정 핵 정체성17통해 Nomarski 광학에 의해 이후에 의해 레이블이 막 통해 형광 현미경 검사 법에 자사의 morphogenesis에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다 특정 방향 세포 분열 및 움직임 (, 윤, 오른쪽 왼쪽 asymmetries, 앞쪽에 및 사후 관 회전)14,18 셀 자치 및 셀-비-자치 요구 사항 . 초기 endodermal 셀 사양 및 기관이 클론 모델의 개발을 제어 유전자 규제 네트워크 잘 특징이19,20있습니다. 그러나 여기에,, 초점은 편광된 막과 단 관 세포의 루멘 속의 endomembranes, cytoskeletal 구조와이 과정을 동반 하는 세포의 세포내 asymmetries의 분석에 있습니다. 분석은 어디 (ultrastructural 수준에 microvilli로 구분) 모든 꼭대기 막 루멘 얼굴과 모든 기저 막 서로 연락 측면 멤브레인과 외부 튜브 표면, 얼굴,이 튜브의 단순에 의해 촉진 된다 접합 하 여 꼭대기 막에서 분리 (그림 1 회로도; C. 선 충에 대 한 참조 참조 (16,21)-꽉의 특정 조직 및 외화 접합 구성 요소). 꼭대기 막 속은 이렇게 루멘 morphogenesis 일치 이다. 또한, 성인 장 세포-배설 셀의 예외) (와이 작은 동물의 가장 큰 셀-의 크기 대략 vivo에서 시각적 추적의 subcellular 요소, 예를 들면 허용, 포유류 세포의 크기 일반적으로 소포 궤적에 시도 생체 외에서 문화 접시에.

이 세포 및 subcellular 분석을 위해 적절 한 라벨링은 중요 합니다. 장 엔 또는 플라즈마 멤브레인 도메인, 접합, cytoskeletal구조, 핵 및 다른 subcellular 세포는 그들의 특정 분자 구성 요소에 라벨 하 여 구상 될 수 있다. 이러한 많은 구성 요소 특징 되었습니다와 발견 계속 ( 1 몇 가지 예제를 제공 하 고 리소스 참조). 예를 들어, 플라즈마 막에 포스트-골 지 소포를 통해 골을 응급실에서 장 endomembrane 시스템의 관 또는 기공을 구획을 구별 하는 다양 한 분자 식별된22되었습니다. 특정 단백질 (로 지질과 당 분) 수 중 표시를 직접 또는 간접적으로 단백질 바인딩 통해. 이 프로토콜은 제자리에 고정된 표본, 두 표준 라벨 기법 중의 항 체 얼룩이에 초점을 맞추고 (동반 종이 대 한 설명은 다른 기술2 -배설 운하 tubulogenesis에 참조 vivo에서 라벨 형광 성 단백질 융해-소장;에 직접 적용 되는 통해 테이블 2 소장 같은 융해 단백질의 표정 드라이브를 사용할 수 있는 내장 전용 발기인의 예를 제공 합니다). 더블-또는 어느 방식으로 또는 두 플러스 추가 화학, 얼룩이 지기의 조합으로 여러 라벨 수 큰 깊이 있는 영상 해상도 공동 지역화에 공간 및 시간적 변화의 시험 및 특정의 모집 분자 또는 subcellular 부품 (그림 2). 고정 하 고 녹색 형광 단백질 (GFP) immunostaining 절차 동안 라벨의이 프로토콜 지원 보존에 설명 된 절차를 얼룩. 이미징에 대 한 핵심 포인트는 검출 및 표준 현미경 절차 (형광 해 고 confocal 현미경 검사 법)를 통해 고기는 tubulogenesis의 (, 그림 3 4설명). 이러한 고해상도 이미징 인스턴스 해상도 현미경 검사 법 그리고 전송 전자 현미경 검사 법 (여기 설명)에 대 한 접근을 확장할 수 있습니다.

이 시스템의 주요 힘은 성인 기 통해 embryogenesis에서 다른 발달 단계에서 개별 셀에 극성을 분석 하는 능력 이다. 예를 들어, 꼭대기 막 도메인 및 루멘 속 추적할 수 있습니다 단일 세포 수준에서 개발에 걸쳐 음-1, Ezrin-Radixin-Moesin 가족23,24의 높은 보존된 막 걸 링커로 통해 . 음-1 때 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션 (apically 윤 중 루멘 주위 세포 이동)15; 배아 튜브 morphogenesis, 동안 꼭대기 막 속 (1) 시각화 (2) 세포 분열 또는 마이그레이션;의 부재에서 진행 하는 늦은 배아와 애벌레 튜브 확장 중 (3) 편광된 막 도메인 (그림 1)을 유지은 성인 소장에서. 확장 포스트 mitotic 애벌레 상피에 드 노 보 편광 막 속 따라서 편광된 조직 morphogenesis 불가능 대부분 vivo에서 그리고 생체 외에서 상피 극성 모델에,에서 분리 될 수 있다 단일 셀 해상도 (예: 3D MDCK 낭종 모델8)에 그들을 포함 하 여. 다른 구성 요소에 대 한 라벨,이 설정은 제공 기회 (특히 L1 애벌레 단계에서 때 세포가 높은 세포질/핵 비율) 막 속 (편광에 관련 된 그 세포내 변화를 구별 하 예를 들어 밀매 궤적의 재교육) 수반 편광된 세포 분열 및 마이그레이션에 필요한에서.

C. 선 충 의 유전자 다양성은 잘 알려진25그리고 생물학 질문의 분자 분석에 대 한 강력한 모델 시스템. Morphogenesis에 대 한 연구 예를 들어, 야생-타입 스트레인, 관심 (예: 막)의 구조 라는 형광 표시와 함께 또는이 결함 손실 또는 이득-의-기능 돌연변이와 유전자 변형 긴장을 시작할 수 있습니다. 구조입니다. 전형적인 역 유전자 연구 mutagenesis (일반적으로 생산 필연적인 손실, 감소, 또는 기능에 이득 포인트 돌연변이 의해 수정 (예: 대상된 삭제에 의해), 생식에 관심사의 유전자 삭제 돌연변이 생성할 수 있습니다. 유전자), 또는 그것의 사본을 RNAi에 의해 감소 된다. 먹이 선 충 C.26 에 의해 RNAi의 용이성 또한 관심사의 유전자의 큰 그룹을 검사 하는 대상 화면 디자인에 적용 됩니다. 유전자 모델 생물의 틀림 없이 가장 큰 힘이 이다 vivo에서 앞으로 화면 (예: mutagenesis, 체계적인 또는 게놈 넓은 RNAi 스크린)의 표현 형에 대 한 분자 원인으로 중 정한 조회를 수행 하는 기능 관심입니다. 예를 들어, 편견된 visual 유전자 변형 동물 꼭대기 막 음 1 표시와 함께 시작 하는 선 충 C. RNAi tubulogenesis 스크린, 발견 한 흥미로운 가역 장의 극성 변환 및 소성 루멘 형, 사용 분석의이 유형에 대 한 예로 여기. 이 화면이이 극성을 일으키는 특정 분자 결함으로 glycosphingolipids (GSLs; 의무 막 지질, 그들의 GLS 생 합성 효소를 통해 식별)의 고갈 및 소포 코트 clathrin와 그것의 AP-1 어댑터의 구성 요소 식별 변환 형, 따라서 vivo에서 으로 분자를 밀매 이러한 특성화 꼭대기 막 극성과 루멘12,13위치에 대 한 단서. 같은 화면 (또는 단일 유전자/RNAi 상호 작용 실험) 수 관심 (참조 종이 배설에 동반의 두 개 또는 여러 개의 유전자 간의 상호 작용을 기능 검사 또한 특정 유전자 돌연변이/morphogenesis 표현 형으로 시작, 이 같은 분석의 예 운하)2. 이 프로토콜은 RNAi는 직접 그 손실 앞으로 스크린에 표현 형을 하면 유전자를 식별 하는 능력 뿐만 아니라 morphogenesis의 분석에 대 한 구체적인 장점을 제공에 집중 한다. 종종 morphogenesis 감독 유전자 제품 복용량 의존 방식에서 작동, RNAi 이므로 일반적으로 고기의 스펙트럼을 생성에 성공. 유익한 부분 손실의 기능 고기를 생성 하는 기능 또한 중요 한 tubulogenesis 유전자의 대다수는 필수 고 그들의 손실을 불 임의 원인과 초기 배아 치 사 율 그 문제를 해결 하기 위해 도움이 됩니다. 이 프로토콜이이 어려움을 극복 하기 위해 조건부 RNAi 전략을 포함 하 고 고기, mutagenesis에 의해 생산 하는 유전자 시리즈의 광범위 한 스펙트럼의 생성을 최적화 하는 방법을 제안.

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Protocol

1. C. 선 충 장 라벨

참고: 조직의 특정 형광 성 감 적의 건설에 대 한 배설 운하 tubulogenesis 2의 분석에는 저자에 의해 동반 종이 참조 플라스 미드 그리고 transcriptional 및 변환 융합 단백질 (관심사의 분자의 subcellular 지 방화에 필요한 후자)에 대 한 논의 포함 하 여 유전자 변형 동물의 세대. 이 절차는 소장에 관심사의 분자를 특정 발기인을 사용 하 여 적응 될 수 있다. 표 1 C. 선 충 장 엔도-하 고 플라즈마 막과 그들의 접합을 시각화 하는 데 유용 하 게 입증 하는 분자의 예 식 소장, 운전에 대 한 발기인의 예제를 보려면 표 2 참조 장 표시자 및 발기인의 더 포괄적인 컬렉션에 대 한 리소스에 대 한 표 3.

