استخدام كبسولات لالتلطيخ السلبي من العينات الفيروسية ضمن بيوكنتينمنت

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

يوفر هذا البروتوكول تعليمات لعينات فيروس تلطيخ السلبية التي يمكن استخدامها بسهولة في بسل-2، -3، أو -4 المختبرات. ويشمل استخدام كبسولة المعالجة المبتكرة، الذي يحمي شبكة المجهر الإلكتروني انتقال ويوفر للمستخدم التعامل أسهل في البيئات أكثر اضطرابا ضمن بيوكنتينمنت.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

يستخدم انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) لمراقبة البنية التحتية للفيروسات ومسببات الأمراض الميكروبية الأخرى مع قرار نانومتر. معظم المواد البيولوجية لا تحتوي على عناصر كثيفة قادرة على تشتت الإلكترونات لخلق صورة؛ وبالتالي، وصمة عار السلبية، الذي يضع أملاح المعادن الثقيلة الكثيفة حول العينة، مطلوب. من أجل تصور الفيروسات في تعليق تحت تيم يجب تطبيقها على شبكات صغيرة المغلفة مع سطح شفاف فقط نانومتر سميكة. ونظرا لصغر حجمها وهشاشتها، يصعب التعامل مع هذه الشبكات وتتحرك بسهولة بواسطة التيارات الهوائية. يتم تلف السطح الرقيق بسهولة، وترك العينة صعبة أو مستحيلة للصورة. يجب التعامل مع الفيروسات المعدية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك) وبعضها يتطلب بيئة مختبرية حيوية. تلوث الفيروسات في مستويات السلامة الحيوية (بسل) -3 و -4 يشكل تحديا خاصا لأن هذه البيئات أكثر اضطرابا والفنيين مطلوب to ارتداء معدات الوقاية الشخصية (ب)، مما يقلل من البراعة.

في هذه الدراسة، قمنا بتقييم جهاز جديد للمساعدة في الفيروسات تلطيخ السلبية في بيوكنتينمنت. الجهاز هو كبسولة التي تعمل بمثابة طرف ماصة المتخصصة. مرة واحدة يتم تحميل شبكات في كبسولة، المستخدم ببساطة ينضح الكواشف في كبسولة لتسليم الفيروس والبقع إلى شبكة مغلفة، وبالتالي القضاء على التعامل مع المستخدم من الشبكات. على الرغم من أن هذه التقنية تم تصميمها خصيصا للاستخدام في بسل-3 أو -4 بيوكنتينمنت، فإنه يمكن تخفيف إعداد العينات في أي بيئة المختبر من خلال تمكين السهل تلطيخ السلبية من الفيروس. ويمكن أيضا أن تطبق هذه الطريقة نفسها لإعداد عينات تيم الملون السلبي من الجسيمات النانوية، والجزيئات الكبيرة وعينات مماثلة.

Introduction

انتقال المجهر الإلكتروني (تيم) هو أداة فعالة لعرض التشكل والبنية التحتية من العينات البيولوجية التي هي صغيرة جدا أن ينظر إليها مع المجهر الضوئي التقليدي 1 ، 2 ، 3 ، 4 . تيمس تبادل لاطلاق النار الإلكترونات من خلال عينة رقيقة جدا تنتج صورة عالية الدقة والإلكترونات لديها طول موجي أقصر بكثير من الضوء. المناطق من العينة التي ثني أو منع الإلكترونات تظهر مظلمة، في حين أن المناطق التي الإلكترون لوسنت تظهر بيضاء.

عدم وجود مادة كثيفة الإلكترون يجعل من الصعب فيروسات لعرض تحت تيم لأنها لا يمكن مبعثر الإلكترونات. تلطيخ السلبية هي الطريقة الأكثر شيوعا المستخدمة لخلق التباين وعرض الفيروسات مع تيم. وقد اقترح أول إجراء سلبي تلطيخ من قبل برينر وهورن في عام 1959، استنادا إلى تجربة حيث هول (1955) وهكسلي (1957) أوسرفي ظهور الهياكل البيولوجية في النقيض العكسي عندما مغمورة في مادة كثيفة الإلكترون 5 . وقد ظلت عملية التلطيخ السلبي دون تغيير تقريبا خلال نصف القرن الماضي. تلطيخ سلبي ينطوي لفترة وجيزة تطبيق محلول ملح المعادن الثقيلة لعينة على شبكة تيم في محاولة لإحاطة الفيروس مع مادة كثيفة دون تسلل الفيروس 6 . هذا يخلق الحدود المظلمة ويكشف عن شكل الجسيمات 5 . تستخدم هذه الدراسة اثنين من الكواشف لالتلطيخ السلبي، خلات اليورانيل (وا) وحمض البوتاسيوم فوسفهوتنغستيك (بتا). كل من هذه البقع تستخدم عادة لصبغة سلبية العينات البيولوجية الصغيرة، مثل الفيروسات، المجمعات البروتين، والجسيمات النانوية 7 ، 8 ، 9 .

