Biocontainment 내 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 캡슐의 활용

Immunology and Infection

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Summary

이 프로토콜은 BSL-2, -3 또는 -4 실험실에서 쉽게 사용할 수있는 음성 염색 바이러스 샘플을 제공합니다. 여기에는 투과 전자 현미경 그리드를 보호하고 생체 내에서 난기류 환경에서 사용자가보다 쉽게 ​​취급 할 수있게 해주는 혁신적인 가공 캡슐의 사용이 포함됩니다.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

Transmission electron microscopy (TEM)는 나노 미터 해상도의 바이러스 및 기타 미생물 병원체의 미세 구조를 관찰하는 데 사용됩니다. 대부분의 생물학적 물질은 전자를 산란시켜 이미지를 생성 할 수있는 조밀 한 요소를 포함하지 않습니다. 따라서 시료 주위에 짙은 중금속 염을 포함하는 음성 염색이 필요합니다. TEM 하에서 현탁액에서 바이러스를 가시화하기 위해서는 나노 미터 두께의 투명한 표면으로 코팅 된 작은 그리드에 적용해야합니다. 크기가 작고 부서지기 쉽기 때문에이 그리드는 취급하기가 어렵고 기류로 쉽게 움직일 수 있습니다. 얇은 표면은 쉽게 손상되어 이미지를 어렵게하거나 불가능하게 만듭니다. 감염성 바이러스는 생물 안전성 캐비닛 (BSC)에서 처리해야하며 일부는 생물학적 환경 실험실 환경이 필요합니다. 특히 생물 안전성 수준 (BSL) -3 및 -4로 바이러스를 염색하는 것은 이러한 환경이 더욱 난기류이며 기술자가 필요하기 때문에 특히 어려움o 손재주를 감소시키는 개인 보호 장비 (PPE)를 착용하십시오.

이 연구에서 우리는 생물학적 성취에서 음성 염색 바이러스를 돕기위한 새로운 장치를 평가했습니다. 이 장치는 전문 피펫 팁으로 작동하는 캡슐입니다. 그리드가 캡슐에로드되면 사용자는 간단하게 캡슐에 시약을 흡인하여 캡슐화 된 그리드에 바이러스와 얼룩을 전달하여 그리드의 사용자 처리를 제거합니다. 이 기술은 BSL-3 또는 -4 생체 적합에 사용하기 위해 특별히 설계되었지만 바이러스의 음성 염색을 용이하게하여 모든 실험실 환경에서 시료 준비를 쉽게 할 수 있습니다. 이 같은 방법은 나노 입자, 거대 분자 및 유사한 표본의 음성 스테인드 TEM 표본을 준비하는 데에도 적용 할 수 있습니다.

Introduction

투과 전자 현미경 (Transmission Electron Microscopy, TEM)은 전통적인 광학 현미경 1 , 2 , 3 , 4 로 볼 수 없을 정도로 작은 생물 표본의 형태 및 초 미세 구조를 관찰하는 데 효과적인 도구입니다. TEM은 매우 얇은 표본을 통해 전자를 쏘아 전자가 빛보다 훨씬 짧은 파장을 가지므로 고해상도 이미지를 생성합니다. 전자를 구부리거나 차 단하는 샘플의 영역은 어둡게 보이고 전자 발광 인 영역은 흰색으로 보입니다.

전자 밀도가 낮 으면 전자를 산란시킬 수 없으므로 TEM 하에서 바이러스를보기가 어렵습니다. 음성 염색은 대조를 만들고 TEM으로 바이러스를 관찰하는 데 사용되는 가장 일반적인 방법입니다. 최초의 음성 염색 절차는 Hall (1955)과 Huxley (1957)가 관찰 한 실험을 바탕으로 1959 년 Brenner와 Horne에 의해 제안되었다전자 밀도가 높은 물질에 잠길 때 역으로 대조되는 생물학적 구조의 출현 5 . 네거티브 얼룩의 과정은 지난 반세기 동안 사실상 변하지 않았습니다. 부정적인 염색 간단히 바이러스 6 침투하지 않고 고밀도 물질과 바이러스를 포위하기위한 시도의 TEM 그리드 샘플에 대한 중금속 염 용액을 적용하는 단계를 포함한다. 이것은 어두운 테두리를 만들고 입자의 모양을 드러냅니다 5 . 이 연구는 네거티브 염색을위한 2 가지 시약 인 uranyl acetate (UA)와 potassium phosphotungstic acid (PTA)를 사용합니다. 이 두 가지 얼룩은 일반적으로 바이러스, 단백질 복합체, 나노 입자 7 , 8 , 9 와 같은 작은 생물학적 시료를 부정적으로 오염시키는 데 사용됩니다.