    항 체 선 충 C. 내장의 얼룩
  1. 27 , 28
    1. 고정
      1. 깨끗 한 유리 슬라이드 하 고 폴 리-L-리 신을 사용 에 붙어 벌레에 대 한 박막을 생성 합니다. 장소 30 µ L 0.1-0.2 %lysine 폴 리-L-리 신 슬라이드와 장소 있도록 폴 리-L-리 신 드롭에 두 번째 슬라이드에는 " 샌드위치 ". 다음 둘 다의 전체 표면에 젖은 고 연필로 슬라이드의 30 분 라벨 두르고 측면에 대 한 건조 한 공기를 슬라이드 몇 번 부드럽게 문질러.
        참고: 200 µ L의 0.2% 폴 리-L-리 신 aliquots dH 2 O; 분말을 용 해 하 여 만들어진 이 벌레의 고집 개선-20 ° C. 사용 높은 분자량 폴 리-L-리 신에 저장할 수 있습니다. 폴 리-L-리 신의 농도 또한 긴요 하다. 너무 낮은 농도 벌레 막대기를 허용 하지 않습니다 하지만 너무 높은 농도 형광 배경 신호를 생성할 수 있습니다. 너무 두꺼운 필름 전체에 풀고 있습니다.
      2. 장소 (예: 폴리스 티 렌 컨테이너) 컨테이너의 하단에 액체 질소로 채워진 평면 금속 블록.
        참고: 하나 대신, 드라이 아이스를 사용할 수 있지만 액체 질소 컨테이너 바닥에 금속 블록 더 안정적으로 유지 하 고 잘 오.
      3. 수집 벌레 중으로 그들을 세척 M9 29와 그들의 번호판을 해제 또는 각 슬라이드에 다른 단계 웜 (중 계란, L1, L2, L3, L4 애벌레 단계 웜). 일반적으로 100 ~ 애벌레와 배아 또는 ~ 20 성인 각 슬라이드를 선택 합니다. 슬라이드의 중간에 웜 씻어 장소 10 µ L 또는 선택 계란/웜 10 µ L에 M9 또는 10 µ L 1 x PBS 27 (버퍼링 하는 인산 염).
        1. 는 피 펫을 사용 하 여 응집을 방지 하는 벌레의 다 수 밖으로 확산.
          참고: 혼합의 벌레를 씻어 잘 고 덜 효과적으로 동결-금이 (아래 참조)의 단계, 두께 때문에 크롤 링 하 고 다른 스틱을 하지 않는, 따라서 따기 단계 특정 벌레 (또는 동기화 된 인구) 우수한 결과 제공. 애벌레는 성인 보다 더 나은 스틱 및 슬라이드 당 더 많은 동물을 배치 될 수 있습니다.
        2. 전에 따기에 슬라이드, 웜 OP50 박테리아 없이 선 충 류 성장 매체 (NGM) 플레이트 29에 그들을 전송. 벌레를 초과 박테리아 부착 또한 고집 방해할 수 있습니다. 벌레를 밖으로 건조 하지 마십시오 주의.
      4. 부드럽게 장소 (드롭)는 22 × 22mm coverslip 크로스-방법으로 수집의 위에 벌레 같은 모서리는 슬라이드의 적어도 1 개의 측 만요. 눌러 곧장 부드럽게 하지만 단단히 하나 또는 두 개의 손가락으로는 coverslip에. 피하 조직의 무결성을 손상 시킬을 기울이기.
      5. 즉시 부드럽게 슬라이드를 액체 질소에 금속 블록을 전송 하 고 동결 약 5 분 동안 앉아 보자. 그런 다음 "에서 영화 " 한 스위프트에 coverslip 돌출 가장자리를 사용 하 여 이동.
        참고:이 단계는 결정적으로 수행 되어야 합니다 그리고 슬라이드를 달성 하기 위해 고정 하는 동안 " 균열 " 표 피의. 주의: 액체 질소를 사용 하는 경우 제발 PPE (개인 보호 장비) 지침을 따릅니다.
      6. 담가 메탄올로 동결 금이 슬라이드--20 ° c.에 5 분 동안 유리 Coplin jar를 가득 다음 아세톤을 전송--20에서 또 다른 5 분 동안 유리 Coplin jar를 가득 ° c.
        참고: 메탄올과 아세톤 사용 하기 전에 적어도 30 분 동안-20 ° C에 저장 되어야 합니다. 고정, 후 슬라이드-20에 저장 될 수 있다 ° c. 주의: 메탄올과 아세톤은 유독.
      7. 항아리에서 슬라이드를 제거 하 고 그들을 사용 하기 전에 실내 온도 (RT)에서 건조 한 공기 보자.
    2. 얼룩
      1. 슬라이드에 석유 젤리의 얇은 층으로 고정된 벌레의 영역을 둘러싸고. 자리 표시 슬라이드의 아래쪽에이 주변 원을 그립니다.
        참고: 그것은 중요 한 젤리 원 얼룩 솔루션의 누설을 방지 하기 위해 얼룩 절차에 걸쳐 그대로 유지.
      2. 준비는 " 젖은 챔버 " 배치 하 여 뚜껑을 가진 플라스틱 상자에 종이 타 올 그것으로 젖은. 이 걸 슬라이드 배치 " 젖은 챔버 " 얼룩 동안 슬라이드의 건조를 방지 하기 위해.
        참고: 슬라이드 해서는 안 물 접촉 또는 서로와.
      3. 젤리 원형으로, 충분히 커버 영역을 부드럽게 약 50 µ L 1 x PBS를 플라스틱. 닫기는 " 젖은 챔버 " 뚜껑. 5 분에 대 한 RT에서 품 어
        참고:이 단계에서 벌레를 잃지 않으려면 할 하지 플라스틱 PBS 벌레에 직접. 부드럽게 피 펫 팁 원의 가장자리에 놓고 원활 하 게 벌레를 통해 분산을 액체 허용.
      4. 는 슬라이드를 기울기와 피 펫으로 PBS를 천천히 발음. 슬라이드 다시 평면 선반에 놓고 50 µ L (또는 자리를 충당 하기 위해 필요한 금액) 추가 차단 솔루션 신중 하 게. 15 분에 대 한 실시간에 젖은 실에서 이것을 품 어. 기다리는 동안, 차단 솔루션 기본 항 체 희석 (테이블의 자료에 대 한 1 차 항 체 농도의 예 참조).
        참고: 갓 1 x PBS (10 mL), 10% 트윈 (50 µ L), 분유 (0.2 g)를 사용 하 여 차단 솔루션을 준비 합니다. 세제와 우유의 농도의 양을 사용 하는 항 체에 따라 다를 수 있습니다 그리고 실험적으로 결정 될 필요가 있습니다. 슬라이드에서 액체의 포부는 쉽게 벌레를 잃고 또 다른 단계입니다. 해 범위에서 슬라이드를 검토 하 여 진행 상황을 확인 하지만 슬라이드 밖으로 건조 하지 않습니다.
      5. 는 슬라이드를 기울기와 멀리 차단 솔루션을 위에서 설명한 대로 같은 예방 조치를 사용 하 여 발음. 슬라이드 다시 평면 선반에 놓고 천천히 50 µ L 희석된 주 항 체 같은 예방 조치를 사용 하 여 추가 합니다. 닫기는 " 젖은 챔버 "와 하룻밤 또는 실시간에 짧은 기간 동안 4 ° C에서 품 어
        참고: 보육 시간 특정 항 체에 대 한 경험적으로 결정 해야 할 수도 있습니다.
      6. Aspirate 1 차적인 항 체 솔루션 다른 솔루션에 대 한 일에서. 다음 씻어 10 분 동안 차단 솔루션 슬라이드 3 번 추가 하 고 위에서 설명한 대로 같은 패션에는 솔루션 제거.
      7. 추가 보조 (붙일 표시) 항 체 희석 차단 솔루션, 1 시간에 대 한 RT에서 품 어. 테이블의 자료에 대 한 2 차 항 체 농도의 예를 참조 하십시오.
      8. 이차 항 체 및 세척, 위와 같이, 차단 솔루션 2 시간이 고, 10 분의 1 x PBS와 차단 솔루션에서 취소 제거.
      9. 떨어져 건조 하 고 젤리는 시료 주위를 조심 스럽게 제거 하 견본을 허용 하지 않고 가능한 많은 PBS을 발음.
      10. 한 방울 장착 매체는 견본에 추가 하 고 위에 coverslip을 부드럽게 장소. 매니큐어와 coverslip의 가장자리를 밀봉 하십시오. 얼룩을 보존 하 고 4에 저장 어두운 슬라이드 상자에서 슬라이드 배치 ° c.
        참고: 빛이 감도 때문에 어둠 속에서 슬라이드를 계속 (형광 시간과 함께 사라질 수 있습니다) 됐고, 같은 이유로 그들을 유지 하 여 공기 노출을 방지 하 고. 4 ° C 또는-20 시간의 연장된 기간에 대 한 슬라이드를 저장할 수 있습니다 ° c.

2. C. 선 충 내장에서 필수 tubulogenesis 유전자의 기능을 가진 방해. 예: RNAi.

참고: C. 선 충 종자 표준 프로토콜 29에 따라 NGM 접시에 시드 OP50 박테리아에 교양. RNAi에 대 한 C. 선 충 HT115 RNAi 박테리아 RNAi 접시 25 µ g/mL carbenicillin와 2mm IPTG (이소프로필 베타-D-1-thiogalactopyranoside)를 생성 하는 세균 발기인의 유도 대 한 보충에 먹이 두 배는 소개에서 RNA (dsRNA) 좌초 C. 선 충 유전자. 항생제와 IPTG 농도 RNAi 클론/라이브러리 및 원하는 RNAi 강도, 거동 특정 RNAi 클론에서에서 얻어질 수 있다 상업적으로 사용 가능한 게놈 넓은 RNAi (( 26 , 참조 하는 라이브러리를 먹이 따라 다를 수 있습니다. 30 , 31) 자료/시 약 및 RNAi 라이브러리에 대 한 C. 선 충테이블의 자료에서 RNAi를 먹이에 대 한 배경).