تقنية تلطيخ السلبية التقليدية هي دليل قطرة سلبية تلطيخ التكنولوجيانيك 7 . هذا الأسلوب يتطلب معالجة دقيقة من الصغيرة، والهياكل تيم الهشة مع ملقط لتطبيق كميات صغيرة من عينة الفيروس، وصمة عار، ويشطف. بروتوكول إعداد نموذجي ينطوي على تطبيق قطرة من تعليق عينة على سطح شبكة تيم المغلفة فيلم ( الشكل 1A ). بعد تعلق العينة على سطح الفيلم، يتم شطف الشبكة لإزالة الفيروسات غير الملتصقة وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى دقيقة، اعتمادا على نوع العينة. السائل الزائد هو الأشرار بعيدا عن الشبكة عن طريق لمس قطعة من ورقة الترشيح على حافة الشبكة.

يتطلب أسلوب قطرة اليدوي أن يتم كل شبكة بشكل فردي. إذا لم يتم التعامل معها بعناية، يتم ثقب شبكات تيم المغلفة بسهولة، عازمة، أو ملوثة. معالجة عينات متعددة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في تتبع الشبكات وضمان تلطيخ متسقة لكل عينة. هذا الإجراء تلطيخ دليل أكثر من ذلك بكثير د(بسل) -3 و -4 مختبرات احتواء حيوي، وذلك بسبب معدات الوقاية الشخصية المطلوبة (ب) المطلوبة لهذه البيئات. معدات الوقاية الشخصية مرهقة وبيئة الاحتواء البيولوجي هو أكثر اضطرابا بكثير مقارنة مع مختبر منتظم. ويطلب من العاملين في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-3 ارتداء زوجين من القفازات والعمل في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية (بسك). هذه الطبقة المزدوجة من القفازات تقلل من حساسية اللمس وتقيد حركة المحركات الدقيقة. تدفق الهواء من بسك الذي يحمي المستخدم ويساعد على منع تلوث العينة يمكن أن يسبب العينات والبقع لتجف بسرعة كبيرة مما يؤثر على جودة وصمة عار. تدفق الهواء المضطرب قوي في بسك يمكن أيضا ضربة بسرعة بعيدا الشبكة التي ليست مضمونة بشكل جيد. في مختبرات الاحتواء البيولوجي بسل-4، هناك متطلبات إضافية للسلامة. ويطلب من الموظفين ارتداء بدلة ضغط إيجابية، مما يزيد من تقييد الحركة المادية والقدرة على رؤية واضحة والتلاعبصفح الشبكات. فني يعمل في بسل-4 أيضا يرتدي على الأقل 2 أزواج من القفازات، مع الزوج الخارجي كونه قفاز سميك مما يقلل كثيرا من البراعة والإحساس اللمسي. وأخيرا، فإن ملقط تستخدم للتعامل مع شبكات تيم حادة، مما يشكل خطرا على فني نظرا لقدرتها على ثقب القفازات. مع كبسولات تحتوي على شبكات، ملقط ليست ضرورية، وبالتالي توفير بديل آمن، ملقط خالية لمعالجة الشبكات في بيوكنتينمنت. وأخيرا، فإن الكبسولات توفر أيضا وسيلة فعالة لتخزين الشبكات أثناء المعالجة، والتطهير بخار الأوزميوم، وأثناء التخزين. وبالتالي الحفاظ على الشبكات المنظمة وآمنة من التلف.

