माउस न्यूमोनोटीमामी और प्रोस्थेशिस इम्प्लांटेशन के माध्यम से आंतरिक फेफड़े की सतह के क्षेत्र को मापने के लिए एक मानकीकृत विधि

Developmental Biology

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Summary

फेफड़े की बीमारियों और चोट से प्रेरित एल्वोलोर पुनर्जनन में फेफड़े के आकारिकी और शरीर विज्ञान के मूल्यांकन के लिए आंतरिक फेफड़े की सतह क्षेत्र (आईएसए) एक महत्वपूर्ण मानदंड है। हम यहां एक मानकीकृत विधि का वर्णन करते हैं जो फेफड़े की न्यूमोनोटीमी और प्रोस्थेसिस आरोपण माउस मॉडल दोनों में आईएसए के लिए माप पूर्वाग्रह को कम कर सकता है।

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Liu, Z., Fu, S., Tang, N. A Standardized Method for Measuring Internal Lung Surface Area via Mouse Pneumonectomy and Prosthesis Implantation. J. Vis. Exp. (125), e56114, doi:10.3791/56114 (2017).

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Abstract

Introduction

फेफड़े का मूलभूत कार्य रक्त वाहिकाओं और वातावरण के बीच ऑक्सीजन और कार्बन डाइऑक्साइड का आदान-प्रदान है। ब्रोंकोपोल्मोनरी डिस्प्लाशिया (बीपीडी), क्रोनिक ऑब्स्ट्रक्टिव फेलमोनरी डिजीज (सीओपीडी) और तीव्र श्वसन संक्रमण के रूप में फेफड़े के रोग, परिणामस्वरूप आईएसए 2 में कमी आई है फेफड़े की बीमारी के अध्ययन के शोधकर्ताओं ने फेफड़े के रूप में एमएलआई, आईएलवी, संख्या की संख्या, आईएसए, और फेफड़े के ऊतक अनुपालन 2 , 3 सहित फेफड़ों के आकार के मूल्यांकन के लिए कई मात्रात्मक तरीकों का विकास किया है। वीबेल एट अल द्वारा अग्रणी अध्ययन 4 और डुगुइड एट अल 5 ने एक साथ स्थापित किया कि आईएसए को मानव फेफड़ों में फेफड़े के गैस-आदान-प्रदान क्षमता के प्रत्यक्ष उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और इसका उपयोग वातस्फीति तीव्रता को निर्धारित करने के लिए एक मानदंड के रूप में किया जा सकता है। पिछले पांच सालों में प्रकाशित कई अध्ययनों ने फेफड़े के आकारिकी मापदंडों ( जैसे, 6 और चोट पीएनएक्स 1 , 7 से पुनर्प्राप्ति के दौरान। आईएसए का आकलन 1 8 , 9 का उपयोग करके किया जाता है:

समीकरण

, जहां आईएलवी आंतरिक फेफड़े की मात्रा है और एमएलआई एक मध्यस्थ पैरामीटर है जो फुफ्फुसीय परिधीय हवाई क्षेत्र आकार 10 का प्रतिनिधित्व करता है।

पीएनएक्स, एक या अधिक फेफड़े के शल्यचिकित्सा को हटाने के लिए, कई प्रजातियों में मनुष्यों 11 , 1 चूहों, 12 कुत्तों, 13 चूहों, और खरगोश 14 , 15 सहित कई प्रजातियों में एल्वोलोर पुनर्जनन के लिए व्यापक रूप से सूचित किया गया है। घुड़सालचौदह दिनों के बाद पीएनएक्स के चूहों के फेफड़ों में वाई ने दिखाया कि पूर्व-विद्यमान एलविओली का विस्तार और एलिवोलि के डी नोवो का निर्माण ईएसए, आईएलवी की बहाली और शेष फेफड़े के ऊतकों 1 में एलविओली की संख्या में योगदान देता है। हम और दूसरों ने दिखाया है कि पीएनएक्स ( यानी , प्रोस्टेसिस इम्प्लांटेशन) के कारण रिक्त वक्ष गुहा में स्पंज, मोम, या कस्टम-आकार वाले कृत्रिम अंग जैसे सामग्री को सम्मिलित करने से एल्वोलर रिजनेरेशन खराब होता है। अब यह दृढ़ता से स्थापित किया गया है कि यांत्रिक बल 1 9 , 16 , 17 के दौरान एल्वोलोर पुनर्जनन के लिए सबसे महत्वपूर्ण कारकों में से एक के रूप में कार्य करता है। इस तरह के अध्ययन ने पीएनएक्स-इलाज और प्रॉस्थीसिस-प्रत्यारोपित फेफड़ों से आईएसए मूल्यों का उपयोग करने की प्रभावशीलता को उजागर किया है, ताकि मस्तिष्क के पुनर्निर्माण का मात्रात्मक मूल्यांकन किया जा सके।

ऑब्जर्वर पूर्वाग्रह को मापने के लिए काफी महत्वपूर्ण माना जाता हैफेफड़े के आकारिकी मापदंडों ( जैसे , एमआईएल और आईएलवी) के लिए ल्यूज़ आईएसएलए की गणना में उपयोग किए जाने वाले दो मापदंड हैं जो आईएलवी और एमआईआई दोनों का निर्धारण करने में मानकीकृत प्रोटोकॉल का उपयोग इस पूर्वाग्रह को समाप्त करने के लिए किया जा सकता है। यहां, हम इन फेफड़ों के मापदंडों को मापने के लिए उच्च-विस्तृत, मानकीकृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। महत्वपूर्ण रूप से, आईएसए का सटीक रूप से मापने की क्षमता चोट-प्रेरित एल्वोलोर उत्थान मॉडलों में फेफड़ों के कार्य के अध्ययन की विश्वसनीयता और प्रजनन क्षमता को सुधारने का वादा करती है और कई फेफ्लॉनरी रोगों में तंत्रिकीय खोजों को सुविधाजनक बनाना चाहिए।