기존의 음성 염색 기술은 수동 액적 음성 염색 기술입니다네크 7 . 이 방법은 작은 양의 바이러스 샘플, 얼룩 및 헹굼 물을 적용 할 수있는 집게가있는 작고 깨지기 쉬운 TEM 그리드를 정밀하게 처리해야합니다. 전형적인 준비 프로토콜은 필름 코팅 된 TEM 그리드 ( 그림 1A )의 표면에 샘플 현탁액을 떨어 뜨리는 것과 관련됩니다. 샘플을 필름 표면에 부착 한 후 그리드를 세척하여 비 점착성 바이러스를 제거하고 샘플 유형에 따라 몇 분에서 1 분 동안 UA 또는 PTA로 염색합니다. 그리드의 가장자리까지 여과지를 만져서 초과 액체가 그리드에서 멀리 떨어지게됩니다.

수동 물방울 방법은 각 그리드를 개별적으로 만들어야합니다. 조심스럽게 다루지 않으면 코팅 된 TEM 그리드는 쉽게 구멍이 뚫리거나 구부러 지거나 오염됩니다. 여러 샘플을 처리하면 그리드를 추적하는 데 어려움이 생길 수 있으며 각 샘플에 일관된 염색을 보장 할 수 있습니다. 이 수동 염색 절차는 훨씬 더 d이러한 환경에 필요한 개인 보호 장비 (PPE)로 인해 생물 안전성 수준 (BSL) -3 및 -4 생물 환경 실험실에서 수행 할 수없는 경우. PPE는 성 가시고 생체 환경은 일반 실험실에 비해 훨씬 혼란 스럽습니다. BSL-3 생물 공학 실험실에서 근무하는 인원은 2 쌍의 장갑을 착용하고 생물 안전성 캐비닛 (BSC)에서 작업해야합니다. 장갑의 이중층은 촉감 감도를 감소시키고 미세한 운동을 제한합니다. 사용자를 보호하고 샘플 오염을 방지하는 데 도움이되는 BSC의 공기 흐름은 샘플과 얼룩을 너무 빨리 말려서 얼룩 품질에 영향을 줄 수 있습니다. BSC의 강한 난기류는 또한 잘 보호되지 않은 그리드를 빠르게 날려 버릴 수 있습니다. BSL-4 생물 환경 실험실에서는 추가적인 안전 요구 사항이 있습니다. 작업자는 양압의 옷을 입어야한다. 신체적 인 움직임과 명확하게 보이고 조작 할 수있는 능력을 더 제한한다.그리드 그리드. BSL-4에서 일하는 기술자는 적어도 2 쌍의 장갑을 착용하고 외측 쌍은 두꺼운 장갑이어서 손재주와 촉각을 크게 감소시킵니다. 마지막으로, TEM 그리드를 처리하는 데 사용되는 집게는 날카 롭기 때문에 장갑을 뚫는 능력으로 인해 기술자에게 위험을 초래할 수 있습니다. 그리드가 포함 된 캡슐을 사용하면 포셉이 필요하지 않으므로 생체 적응에서 그리드를 조작하기위한 포셉이없는 안전한 대안을 제공 할 수 있습니다. 마지막으로, 캡슐은 가공, 오스뮴 증기 오염 제거 및 보관 중에 그리드를 저장하는 효과적인 방법을 제공합니다. 그리드를 조직적으로 안전하게 유지하고 손상으로부터 보호합니다.

이 보고서에서는 mPrep / g 캡슐, 그리드 처리 및 염색을위한 캡슐 기반 장치 인 10 , 11 , 12 를 사용하는 생물학적 접근 실험실에서 TEM 그리드를 음성으로 오염시키는 새로운 방법을 소개합니다. 캡슐 받침목2 개의 TEM 그리드를 수정하고 직접 핸들링을 최소화하며 그리드 손상 가능성을 줄입니다. 캡슐은 피펫 팁과 동일한 방식으로 단일 또는 다중 채널 피펫에 직접 부착되어 다양한 액체를 내부의 그리드에 적용 할 수 있습니다. 이렇게하면 중복 그리드 ( 그림 1B )로 여러 샘플을 동시에 준비 할 수 있습니다. 캡슐로 음이온을 붙이려면 바이러스 샘플을 캡슐에 흡입하고 10 분간 보관하여 바이러스가 그리드 표면에 흡착되도록합니다. 흡착 된 바이러스가있는 그리드는이어서 탈 이온 (dI) 물로 세척하고 UA 또는 PTA로 수 초에서 1 분 동안 염색합니다. 이 프로세스는 수동 드롭 렛 방법과 동일한 프로토콜 단계 및 시약을 사용합니다. 차이점은 모든 작업이 그리드의 물리적 처리없이 캡슐 내부에서 발생한다는 것입니다. (도 1C , 1D ).