في هذا التقرير، ونحن نقدم طريقة جديدة لشبكات تل تلطيخ السلبية في مختبرات الاحياء البيولوجية التي تستخدم كبسولات مبريب / ز، جهاز يستند إلى كبسولة لمعالجة الشبكة وتلطيخ 10 ، 11 ، 12 . كبسولة أكوموتعديل اثنين من شبكات تيم، ويقلل من التعامل المباشر، ويقلل من احتمال تلف الشبكة. الكبسولة تعلق مباشرة إلى ماصة واحدة أو متعددة القنوات بنفس الطريقة كما غيض ماصة، والسماح لتطبيق السوائل المختلفة للشبكات الواردة في. وهذا يتيح إعداد في وقت واحد من عينات متعددة مع شبكات مكررة ( الشكل 1B ). إلى وصمة عار سلبية مع كبسولات يتم استنشق عينة الفيروس في كبسولة وعقد لمدة 10 دقيقة للسماح للفيروسات امتزاز على أسطح الشبكة. ثم يتم غسل الشبكات مع الفيروس كثف مع منزوع الأيونات (دي) المياه وملطخة إما وا أو منطقة التجارة التفضيلية لبضع ثوان إلى 1 دقيقة. تستخدم هذه العملية نفس الخطوات بروتوكول والكواشف كطريقة قطرات اليدوي. والفرق هو أن كل عمل يحدث داخل الكبسولة مع عدم وجود مناولة المادية للشبكات. ( أرقام 1C ، 1D ).

وكان الغرض من هذه الدراسة لتقييم كبسولات كماطريقة جديدة للتلطيخ السلبي لعينات الفيروسات في بيئات الاحتواء البيولوجي. كما بحثت هذه الدراسة نوعية الصور تيم المنتجة من اثنين من إجراءات تعطيل الفيروس المختلفة: 1) تعطيل السريع، مع 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد، و 2) 24 ساعة تعطيل مع 2٪ غلوتارالدهيد. وقد أجريت كل من هذه باستخدام كبسولات. وأخيرا، قمنا بتقييم اثنين من البقع السلبية المستخدمة عادة، وا و بتا، لاستخدامها في الكبسولة. 13

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد التجربة في بيئة بسل-2 قبل العمل مع عينات الفيروسات

  1. إعداد أو شراء فورمفار وشبكات النحاس المغلفة الكربون تيم، وعادة 200-400 شبكة.
  2. إدراج شبكات تيم المغلفة في كبسولات.
    1. استخدام عدسة مكبرة لجعل هذه العملية سهلة لأداء. يمكن إدراج واحد أو اثنين من الشبكات في كل كبسولة. يمكن شراؤها كبسولات محملة مسبقا للقضاء على هذه الخطوة إذا رغبت في ذلك.
  3. نقل الكبسولات مع إدراج شبكات المغلفة تيم، جنبا إلى جنب مع غيرها من الكواشف والكواشف، إلى الاحتواء البيولوجي حيث سيتم الملطخة الفيروسات بشكل سلبي.

2. طريقة كبسولة للتلطيخ السلبي في بيوكنتينمنت باستخدام غلوتارالدهيد مائي و 1٪ أوزميوم تيبروكسيد بخار إيناكتيفاتيون