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल की जाने वाली सभी प्रक्रियाएं बीजिंग के राष्ट्रीय जैव विज्ञान संस्थान के प्रयोगशाला प्रयोगशाला के देखभाल और प्रयोग के लिए दिशानिर्देशों के अनुसार सिफारिशों के अनुसार किए गए। 8 सप्ताहीय सीडी-1 पुरुष चूहों को एक निश्चित रोगजन मुक्त (एसपीएफ़) की सुविधा में रखा गया था जब तक प्रयोगों का आयोजन नहीं किया गया था। पूरी तरह से anesthetized चूहों ( यानी , कोई पैर की अंगुली चुटकी प्रतिक्रियाओं के बिना) की शल्य चिकित्सा का प्रदर्शन किया गया था। शल्य चिकित्सा के बाद, चूहों को गर्म और आर्द्र कमरे में पर्याप्त भोजन और ताजे पानी में रखा गया था। इंस्राइटिटोनियल इंजेक्शन द्वारा वितरित संवेदनाहारी की अधिक मात्रा का उपयोग करके चूहे को बलिदान किया गया था।

1. माउस पीएनएक्स सर्जरी

  1. इंट्रापेरोटोनियल (आईपी) इंजेक्शन के माध्यम से सोडियम phenobarbital (120 मिलीग्राम / किग्रा के शरीर का वजन) और ब्यूपेरोनोफ़िन (0.1 मिलीग्राम / किलो वजन) के साथ चूहों को पूर्ण रूप से अनैस्टेट करें। सर्जरी करते समय चूहों ने पैर की अंगुली का मुंह बंद करने पर प्रतिक्रिया नहीं की।
  2. रासायनिक डेप के साथ चूहों के बाएं छाती पर बाल निकालेंनिष्क्रिय उपचार (~ 3 x 3 सेमी 2 क्षेत्र)
  3. ऑपरेटर का सामना कर रहे अपने उदर भाग के साथ एक इंटुबेशन प्लेटफॉर्म पर प्रत्येक माउस को सुरक्षित करें ( चित्रा 1 ए )।
  4. माउस जीभ को बाहर निकालें और कैथोलिक मार्गदर्शक के कैथेटर्स 18 ( चित्रा 1 ए ) के लिए एक पायदान युक्त एक छोटे पशु लैरींगोस्कोप के साथ मुखर रस्सियों को रोशन करें।
  5. श्वास के दौरान मुखर रस्सियों के आंदोलन को देखकर मुखर रस्सियों को अलग करें। धीरे से एक पूर्वकाल कोण 19 में ट्रेकिआ में 20 जी अंतःशिरा इंटुबेशनल प्रवेशिनी डालें
  6. एक सही पार्श्व लेटा हुआ स्थिति में चूहों को रखें और एक यांत्रिक वेंटीलेटर ( जैसे, दबाव नियंत्रित; सामग्री की तालिका देखें) में प्रवेशनी को एक यांत्रिक वेंटीलेटर से कनेक्ट करें। माउस छाती ( चित्रा 1 बी ) के साँस लेने के आंदोलनों को देखकर ट्रेकिआ में प्रवेशनी की प्रविष्टि देखें।
  7. प्रेरक दबाव ओ सेटएफ को 12 सेमी एच 2 ओ पर वेंटीलेटर और श्वसन की दर प्रति मिनट 120 श्वास ( चित्रा 1 बी ) निर्धारित करें।
  8. बीटाडिन और 70% इथेनॉल के साथ शल्यक्षेत्र में त्वचा को हटा दें।
  9. 5 वें इंटरकॉस्टल स्पेस पर अंतरिक्ष में 2 - 3 सेमी पोस्टरोलिग्र थोरैकोटोमी चीरा बनाएं, नोयस स्प्रिंग कैंची (काटने के किनारे: 14 मिमी; टिप व्यास: 0.275 मिमी) ( चित्रा 2 बी , सी ) के साथ त्वचा और मांसपेशियों में कटौती करें। थोरैकोटॉमी प्रक्रिया के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले सर्जिकल उपकरणों का प्रयोग करने से पहले निष्फल हो जाता है।
  10. बाएं फेफड़े ( चित्रा 2 डी , ई ) का पर्दाफाश करने के लिए 5 वें इंटरकॉस्टल स्पेस पर 1.5 सेमी चीरा करें। ऑपरेशन के दौरान, रक्तस्राव को रोकने के लिए एक उच्च तापमान कैटरिजर का उपयोग करें।
  11. कुंद टिप संदंश ( चित्रा 2 एफ ) के साथ सीने से बाएं फेफड़े के लोब का एक तिहाई भाग लें और फिर पूरे बाएं खींचने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करेंफेफड़े ( चित्रा 2 जी )।
  12. बाईं फेफड़े के लोब ( चित्रा 2 जी ) के फुफ्फुसीय धमनी और ब्रोन्की की पहचान करें।
  13. रेशम सर्जिकल सिवनी के साथ हेलम में ब्रांकाई और जहाजों को कसकर लंगर डालना और बाघ के फेफड़े के लोब को 3-4 मिमी ( चित्रा 2 एच , आई ) से काट लें।
    नोट: बाएं हिलम पर सीवन समुद्री मीट काट नहीं करने के लिए सावधान रहें, जिससे न्युमोथोरैक्स हो सकता है ( यानी थोरैक्स की गुहा में वायु या गैस)
  14. 1 सीवन के साथ छाती की दीवार को बंद करें, और फिर मांसल परत और त्वचा परत अनुक्रमित रूप से, 5 - 6 बाधित वायलेट का उपयोग करके। प्रत्येक सिवनी ( चित्रा 2 एम , 2 एन ) के बीच 3-4 मिमी की गहराई छोड़ दें।
    नोट: सर्जिकल सीवन सुई को दिल से दूर रखें; अनजान कार्डियक पंचर तत्काल मौत में परिणाम होगा
  15. पोविदोन-आयोडीन के साथ सर्जिकल क्षेत्र कीटाणुरहित
  16. afteसर्जिकल ऑपरेशन आर, माउस को 38 डिग्री सेल्सियस थर्मल पैड पर रखें और माउस को वेंटिलेटर पर कनेक्ट करें जब तक कि सहज साँस लेने की गति शुरू हो जाए ( चित्रा 2O )।