이 연구의 목적은 캡슐을생물학적 환경에서 바이러스 샘플의 음성 염색을위한 새로운 방법. 이 연구는 또한 2 가지 다른 바이러스 불활 화 과정에서 생성 된 TEM 이미지의 품질을 조사했습니다 : 1) 1 % 오스뮴 테트 록 시드 증기를 이용한 급속 비활성화, 2) 2 % 글루 타르 알데하이드로 24 시간 불 활성화. 이 두 가지 모두 캡슐을 사용하여 실시되었습니다. 마지막으로 우리는 캡슐에 사용하기 위해 일반적으로 사용되는 두 가지 부식제 인 UA와 PTA를 평가했습니다. 13

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Protocol

1. 바이러스 샘플 작업 전에 BSL-2 환경에서의 실험 준비

  1. Formvar 및 탄소 코팅 TEM 구리 격자 (일반적으로 200-400 메쉬)를 준비하거나 구매하십시오.
  2. 코팅 TEM 그리드를 캡슐에 넣습니다.
    1. 이 과정을 쉽게 수행하려면 확대 된 렌즈를 사용하십시오. 하나 또는 두 개의 그리드가 각 캡슐에 삽입 될 수 있습니다. 원하는 경우이 단계를 없애기 위해 사전로드 된 캡슐을 구입할 수 있습니다.
  3. 삽입 된 TEM 코팅 그리드가있는 캡슐을 다른 소모품 및 시약과 함께 바이러스가 부식 될 생물 부착으로 옮깁니다.

2. 수용성 글루 타르 알데히드와 1 % 오스뮴 테트 록 시드 (Tetroxide Vapour Inactivation)를 이용한 생물학적 성질에서 네가티브 염색을위한 캡슐 방법

  1. biocontainment BSC 내부 피펫에 연결된 캡슐에 바이러스 현탁액 40 μL를 대기음.
    참고 : 피펫은 th에 붙어 있습니다.e 캡슐이 완성 될 때까지 기다린다. 바이러스 준비는 이전의 출판물 14 에 따른다.
  2. 수평 방향으로 그리드와 10 분 동안 그쪽에 피펫을 놓으십시오. 이는 코팅 된 그리드에 바이러스 입자가 고르게 분포되도록하는 것입니다.
  3. biocontainment BSC 안의 캡슐 내에서 바이러스를 비활성화하십시오.
    1. 피펫을 들고 플런저를 눌러 바이러스 용액을 폐기물 용기에 분배합니다.
    2. 캡슐에 2 % 글루 타르 알데하이드 정착액 40 μL를 대기음.
      주의 : 글루 타르 알데히드는 위험한 화학 물질이며 적절한 보호가 필요합니다. 글루 타르 알데히드는 일반 BSC에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있지만 연장 된 시약은 덕트 형 BSC 또는 화학 흄 후드에서 작업해야합니다.
    3. 20 분 동안 그 측면에 피펫을 놓습니다. 이것은 샘플이 잘 고정되도록하기위한 것입니다.
    4. 정착액을 배출하고 캡슐에 dI 물 40 μL를 대기음천천히 정착액. 이 세척 단계를 반복하여 총 3 회의 헹굼 사이클을 반복하십시오.
  4. 1 % uranyl acetate (UA) 또는 1 % potassium phosphotungstic acid (PTA) 중 40 μL를 캡슐에 넣고 30 초 동안 기다립니다.
    참고 : 염색 시간은 바이러스 샘플에 따라 10 초에서 1 분까지 다양합니다.
    주의 : UA는 알파 이미 터 및 누적 독소입니다. 적절한 보호 장치로 취급하십시오.
  5. 피펫에서 캡슐을 꺼내 그리드가 캡슐 안에 남아있는 동안 그리드의 가장자리에 필터 종이를 접촉하여 그리드를 건조시킵니다.
  6. Osmium Tetroxide 증기 비활성화 절차.
    1. 1 % 오스뮴 tetroxide 솔루션에 담근 여과지가 들어있는 50 ML 원심 관에 뚜껑이 열려있는 캡슐을 놓으십시오.
      주의 : 오스뮴 테트 록 시드는 낮은 증기압으로 극도로 유독합니다. 덕트 형 BSC 또는 화학 흄 후드에서 사용해야합니다. 적절한 보호 장치로 취급하십시오. 게시물 경고작업 영역의 정보.
    2. 50mL 원심 분리 관을 1 시간 동안 밀봉하여 오스뮴 삼중화물 증기가 완전히 투과되도록하십시오. 그런 다음, 생물학적 제거에서 튜브를 오염 제거하고 BSL-2 EM 시설로 옮깁니다.
  7. 캡슐에서 EM 그리드를 제거하십시오.
    1. BSL - 2 EM 시설에서, 원심 튜브에서 캡슐을 제거하고 피펫에 놓습니다.
    2. 캡슐에 dI 물 40 μL를 대기음과 폐기물 용기에 물을 세 번 분배.
    3. 피펫에서 캡슐을 꺼내고 그리드의 가장자리를 만지기 위해 여과지를 사용하여 그리드를 건조시킵니다.
    4. 공기 건조 후, 후속 TEM 이미징을 위해 그리드를 보관하십시오.