  1. داخل بيوكنتينمنت بسك، نضح 40 ميكرولتر من تعليق الفيروس في كبسولة تعلق على ماصة.
    ملاحظة: يبقى ماصة تعلق على الكبسولة ه حتى اكتمال العملية. إعداد الفيروسات وفقا لنشرنا السابق 14 .
  2. وضع ماصة على جانبها لمدة 10 دقيقة مع شبكات المنحى أفقيا. هذا هو لتعزيز توزيع حتى من جسيمات الفيروس على شبكات المغلفة.
  3. تعطيل الفيروس داخل الكبسولة داخل بيوكنتينمنت ش.م.ب.
    1. التقاط ماصة وخفض المكبس للاستغناء عن حل الفيروس في حاوية النفايات.
    2. نضح 40 ميكرولتر من 2٪ غلوتارالدهيد تثبيتي في كبسولات.
      تنبيه: الجلوتارالدهيد هو مادة كيميائية خطرة ويتطلب الحماية المناسبة. ويمكن استخدام الجلوتارالدهيد لفترات قصيرة في بسك العادي، ولكن يتطلب كاشف مفتوح الموسعة العمل في بسك مجاري الهواء أو غطاء الدخان الكيميائية.
    3. وضع ماصة على جانبها لمدة 20 دقيقة. هذا هو لضمان عينات ثابتة بشكل جيد.
    4. طرد تثبيتي ونضح 40 ميكرولتر من الماء دي في كبسولات ل wالرماد بعيدا تثبيتي. كرر هذه الخطوة غسل ما مجموعه 3 دورات شطف.
  4. نضح 40 ميكرولتر إما 1٪ خلات اليورانيل (وا) أو 1٪ حمض البوتاسيوم فوسفهوتنغستيك (بتا) في كبسولات والسماح للجلوس لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: قد يتفاوت وقت تلطيخ من 10 ثانية إلى 1 دقيقة بناء على عينة الفيروس.
    تنبيه: وا هو باعث ألفا، وسموم التراكمي. التعامل معها مع الحماية المناسبة.
  5. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات عن طريق لمس قطعة من ورقة الترشيح على حافة الشبكات في حين تبقى الشبكات داخل كبسولة.
  6. أوزميوم رباعي أكسيد بخار تعطيل الإجراء.
    1. وضع كبسولة، مع فتح الغطاء، إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على ورقة الترشيح غارقة في محلول رباعي أكسيد الأوسيميوم 1٪.
      الحذر: رباعي أكسيد الأوسيميوم هو سامة للغاية مع انخفاض ضغط البخار. يجب أن تستخدم في بسك المجاري أو غطاء الدخان الكيميائية. التعامل معها مع الحماية المناسبة. تحذير آخرالمعلومات في منطقة العمل.
    2. ختم أنبوب الطرد المركزي 50 مل لمدة 1 ساعة للسماح نفاذية كاملة من بخار رباعي أكسيد الأوسميوم. ثم، بعد ذلك تطهير ونقل الأنبوب من بيوكنتينمنت إلى مرفق بسل-2 إم.
  7. إزالة شبكات إم من الكبسولة.
    1. في مرفق بسل-2 إم، وإزالة كبسولة من أنبوب الطرد المركزي ووضعه على ماصة.
    2. نضح 40 ميكرولتر من الماء دي في كبسولة واستغناء الماء في حاوية النفايات ثلاث مرات.
    3. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات باستخدام ورقة مرشح للمس حافة الشبكات.
    4. بعد تجفيف الهواء، وتخزين الشبكات للتصوير تيم لاحق.

3. طريقة كبسولة لتعطيل في بيوكنتينمنت مع 2٪ غلوتارالدهيد، تليها تلطيخ سلبي في مختبر بسل-2

  1. إجراء تعطيل الفيروسات.
      تنبيه: الجلوتارالدهيد هو مادة كيميائية خطرة ويتطلب الحماية المناسبة. ويمكن استخدام الجلوتارالدهيد لفترات قصيرة في بسك العادي، ولكن يتطلب كاشف مفتوح الموسعة العمل في بسك مجاري الهواء أو غطاء الدخان الكيميائية.
    1. تعطيل الفيروسات مع تثبيتي لمدة لا تقل عن 24 ساعة قبل التعبئة والتغليف، وإزالة التلوث، ونقله إلى مرفق بسل-2 إم.
  2. في مرفق بسل-2 إم، نضح الفيروس وخليط تثبيتي في كبسولة، التي تحتوي على اثنين من شبكات تيم، تعلق على ماصة.
  3. وضع ماصة أفقيا لمدة 10 دقيقة مع الشبكات الموجهة أفقيا.
    ملاحظة: هذا هو لتعزيز توزيع حتى من جسيمات الفيروس على شبكات تيم.
  4. التقاط ماصة وخفض المكبس لطرد الفيروس إلى حاوية النفايات. نضح 40 ميكرولتر من ديالماء في الكبسولات وطرده في حاوية النفايات لمدة 3 دورات شطف.
  5. نضح 40 ميكرولتر إما 1٪ وا أو 1٪ بتا في كبسولات لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: تباين الوقت تلطيخ من 10 ثانية إلى 1 دقيقة على أساس عينة الفيروس.
    تنبيه: وا هو باعث ألفا، وسموم التراكمي. التعامل معها مع الحماية المناسبة.
  6. إزالة الكبسولة من ماصة وصمة عار تجفيف الشبكات عن طريق لمس حافة الشبكات إلى قطعة من ورقة الترشيح. الهواء تجفيف الشبكات وتخزينها لتصوير تيم لاحق.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