2. प्रोस्थीसिस इम्प्लांटेशन

  1. पीएनएक्स प्रक्रिया की 1.1 - 1.13 कदम (जो उस बिंदु तक है, जब माउस का बाएं फेफड़े की लोब निकाल दी जाती है)।
  2. कुंद संदंश ( चित्रा 2 जे ) का उपयोग करते हुए सिलिकॉन कृत्रिम अंग का केंद्र (ग्राहक बनाया, लम्बा में 12 मिमी, मोटाई में 3 मिमी, चौड़ाई 7 मिमी, 0.2 ग्राम, अंडाकार-आकृति) को दबाना । सम्मिलन से पहले सिलिकॉन कृत्रिम स्टेरिलाइज़ करें।
  3. थोरैसिक गुहा का पर्दाफाश करने के लिए एक हाथ से संदंश के साथ रिब को पकड़ो, और फिर एक दूसरे हाथ से बाईं खाली खाली छिद्र में कृत्रिम अंग डालें।
    नोट: प्रविष्टि कोण कृत्रिम अंग के सामने वाले विमान और छाती की सतह ( चित्रा 2 के बीच लगभग 45 डिग्री है ,एल)। कृत्रिम अंग डालने में बहुत मज़ेदार रहें अत्यधिक बल के परिणामस्वरूप फुफ्फुस टूटना।
  4. कृत्रिम अंग के निचले हिस्से को समायोजित करने के लिए कुंद संदंश के साथ समायोजित करें यह सुनिश्चित करने के लिए कि कृत्रिम अंग डालें खाली खाली छिद्र गुहा पर है।
  5. माउस पीएनएक्स प्रक्रिया का 1.14 - 1.16 कदम उठाएं।

3. आईएलवी का मापन

  1. एक कस्टम डिवाइस ("मुद्रास्फीति ट्यूब") तैयार करें जिसमें डिस्पोजेबल सीरॉलॉजिकल पिपेट (10 एमएल), एक 40 सेंटीमीटर लंबी लचीली ट्यूब सुई एडाप्टर, एक फ्लो रेट कंट्रोल वाल्व और 18 जी सुई से हटाया गया एक सवार है। विधानसभा के बाद, टेप के साथ बोर्ड पर विंदुक सुरक्षित करें ( चित्रा 3 ए )। विंदुक के शीर्ष और प्रायोगिक बेंच के बीच की दूरी कम से कम 30 सेंटीमीटर होगी।
  2. 500 मिलीलीटर पूर्व गर्म 1x फॉस्फेट बुखार खारा (पीबीएस) 55 डिग्री सेल्सियस पानी के नहाने पर मैन्युअल रूप से मिलाते हुए 20 ग्राम पीएफए ​​को भंग करके ताजा 4% पैराफॉर्मालाडीहाइड (पीएफए) निर्धारण समाधान तैयार करें।हर 10 मिनट तक समाधान स्पष्ट नहीं है। कमरे के तापमान को ठंडा करने के बाद, समाधान को 0.45 माइक्रोन फिल्टर के साथ फिल्टर करें।
    सावधानी: पीएफए ​​से निपटने के दौरान उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।
  3. संवेदनाहारी (0.8% phenobarbital सोडियम, 1,000 यू / एमएल हेपरिन) की अधिक मात्रा इंजेक्शन के साथ बलिदान चूहों।
  4. एक पॉलीस्टाइन विच्छेदन प्लेट पर प्रत्येक माउस को सुरक्षित करें और 70% अल्कोहल के साथ स्प्रे करें।
  5. सावधानी से माउस छाती को खोलें और छाँटो के छिलके को अच्छी तरह से उजागर करने के लिए कैंची का उपयोग करके छाले को काट लें।
  6. ट्रेकिआ को उजागर करने के लिए कैंची का उपयोग करके अत्यधिक ऊतक निकालें घुटकी से ट्रेकिआ को अलग करना सुनिश्चित करें
  7. पेट की महाधमनी काटकर दिल की सही वेंट्रिकल में 25 गेज सुई डालें; इस प्रविष्टि से पहले 20 एमएल सिरिंज के लिए सुई को कनेक्ट करें। धीरे-धीरे 1x पीबीएस को दिल में धकेलिए, जब तक कि फेफड़े सफेद न हो जाए तब तक रक्त कोशिकाओं को निकालने के लिए। आमतौर पर, फुफ्फुसीय रक्त वाहिकाओं को साफ करने के लिए 5-10 एमएल पीबीएस की आवश्यकता होती है।
  8. भरें वेंई कस्टम-निर्मित मुद्रास्फीति ट्यूब 4% ताजा पीएफए ​​के साथ और मुद्रास्फीति ट्यूब से सभी बुलबुले को हटा दें।
  9. मुद्रास्फीति ट्यूब के 18-गेज सुई को ट्रेकिआ में डालें और तरल लीक से बचने के लिए पोत क्लिप के साथ ट्रेकिआ को क्लिप करें।
  10. फुफ्फुस से 4% पीएफए ​​के साथ 25 सेमी / एच 22 , 20 के निरंतर पिप्रोलम्बोनेरी दबाव में बढ़ोतरी करें। फेफड़ों को 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर पूरी तरह से विस्तारित फेफड़ों को प्राप्त करने के लिए सेते हैं। फेफड़े के आकारिकी के संरक्षण के लिए यह "पूर्व तय" चरण महत्वपूर्ण है
    1. मुद्रास्फीति ट्यूब की निगरानी करके, प्रारंभिक 4% पीएफए ​​मात्रा का मूल्य रिकॉर्ड करें और अंतिम मात्रा रिकॉर्ड करें। आंतरिक फेफड़े की मात्रा प्रारंभिक 4% पीएफए ​​वॉल्यूम के बराबर होती है, अंतिम 4% पीएफए ​​वॉल्यूम।
  11. ट्रेकिआ और कैंची का उपयोग करते हुए लगी, धीरे-धीरे आसपास के संयोजी ऊतकों से फेफड़े (फेफड़ों को बरकरार रखने) को बाहर निकालना। फेफड़ों को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए बहुत ही मज़ेदार रहें
  12. Incuएक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 4% पीएफए ​​के साथ 4 डिग्री सेल्सियस के साथ भरने वाले फेफड़े को एक प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर कोमल झटकों के साथ। टिशू प्रसंस्करण और धुंधला हो जाना (खंड 4 देखें) के लिए आगे बढ़ें।