  • 먹이로 표준 RNAi
      26 , 31
      1. -80 ° C에서 RNAi 라이브러리 접시를 꺼내와 드라이 아이스에 넣어. 봉인 테이프를 제거 하 고 살 균 피 펫 팁을 사용 하 여 파운드 (Luria 국물) 한 천 배지 29 100 µ g/mL 암 피 실린 및 15 µ g/mL 항생물질 보충에 관심의 부착 박테리아를 전송. 한 천 격판덮개에 박테리아에 밖으로 행진입니다. 새로운 씰링 테이프와 RNAi 라이브러리 접시를 봉인. 37에서 하룻밤 박테리아 성장 ° c.
        참고:이 한 천 배지 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 주 동안. 새로운 박테리아 원래 RNAi 라이브러리를 보호 하기 위해 그들 로부터 직접 경작 될 수 있다.
      2. 다음 날, 1 mL 파운드 액체 매체 29 포함 된 50 µ g/mL 암 피 실린 각으로 파운드 한 천 배지에서 RNAi 박테리아를 예방 하 고 14 (8-18) h 흔들거나 37에서 하룻밤 ° c.
        참고: 최적의 결과 대 한 사용 하 여 신선한 박테리아 각 시간. 참조 다른 문화 조건 (예: 문화의 타이밍)의 비교에 대 한 참조 ( 30).
      3. 다음 날, 씨앗 200 µ L 당 별도 RNAi 접시에 교양된 RNAi 박테리아의. 접시 건조 및 세균 발기인의 유도 대 한 RT에서 하룻밤 둡니다.
      4. 전송할 각 RNAi 접시에 4-6 L4 단계 애벌레. 3-5 일 동안 실시간 또는 22 ° C에서 시드 RNAi 접시를 품 어.
        참고: RNAi, 방해 또는 직렬 전송 OP50 없이 새로운 NGM 접시에 세 번 부착 OP50를 제거 박테리아 없이 NGM 접시에 L4 애벌레를 먼저 선택 하십시오. -벌레에 대 한 선호 OP50 음식 처럼 오염 박테리아-도 RNAi와 방해로 긴장을 오염 하지 있는지 확인 합니다. 필요에 따라 온도 조정: 예를 들면 개발 가속 높은 온도; 긴장은 온도 민감한 있을 수 있습니다.
      5. 발달 연구에 대 한 확인 이후 하루 2에서에서 F1 자손의 고기.
        참고: 그것은 동물 모양 또는 표현 형 (예: 마커 변위)의 진행을 때 누락 방지를 자주 확인 하는 중요 한 개발 하는 동안 편광된 막 속 평가. F2 모집단 강한 고기 (예: 하루에 가장 강하게 영향을 그들의 자손의 중간 부분에 대 한 선택 하는 2 새로운 RNAi 접시에 부모 광고에 나온 것을 선택 하 여)의 농축은 스펙트럼 온화한에서 강한 이후 거의 필요 고기 바람직합니다.
    1. 조건부 RNAi
      참고: 감소, 또는 가벼운 효과, 증가 하거나 무대 특히 방해 RNAi 조건을 수정할 수 있습니다; 수정의 phenotypic 효력의 완전 한 평가 대 한 도움이 되는 자주 치명적인 tubulogenesis의 유전자
      1. 애벌레 RNAi-RNAi의 평가 효과 같은 세대 (온화 하 고, 무대 관련 RNAi)
        참고: RNAi에 유도 불 임 또는 배아 치 사 율을 극복 하기 위해 또는 특정 단계 게시물 embryogenesis 유전자 기능을 방해 하 애벌레, embryonically 게시. 치료 계란 (2.2.1.1) 벗 성인 (2.2.1.2) 장소 또는 L1 동기화 (또는, 원하는 경우, 나중 단계) 애벌레 (2.2.1.3)에 RNAi 접시; 예를 들어 2 일 후 이후, 같은 세대에 애벌레 또는 성인에서 RNAi 효과 평가 합니다. 하나로
        1. 선택 30-50 벗 성인 드롭 표백 솔루션 (10 M NaOH와 가정용 염소의 1: 4 솔루션)는 RNAi 접시의 가장자리에 배치. 건조 하 고 해치는 세균 잔디밭으로 이동 하는 L1s를 허용 하자.
          참고: 모든 것이 그들의 달걀 껍질에서 배아 죽 것 표백 솔루션, 오염 제거, 일반적으로 사용 됩니다. 따라서, 표백 솔루션 또는 RNAi 박테리아에 가까이 놓지 마십시오.
        2. RNAi 접시 고 그들 2-3 h에 대 한 알에 20 ~ 젊은 벗 성인 씨 또는 접시를 약 300 알 때까지 다음 성인에서 선택 선택.
          참고:이 메서드는 OP50에 의해 RNAi 박테리아의 오염을 발생할 수 있습니다. 이러한 위험을 줄이려면, 먼저 OP50 부착 벌레를 제거 박테리아 없이 NGM 접시에 성인 전송. 성인을 피하기 위해 배아에서 RNAi 효과 RNAi 접시에 너무 오래 체류 하지 않도록 돌.
        3. 선택 하거나 L1 단계 웜 RNAi 접시에 직접 (참조 ( 29)-동기화 프로토콜).
          참고: 하나 계란만 남을 때까지 대 한 M9 밀도가 접시에서 벌레 여러 번 세척 하 여 (예: 적당히 큰 규모 설정에 대 한) 하는 약식된 동기화 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 후 2-3 h L1s 부 화 다음이 플레이트에서 M9에서 수집할 수 있습니다, 추가 세척 (M9에 3 배), 박테리아를 제거 하 여 청소 하 고 RNAi 접시에 시드.
      2. 빈 벡터 RNAi 박테리아 (가벼운 RNAi) 희석의 RNAi 박테리아
        참고: dsRNA RNAi 박테리아의 양을 diluting 하 여 양을 감소 수 있습니다 온화한 효과 유도 하는 것 충분 하 고 또한 배아 치 사 율을 줄일 수 있습니다 없이 모든 배아 효과 폐지. RNAi 박테리아의 희석 유전자 상호 작용 실험 (예: 향상의 평가 대 한 온화한 효과 및 강한 효과 억제의 평가 대 한 생성)에 대 한 조건을 적정 하 고 더블 RNAi 실험에도 사용 됩니다.
        1. RNAi 및 그들을 성장pty 벡터 1 mL 파운드 매체 50 µ g/mL 암 피 실린와 함께 HT115 RNAi 박테리아 표준 RNAi 조건 일.
        2. 다른 농도의 예를 들어 5%, 15%, 30%, 50%, 70%의 범위를 달성 하기 위해 빈 벡터 RNAi 박테리아와 RNAi 박테리아 희석. 박테리아를 위아래로 pipetting으로 잘 섞는다. 200 µ L RNAi 격판덮개에 박테리아를 혼합 플라스틱.
        3. 각 RNAi 접시에 4-6 L4 애벌레를 선택합니다. 앞으로 하루 2에서에서 표현 형 검사.
      3. RNAi 민감한 긴장 (강한 RNAi)
        1. 사용할 수 RNAi 민감한 긴장, 예를 들면 에 리-1 (mg366), rrf-3 (pk1426) 또는 리-1 (mg366) 린-15B (n744) (후자 supersensitive), 사용 하 고 따라 2.1 31 , , 32 33에서 설명 하는 표준 RNAi 절차.
          참고: RNAi 민감한 긴장 (예: rrf-3에 리-1) 야생-타입 동물 보다 낮은 쪽 크기가 수 있습니다 및 25 ° c.에 살 균 수 그들은 또한 낮은 배경의 자신의 고기를 할 수 있습니다, 예를 들어 특정 RNAi 효과 평가할 때 고려 되어야 하는 침투 배아 치.

    3. 형광 현미경 검사 법을 해 부에 의해 선 충 C. 내장의 vivo에서 이미징

    1. 형광 조명 아래에서 동물을 시각화 하기 전에 체크 해 어떤 현미경에 밝은 빛 아래에서 RNAi 접시. 평가 (그리고 잠재적으로 기록) 고기 불 자손의 (낮은 번호), 임 치 등의 분석에 영향을 줄 수 있는 밝은 빛 아래에서 보이는 발달 (예: 애벌레 체포)와 도움이 될 수 있는 다른 보이는 고기 편광된 막 속 및 루멘 morphogenesis에 관련 된 유전자의 기능 특성.
      참고: 유일한 점수 접시 평가 (적어도 50)에 대 한 충분 한 자손, 그렇지 않으면 시도 대체 RNAi 조건. 양적 평가 대 한 번호판은 오염 되지 있는지 확인 하거나 OP50 (즉 RNAi 방해) 성장.
    2. 형광 조명 아래에서 동물을 시각화 하 뚜껑을 제거 하 고 직접 해 형광 현미경 RNAi 접시를 놓습니다.
      참고: 미묘한 장 고기를 감지 하나 필요 합니다 확대의 충분 한 범위를 허용 하는 더 높은 전원 스테레오 형광 첨부 해 현미경. 1.5와 목표, 확대/축소 범위는 3.5에서 45 ~ 10x 범위를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다.
    3. 우선 초점을 밝은 빛 아래에서 동물을 찾을. 낮은 확대 (예: 1.5 x 목표 아래), 형광 조명 아래에서 동물을 검사 다음, 적절 한 필터를 사용 하 여. 왼쪽 상단에서 체계적으로 스캔 고기에 대 한 전체 플레이트 오른쪽 아래에 접시를 검사.
    4. 관심의 동물을 선택 하 고 10 x 목표 변경. 소장에 집중 하 고 확대/축소를 사용 하 여 tubulogenesis/루멘 morphogenesis 표현 형 평가. 고기의 점수에 대 한 섹션 5를 참조. 먼저, 낮은 확대율에서 이미지를 가져가 라. 다음 높은 배율로 전환.
      참고: 이후 건강 한 동물 빨리 이동 하면서 다른 한 손으로 현미경 이미지 수집을 위한 컴퓨터 마우스에 한 손으로 신속 하 게, 작동 합니다. 동물 (예: 4 ° C에 번호판의 일시적인 배치에 의해) 둔화 수 없습니다 필요에 tubulogenesis 고기를 주로 사용 하는 것은 배아 초기 애벌레를 체포 하는 경우. 영상과 현미경에 장착 된 CCD 카메라에 의해 촬영 된 수 있습니다 이미지 캡처 소프트웨어.