3. BSL-2 실험실에서 2 % 글루 타르 알데하이드로 생체 장해에서 불활 화를위한 캡슐 방법, 음성 염색이 뒤 따른다.

  1. 바이러스 비활성화 절차.
      주의 : 글루 타르 알데히드는 위험한 화학 물질이며 적절한 보호가 필요합니다. 글루 타르 알데히드는 일반 BSC에서 짧은 기간 동안 사용할 수 있지만 연장 된 시약은 덕트 형 BSC 또는 화학 흄 후드에서 작업해야합니다.
    1. 포장, 오염 제거 및 BSL-2 EM 시설로 이송하기 전에 최소 24 시간 동안 고정액으로 바이러스를 비활성화하십시오.
  2. BSL - 2 EM 시설에서 피펫에 첨부 된 두 TEM 그리드를 포함하는 캡슐에 바이러스와 fixative 혼합물을 대기음.
  3. 수평 방향으로 그리드와 10 분 동안 피펫을 수평으로 놓습니다.
    참고 : 이것은 TEM 그리드에 바이러스 입자가 고르게 분포되도록 촉진하기위한 것입니다.
  4. 피펫을 들고 플런저를 눌러 바이러스를 폐기물 용기로 배출하십시오. dI 40 μL를 대기음물을 캡슐에 넣고 3 회 헹굼 사이클 동안 폐기물 용기로 배출하십시오.
  5. 1 % UA 또는 1 % PTA 중 40 μL를 30 초 동안 캡슐에 흡인하십시오.
    참고 : 얼룩 시간은 바이러스 샘플을 기준으로 10 초에서 1 분까지 다양합니다.
    주의 : UA는 알파 이미 터 및 누적 독소입니다. 적절한 보호 장치로 취급하십시오.
  6. 피펫에서 캡슐을 제거하고 격자 종이의 가장자리에 그리드의 가장자리를 만져 그리드를 건조 시키십시오. 그리드를 공기 건조시키고 연속적인 TEM 이미징을 위해 저장합니다.

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Representative Results

캡슐 방법은 TEM 이미징을위한 양질의 음성 염색을 생성합니다.

첫째, 수동 액적 법과 자이레 에볼라 바이러스에 대한 캡슐 방법을 모두 사용하여 생성 된 이미지의 품질을 평가했습니다. Ebolaviruses는 Marburg 바이러스와 함께 Filoviridae 가족의 구성원입니다. 에볼라 바이러스는 전형적으로 직경이 80 내지 100 nm이고 길이가 1,000 nm 이상일 수있다. 에볼라 바이러스는 BSL-4 생물학적 환경에서 처리해야합니다. 그림 2 는 수동 물방울 방법과 부정적인 얼룩에 대한 캡슐 방법을 사용하여 생성 된 이미지를 보여줍니다. 그림 2A (수동 액적 법)와 그림 2B (캡슐 법)는 virion의 중심에 nucleocapsid 구조가있는 세부 사항을 명확하게 정의한 에볼라 바이러스 샘플을 보여 주며, 볼 수있는 에볼라 바이러스 glycoprotein표면에. 따라서, 캡슐 및 물방울 방법 모두 유사한 품질의 TEM 이미지를 생성하는 능력을 갖는다.