4. ऊतक एम्बेडिंग, अनुभागिंग, और हेमटॉक्सिलीन एंड ईसिन (एच एंड ई) स्टीनिंग

  1. निर्धारण के बाद, फेफड़ों से हृदय और अत्यधिक संयोजी ऊतकों को ट्रिम करने के लिए नोयस स्प्रिंग कैंची का उपयोग करें। फेफड़ों के गोले को ट्रेकिआ से जोड़ते हुए ब्रोन्कस को काटने से अलग-अलग फेफड़े के अलग-अलग हिस्सों को धीरे से अलग करें।
  2. ऑर्बिटल प्रकार के बरतन (50 आरपीएम) पर 50 मिलीलीटर 1 एक्स पीबीएस (30 मिनट / धो) में 4 बार फेफड़े के गोले को बड़े पैमाने पर धो लें।
  3. अंतिम धोने के बाद, फेफड़े के गोले को 4 डिग्री सेल्सियस तक 30% सुक्रोज़ समाधान (1x पीबीएस में) में विसर्जित कर, जब तक कि ऊतक 50-एमएल शंक्वाकार ट्यूबों (लगभग 12 घंटे) के नीचे डूबता नहीं हो जाता है।
  4. ऊतकों को एम्बेड करने और रुकने से पहले, संदंश के साथ ट्यूबों के फेफड़े के लोब नमूनों को हटा दें, acces को बनाए रखेंहिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए सर्री लॉबस, गौण लोब नमूनों की सतह से शेष सूक्रोज समाधान को दबाएं, और फिर लगभग 30 मिनट के लिए इष्टतम काटने के तापमान (ओसीटी) युक्त पेट्री डिश में नमूना को विसर्जित कर दें।
  5. क्रायोमॉल्ड का उपयोग करते हुए तरल नाइट्रोजन में ओसीटी-एम्बेडेड गौण लोब नमूनों को फ्रीज करें। ढालना के निचले हिस्से के समानांतर लोब के सबसे बड़े सतह क्षेत्र की स्थिति।
  6. हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए cryosectioning के दौरान प्रत्येक नमूने के लिए तीन 10-μm- मोटी वर्गों की कुल तैयार करें। पहले 1 मिमी ऊतक को त्यागें, एक 10-माइक्रोग्राम-मोटे खंड को इकट्ठा करें, 0.5 मिमी ऊतक को छोड़ दें, एक अन्य खंड को इकट्ठा करें, 0.5 मिमी ऊतक को त्याग दें, और तीसरा (अंतिम) खंड जमा करें।
  7. एच एंड ई धुंधला हो जाने से पहले 1 घंटे के लिए हवा को सूखा।
  8. एच एंड ई धुंधला हो जाना
    1. 3-4 नल के पानी के बदलावों में वर्गों को धो लें और फिर दो मिनट के लिए ताजा हेमटेटाक्साइलिन में वर्गों को दाग दें; नल का पानी चलाने के तहत अनुभाग कुल्ला; 1% एचसीएल -70% इथेनॉल समाधान में सेक्शन में दो बार विसर्जित करें।
    2. 3 मिनट के लिए ताजा एओसिन में अनुभाग दाग़ी; 95% इथेनॉल में दो लगातार 30s washes और 100% इथेनॉल के साथ दो 30s washes के साथ वर्गों निर्जलीकरण; 30 एस के लिए xylene में वर्गों को साफ़ करें, ताज़ा xylene में एक बार समाशोधन चरण दोहराएं; कांच के कवरलिप्स के माध्यम से बढ़ते माध्यमों के साथ स्लाइड्स माउंट करें