طريقة كبسولة تنتج نوعية جيدة تلطيخ سلبي للتصوير تيم:

أولا، قمنا بتقييم جودة الصور التي تم إنشاؤها باستخدام كل من طريقة قطيرة اليدوي وطرق كبسولة لتلطيخ سلبي فيروس زايير إيبولافيروس. الفيروسات الإيبولافيروسية هي أعضاء في عائلة فيلوفيريداي ، جنبا إلى جنب مع فيروس ماربورغ. وعادة ما يكون إيبولافيروس 80 إلى 100 نانومتر في القطر ويمكن أن يزيد عن 1000 نانومتر في الطول. يجب التعامل مع فيروس إيبولافيروس في بيئة بيسل-4 بيوكنتينمنت. ويبين الشكل 2 الصور التي تم إنشاؤها باستخدام طريقة قطرة اليدوية وطريقة كبسولة لالتلطيخ السلبي. الشكل 2A (طريقة قطرة اليدوية) والشكل 2B (طريقة كبسولة) تظهر عينات فيروس إيبولافيروس التي لديها تفاصيل محددة بوضوح مع هياكل نوكليوكابسيد في وسط فيريون، والبروتين سكري واضح فيروس إبولافs على السطح. وهكذا، فإن كل من كبسولة وأساليب قطرة لديها القدرة على إنتاج صور تيم نوعية مماثلة.

مقارنة وتقييم جودة الصورة إم بعد التعطيل السريع مع غلوتارالدهيد مائي و 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد مقابل 24 ساعة تعطيل مع 2٪ غلوتارالدهيد مائي، وذلك باستخدام طريقة كبسولة:

قمنا بتقييم جودة الصور تيم ولدت من طريقتين مختلفة من تعطيل عينة باستخدام فيروس تشيكونغونيا. شيكونغونيا الفيروس هو عضو في جنس الألفاوية في الأسرة الفيروسات الطخائية. وهو كروية بقطر 60-70 نانومتر. فيريون يحتوي على مغلف غنية في بروتين سكري التي تشكل المسامير تريمريك على السطح الفيروسي. يجب التعامل مع فيروس تشيكونغونيا في بسل-3. ويتحقق تعطيل سريع باستخدام 2٪ غلوتارالدهيد لمدة 20 دقيقة تليها 1 ساعة التعرض إلى 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد، مع كامل نيغعملية تلطيخ أتيف تحدث في كبسولة داخل بسك في المختبر البيولوجي ( الشكل 1C ). ومع ذلك، عند استخدام غلوتارالدهيد 2٪ لمدة 24 ساعة لتعطيل الفيروس، يحدث التعطيل داخل بيئة بيوكنتينمنت، ولكن يتم إجراء 1٪ وا إجراء وصمة عار سلبية باستخدام طريقة كبسولة في مختبر بسل-2 ( الشكل 1D ). هذه الإجراءات تعطيل لا تنتج نفس جودة الصور ( الشكل 3 ). فمن الواضح من الشكل 3 أن التثبيت في غلوتارالدهيد دون وجود رباعي أكسيد الأوسميوم ( الشكل 3A ، 3B ) يظهر المزيد من التفاصيل التركيبية من العينات التي أعدت مع غلوتارالدهيد وأكسيميوم رباعي أكسيد ( الشكل 3C ، 3D ).

طريقة الكبسولة تعمل بشكل جيد باستخدام خلات الأورانيل (وا) والفوسف أوتنغستيك حمض (بتا) كما البقع السلبية للألدهيد عينات ثابتة.

وترد أمثلة على وا و بتا تلطيخ السلبي باستخدام طريقة كبسولة في الشكل 4 على ألدهيد الثابتة الفيروسات مثل الجسيمات (فلبس). و فلبس هي البروتينات تجميعها في الفيروسات مثل الهياكل، ولكن لا تحتوي على أي مادة وراثية الفيروسية. وهي تستخدم عادة في تطوير اللقاحات والبحوث الفيروسية الأساسية. تلطيخ سلبي هو أداة قيمة لتقييم التجمع فلب والمورفولوجيا. استخدمنا كلا وا و بتا للتلطيخ السلبي من فلبس مع طريقة الكبسولة. كل البقع عرض نتائج ذات جودة عالية مع بروتين سكري واضحة وحدود محددة بوضوح من إيبولا نانو-فلبس 15 ( الشكل 4A ، 4B ) والفئران فقر الدم فلبس 16 ( الشكل 4C ، 4D ).