캡슐 방법을 사용하여 2 % 수성 글루 타르 알데히드로 24 시간 불활 화하는 대신 수성 글루 타르 알데하이드 및 1 % 오스뮴 테트 록 시드 증기로 신속하게 불 활성화 한 후 EM 이미지 품질을 비교하고 평가하십시오.

우리는 Chikungunya 바이러스를 사용하여 두 가지 샘플 불활 화 방법으로 생성 된 TEM 이미지의 품질을 평가했습니다. Chikungunya 바이러스는 Togaviridae 계통의 Alphavirus 속의 구성원입니다. 직경이 60-70 nm 인 구형입니다. 비리 온은 바이러스 표면에 삼량 체 스파이크를 형성하는 당단백이 풍부한 봉투를 포함합니다. Chikungunya 바이러스는 BSL-3에서 처리해야합니다. 2 % 글루 타르 알데히드를 20 분 동안 사용하고 1 % 오스뮴 테트 록 시드 증기에 1 시간 노출시킨 후 전체 negbiocontainment 실험실에서 BSC 내의 캡슐에서 일어나는 얼룩 염색 과정 ( 그림 1C ). 그러나 24 시간 동안 2 % 글루 타르 알데하이드를 사용하여 바이러스를 비활성화하는 경우 불활 화는 생물학적 환경에서 발생하지만 BSL-2 실험실 ( 그림 1D )의 캡슐 방법을 사용하여 1 % UA 음성 염색 절차가 수행됩니다. 이러한 비활성화 절차는 동일한 품질의 이미지를 생성하지 않습니다 ( 그림 3 ). 도 3에서 알 수있는 바와 같이, 사 산화 오스뮴 ( 그림 3A , 3B )이없는 글루 타르 알데하이드의 고정은 글루 타르 알데하이드 및 오스뮴 테트라 록 시드 ( 도 3C , 3D )로 제조 된 샘플보다 더 미세한 구조를 나타낸다.

캡슐 방법은 Uranyl acetate (UA)와 Phosphotungstic acid (PTA)는 알데히드 고정 샘플에 대한 네거티브 얼룩으로 나타납니다.

캡슐 방법을 이용한 UA 및 PTA 음성 염색의 예가 알데히드 고정 바이러스 - 유사 입자 (VLP)에 대한 도 4 에 도시되어있다. VLP는 바이러스와 같은 구조로 모인 단백질이지만 바이러스 성 유전 물질은 포함하지 않습니다. 그들은 일반적으로 백신 개발 및 기본적인 바이러스 연구에 사용됩니다. 음성 염색은 VLP 어셈블리 및 형태를 평가하는 데 유용한 도구입니다. 우리는 캡슐 방법으로 VLP의 음성 염색에 UA와 PTA를 모두 사용했습니다. 두 얼룩 모두 에볼라 나노 -VLP 15 ( 그림 4A , 4B )와 쥐 백혈병 VLP 16 ( 그림 4C , 4D )의 가시적 인 경계와 명확하게 정의 된 글리코 단백질로 고품질의 결과를 보여줍니다.


그림 1 : 부정적인 염색법 개요. ( A ) 수동 물방울 방법은 TEM 그리드를 물방울에서 표본, 물줄기 및 얼룩으로 순차적으로 이동시켜 수행합니다. ( B ) 그리드 및 시료 현탁액의 적용으로 캡슐 방법 설정. ( C ) 1 % 오스뮴 tetroxide 증기로 단기 불활 화와 biocontainment에서 캡슐 방법을 사용하여 일반적인 절차. ( D ) 2 % 글루 타르 알데히드로 장시간 불활 화하여 생체 내 캡슐 방법을 사용하는 권장 절차. 그림은 이전에 발행되어 재사용이 가능한 참고 문헌 13의 사용 권한과 함께 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 2 : 1 % PTA 음성 스테인드 에볼라 바이러스 입자의 비교. ( A ) 수동 물방울 방법으로 음 염색. ( B ) 캡슐 방법을 사용하여 음성 염색. 그림은 이전에 발행되어 재사용이 가능한 참고 문헌 13의 사용 권한과 함께 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3 : 다른 비활성화 절차를 사용하여 Chikungunya 바이러스의 캡슐 방법으로 1 % UA 부정적인 얼룩. 2 % 글루 타르 알데히드로 최소 24 시간 동안 ( A , B ) 불 활성화. ( C ,D) 2 % 글루 타르 알데하이드 및 1 % 오스뮴 테트라 옥사이드 증기로 급속한 불활 화. 그림은 이전에 발행되어 재사용이 가능한 참고 문헌 13의 사용 권한과 함께 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 : 포스 포 텅스텐 산 (PTA)과 우라 닐 아세테이트 (UA) 음성 캡슐 방법을 이용한 바이러스 유사 입자 (VLP)의 예 ( A ) 1 % PTA 스테인드 에볼라 나노 VLP의 낮은 배율 개요. ( B ) PTA로 염색 된 에볼라 나노 -VLP의 구조적 세부 사항을 보여주는 고배율 TEM 이미지. ( C ) 1 % UA로 염색 된 Murine Leukemia VLP의 저배율 개요. ( D ) 구조 det를 보여주는 고배율 TEM 이미지UA의 ails는 그들의 표면에 에볼라 바이러스 당 단백질 (ebolavirus glycoprotein)을 가진 Murine Leukemia VLP를 염색했다. 그림은 이전에 발행되어 재사용이 가능한 참고 문헌 13의 사용 권한과 함께 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