    4. 레이저 confocal 현미경 검사 법 34 , 35를 스캔 하 여 높은 해상도에서 선 충 C. 소장 이미징

    1. 장착 및 동원 정지
      1. 사용 적은 양의 기름 또는 석유 젤리 원형에서 유리 슬라이드 (~ 6-8 mm 직경)에 얇게 확산 손가락.
        참고: 그리스 원의 두께 장착에 대 한 중요 한. 최고의 결과 이미지, 한 번에 하나 또는 여러 애벌레를 이미지 하 고 동물 직접 유리 슬라이드와 커버 슬립 사이 붙어 그런 가능한 작은 액체와 ultrathin 그리스 원 사용 (완벽 하 게 수행 하는 경우 동물 것입니다 될 움직일 수 없이 마 취)입니다. 장착의 계란 및 더 오래 된 동물의 요구을 커버 슬립을 추가할 때 샘플의 파괴를 피하기 위해 다소 두꺼운 원.
      2. 원의 중간에 일반적으로 3.5 µ L 10 m m 나트륨 아 지 드 솔루션의 한 방울을 추가 하 고 선택 해 현미경으로 웜.
        참고: 1 ml dH 2 O; 65.01 mg NaN3를 용 해 하 여 1 M 나트륨 아 지 드 재고 솔루션을 준비 20 mL M9 버퍼 솔루션이 1 M의 200 µ L를 추가 합니다. 방울을 건조 솔루션을 피하기 위해 나트륨 아 지 드 솔루션으로 신속 하 게 벌레를 선택 합니다. 더 큰 인구를 조사할 때 약 20 애벌레와 슬라이드 당 약 50 배아를 목표로 최적의 설치를 위해 별도로 단계를 선택 합니다. 하나는 배아를 따기 때 나트륨 아 지 드 솔루션 대신 M9 사용할 수 있습니다. 나트륨 아 지 드를 사용 하는 경우 동물이 독성 화학 물질의 조직 손상을 방지 하기 위해 30 분 이내 몇 군데 합니다.
        주의: 나트륨 아 지 드 이다 독성.
      3. 부드럽게 슬라이드 22 × 22mm coverslip 장소. 일 벌레를 분쇄 하지 않도록 주의 하십시오. 가벼운 압력을 사용 하 고 해 부 현미경 벌레는 슬라이드와 커버 슬립 사이 잘 고정 되도록 아래. 슬라이드 레이블.
        참고: 압력의 정확한 금액은 견본 (너무 많은 압력)을 손상 하 고 그것을 잘 고정 하지 않아도 중요 한 (너무 작은 압력: 슬라이드에 집착 하는 대신 플 로트 동물). 부동 동물은 본질적으로 적절 한 이미지를 배제.
    2. 이미징
      1. confocal 현미경 장소 슬라이드. 10 배 목표와 벌레에 대 한 검색.
        참고: 초점에 밝은 빛을 사용 하는 photobleaching을 피하기 위해 가능한.
      2. 변경 또는 100 x 60 x 목표와 소장.
        참고: 소장 식별할 수 있습니다 쉽게 밝은 빛 아래에서 꼬리의 끝 근처 항문 인 두에서 동물의 중간을 통해 실행의 루멘으로. 60 x 100 x 오일 목표에 석유를 적용할 때 주의 해야 합니다. 오일의 종류를 혼합은 더 이미징 방해할 수 있습니다. 석유 슬라이드를 똑바로 현미경을 사용 하는 경우 또는 다른 목표 또는 현미경의 부분을 오염 하지 않도록 주의 복용 거꾸로 범위를 사용 하 여 목표의 장소 작은 방울.
      3. 36를 검색 하는 데 사용할 목적에 대 한 설정 Kohler DIC/Nomarski 조명. 동물 내장의 라벨을 확인 및/또는 표현 형, 이미징에 대 한 적당 한 견본을 선택 하기 위해 확인 하는 적절 한 채널 형광 조명 아래에서 검사 합니다. 표백 하지 않도록 신속 하 게 작업.
      4. 스위치 레이저 스캐닝 검색의 등 쪽과 복 부 측면에서 경계를 설정 하 여 소장에 미래의 이미지를 제한 하.
        참고:이이 방법으로 내장을 Bracketing fluorophore는 또한 소장 외부 구조를 레이블 경우 중요 합니다. Av에 빠른 검색 조건 사용이 파일럿 검사 중oid photobleaching.
      5. 실험에 대 한 검색 매개 변수를 선택 하려면 검색을 중지 합니다. 문의 동물 및 기술 고려의 단계에 따라 0.2 µ m 간격으로 z 축 장 검사, 예를 들면 6-20 섹션을 설정 합니다. 프레임 라벨의 복잡성에 따라 이미지 당 평균 설정 하 고 필요한 소음을 줄이기 위해 해상도.
        참고: 세부 내용을 설정 따라 현미경 그리고 실험. 하나는 표백 세 다른 fluorophores의 순차 검색을 수행 하는 경우를 방지 하려면 섹션의 양을 줄이기 위해 할 수 있습니다. 프레임 수 (이미지 왜곡을 피하기 위해 섹션의 수 보다는 더 낮은, 또한 photobleaching의 증가 무게 이어야 한다) 섹션의 수를 조정 합니다. 4-6 프레임은 일반적으로 충분 한.
      6. 검색 조건 확정 (느린) 레이저 스캔에 다시가 고 조정: 밝기 (배경을 줄이기 위해 사용 최소 이득); 레이저 출력 (필요, 낮은 가능-증가 photobleaching 높은; 일반적으로 최소 설정 하다); 작은 구멍 (오프닝 방지 하지 않을 경우, 해상도 유지 하는 데 필요한).
        참고: 검색 조건 견본에 따라 고 검색 세션의 시작 부분에 실험적으로 결정 될 필요가 있다. 명도 채도 (이미징 소프트웨어에 의해 연속적으로 이미지를 수정 하는 기능을 제한할 것 이다)를 초과 하지 않는 다는 것을 확인 하십시오. 검색 조건 설정, 또한 때는 동일한 조건 모든 이미징 컨트롤 실험 동물을 비교 하는 실험에 사용 해야 합니다.
      7. 캡처 이미지 시리즈입니다. 이미지를 단일 프로젝션 이미지를 병합할.
        참고: 프로젝션 이미지 또는 오버레이 현미경에 따라 별도로 저장 해야 할 수 있습니다.
      8. 다중 채널 이미지를 찍을 때 사용 하 여 순차적 검색 채널 (공동 지역화 연구에 대 한 중요 한) 사이 도련 통해 피하려고.
        참고: 이미지 설정 수 있습니다 변경할 필요가 증가 photobleaching 이상에 연결 된 주어진 시간 검색.
      9. 항상 랜드마크 스캔된 동물의 형태학의 전반적인 상태에 대 한 해당 DIC/Nomarski 이미지 (섹션)을 취득.

    5. C. 선 충 창에 편광된 막 속의 정량화 결함

    참고: 예: 하자-767에 의해 유도 된 꼭대기 음-1::GFP 및 소성 측면 루멘 형성의 Basolateral 변위 및 ap-1 RNAi.

    1. 점수에 대 한 정의 범주 ( 그림 5 A, D, E) 해 현미경 고기 점수
        . 예: (i) 야생-타입 (WT), (ii) basolateral 변위 (basolateral 변위 후속 개발) 음-1::GFP (극성 결함), 및 (iii) 소성 루멘 형성.
        참고: 낮은 확대 시각적 분석 또는 특정 phenotype 없이 동물의 숫자를 점수에 빌려준다. 여기, 우리는 분석은 극성 표현 형의 악화의 동일한 시간 지표에 있는 3 개의 질적으로 다른 phenotypic 종류의 예를 선택. 그러나, 다양 한 다른 질적 및 양적 고기 수 득점, 루멘 morphogenesis 결함, 부재/존재 (또는 숫자)의 GFP 긍정적인 세포질 그들, 루멘 직경 및 크기 또는 intralumenal cysts의 번호 등 (참조 < 강력한 클래스 "xfig" = > 그림 3에 대 한 예).
      1. 실험의 중복 또는 triplicate 집합에서 예상된 차이의 크기에 따라 점수 해 현미경 아래에서 그들의 천 판에 약 100 라이브 웜.
        참고: 하나 해야 점수를 보기에 온다 때 접시를 체계적으로 검색 예: 낮은 접시의 오른쪽 상단 왼쪽에서 모든 동물 (벌레는 채워지는지 확인 번호판 균등).
      2. 반복 실험의 3 독립적인 세트에 대 한이. 막대 그래프를 생성 하 고 결과의 의미를 평가.
    2. Confocal 현미경 ( 그림 5 B) 득점 고기
      1. 득점, 소성 루멘 동물의 수에 대 한 범주 정의
        참고: 높은 확대 비주얼 분석 정량 마커 또는 동물 당 형 점수를 고 해 부 현미경으로 인지할 수 있습니다 subcellular 마커의 득점 있습니다. 동물 해 부 현미경 (5.1.1, 카테고리 3)에 의해 평가 이전 같은 실험의 벌레의 하위 집합에서 소성 루멘 계산의 현재 예 여기 검사 악화 극성 표현 형의 평가 통해 생생한. 그러나, 다양 한 다른 고기 또는 매개 변수 수 있다 득점, 소포, 존재 또는 휴무 또는 공동 지역화, 형광 강도 subcellular 부품 수의 수 (ImageJ로 후자 계량; 종이 함께 참조는 배설도) 2.
      2. 예상된 차이의 크기에 따라 계량 phenotypic 마커 (여기, 소성 루멘) confocal 현미경 실험의 중복 또는 triplicate 세트에 약 20 동물에서.
      3. 3 독립에 대 한 반복 실험의 세트. 막대 그래프를 생성 하 고 결과의 의미를 평가.
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    Representative Results