ther.within الصفحات = "1"> شكل 1
الشكل 1: نظرة عامة لطرق التلطيخ السلبية. ( A ) يتم تنفيذ طريقة قطرة اليدوية عن طريق نقل بالتتابع شبكات تيم من قطرة إلى قطرة من العينة، يشطف والبقع. ( ب ) إعداد طريقة كبسولة مع شبكات وتطبيق تعليق العينة. ( C ) إجراء نموذجي باستخدام طريقة الكبسولة في بيوكنتينمنت مع التعطيل على المدى القصير مع 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد. ( D ) الإجراء الموصى به باستخدام طريقة كبسولة في بيوكنتينمنت مع تعطيل على المدى الطويل مع 2٪ غلوتارالدهيد. تم نشر الشكل سابقا وإعادة استخدامها مع أذونات من المرجع 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

er.within الصفحات = "1"> الشكل 2
الشكل 2: مقارنة 1٪ منطقة التجارة التفضيلية السلبي الملون إيبولافيروس الجسيمات. ( A ) ملطخة السلبي مع طريقة قطرة اليدوي. ( ب ) الملون السلبي باستخدام طريقة الكبسولة. تم نشر الشكل سابقا وإعادة استخدامها مع أذونات من المرجع 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3
الشكل 3: 1٪ وا تلطيخ السلبية مع كبسولة طريقة تشيكونغونيا فيروس باستخدام إجراءات تعطيل مختلفة. ( A ، B ) لمدة لا تقل عن 24 ساعة مع غلوتارالدهيد 2٪ فقط. ( C ،د) التعطيل السريع مع 2٪ غلوتارالدهيد و 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد. تم نشر الشكل سابقا وإعادة استخدامها مع أذونات من المرجع 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4: أمثلة من حمض فوسفهوتنغستيك (بتا) و أورانيل خلات (وا) الملطخة سالبة الفيروسات مثل الجسيمات (فلبس) باستخدام طريقة كبسولة. ( A ) لمحة التكبير منخفضة من 1٪ بتا الملون إبولا نانو-فلبس. ( B ) التكبير عالية تيم صورة تظهر التفاصيل الهيكلية من بتا الملون إبولا نانو-فلبس. ( C ) لمحة التكبير منخفضة من 1٪ وا الملون الفئران سرطان الدم فلبس. ( D ) التكبير عالية تيم صورة تظهر ديت الهيكليآلام من وا الملون الفئران سرطان الدم فلبس مع بروتين سكري الفيروسي على سطحها. تم نشر الشكل سابقا وإعادة استخدامها مع أذونات من المرجع 13 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

تلطيخ السلبية هي تقنية تيم قيمة لتقييم وتحجيم الفيروسات والمجمعات البروتين والجسيمات النانوية. وقد تم إعداد قطرات من هذه العينات عن طريق التحرك اليدوي للشبكات من كاشف إلى البقع السلبية البروتوكول الكلاسيكي لأكثر من نصف قرن. إنها عملية بسيطة، ولكنها تتطلب الخبرة المكتسبة من خلال التدريب لإنجازها بنجاح. لا يزال يعتبر التلطيخ السلبي ممتازة من مجموعة من أحدث المهارات والمطلوب للغاية في العديد من مختبرات تيم. طريقة الكبسولة لديها العديد من المزايا المميزة على طريقة قطرات اليدوي، وخاصة في مختبرات الاحتواء البيولوجي. أولا، طريقة قطرة اليدوي يتطلب تدريبا كبيرا والخبرة قبل أن يمكن أن يؤديها بنجاح، في حين أن سهلة لاستخدام طريقة كبسولة يمكن أن يتحقق من قبل الفنيين مستوى الدخول عن طريق بيبتينغ بسيطة. التحدي الأكبر مع طريقة قطرة اليدوية هو التعامل الناجح شبكات تيم مع ملقط في بسل-3 و بسل-4 معدات الوقاية الشخصية بسبب tس تقلص إلى حد كبير عن طريق اللمس الإحساس والبراعة. تتأثر شبكات تيم المغلفة الهشة بسهولة أو ثقب بواسطة ملقط. لا يتم الكشف عن الأضرار التي لحقت شبكة تيم المغلفة حتى ينظر إليها مع تيم. ميزة ثانية من كبسولات هو أن يتم التعامل مع شبكات تيم فقط مباشرة عندما يتم إدراجها في كبسولات وعندما يتم إزالتها لإدراجها في المجهر الإلكتروني. وسواء أكانت تعمل في مختبر التحصين البيولوجي أو في مرفق بسل-2 إم، فلا توجد معالجة مباشرة للشبكة. والميزة الثالثة من طريقة الكبسولة هي أن كلا الجانبين من الشبكة مغطاة بالفيروسات والبقع. هذا يمكن أن يكون مفيدا عندما تركيز العينة منخفضة؛ ولكن هذا يمكن أن يسبب الكثير من العينة إذا كان تركيز مرتفع، أو يؤدي إلى التخفيف من العينة قبل استخدامها.