5. एमआईआई की मात्रा

  1. एक उज्ज्वल-क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एच एंड ई के डिजिटल छवियों को गौण सहायक लोब अनुभाग (20X बढ़ाई) प्राप्त करें।
  2. एमएलआई का अनुमान लगाने के लिए, 3 खंडों के उपयुक्त क्षेत्रों (धमनियों और नसों, प्रमुख वायुमार्गों, और वायुविच्छेदन नलिकाओं के बिना) से बेतरतीब ढंग से कुल 15 गैर-ओवरलैपिंग दृश्यों (1,000 माइक्रोग्राम x 1,000 सुक्ष्ममापी) का चयन करें।
  3. ग्रिड को 10 समान रूप से वितरित ऊर्ध्वाधर लाइनों के साथ रखें और परिभाषित लेन की 10 समान रूप से वितरित क्षैतिज रेखाएंशासक उपकरण का उपयोग करते हुए देखने के चुने हुए क्षेत्रों पर gth (1,000 माइक्रोन); प्रत्येक पंक्ति इस प्रकार 100 माइक्रोन अलग है ( चित्रा 4 बी )।
  4. दो आसन्न वायुवीर उपकला के बीच की रैखिक लंबाई के रूप में एक अवरोधन के मूल्य को परिभाषित करें। प्रत्येक 1,000 सुक्ष्ममापी लंबाई रेखा के साथ सभी अवरोधों के मूल्यों को मापें
  5. प्रत्येक ग्रिड के लिए, 10 क्षैतिज 1000 सुक्ष्ममापी लंबाई लाइनों और 10 ऊर्ध्वाधर 1,000 सुक्ष्ममापी लंबाई लाइनों के बीच सभी अवरोधों के मूल्यों का अनुमानित करें।
    नोट: एमआईआई प्रत्येक गौण स्थान के लिए तैयार 3 खंडों में से कुल 15 ग्रिड के इंटरसेप्ट लंबाई का औसत मूल्य है।

6. आईएसए की गणना

  1. समीकरण 1 ( परिचय देखें) का उपयोग करके ISA की गणना करें आईएलवी की माप के लिए धारा 3 को देखें और एमआईआई की मात्रा का ठहराव के लिए धारा 5 देखें।

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Representative Results

हमने यहां एक पीएनएक्स-इलाज वाले समूह के साथ एक प्रयोग किया और एक प्रोस्थेशिस इम्प्लांटेशन (प्रोस्थिसिस-इम्प्लांट) समूह रखा था। यह समूह हमारे अनुसंधान समूह 14 के पूर्व-प्रकाशित अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले समूह के समान हैं।

माउस पीएनएक्स और प्रोस्थेसिस आरोपण प्रक्रिया 2 चित्रा में दिखाया गया है। 8 सप्ताहीय सीडी-1 पुरुष चूहों का प्रयोग सर्जरी के लिए और मात्रा का ठहराव के लिए किया जाता है। PNX इलाज समूह और कृत्रिम अंग-प्रत्यारोपित समूह में, बाएं फेफड़े पालियों दोनों उच्छेदन गया (चित्रा 2A - 2I)। प्रोस्थिसिस-प्रत्यारोपित समूह में, एक कृत्रिम अंग जो बाएं फेफड़े के लोब के आकार और आकार की नकल करता है, उसे बाएं फेफड़े के लोब को हटा दिए जाने के बाद छाती में डाला गया ( चित्रा 2J - 2 एल )।

सर्जरी के बाद चौदह दिन, एक कस्टम मुद्रास्फीति ट्यूब का उपयोग शेष दायें फेफड़ों के आईएलवी ( चित्रा 3 ए ) को निर्धारित करने के लिए किया गया था। शेष दायें का औसत आईएलवी 5 पीएनएक्स वाले चूहों के फेफड़े लगभग 1.4 एमएल थे, जो 5 प्रोस्थिसिस-इम्पेमेंटेड चूहों ( चित्रा 3 बी , तालिका 1 ) के दाएं फेफड़ों के 1.05 एमएल आईएलवी मानों से काफी अधिक थे।

एमआईआई मापन के लिए, प्रत्येक माउस से तैयार 3 खंडों में से कुल 15 विचारों का विश्लेषण किया गया। चित्रा 4 ए एक एसेसरी लॉब से एक मर्ज की गई छवि को दिखाता है और एक चुने हुए क्षेत्र ( जैसे 1 दृश्य देखें) या एक गैर-चुने हुए क्षेत्र ( जैसे 4 - 5 देखें) के लिए morphological मानक एमआईआई की मात्रा का ठहराव के लिए इस्तेमाल किया जाता है। यहां, पीएनएक्स-इलाज वाले समूह के गौण फेफड़े के लोब से 3 को देखने के लिए एक उदाहरण के रूप में लिया गया थाएमआईआई ( चित्रा 4 बी ) का माप दृश्य 3 की एक विस्तृत तस्वीर चित्रण के लिए भी प्रदर्शित की जाती है ( चित्रा 5 ए )। रेखा 3 को एक उदाहरण के रूप में प्रस्तुत किया गया है: डबल-सिर वाले तीर लाइनों द्वारा संकेतित अवरोधक वायुपथ अंतरिक्ष की लंबाई। हमारे विश्लेषण से पता चला है कि पीएनएक्स-चूहों के शेष दायें फेफड़ों में एमएलआई मूल्य प्रोस्टिसिस-इम्प्लांट चूहों के शेष दायें फेफड़ों की तुलना में काफी अधिक थे ( चित्रा 5 बी , तालिका 1 )। सभी डेटा औसत ± SEM के रूप में प्रस्तुत किए जाते हैं ( चित्रा 5 बी )।

ईसा की गणना 1 समीकरण का उपयोग कर की गई थी तालिका 1 सभी फेफड़ों के आईएलवी मान, एमआईआई मूल्यों और आईएसए को दिखाता है। प्रोस्थिसिस-इम्पेमेंटेड चूहों का आईएसए पीएनएक्स-चूहों की तुलना में काफी छोटा था, यह दर्शाता है कि डार्विनएक कृत्रिम अंग के एन पीएनएक्स प्रेरित प्रेरित पुनरुत्थान।

आकृति 1
चित्रा 1: माउस एंडोट्रैचियल इंटुबैक्शन और मैकेनिकल वेंटिलेशन। ( ) लैरींगोस्कोपी के माध्यम से 20 जी अंतःशिरा इंटुबेशियन प्रवेशनी के साथ एंडोट्रैचियल इंटुब्यूशन। ( बी ) शल्य चिकित्सा से पहले एक दबाव-नियंत्रित यांत्रिक वेंटीलेटर को पूर्ण-संवेदनाहारी माउस से कनेक्ट करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: माउस न्यूमोनोटीमी (पीएनएक्स) और प्रोस्थेशिस इम्प्लांटेशन। ( - सी ) त्वचा और मांसपेशी परत कट; बंद करोसर्जिकल ऑपरेशन के दौरान एक उच्च तापमान cauterizer के साथ leeding। ( डी - ) 5 वें इंटरकॉस्टल स्पेस पर 1.5 सेमी चीरा बनाएं। ( एफ - एच ) कुंद संदंश के साथ बाएं फेफड़े के लोब को बाहर निकालना और फुफ्फुसीय धमनी और ब्रांकाई की पहचान करना, हिल्म में लगी हुई है। Arrowheads फुफ्फुसीय धमनी और बाईं फेफड़े के लोब की ब्रांकाई का प्रतिनिधित्व करते हैं। ( आई ) बाएं फेफड़ों की लोब 3-4 मिमी में लगी थी। ( जे - एल ) बाएं वक्ष गुहा में एक कृत्रिम अंग डालें। ( एम, एन ) छाती, मांसपेशी परत, और त्वचा की परत सिवनी। ( ) उत्स्फूर्त श्वास आंदोलन शुरू होने तक चूहों की निगरानी करें। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें


चित्रा 3: शेष दाएं फेफड़ों के आंतरिक फेफड़े की मात्रा (आईएलवी) का मापन। ( ) आंतरिक फेफड़े की मात्रा को मापने के लिए एक कस्टम डिवाइस ("मुद्रास्फीति ट्यूब") ( बी ) पीएनएक्स-इलाज समूह के शेष दायें फेफड़ों के आईएलवी (मतलब ± एसईएम) और प्रॉस्थीसिस-प्रत्यारोपित समूह को 14 दिनों के बाद-पीएनएक्स में मापा गया था। **, पी <0.01, छात्र का टी- टेस्ट इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: शेष दाएं फेफड़ों में गौण आंतों के मीन रैखिक अवरोधन (एमएलआई) की मात्रा। ( ) एक विलय आईएमएक सहायक लोब अनुभाग की आयु दिखाया गया है। चुने हुए क्षेत्रों के उदाहरण ( जैसे, दृश्य 1-3) और गैर-चुने हुए क्षेत्रों ( जैसे, दृश्य 4 - 5) एमआईआई मात्रा का ठहराव के लिए उपयोग किया जाता है। ( बी ) 10 समान रूप से दूरी वाली ऊर्ध्वाधर लाइनें और निर्धारित समानता के 10 समान-दूरी वाली क्षैतिज रेखा (1,000 माइक्रोन) को चुने हुए क्षेत्र पर रखा गया था। स्केल बार = 1 मिमी इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5: पीएनएक्स उपचारित फेफड़े और प्रोस्थिसिस-प्रत्यारोपित फेफड़ों में एमएलआई की मात्रा। ( ) चित्रा 4 बी में दृश्य 3 की एक विस्तृत तस्वीर दिखाई जाती है। डबल ऐरोहेड्स के साथ लाल रंग की रेखाएं एक रेखीय अवरोधन की लंबाई का प्रतिनिधित्व करती हैं। ( बी ) एमआईआई मूल्य (मतलब ± एसईएम.एन.) पीएनएक्स-उपचार वाले चूहों और प्रोस्थिसिस-इम्पेमेंटेड माइस के सहायक लब्बों के 14 दिन बाद पीएनएक्स में मापा गया। *, पी <0.05, छात्र का टी- टेस्ट। स्केल बार: 100 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

सर्जरी के 14 दिन बाद आंतरिक फेफड़े की मात्रा (एमएल) मतलब रेखीय अवरोधन (मिमी) आंतरिक फेफड़े की सतह क्षेत्र = 4ILV / एमएलआई (सेमी 2 )
PNX का इलाज 1.5 57.8 1038.06
1.35 49.6 1088.71
1.42 48.5 1171.13
1.4 51.5 1087.38
1.4 54.6 1025.64
कृत्रिम अंग-प्रत्यारोपित 1.1 49.6 887.10
1 50.5 792.08
1.1 47.3 930.23
1.15 44.8 1026.79
0.86 46.3 742.98

तालिका 1: पीएनएक्स-इलाज और प्रोस्थिसिस-इम्पेमेंटेड चूहे के आईएसए मूल्यों की गणना। 14 दिनों के बाद-पीएनएक्स में एक्सेसरी लॉब के आईएलवी, एमआईआई और आईएसए के मूल्य

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में, माउस फेफड़ों पीएनएक्स और प्रोस्थेसिस आरोपण के बाद फेफड़े के मापदंडों के माप के बारे में हम विस्तृत विवरण प्रदान करते हैं। ISA को अब कई फेफड़े के रोगों और चोट से प्रेरित एल्वोलोर पुनर्जनन में श्वसन समारोह के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण मीट्रिक माना जाता है। हालांकि, हालांकि फुफ्फुसीय शोध समुदाय आईएसए की उपयोगिता के बारे में एक उपयोगी मीट्रिक के रूप में सहमत है, हालांकि, आईएलवी और एमआईआई के माप के मानकीकरण का बहुत कम विचार है, आईएसए की गणना के लिए प्रयुक्त दो पैरामीटर जाहिर है, किसी भी माप के साथ, निष्पक्ष डेटा प्राप्त करने का प्रयास करना महत्वपूर्ण है। वर्तमान अनुसंधान प्रयासों का मुख्य लक्ष्य है कि मूरीन फुफ्फुसीय शोध समुदाय द्वारा इस्तेमाल के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल स्थापित करना।