    이 프로토콜 분자로 분석 하 고 단일 세포 및 subcellular 수준에서 선 충 C. 내장에서 편광된 막 속 및 루멘 morphogenesis 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 20-셀 단일 레이어 C. 선 충 장 감독된 세포 분열 및 중앙 embryogenesis 동안 마이그레이션에 의해 형성 된다. 도메인 설치 되 고,이 시간, 편광 막 아직 드 노 보 에서 편광된 막 속에는 성숙한 계속 하지만 편광 분석에 초점을 수 있도록 성인 기까지 4 개의 애벌레 단계에 걸쳐 상피를 확대, 막 속 (그림 1A)

    C. 선 충 세포 및 subcellular 구성 요소를 시각화 하려면 두 가지 일반적으로 사용 됩니다: 면역 형광 (에 대 한 자세한이 프로토콜 섹션 1; 그림 2 , 그림 4D -F) 그리고 형광 융합 단백질 (배설 운하 편광 막 속2;에 동반 종이에 자세히 표현 그림 1B, 그림 2, 그림 4, 그림 5C). 이중 및 다중 라벨, 결합 각 또는 두 메서드의 다른 레이블을 해결할 수 막 asymmetries 같은 꼭대기 basolateral 막 도메인, 및 (그림 2, 서로 다른 subcellular 컴포넌트의 관계 그림 4D-E). 막 골격 링커 ERM 1::GFP 표시이 단일 계층화 상피에 루멘 morphogenesis 일치 꼭대기 막 속의 지표로 서 여기. 이 마커를 사용 하 여 장 꼭대기 막/루멘 속 결함 및 그들의 원인이 유전자 결함의 배열 식별할 수 있습니다 손실의 기능 연구에 의해 예를 들어 RNAi를 사용 하 여 편견된 게놈 넓은 스크린 (RNAi 방법을 채택 하는 같은 고기의 세대는 설명이 프로토콜의 섹션 2에서에서). 그림 3그림 4 꼭대기 막/루멘의 저 중 확대 이미지의 예를 보여 속 고기 인수 해 형광 현미경을 갖춘 고성능 목표; 그리고 더 높은 확대의 이미지 인수 confocal 레이저 스캔 현미경 (현미경 방법 3 및 4 섹션에서 설명). 편광된 막 속 결함, 하자-767 (스테로이드 효소/3-ketoacyl-CoA reductase 인코딩)으로 RNAi의 효과 측정의 예를 들어 ap-1 (인코딩 clathrin AP-1의 시그마 소 단위 어댑터) ERM-1::GFP에 지역화 및 루멘 위치 그림 5에 나와 있습니다.

    Figure 1
    그림 1 : 세포 및 subcellular 구조와 morphogenesis 야생-타입의 C. 선 충 소장. (A) C. 선 충 장 개발, 세포, 그리고 엔도-구성과 플라즈마 세포 막의 구조. C. 선 충 장 clonally 8 세포 단계에서 태어난 E blastomere에서 생성 됩니다. 4 라운드 후의 세포, 그것의 16 (E16 단계) 형태15radially 대칭 두 배 층이 된 상피 세포. 이 단계에서,에서 하는 각 셀의 세포질, 핵 반대 쪽으로 이동 미래 꼭대기, 및 세포질 구성 요소 이동으로 (미래 기초), 막 도메인. 한 윤 단계에서 왼쪽 및 오른쪽 복 부 셀 이동 (병렬로) 등 셀 레이어로 9 INT 반지의 양측 대칭 튜브를 형성. 각 셀의 얼굴과 그 꼭대기/lumenal 막으로 루멘을 빌드 (녹색, 특정 막 microdomains, microvilli로 구조적으로 구분) 및 첫 번째를 제외 하 고 셀 또는 그것의 basolateral 막 (파란색)와 신체 구멍 이웃 연락처 4 개의 세포에 의해 형성 되는 INT 반지. 꼭대기 접합 (레드) 꼭대기와 basolateral 막 도메인을 구분합니다. 윤, 후 데 노 보 막 속 계속 성인,으로 늦은 embryogenesis 및 4 개의 애벌레 단계 동안 내장의 성장과 함께 최소한의 추가 성장 발생 (편광된 막 유지 관리의 단계 ). 확대 된 단일 셀 핵 (N)와 endosomal 소포 위에 ER와 Golgi endomembrane 시스템을 나타냅니다. (B) DIC/Nomarski 고 꼭대기 막-골격 표시 음-1::GFP와 함께 표시 하는 개발 C. 선 충 장의 confocal 오버랩 현미경. 흰색 선으로 설명 하는 쉼표로 단계에서 소장 (음-1::GFP 윤의 맨 꼭대기 막에서 이미 희미하게 표현 하지만이 이미지에서 인정 될 수 없습니다). 동물 여기 고 앞쪽 (머리) 왼쪽으로 표시, 후부 (꼬리) 바로, 등 위쪽, 복 부 아래 아래. 눈금 막대: 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 2
    그림 2 : 더블, 트리플 야생-타입 개발의 라벨의 예 C. 선 충 항 체 융합 단백질을 사용 하 여 내장. (A, B) 배아입니다. (A) 쉼표 무대. 파-6::GFP (그린, 복잡 한 꼭대기 파 극성의 구성 요소), 반대로 PAR 3 항 체 (레드/TRITC (tetramethyl rhodamine isothiocyanate), 복잡 한 꼭대기 파 극성의 다른 구성 요소), 그리고 MH33 (블루/Cy5 (Cyanine5), 안티-IFB-2/중급 필 라 멘 트)입니다. 파-6::GFP와 파 3 항 체 (괄호) C. 선 충 장의 꼭대기 막 레이블을. IFB-2, 나중 단계에서 또 다른 꼭대기 마커는이 초기 단계에서 지역화 된 panmembraneously. 파-6::GFP 안티 PAR 3 또한 레이블 인 두 (왼쪽); 창 자 루멘 IFB-2 (청록색) 그들의 중복으로 표시 되 고 장 튜브 블루 안티-IFB-2 (오른쪽)에 의해 설명 되어있습니다. (B) 2-fold 무대. AJM-1::GFP (그린, 연결 구성 요소), ICB4 항 체 (레드/알 렉 사, ICB4 알 수 없는 membraneous 장 항 원 검출). AJM 1::GFP 레이블 소장의 C. 선 충 , peri lumenal 사다리 패턴으로 보이는 꼭대기 접합 (그것은 또한 hypodermal 접합 레이블; 이미지부터 보이지 않는에 초점을 맞추고 소장 참조 4, confocal 영상). ICB4 선 충 C. 내장의 모든 막 얼룩. 화살표는 basolateral 막 안티-ICB4에 의해 스테인드 가리킵니다. (C, D) L2의 애벌레 (C) 하자-413::GFP (녹색), phalloidin (레드/텍사스-레드, F 걸에 바인딩 phallotoxin) 및 MH33 (블루/Cyanine5, 안티-IFB-2). 하자-413/낙서 복잡 한 기저 극성의 구성 요소 이며 (괄호) 선 충 C. 내장의 basolateral 막 localizes. Phalloidin 및 IFB-2 항 체 (보라색) C. 선 충 장의 꼭대기 submembraneous 골격 레이블을. Phalloidin 또한 강력 하 게 몸 벽 근육, 압도적인 장 얼룩 얼룩. 삽입 된 박스형 영역의 높은 확대를 보여줍니다. (E) L3 유 충. SLCF-1::GFP (녹색; 정수 계열 membrane 구성 요소/설탕 운송업 자), 음-1::mCherry (빨강)와 MH27 항 체 (블루/Cyanine5, 안티-AJM-1). SLCF 1::GFP 레이블 basolateral 막 음-1::mCherry 레이블 (괄호); C. 선 충 장의 꼭대기 막 하면서 AJM-1 라벨의 꼭대기 접속점. (F-F' ') L2 애벌레입니다. (F, F') 단색 이미지입니다. SLCF-1::GFP (녹색) 라벨 basolateral 막 (옆 막 얇은 흰색 화살표로 표시). MH27 (블루/Cyanine5) 레이블 꼭대기 접합 (짧은 노란 화살표). (F"F' ') 오버레이 이미지와 걸 없이. 인세트 박스형된 분야의 더 높은 배율을 표시합니다. 참고 단일 컬러 이미지 (F, F')에 표면으로 유사 하 게 나타납니다 이러한 다른 막/접합 마커에 의해 창 자 세포의 apicolateral 각도의 명확한 구별. F에 두꺼운 흰색 화살표' '(그렇지 않으면 압도 하 여 근육 걸) phalloidin에 의해 표시 된 꼭대기/lumenal 걸 골격을 가리킨. 모든 이미지는 confocal 계획 (z-의 스택을 0.2 µ m), 채널간 도련 통해 피하려고 순차적 검색에 의해 인수. 스케일 바 (A-E, F-F에 대 한 ' ' 그리고 모든 인세트): 5 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 3
    그림 3 : 예 C. 선 충 장의 편광된 막과 루멘 morphogenesis 저 중 확대 (형광 현미경을 해 부)에서 결함. 모든 이미지는 주문 품 고 출력 스테레오 형광 첨부 파일 (자료 테이블)를 장착 해 형광 현미경으로 획득 됩니다. 다른 확대 표시 됩니다. 모든 고기는 음-1::GFP (배아 및 초기 애벌레 단계, 여기에서 장 고 배설 운하 꼭대기/lumenal 막에 지역화)으로 표시 하는 스트레인에 다른 유전자를 가진 RNAi에 의해 얻은 했다. 창 자 루멘 및 극성 고기는: (A, B) 야생 타입 배아 (A)와 애벌레 (B); 음-1::GFP;의 basolateral 변위 (C, D) 장 세포 확대는 나타나고 부풀어이 배아에서 (C, 화살표 가리킵니다 단일 장 셀), 하지만 야생-타입 크기 및 배열에 이러한 애벌레 (D, 측면 막 INT II 및 III 사이 화살표 포인트); (E) 확대 및 루멘 3 배아;에 뒤 얽힌 (F) 음-1::GFP GFP 네거티브 그들 (화살표);를 포함 하는 창 자 세포질와 측면 접합 지역 (지그재그 루멘)로 확대 (G) lumenal cysts inbetween intralumenal 유착 (두 cysts에 화살표 지점). (H) Cytoplasmic 그리고 basolateral ERM 1::GFP 변위와 소성 루멘 (화살표); () 음-1::GFP 세포질에 GFP-긍정적인 puncta (화살표)을 치환입니다. 배설 운하와 배설 운하 고기 여기 설명 하지 않습니다 (운하는 모든 이미지에 오른쪽, 왼쪽된 창에 표시 됩니다). 스케일 바: 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 4
    그림 4 : 예 C. 선 충 장의 편광 막과 루멘 morphogenesis 결함 높은 확대 (confocal 이미지). (A, C, E, G, I, K) 배아입니다. (B, D, F, H, J, L) 애벌레입니다. 모든 고기는 음-1::GFP (모든 이미지에서 녹색)으로 표시 하는 스트레인에 다른 유전자를 가진 RNAi에 의해 얻은 했다. 영상 소장에 집중 된다. 배아의 이미지는 또한 배설 운하 (왼쪽 이미지), 운하 고기 (설명 되지 않은)를 포함 하 여 표시 합니다. (A, B) 강포한 유형 태아 (A) 그리고 애벌레 (B). (C) 꼭대기 음-1::GFP (쉼표 단계; 늦게 윤)의 Basolateral 변위. (D) 극성 변환: 꼭대기 음-1::GFP과 basolateral ICB4, 이중 라벨에 의해 계시의 꼭대기 축적의 basolateral 변위. F-말라 (phalloidin-TRITC에 의해 표시 된) 경도 근육 번들 (동물 이다 라는 트리플)을 착 색 하 여 동물을 설명 합니다. (E) 음-1::GFP의 늦은 3 배아 Basolateral 변위. 꼭대기 IFB-2 항 체 (블루/Cyanine5) 그대로 루멘 나타내고 peri lumenal 중간 필 라 멘 트. (F) 소성 루멘 안티-IFB-2 (블루/Cyanine5)으로 분류. (G) 음-1::GFP 장 세포질에서 그들 네거티브. (H) 장 세포질에 ERM 1::GFP 긍정적인 그들. (I, J) 배아와 애벌레, 루멘의 각각. (K) 다양 한 용기입니다. (L) 낭 성 고 뒤 얽힌된 창 자. (A, D, H, I, J, K, L) confocal 예측. (B, C, E, F) confocal 섹션이 있습니다. 밝기는 세포질 GFP 부정적인 그들을 강조 하기 위해 G 에 증가 되었다. 스케일 바: 10 µ m (같은 모든 배아 및 애벌레, 각각). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    Figure 5
    그림 5 : 장의 극성 변환 및 복구: 편광된 막과 루멘 속 결함의 정량화에 대 한 예. (A, B, C) 하자-767aps-1두 RNAi 원인이 음 1::GFP basolateral 변위 (BL) 과 소성 루멘 형성 (엘), 하지만 서로 다른 발달 단계에서. 해 부 현미경에 의해 (A) 정량화: RNAi 접시에 벌레를 뿌리기 후에 2 일 극성 고기와 배아 (왼쪽)와 애벌레 (오른쪽)의 계산. 그러나 참고:이 시간에 모든 모 및 let-767(RNAi) 동물 부 화는 (따라서 했다,, 모든 야생-타입 극성; 없는 배아는 고장 선 열). ap-1 RNAi 하자 767RNAi 애벌레에 그들을 유도 하는 반면 배아에 이미 극성 결함을 유도 합니다. Ap-1RNAi 태아 애벌레 대에 소성 루멘 (vs basolateral 변위)의 더 높은 백분율 소성 루멘 배아의 체포 때문 이다. Confocal 현미경 검사 법에 의해 부 량 (B): 소성 루멘 애벌레에 소성 루멘 개발의 시작에서 동물의 세. 하자-767 RNAi 유도 ap-1(ap-1RNAi 애벌레는 "escapers" arres 하지 않은 RNAi 보다 애벌레에 더 소성 루멘배아로 테드). 야생-타입 애벌레와 애벌레 ERM 1::GFP basolateral 변위 (BL)와 소성 루멘 (엘); (C) 공초점 이미지 눈금 막대: 5µm. (D, E) 극성 복귀 하자 767RNAi 동물 (와 극성 결함 [BL/엘] 없이 동물의 해 부 현미경 하 여 계산). 온화한 소성 루멘 고기 20 let-767(RNAi) 동물 하루에 4 OP50 플레이트는 RNAi 플레이트에서 전송 하 고 40 시간 후 평가 했다. (D) 보다 50% 애벌레 야생-타입 극성 (꼭대기 막 음-1)로 되 돌. (E)의 20% 동물 L1 애벌레 단계 (L1 체포에서let-767(RNAi) 결과) 넘어 성장 하는 있다. 모든 데이터 의미 SEM, +로 표시 됩니다 n = 3. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