음성 염색은 바이러스, 단백질 복합체 및 나노 입자를 평가하고 크기를 정하는 데 유용한 TEM 기술입니다. 시약에서 네거티브 얼룩으로 수동 그리드 이동에 의한 이들 시편의 액적 준비는 반세기 이상 동안 고전적인 프로토콜이었습니다. 그것은 간단한 과정이지만, 성공적인 완료를 위해 훈련을 통해 얻은 전문 지식이 필요합니다. 탁월한 음성 염색은 여전히 ​​최첨단 기술로 간주되며 많은 TEM 실험실에서 매우 바람직합니다. 캡슐 방법은 수동 액적 법보다 몇 가지 뚜렷한 장점을 가지고 있는데 특히 생물학적 실험실에서 그러합니다. 첫째, 수동 액 적법은 성공적으로 수행되기 전에 상당한 훈련과 경험이 필요하며 간단한 피펫 팅으로 엔벨로프 레벨 기술자가 캡슐 방법을 쉽게 사용할 수 있습니다. 수동 액 적법의 가장 큰 문제점은 BSL-3 및 BSL-4 PPE에서 포셉이있는 TEM 그리드를 성공적으로 다루는 것입니다.o 크게 감소 된 촉감과 손재주. 깨지기 쉬운 코팅 된 TEM 그리드는 포 셉터로 쉽게 손상되거나 구멍이 뚫립니다. 코팅 된 TEM 그리드의 손상은 TEM으로 볼 때까지 드러나지 않습니다. 캡슐의 두 번째 장점은 TEM 그리드가 캡슐에 삽입되고 전자 현미경에 삽입하기 위해 제거 될 때 TEM 그리드 만 직접 취급된다는 것입니다. Biocontainment 실험실에서든 BSL-2 EM 시설에서든 상관없이 직접적인 그리드 처리는 없습니다. 캡슐 방법의 세 번째 이점은 그리드의 양 측면이 바이러스 및 얼룩으로 덮여 있다는 것입니다. 이것은 시료 농도가 낮을 ​​때 유용 할 수 있습니다. 그러나 농도가 높거나 사용하기 전에 샘플이 희석 될 경우 너무 많은 샘플이 발생할 수 있습니다.

수동 액적 기술을 사용하여 여러 개의 그리드를 음 염색하는 것은 각 샘플을 개별적으로 준비하고 염색해야하기 때문에 시간이 오래 걸립니다. 이것은 어려움을 obtai로 이끈다.일관되고 재현성있는 염색이 가능합니다. 또한 많은 개별 그리드를 추적하는 것은 항상 어려운 일입니다. 각 캡슐에는 두 개의 그리드가 있으며 다중 캡슐을 다중 채널 피펫에 부착하여 공정을 합리화 할 수 있습니다. 따라서 캡슐은 일정한 샘플 조건 하에서 동시에 매우 유사한 과정을 사용하여 그리드가 염색되도록합니다. 캡슐은 조직을 돕기 위해 라벨을 붙일 수 있으므로 그리드의 혼동이나 오판 가능성을 줄입니다. 수동 액 적법을 사용할 때 직면하게되는 또 다른 공통적 인 문제는 그리드 오염입니다. 그리드가 야외에서 너무 오랫동안 방치되거나 떨어질 때 발생할 수 있습니다. 캡슐은 야외에서 TEM 그리드를 보호하고 떨어 뜨리지 않도록 단단히 고정시킵니다. 캡슐은보다 통제 된 환경이기 때문에, 준비 및 음성 염색시 실험 제어 및 재현성이 우수합니다.

캡슐은 de아내. 캡슐에 그리드를 수동으로로드하는 것은 그리드가 손상되지 않도록하기위한 연습을 필요로합니다. 캡슐 방법은 또한 수동 액적 법보다 약간 더 많은 샘플과 얼룩이 필요합니다. 캡슐 방법은 최소 8 μL로 수행 할 수있는 수동 액적 법과 비교하여 최소 40 μL의 시료가 필요합니다.

바이러스 비활성화는 BSL-3 및 BSL-4의 음성 염색에서 중요한 역할을합니다. 이는 EM 시설에서 이미징을 위해 생물학적 활성 연구소에서 비활성화 된 바이러스를 제거 할 수 있기 때문입니다. 고착제를 사용하는 불활 화는 바이러스를 고칠 수 있고 분해를 예방하는 이점이 있습니다. 이 연구에서 검사 된 두 가지 다른 방법으로 바이러스 샘플을 비활성화 할 수 있습니다. 첫 번째는 코팅 된 TEM 그리드에 바이러스를 부착시키고, 2 % 글루 타르 알데히드 용액에서 20 분간 바이러스를 고정시킨 후 그리드를 오스뮴 테트 록 시드 증기에 1 시간 노출시켰다 ( 그림 1C ). 이 비활성이온법은 1 시간 20 분 후에 시료를 생물학적 실험실에서 꺼내어 시간을 절약 할 수 있기 때문에 유리합니다. 또한 코팅 된 TEM 그리드에 적용하기 전에 바이러스가 희석되는 것을 방지하기 때문에 TEM 검출 한계 근처에있는 것으로 의심되는 샘플의 경우 필요할 수 있습니다. 그러나 1 % 오스뮴 삼산화물 증기는 오스뮴이 시료를 더 오염시킬 수 있으므로 TEM 이미지의 품질을 저하시킵니다 ( 그림 3 ). 이전 보고서에 따르면 오스뮴 테록 시드 증기에 5 분간 노출되면 음의 염색시 큰 효과가 나타납니다. 그러나, 절대적인 바이러스 비활성화에 필요한 더 긴 노출은 양성 및 음성 염색 17 의 혼합물을 생성했습니다. 두 번째 불활 화 방법은 2 % 글루 타르 알데하이드 용액에서 최소 24 시간이 소요되며 오스뮴 테트 록 시드 증기 처리가 필요하지 않습니다 ( 그림 1D ). 이 두 번째 방법은 샘플이 생화학 실험실에서 제거되지 않으므로 완료하는 데 시간이 오래 걸립니다.24 시간 동안 평가할 수 있지만, BSL-2 환경에서 생물학적 성질을 벗어난 상태에서 음성 염색을 할 ​​수 있고, 위험한 오스뮴 4 산화수소가 필요 없기 때문에 유리할 수 있습니다. 우리의 결과는 24 시간 동안 글루 타르 알데히드 불 활성화가 샘플을 오스뮴 테트 록 시드 증기로 처리했을 때보 다 고품질의 TEM 이미지를 생성 함을 보여줍니다 ( 그림 3 ).

이 실험에서 두 가지 부정적인 얼룩이 사용되었습니다 : UA와 PTA. 두 얼룩 모두 1 % 솔루션으로 사용됩니다. 고밀도 우라늄 원자가 전자 5 산란 때문에 UA 우라늄의 아세트산 염, 음극 얼룩이 잘 작동한다. PTA, 헤테로폴리산은 유사 고밀도 텅스텐 원자 (5)에 의한 부정적인 얼룩으로 잘 작동합니다. PTA는 유독성이 훨씬 적기 때문에 UA보다 선호되며, 흡입하거나 접촉하면 가벼운 자극 만 유발할 수 있습니다. 부정확 한 샘플을 염색 할 때, UA의 더 낮은 pH는 손상을 야기 할 수 있으므로 고려되어야한다.샘플. 이 실험에 사용 된 바이러스는 불활 화를위한 고정을 필요로하므로 UA와 PTA는 비슷한 결과를 얻었으며 어떤 얼룩에 대해서도 별다른 이점이 발견되지 않았습니다. 두 얼룩은 모두 사용하기 쉽고 비슷한 품질의 TEM 이미지를 생성합니다 ( 그림 4 ).

전반적으로 캡슐 방법은 생물학적 환경에서 사용하기가 더 쉽고 수동 물방울 방법의 대안으로 사용할 수 있습니다. 캡슐을 사용하면 시료 조작상의 결함을 완화하고 우수한 품질의 TEM 이미지를 얻을 수 있습니다. 캡슐 방법을 사용하여 생성 된 이미지는 수동 액적 방식을 사용하여 생성 된 이미지와 유사합니다. 오스뮴 tetroxide로 짧은 바이러스 비활성화는 속도를 향상 시키지만 이미지 품질이 떨어지거나 바이러스가 희석 된 것으로 의심되는 경우에만 절차의 TEM 검출 한계 이하로 떨어 뜨릴 수 있습니다. UA와 PTA 모두이 연구에서 사용 된 고정 바이러스 샘플과 유사한 결과를 제공합니다. 호Wever, 결과는 고정되지 않은 바이러스를 염색 할 때 다를 수 있습니다.

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Disclosures

이 기사에서 언급 한 의견, 해석, 결론 및 권고 사항은 저자의 것이며 의견이 미 육군이나 국방부에서 반드시지지하는 것은 아닙니다.

Acknowledgements

정제 된 에볼라 나노 -VLP를 제공 한 Dr. John Carra와 Rowena Schokman, Chikungunya 바이러스를 제공 한 Dr. Rajini Mudhasani 및 Ebolavirus glycoproteins을 발현하는 Murine Leukemia VLP를 제공 한 Dr. Charles (Jason) Shoemaker에 감사드립니다. 여름 인턴쉽 프로그램 (SIP) 및 과학 및 공학 견습 프로그램 (SEAP) 및 실험실 안전 교육을위한 Catherine Wilhelmsen 박사를 지원 한 MAJ Carl Soffler에게도 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

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References

  1. Gentile, M., Gelderblom, H. R. Electron microscopy in rapid viral diagnosis: an update. New Microbiol. 37, (4), 403-422 (2014).
  2. Kruger, D. H., Schneck, P., Gelderblom, H. R. Helmut Ruska and the visualisation of viruses. Lancet. 355, (9216), 1713-1717 (2000).
  3. Curry, A., Appleton, H., Dowsett, B. Application of transmission electron microscopy to the clinical study of viral and bacterial infections: present and future. Micron. 37, (2), 91-106 (2006).
  4. Goldsmith, C. S., Miller, S. E. Modern uses of electron microscopy for detection of viruses. Clin Microbiol Rev. 22, (4), 552-563 (2009).
  5. Kiselev, N. A., Sherman, M. B., Tsuprun, V. L. Negative staining of proteins. Electron Microsc Rev. 3, (1), 43-72 (1990).
  6. Brenner, S., Horne, R. W. A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses. Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).
  7. Harris, J. R. Negative staining of thinly spread biological samples. Methods Mol Biol. 369, 107-142 (2007).
  8. Bradley, D. E. Ultrastructure of bacteriophage and bacteriocins. Bacteriol Rev. 31, (4), 230-314 (1967).
  9. Suzuki, H., et al. Effects of two negative staining methods on the Chinese atypical rotavirus. Arch Virol. 94, (3-4), 305-308 (1987).
  10. Benmeradi, N., Payre, B., Goodman, S. L. Easier and Safter Biological Staining: High Contrast Uranyless Staining of TEM Grids using mPrep/g Capsules. Microsc Microanal. 21, Suppl 3. 721 (2015).
  11. Goodman, S. L., Wendt, K. D., Kostrna, M. S., Radi, C. Capsule-Based Processing and Handling of Electron Microscopy Specimens and Grids. Microscopy Today. 23, (5), 30-37 (2015).
  12. Goodman, S. L., Kostrna, M. S. Reducing Reagent Consumption and Improving Efficiency of Specimen Fixation and Embedding, Grid Staining and Archiving using mPrep Capsule Processing. Microsc Microanal. 17, Suppl 2. 174-175 (2011).
  13. Monninger, M. K., et al. Preparation of viral samples within biocontainment for ultrastructural analysis: Utilization of an innovative processing capsule for negative staining. J Virol Methods. 238, 70-76 (2016).
  14. Rossi, C. A., et al. Evaluation of ViroCyt(R) Virus Counter for rapid filovirus quantitation. Viruses. 7, (3), 857-872 (2015).
  15. Carra, J. H., et al. A thermostable, chromatographically purified Ebola nano-VLP vaccine. J Transl Med. 13, 228 (2015).
  16. Rein, A. Murine leukemia viruses: objects and organisms. Adv Virol. 403419 (2011).
  17. Barland,, Rojkind, M. Negative staining with osmium tetroxide vapour. Nature. 212, (5057), 84-85 (1966).

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