السلبي تلطيخ شبكات متعددة باستخدام تقنية قطرة اليدوي هو مضيعة للوقت لأن كل عينة تحتاج إلى أن تكون على استعداد فردي وملطخة. وهذا يؤدي إلى صعوبات أوبتاينينغ متسقة، استنساخه استنساخه. وعلاوة على ذلك، تتبع العديد من الشبكات الفردية هو دائما تحديا. كل كبسولة يحمل اثنين من شبكات ويمكن كبسولات متعددة تعلق على ماصة الأقنية، وتبسيط العملية. لذلك، كبسولات ضمان أن يتم ملطخة الشبكات باستخدام عملية مماثلة جدا، في ظل ظروف عينة متسقة، وفي الوقت نفسه. ويمكن وصف الكبسولات للمساعدة في التنظيم، وبالتالي تقليل إمكانية خلط أو سوء تعريف الشبكات. وهناك مشكلة شائعة أخرى تواجه عند استخدام طريقة قطرة اليدوي هو تلوث الشبكة. ويمكن أن يحدث هذا عندما تترك الشبكات في الهواء الطلق لفترة طويلة جدا أو يتم إسقاطها. كبسولة يحمي شبكات تيم من الهواء الطلق ويحمل لهم بشكل آمن بحيث يتم إسقاطها أبدا. كبسولات توفر أكبر السيطرة التجريبية والتكرار عند إعداد وتلطيخ سلبي لأن الكبسولة هي بيئة أكثر رقابة.

كبسولات يمكن شراؤها قبل محملة إذا ديانجب. يدويا تحميل الشبكات في كبسولات يأخذ بعض الممارسات لضمان الشبكات ليست معطوبة. طريقة كبسولة يتطلب أيضا أكثر قليلا عينة وصمة عار من طريقة قطرة اليدوي. طريقة كبسولة يتطلب ما لا يقل عن 40 ميكرولتر من العينة، مقارنة مع طريقة قطرة اليدوية، والتي يمكن القيام به مع اقل من 8 ميكرولتر.

تعطيل الفيروسات هو جزء مهم من تلطيخ السلبي في بسل-3 و بسل-4، لأنها تسمح للفيروس المعطل أن تؤخذ من مختبرات الاحتواء البيولوجي للتصوير في منشأة إم. التعطيل باستخدام فيكساتيفس لديه فائدة إضافية من تحديد الفيروس، ومنع تدهور. هناك طريقتان مختلفتان لتعطيل عينة الفيروس، وكلاهما تم فحصها في هذه الدراسة. الأولى تلتزم الفيروس لشبكات تيم المغلفة، ويحدد الفيروسات لمدة 20 دقيقة في محلول غلوتارالدهيد 2٪، تليها 1 ساعة التعرض للشبكة لبخار أكسيد الأوسميوم ( الشكل 1C ). هذا إناكتيفاتأيون هو مفيد لأنه يوفر الوقت من خلال تمكين العينة أن تؤخذ من المختبر البيولوجي بعد 1 ساعة و 20 دقيقة. كما أنه يمنع التخفيف من الفيروس قبل تطبيق لشبكة تيم المغلفة، لذلك قد يكون من الضروري للعينات يشتبه في أن يكون بالقرب من حد الكشف تيم. ومع ذلك، 1٪ أكسيد الأكسيميوم رباعي أكسيد يقلل من جودة الصور تيم كما يمكن الأوسميوم مزيد من وصمة عار العينة ( الشكل 3 ). وتظهر التقارير السابقة التعرض لمدة 5 دقائق لبخار أكسيد الأوكسيوم يوفر نتائج كبيرة عندما تلطيخ سلبي. ومع ذلك، يعد التعرض المطلوب لإبطال الفيروس المطلق ولدت خليط من تلطيخ الإيجابية والسلبية 17 . طريقة التعطيل الثانية تنطوي على حد أدنى من 24 ساعة في محلول غلوتارالدهيد 2٪، ولا يتطلب الأكسيميوم العلاج بخار رباعي أكسيد ( الشكل 1D ). هذه الطريقة الثانية يستغرق وقتا أطول لإكمال كما لم يتم إزالة العينة من لابو بيتينمنت لابولمدة 24 ساعة، ولكن يمكن أن تكون مفيدة لأنه يسمح تلطيخ سلبي الذي يتعين القيام به خارج بيوكنتينمنت في بيئة بسل-2، ويزيل الحاجة إلى رباعي أكسيد الأوسيميوم الخطرة. نتائجنا تثبت أن 24 ساعة من تعطيل غلوتارالدهيد تنتج صور تيم أعلى جودة من عندما يتم التعامل مع عينات مع بخار رباعي أكسيد الأوزميوم ( الشكل 3 ).