    C. 선 충 애벌레와 성인 장 막 시스템에 대 한 마커의 표 1: 예1.
    단백질 이름 Subcellular 지 방화 단백질 구조/기능 상업적으로 사용할 수 있는 선 충 C. 특정 항 체 (DSHB2) 종자는 CGC에서 사용할 수의 예
    선택-2/PEPT 1 꼭대기 막 횡단 단백질 펩타이드 전송 KWN246 (pha-1(e2123) III, rnyEx133[opt-2(aa1-412)::
    GFP) + pha-1(+)]
    )
    AQP-4 꼭대기 막 횡단 단백질 물 채널
    음-1 꼭대기 brushborder 막-골격 링커 ERM1
    법-5 꼭대기 brushborder 세포질 말라 (3)
    IFB-2 꼭대기 brushborder 중간 필 라 멘 트 구성 요소 MH33
    EPS-8 꼭대기 brushborder human-epidermal-growth-factor-receptor-kinase-substrate-8 ortholog
    파-6 꼭대기 막 꼭대기 극성 복잡 한 구성 요소
    SLCF-1 basolateral 막 횡단 단백질 monocarboxylate 전송
    AQP-1 basolateral 막 횡단 단백질 물 채널
    하자-413 basolateral 막 낙서 homologue, 어댑터 및 극성 결정 LET413
    HMP-1 꼭대기 접합 (CCC4) Α-catenin, cadherin-catenin 복잡 한 구성 요소 FT1609 (unc-119(ed3) III; xnIs528 [hmp-1p::hmp-1::
    GFP + unc-119(+)]
    )
    HMR-1 꼭대기 접합 (CCC) E-cadherin, cadherin-catenin 복잡 한 구성 요소 HMR1
    AJM-1 꼭대기 접합 (DAC5) 연결 무결성 분자, DLG-1/AJM-1complex 구성 요소 MH27 SU159 (jcEx44 [ajm-1::GFP + rol-6(su1006)])
    DLG-1 꼭대기 접합 (DAC) 디스크-대형 homologue MAGUK 단백질, DLG-1/AJM-1complex 구성 요소 DLG1
    랩-11 endosomal 소포 밀매6 RT311 (unc-119 (ed3) III; pwIs69 [vha6p::gfp::rab-11, Cbunc-119(+)])
    랩-5 endosomal 소포 인신 매매 RT327 (unc-119 (ed3) III; pwIs72 [pvha6::gfp::rab-5, Cbunc-119(+)])
    랩-7 endosomal 소포 인신 매매 RT476 (unc-119 (ed3) III; pwIs170 [vha6p::gfp::rab-7, Cbunc-119(+)])
    랩-10 endosomal 소포 인신 매매 RT525 (unc-119 (ed3) III; pwIs206 [pvha6::gfp::rab-10 Cbunc-119(+))
    마르스 골 지 Α-mannosidase II RT1315 (unc-119 (ed3) III; pwIs503 [pvha6::mans::gfp Cbunc-119(+)])
    1 예는 Table3에 나열 된 리소스에서 선택 됩니다.
    2 발달 연구 Hybridoma 은행입니다.
    3 척 추가 있는 걸에 대 한 항 체 cross-react.
    4 CCC: cadherin-catenin 복잡 한; localizes 꼭대기 접합;의 꼭대기 부분에 외화 접합 (AJ)에 대응합니다.
    5 DAC: DLG-1/AJM-1complex; 꼭대기 접합;의 기저 부분에 localizes 꽉 접합 (TJ)에 대응합니다.
    6 추가적인 소포 관련 분자는 소장에 표현에 대 한 심판 (22)를 참조 하십시오.
    참고: 모든 분자 융해 단백질 항 체에 의해 또는 그들의 자신의 발기인으로 테스트 되었습니다.
    표 2 : 예 C. 선 충 장 특정 발기인 및 표현의 시간1.
    발기인 식 단계
    영어 교육-2 식 2 E 셀 단계 시작 하 고 성인으로 계속
    vha-6 식 후반 태아에서 시작 하 고 성인으로 계속
    릿지 1 식 약 4E 세포 단계에서 시작 하 고 성인으로 계속
    끝-1 식 1E 세포 단계 후에 시작 하 고 나중에 embryogenesis 동안 거부
    1 예는 표 3에 나열 된 리소스에서 선택 됩니다.
    테이블 3: 찾을 리소스 C. 선 충 내장-특정 분자, 항 체 및 시 약/종자 라벨.
    1. 꼬마 유전학 센터 (CGC)42 사용 가능한 시 약 및 긴장에 대 한
    2. Wormbase43 장 특정 분자, 긴장 및 항 체에 대 한 내용은
    3입니다. 정보
    내장-특정 분자20,44 에 대 한 기 4. Transgeneome 웹사이트45 변환 GFP 융해 구문에 대 한 5입니다. C. 선 충 식 패턴46 transcriptional GFP 융해 구문에 대 한 6. 국가 유관 프로젝트 (NBRP)::C.elegans47 장 특정 발기인에 대 한 정보 7. 발달 연구 Hybridoma 은행 (DSHB)48 C. 선 충 항 체에 대 한 8. 2 차 항 체와 염료 참조 참조27,28

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    Discussion

    이 프로토콜 표준 기능 손실 유전/RNAi 및 이미징 (라벨 부착 및 현미경) 접근 시각과 분자 해 부 의 생체 조건에 대 한 모델로 C. 선 충 장 상피의 활용을 결합 하는 방법을 설명 합니다. 편광된 막과 루멘 속.

    라벨

    이 프로토콜은 항 체 얼룩이 지기에 초점을 맞추고. 제자리에서 항 체에 의해 라벨 라벨 형광 성 융해 단백질 (배설도 막 속에 동반 종이에 설명)2에 의해 매우 구체적인 대체 접근 방식입니다. 비록 항 체 얼룩이 라이브 이미징 허용 하지 않습니다, 그것은 (어느 라벨 방법은 실패 하지 않고) 관심사의 단백질의 지역화에 대 한 확인을 제공할 수 있습니다. 또한, morphogenesis 또는 단백질의 subcellular 지 방화에 관한 질문 종종 고정 동물에서 평가 수 있습니다. Immunostaining는 이중 및 다중 라벨에 유용 하 고 필요한 고정 및 permeabilization 절차를 통해 보존 될 수 있습니다 이러한 경우 형광 성 융해 단백질에 의해 라벨와 함께 결합 될 수 있다. 여기 명시 된 프로토콜은 일반적으로이 (그림 2)를 허용합니다. 항 체 또는 화학 얼룩에 의해 고정 된 동물의 라벨 제자리에서 제공할 수도 있습니다 장점 해상도 대 한 폭풍 (stochastic 광학 재건 현미경) 같은 미세한 기술. 면역 형광 내 인 성 항 원, 감지 하 고 적응 시킬 수 있다, 예를 들어, 특정 posttranslational 단백질 수정 구별 하. 그것은 결과가 발생할 수 있습니다 빠른 항 체 사용할 수 있는 경우, 한 번 현장에 얼룩 기법-아니라 간단 C. 선 충 표본 세포 배양-에서 설립 되었습니다.

    (그러나 하지 여기에 설명 된) 새로운 항 체의 생성은,, 시간이 많이 걸리는. 불행히도, 선택 상용 C. 선 충 의 주요 항 체 남아 오히려 작은, 그리고 모든 현장에서 항 원 검출 수 있습니다 (참조 1 항 체의 예를 설명에 대 한 검색 장 항에 현장에서및 추가 리소스에 대 한 3 ). 척 추가 있는 항 원에 대해 생성 하는 대부분 항 체 그들의 선 충 C. homologs과 cross-react 하지 것입니다. 이차 항 체의 선택 (일반 면역 형광 검사 프로토콜27,28에서 설명) 첫 번째 항 체의 종 계정에 취해야 합니다. 대형 선택 형광 염료 (예를 들어 알 렉 사 Fluor 염료)을 지속적으로 향상으로 상업적으로 사용할 수 있습니다. 얼룩이 최적화에 대 한 염료 현미경 이미징, 예를 들면 confocal 현미경, 레이저 사용에 맞게 자신의 능력에 대 한 선택할 수 있습니다 또는 계획 하는 경우 슈퍼 해상도 현미경은 또한, 그들의 능력을 "블 링크"37에 대 한. 직접 붙인된 주 항 체 또는 화학 얼룩 (예: 붙일 phalloidin 분류)도 사용할 수 있고 특히 이중 얼룩을 분석 하는 데 유용.

    제자리에서 항 체 얼룩이 C. 선 충 에 대 한 어려움은 배아의 달걀 껍질과 두 조직에 항 체에 대 한 액세스를 허용 하도록 화학 및 기계적 중단 필요 애벌레/성인 표 피의 불 침투성 이다. 복잡 한 액체 항 체 얼룩 프로토콜이 문제27,28을 극복 하기 위해 개발 되었습니다, 하지만 대부분 permeabilization, 대상 조직을 손상 하는 경향이 대 한 콜라를 포함. 반면, 동결 균열 방법을 여기에 설명 된 벌레의 손톱 또는 알 껍질을 열고 간단한 방법입니다. 그것에 직접 실행 된다 유리 슬라이드는 표본 수집 되어 (그리고 나머지는 얼룩도 수행), 그리고 특히 계란과 애벌레에 대 한 작품을 유리 슬라이드 (즉, 단계에 주로 검사를 최고의 스틱 tubulogenesis 연구)입니다. 그것은 또한 fluorophore 표시 된 융해 단백질의 보존을 방해 하지 않습니다. 기술 (flicking) 전에 coverslip에 정확한 압력으로 일부 수동 손 재주를 요구 하 고 전단 압력의 회피는 (로 부드러운 핸들링과 전체 얼룩 절차 동안 pipetting)는 견본을 보존 하기를 위한 중요 한.

    고정 조건 경험적으로 결정 하 고 구조/항 (논의27에서) 스테인드 될 것에 대 한 조정 해야 합니다. 온화한 (예: 포 름 알 데히드 기반) 고정 기법이 morphogenesis의 분석에 대 한 중요 한 조직 형태를 유지 하는 필요와 균형을 해야 비록 antigenicity을 유지 더 나은 수 있습니다. 온화한 고정 조건 또한 이중 라벨 실험에서 형광 성 융해 단백질을 보존 하는 데 도움이. 마찬가지로, 차단 에이전트 (예: 우유 또는 소 혈 청 알 부 민/BSA) 및 세척 솔루션에 세제의 양을 특정 얼룩과 배경 균형을 경험적 조정이 필요 합니다. 면역 형광 검사 기술의 일반적인 측면, 예를 들어 다른 얼룩 기법 토론, 적절 한 컨트롤, 그리고 벌레 창 (예: 창 최소화에 대 한 이러한 절차를 최적화 하기 위한 팁의 디자인에 대 한 내용 일반에 걸쳐 참조로 선 충 C. 특정 면역 형광 검사 프로토콜, autofluorescence)을 찾을 수 있습니다.

    유전자 기능 및 tubulogenesis 고기의 평가와 간섭

    이 프로토콜 하이라이트 특정 RNAi 방법을 초기, 필수 및 유비 쿼터 스 기능으로, 대부분 tubulogenesis 유전자 (우리의 게놈 전체에 대 한 경우 처럼 그 부분 (보다는 오히려 완전 한) 손실을 가장 유익 하다 유전자를 평가할 때 유용 합니다. ERM에 스크린-1::GFP-레이블된 창 제안 그 방해가 같은 유전자 원인 >이 특정 설정12의 모든 유익한 tubulogenesis 고기 들의 90%). C. 선 충 유전자 조작에 대 한 제공 하는 많은 장점 (예: 그것의 짧은 생성 시간)와 (기능/형으로 시작 하는) 앞으로 유전자 기능을 교란 하 고 반전에 다른 접근 (시작는 일반에서 유전자) 유전자 접근 설명 C. 선 충 문학31,38. 상업적으로 사용 가능한 게놈 넓은 RNAi 라이브러리를 또한 먹이의 가용성 기술을 사용 하 여이 역 유전자는 앞으로 유전자 검사 도구 수 (리소스에 대 한 재료의 표 참조). Tubulogenesis의 분석을 위한 RNAi의 구체적인 장점을 포함 능력: 다양 한 돌연변이 유전자 시리즈 (보통이 작품 잘 복용량 의존 morphogenesis 유전자에 대 한);에 해당 고기를 생성 하 (초기 morphogenesis/tubulogenesis에 일반적으로 참여); 모성 RNAs를 제거 하려면 특별히 무대를 (postmitotic 애벌레 성장 하는 동안 편광된 막 속에서 효과 평가 하기 위한 유용한)을 방해 합니다.

    심판 (26, 에서 RNAi 절차의 일반적인 측면에 대 한 내용은 설명s = "외부 참조" > 31). 치명적인 tubulogenesis 고기의 분석에 대 한 키 고기의 스펙트럼을 증가 하기 위하여 RNAi 조건을 조절 하는 기능입니다. 정보 tubulogenesis 고기 일반적으로 소장 관련 RNAi 긴장39에 대 한 필요 없이 야생-타입 백그라운드에서 생성할 수 있습니다. 그러나, 이러한 긴장 사용할 수이 실패 되며 셀-자치 자치 비 효과에서 구별 하는 데 사용 수 있습니다. RNAi의 강도 변조에 대 한 다른 접근 보고 되었습니다, 예를 들면 dsRNA,30가장 재현성 결과 얻을 수 있는 방법의 유도 IPTG 농도의 적정. 그러나, 양적 정확한 적정 수 있습니다 필요 없을 때 다른 고기의 스펙트럼 생성을 목표로. 전반적으로,이 분석의 성공 고기의 유익한 스펙트럼을 생성 하는 RNAi 조건 결정에 RNAi 효과 극대화에 너무 많이 의존 하지 않습니다 (종종 차선 (예: 온화한)의 결과 수 있는 RNAi 조건)입니다.

    Tubulogenesis 고기 RNAi에 의해 유도 된의 시각적 평가 대 한 그것은 phenotypic 평가 대 한 최적의 창을 확인 하는 것이 중요입니다. 그것은 충분히 가능한 늦게 효과 대 한 그들을 따라 일찍 판 (예: 이틀 후 표준 RNAi 조건 하에서 그들의 RNAi 번호판 동물 따기)을 평가 하려면 가장 좋습니다. 예를 들어 악화 극성 결함의 발달 시간 과정 일반적으로 체포 애벌레에 3-7 일을 커버 한다. (로, 예를 들어, let-767(RNAi) 또는 돌연변이 동물 둔화 성장 돌연변이 또는 RNAi 동물을 사용 하는 경우 애벌레 내장의 postmitotic 비 분열 세포에서 편광된 막 속의 분석에 대 한 조건은 더 향상 될 수 있습니다. 12, 그림 5). 모든 시간 과정 F2 동물 표시 하는 경우 중단 될 수 있다 (L4s 모든 동물 하지만 대부분 애벌레로 체포 하는 실험에서 제거할 수 있습니다). 모든 실험에 적절 한 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 (예: 세균 RNAi 복제 정의 tubulogenesis 표현 형을 유발 하 고 빈 벡터 또는 스크램블된 RNAi 클론, 각각)의 수 반하는 평가 해야 합니다. 평가 대 한 또 다른 요구는 충분 한 무리 크기 (적어도 50). 충족 되지 않는 경우 다른 (예를 들어 조건부) RNAi 조건 재판을 받을 수 있습니다. 마지막으로, 일부 특히 흥미로운 tubulogenesis 고기 발생 낮은 penetrance, 따라서 충분 한 수 동물의 평가 되어야 합니다.

    현미경 검사 법

    저 중 확대 형광 현미경 검사 법 및 높은 확대 confocal 현미경 검사 법, 두 가지 표준 이미징 절차 설명, 해 부 특성에 관 또는 루멘 형의 기본적인 측면을 일반적으로 충분 하다는 C.elegans 소장도 앞으로 스크린에서 동물의 더 큰 세트를 시각적으로 화면을 사용할 수 있습니다. 그러나 허용 해 부 형광 현미경 검사 법: 그들의 접시에 동물의 이미징 vivo에서 (, 살아있는 동물, 마 취약에 의해 움직일 정도 복구할 수 있습니다 후 마운트에서 confocal 또는 DIC 이미징); 동물;의 큰 세트를 상영 추적 개발 이벤트 (예: 변위 및 교체 편광 마커의 막 확장 중); 추적 특정 식 패턴 (일부 패턴 및 asymmetries 더 구별 된다 낮은 확대율에서); 선택 하 고 추가 분석 (예를 들면 confocal 현미경 검사 법) 또는 extrachromosomal transgenes의 유지 보수에 대 한 적합 한 형광 웜 따기. Confocal 현미경 검사 법에 의해 높은 확대에 시각화 단일 세포 및 subcellular 수준에서 표현 형의 특성을 허용 합니다. 이 프로토콜 대안 회전 디스크 confocal 현미경 등을 통해 최고의 confocality를 제공 하는 confocal 현미경 스캐닝 레이저로 이미지를 설명 합니다. 그러나 회전 디스크 confocal 현미경은,, 역동적이 고 경과 연구 때문에 적은 phototoxicity 유도 대 한 선택의 현미경 (더 낮은 및 높은 확대의 토론에 대 한 심판 (34,35) 참조 C. 선 충에 현미경)입니다. 기존의 현미경 기술 뿐만 아니라 소설 추가적인 이점을 제공 하 고 나노 스케일 범위 (예: 전송 전자와 슈퍼 해상도 현미경;에서 논의37에 높은 해상도에서 이미지를 허용 40).

    C. 선 충 창 confocal 현미경 이미징 때 장착 및 동원 정지가 중요 합니다. 동원 정지에 대 한 다른 화학 물질 가운데 나트륨 아 지 드-비록 독성-작품 대부분 안정적으로 즉시 이루어집니다 스캔 하는 경우. Levamisole, 비록 하지 독성, 때로는 방해 morphogenesis 고기 평가 hypercontraction를 생성 합니다. 어떤 마 취약 멤브레인 관련 된 형광 단백질을 방해할 수 있습니다 고 극성 결함 처럼 보일 수 있는 아티팩트를 생성할 수 있습니다. C. 선 충 두꺼운 견본 이며 따라서 3D 분석 (단면) (쉽게 꼭대기 접합과 측면 막의 뛰어난 시각화를 허용 관 장 상피의 특정 한 힘의 활용 필수 플랫 epithelia에 접근). Confocal 설정은 모든 슬라이드와 목표 bracketing 평균, 레이저 전력, 이득, 핀 홀, 같은 밝기 매개 변수를 포함 하 여 좋은 품질의 이미지를 조정 해야 합니다. 장 이미지의 한 특정 문제는 녹색/황색 autofluorescent 알갱이의이 오르간의이 콘텐츠 (리소좀 관련 세포 (LROs))의 변위를 평가 하는 경우에 특히, 결과의 해석 방해할 수 있는 GFP 표시도 및 플라즈마 멤브레인 관련된 구성 요소입니다. 이 문제는 분야에서 잘 인식 되 고 DAPI 제외, 스펙트럼 지문, 그리고 경험적 스캐너 설정13,41을 포함 하 여 (현미경)에 따라 다른 방법으로는 태 클 수 있습니다.

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    Disclosures

    저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

    Acknowledgments

    우리 감사 마리오 보노 (MRC 분자 생물학의 실험실, 케임브리지, 영국), 케네스 J. Kemphues (코넬 대학, Ithaca, 미국), 미셸 Labouesse (Institut de Biologie 파리 세 느 강, 대학교 피에르 외 마리 퀴리, 파리, 프랑스), 그레고리우스 미 쇼 (대학교 렌 1, 렌, 프랑스)와 CGC, 긴장 및 항 체에 대 한 NIH 연구 인프라 프로그램 (P40 OD010440)의 사무실에 의해 자금. 이 작품은 NIH GM078653, MGH는 224570 V.G.에 SAA 223809 교부 금에 의해 지원 되었다

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Antibody staining
    poly-L-lysine Sigma P5899
    Methanol Fisher Scientific A452-4
    Acetone Fisher Scientific A949SK-4
    Tween Fisher Scientific 50-213-612
    Permount Fisher Scientific SP15-100
    Powdered milk Sigma MT409-1BTL
    Primary antibodies
    MH27 (mouse) Concentration: 1:20 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
    MH33 (mouse) Concentration: 1:10 Resources: Developmental Studies Hybridoma Bank.
    anti-ICB4 (rabbit) Concentration: 1:5 Resources: A gift from Mario de Bono (Medical Research Council, England)
    anti-PAR-3 (rabbit) Concentration: 1:50 Resources: A gift from Kenneth J. Kemphues (Cornell University)
    Secondary antibodies
    Alexa Floor 568 (anti-rabbit) ABCam AB175471 Concentration: 1:200
    Cy5 (anti-mouse) Life technologies A10524 Concentration: 1:200
    TRITC (anti-rabbit) Invitrogen T2769 Concentration: 1:200
    FITC (anti-mouse) Sigma F9006 Concentration: 1:100
    Labeled chemicals
    Texas Red-Phalloidin Concentration: 1:100 Resources: Molecular Probes-T7471
    Materials
    Vacuum Grease Silicone Beckman 335148
    Microscope slides Fisher Scientific 4448
    Microscope coverslips (22x22-1) Fisher Scientific 12-542-B
    C. elegans related see reference29 for standard C. elegans culture and maintenance procedures.
    LB Medium and plates see reference29 for protocols.
    Tryptone Acros Organics 611845000
    Yeast Extract BD Biosciences 212750
    NaCl Sigma S7653
    Bacto Agar BD Biosciences 214040
    Ampicillin Sigma A0116
    Tetracycline Fisher Scientific BP912
    M9 Medium see reference29 for protocols.
    NaCl Sigma S7653
    KH2PO4 Sigma P0662
    Na2HPO4 Sigma S7907
    MgSO4 Sigma M2773
    NGM plates see reference29 for protocols.
    NaCl Sigma S7653
    Peptone BD Biosciences 211677
    Tryptone Acros Organics 611845000
    Bacto Agar BD Biosciences 214040
    MgSO4 Sigma M2773
    CaCl2 Sigma C3881
    Cholesterol Sigma C8667
    K2HPO4 Sigma P3786
    KH2PO4 Sigma P0662
    RNAi plates see reference30 for protocols.
    NaCl Sigma S7653
    Peptone BD Biosciences 211677
    Tryptone Acros Organics 611845000
    Bacto Agar BD Biosciences 214040
    MgSO4 Sigma M2773
    CaCl2 Sigma C3881
    Cholesterol Sigma C8667
    K2HPO4 Sigma P3786
    KH2PO4 Sigma P0662
    IPTG US Biological I8500
    Carbenicillin Fisher Scientific BP2648
    NaOH Fisher Scientific SS266-1
    Sodium hypochlorite Fisher Scientific 50371500
    Bacteria
    OP50 bacteria CGC
    HT115 bacteria CGC
    Genome-wide RNAi libraries Ahringer genome-wide RNAi feeding library (ref 30,49,50) Source BioScience
    C. elegans ORF-RNAi feeding library (ref51) Source BioScience
    Imaging related
    Sodium azide Fisher Scientific BP9221-500
    Equipment
    dissecting microscope Nikon SMZ-U
    dissecting microscope equipped with a high-power stereo fluorescence attachment (Kramer Scientific), CCD camera with Q capture software and X-Cite fluorescent lamp (Photonic Solutions) Olympus SZX12
    Laser-scanning confocal microscope Leica Microsystem TCS SL
    laser-scanning confocal mounted on an ECLIPSE Ti-E inverted microscope Nikon C2

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    References

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