हमने कई तरीकों से माप पूर्वाग्रह के स्रोतों को कम करने का प्रयास किया जैसा हमने इस प्रोटोकॉल को विकसित किया था। हमने पाया कि आईएलवी माप में बदलाव लाल हो सकता हैट्रस्किया में डाला सुई का आकार dimensionally मिलान (हम पाया गया कि 18-गेज सुइयों बारीकी से चूहों tracheae मिलान) द्वारा insulating द्वारा तरल पदार्थ रिसाव को रोकने के द्वारा। हमने यह भी पाया कि पीएफए ​​मुद्रास्फीति से पहले माउस सीने की दीवार को पूरी तरह से हटाया जाना चाहिए, क्योंकि यह आईएलवी माप पर छाती की दीवार के संभावित प्रभाव को कम करता है। एमएलआई मूल्य एल्विकोलर मोर्फोलॉजी पर काफी हद तक निर्भर करते हैं। तदनुसार, आयु-मिलान और सेक्स-मिलान वाले चूहों का उपयोग करने के महत्व के अलावा, फेफड़ों के निर्धारण प्रक्रियाओं के दौरान एल्विकोलर आकृति विज्ञान के उचित रखरखाव गंभीर रूप से महत्वपूर्ण हैं हमने यहां एक व्यापक रूप से अपनाया निर्धारण पद्धति का इस्तेमाल किया है: हमने फेफड़े को फेफड़ों के ऊतकों को पूरी तरह से फैलाने के लिए ताजे तैयार 4% पीएफए ​​के साथ 25 सेमी एच 2 ओ के एक पारदर्शी दबाव में फुलाया। हमारे अनुभव में, कम दूरी के दबाव से ऊतक संकुचन, असामान्य मूत्राशय की आकृति विज्ञान हो सकती है और अंत में निम्न एमआईआई मूल्यों में परिणाम होता है।

में टिप्पणियांहमारे पिछले अध्ययनों से संकेत मिलता है कि पीएनएक्स पुनर्जनन के बाद, दाएं फेफड़ों के अन्य तीन हिस्सों की तुलना में शेष फेफड़ों की गौण लोब अधिकतम मात्रा में विस्तार को दर्शाता है; शेष फेफड़ों की सहायक लोब में रूपात्मक मापदंडों ( जैसे, एमएलआई) 21 , 22 , 23 , 24 के मूल्य में अधिकतम वृद्धि दर्शाती है। इसलिए हमने विभिन्न फेफड़ों के विभिन्न हिस्सों से भिन्नता से बचने के लिए एसेसरी लॉब से वर्गों का विश्लेषण किया है। एमआईआई की मात्रा का ठहराव में उपयोग किए जाने वाले विभिन्न वर्गों के बीच भिन्नता को कम करने में सहायता के लिए, हम एम्बेडिंग के दौरान लोब की ओरिएंटेशन को नियंत्रित करते हैं: हमने रोओनोम के निचले हिस्से में लोब की सबसे बड़ी सतह रखी। हम नमूना स्लाइस की मोटाई, अनुभाग नमूने का अनुक्रम, और सेक्शनिंग के दौरान काटने की स्थिति को भी सावधानीपूर्वक नियंत्रित करते हैं। नमूना प्रसंस्करण के अलावा, एक और importanमानकीकरण का टी पहलू यह है कि सभी धमनियों और नसों, पिपरा, प्रमुख वायुमार्ग, और वायुकोशीय नलिकाओं को ऊतक क्षेत्रों से बाहर रखा जाना चाहिए, जिन्हें एमआईआई मात्रा का ठहराव के दौरान मूल्यांकन किया जाता है। धमनियों, नसों और वाष्पशील नलिकाएं एलवीओली (4 से 10 बार) से बहुत अधिक हैं, इसलिए विश्वसनीय अवरोध माप प्राप्त करने के लिए इन बड़े संरचनाओं को छोड़ना महत्वपूर्ण है। प्रत्येक समूह के लिए, 5 चूहों मात्रा का ठहराव के लिए पर्याप्त हैं। प्रत्येक माउस के लिए, कुल 15 गैर-ओवरलैपिंग व्यू (1,000 माइक्रोग्राम x 1,000 माइक्रोन) गौण उपेक्षि के 3 खंडों के उपयुक्त क्षेत्रों (बिना धमनियों और नसों, प्रमुख वायुमार्गों, और वायुवीर नलिकाएं) से बेतरतीब ढंग से चुना गया था। नमूना एम्बेडिंग विधि और एमआईआई माप को पैराफिन उपचारित फेफड़े के ऊतकों पर भी लागू किया जा सकता है।

जबकि दूसरों को पार कर वायुकोशीय दीवारों 25 के साथ अवरोध की संख्या से विभाजित कुल लाइन की लंबाई के रूप में MLI परिभाषित किया है, हम यहाँ रैखिक लंबाई के रूप में एक रेखीय अवरोधन इस्तेमाल कियाएमआईआई के आंकड़ों से मेसेनचाइम की मोटाई को देखते हुए, एमआईआई गणना में दो आसन्न वायुविरोधी उपकला दीवारों के बीच तदनुसार, हमने आईएसएल का इस्तेमाल करते हुए ईएसए की गणना की है लेकिन कुल फेफड़े की मात्रा नहीं है।

पीएनएक्स और प्रोस्थेसिस आरोपण प्रक्रियाओं के लिए, पीएनएक्स से गुजरने वाले चूहों की जीवित रहने की दर 85% से लेकर 9 0% तक थी। प्रोस्टेसिस आरोपण के दौर से गुजरने वाले चूहों की जीवित रहने की दर लगभग 80% थी। सभी सर्जरी के दौरान, चूहों के अस्तित्व में सुधार के लिए कई कदम उठाए जाने चाहिए। 1) ट्रेचेआ में कैथेटर का उचित सम्मिलन एक सफल पीएनएक्स ऑपरेशन के लिए एक शर्त है। लैयरींगोस्कोप के मार्गदर्शन के साथ, सुरक्षित और प्रभावी एंडोट्रैचियल इंटुबैशन की सुविधा के लिए माउस का ट्रेकिआ आसानी से देखा जा सकता है। 2) प्रक्रिया के दौरान फेफड़े या दिल को छिद्र न करें। सुनिश्चित करें कि पांचवें बाएं अंतरकोषीय अंतरिक्ष के छाती को व्यापक रूप से खोला गया है और बाएं पालि का हीलम स्पष्ट रूप से लॉबैक्टोमी से पहले पहचाना गया है। जब छोड़ दिया फेफड़े के लोब को प्रदर्शन करते हैंखंड, यह सुनिश्चित करें कि पिलमोनास रक्तस्राव और / या लोबर टूटना से बचने के लिए कुंद संदंश के उपयोग के माध्यम से बाएं लोब बरकरार है। घाव बंद होने के दौरान, हृदय और फेफड़ों से शल्य सुई की नोक दूर रखें। 3) कम थोरैक्स गुहा में कृत्रिम अंग को सम्मिलित करते समय कोमल रहें, क्योंकि अत्यधिक बल से फुफ्फुस का टूटना हो सकता है। 4) चूहों को 38 डिग्री सेल्सियस थर्मल पैड पर रखा जाना चाहिए और उनकी इंद्रियों को ठीक होने तक मॉनिटर किया जाना चाहिए, क्योंकि पोस्टऑपरेटिव हाइपोथर्मिया माउस रोगक्षमता को बढ़ाने के लिए जाना जाता है।

बाएं फेफड़े के लोब को हटाने के बाद, फुफ्फुसीय श्वसन इकाइयों और आंतरिक फेफड़े के गैस एक्सचेंज क्षेत्र दोनों काफी कम थे। सर्जरी के 14 दिनों के बाद, शेष फेफड़े के ऊतकों में आईएलवी, एमआईआई और आईएसए प्रोस्टिशिस-इम्प्लांट समूह की तुलना में चूहों के पीएनएक्स-युक्त समूह में काफी बड़ा था, जोरदार ढंग से सुझाव दे रहा था कि कृत्रिम अंग के सम्मिलन में पीएनएक्स प्रेरित प्रेरित उत्थान। इस प्रकार, पीएनएक्स और कृत्रिम अंग दोनों - आरोपण माउस मोडएलएस का उपयोग यांत्रिक बल प्रेरित पुनर्विक्रियाकरण के दौरान होने वाले सेलुलर और आणविक घटनाओं की जांच के लिए शक्तिशाली उपकरण के रूप में किया जा सकता है। साथ ही, याप AT2 अशक्त फेफड़ों के ईसा मूल्यों के बाद PNX दिन 14 1 पर नियंत्रण फेफड़ों की तुलना में महत्वपूर्ण छोटे थे, यह दर्शाता है कि हमारे प्रोटोकॉल भी आनुवंशिक उत्परिवर्ती चूहों के बिगड़ा उत्थान का पता लगाने के लिए उपयुक्त है। इस अध्ययन में प्रस्तुत कठोर और मानकीकृत मात्रात्मक विधियों को विकास के अध्ययन में फेफड़े के मापदंडों और आईएसए को मापने के लिए लागू किया जा सकता है और आनुवंशिक रूप से संशोधित जानवरों के कई रोगों के पशु मॉडल के साथ, पुरानी प्रतिरोधी फेफड़े के रोगों में फेफड़े के कारण, फेफड़े की चोटों के बाद पुष्पक्रम पुनर्जीवन, और फेफड़े के विकास दोष के।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखक सहायता के लिए बीजिंग के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोलॉजिकल साइंसेज को स्वीकार करना चाहते हैं। यह काम बीजिंग नगर प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नंबर Z17110200040000) द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Low cost cautery kit Fine Science Tools 18010-00
Noyes scissors Fine Science Tools 15012-12
Standard pattern forceps Fine Science Tools 11000-12
Castroviejo Micro Needle Holders Fine Science Tools 12060-01
Vessel clips Fine Science Tools 18374-44
I. V. Cannula-20 gauge Jinhuan Medical Product Co., LTD. 29P0601
Surgical suture Jinhuan Medical Product Co., LTD. F602
Mouse intubation platform Penn-Century, Inc Model MIP
Small Animal Laryngoscope Penn-Century, Inc Model LS-2-M
TOPO Small Animal Ventilator Kent Scientific RSP1006-05L
Thermal pad Stuart equipment SBH130D
Pentobarbital sodium salt Sigma P3761
Heparin sodium salt Sigma H3393
Hematoxylin Solution Sigma GHS132
Eosin Y solution, alcoholic Sigma HT110116
10 mL Pipette Thermo Scientific 170356
Paraformaldehyde Sigma P6148
O.C.T Compound Tissue-Tek 4583
cryosection machine Leica CM1950
Disposable Base Molds Fisher HealthCare 22-363-553
18 gauge needle Becton Dickinson 305199
Povidone iodine Fisher Scientific 19-027132
70% ethanol Fisher Scientific BP82011
Infusion sets for single use Weigao SFDA 2012 3661704
Phosphate buffered saline Gibco 10010023
Tapes 3M Scotch 8915
Cotton pad Vinda Dr.P
Silicone prosthesis Custom made
Brightfield microscope Olympus VS120
Ruler tool Adobe Photoshop

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References

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