تم استخدام اثنين من البقع السلبية في هذه التجربة: وا و بتا. وتستخدم كل من البقع كحل 1٪. وا، الملح خلات من اليورانيوم، يعمل بشكل جيد كما وصمة عار سلبية لأن ذرات اليورانيوم الكثيفة مبعثر الإلكترونات 5 . بتا، وهو حمض هيتيروبولي، وبالمثل يعمل بشكل جيد كما وصمة عار سلبية بسبب ذرات التنغستن الكثيفة 5 . ويفضل أحيانا منطقة التجارة التفضيلية عبر وا لأنها أقل سمية بكثير، ومهيجة خفيفة فقط إذا استنشقت أو اتصلت. عندما عينات تلطيخ السلبية غير المثبتة، وانخفاض درجة الحموضة من وا يجب أن تعتبر لأنها يمكن أن تسبب الضرر رo العينة. الفيروسات المستخدمة في هذه التجربة تتطلب تثبيت لتعطيل، لذلك كلا وا و بتا حققت نتائج مماثلة ولا يمكن الكشف عن ميزة متميزة إما وصمة عار. كل البقع هي سهلة للعمل مع، وكلاهما تنتج نفس جودة الصور تيم ( الشكل 4 ).

وعموما، فإن طريقة الكبسولة هي أسهل للاستخدام في بيئة بيوكنتينمنت ويمكن استخدامها كبديل لطريقة قطرات اليدوية. باستخدام كبسولات يخفف عيوب التلاعب عينة وعوائد نوعية جيدة الصور تيم. الصور التي تنتج باستخدام طريقة الكبسولة هي مماثلة للصور المنتجة باستخدام طريقة قطرة اليدوي. تعطيل فيروس قصير مع رباعي أكسيد الأوسيميوم يحسن سرعة، ولكن ينبغي أن تستخدم إلا إذا خفضت جودة الصورة مقبولة، أو يشتبه في تمييع الفيروس وضعه تحت حد الكشف تيم للإجراء. كل من وا و بتا توفر نتائج مماثلة مع عينات الفيروس الثابتة المستخدمة في هذه الدراسة. حوويفر، قد تكون النتائج مختلفة عند تلطيخ الفيروسات غير المثبتة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الآراء والتفسيرات والاستنتاجات والتوصيات الواردة في هذه المادة هي تلك من المؤلفين وليس بالضرورة أيد من قبل الجيش الأمريكي أو وزارة الدفاع.

Acknowledgements

ونود أن نعرب عن شكرنا للدكتور جون كارا وروينا شكمان على تقديمه إيبولا نانو-فلبس المنقى والدكتور راجيني مدهساني لتوفير فيروس تشيكونغونيا والدكتور تشارلز (جيسون) لإيصال فئران الفئران المختبرية التي تعبر عن البروتينات السكرية لفيروس إيبولافيروس. نود أيضا أن نشكر ماج كارل سوفلر على تسهيل برنامج التدريب الصيفي (سيب) وبرنامج التلمذة الصناعية والهندسية (سيب) والدكتورة كاثرين فيلهلمسن للتدريب على السلامة في المختبر.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics