Utilização de Cápsulas para Coloração Negativa de Amostras Viral dentro de Biocontenimento

Immunology and Infection

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Summary

Este protocolo fornece instruções para amostras de vírus de coloração negativa que podem ser facilmente usadas em laboratórios BSL-2, -3 ou -4. Inclui o uso de uma cápsula de processamento inovadora, que protege a grade de microscopia eletrônica de transmissão e fornece ao usuário um tratamento mais fácil nos ambientes mais turbulentos dentro da biocontainment.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é usada para observar a ultraestrutura de vírus e outros agentes patogênicos microbianos com resolução nanométrica. A maioria dos materiais biológicos não contém elementos densos capazes de espalhar elétrons para criar uma imagem; Portanto, uma mancha negativa, que coloca sais densos de metais pesados ​​em torno da amostra, é necessária. Para visualizar vírus em suspensão sob o TEM, eles devem ser aplicados em grades pequenas revestidas com uma superfície transparente apenas nanômetros de espessura. Devido ao seu pequeno tamanho e fragilidade, essas redes são difíceis de manusear e movimentadas facilmente pelas correntes de ar. A superfície fina é facilmente danificada, deixando a amostra difícil ou impossível de imagem. Os vírus infecciosos devem ser tratados em um gabinete de biossegurança (BSC) e alguns exigem um ambiente de laboratório de biocontainment. A coloração de vírus em níveis de biossegurança (BSL) -3 e -4 é especialmente desafiadora porque esses ambientes são mais turbulentos e técnicos são necessários tUsar equipamento de proteção pessoal (PPE), que diminui a destreza.

Neste estudo, avaliamos um novo dispositivo para auxiliar nos vírus de coloração negativos no biocontainment. O dispositivo é uma cápsula que funciona como uma ponta especializada de pipeta. Uma vez que as grelhas são carregadas na cápsula, o usuário simplesmente aspira reagentes na cápsula para entregar o vírus e manchas na grade encapsulada, eliminando assim o uso do usuário de grades. Embora esta técnica tenha sido projetada especificamente para uso em BSL-3 ou -4 biocontainment, ela pode facilitar a preparação da amostra em qualquer ambiente de laboratório, permitindo uma coloração negativa fácil de vírus. Este mesmo método também pode ser aplicado para preparar espécimes TEM corados negativamente de nanopartículas, macromoléculas e espécimes semelhantes.

Introduction

A microscopia eletrônica de transmissão (TEM) é uma ferramenta eficaz para visualizar a morfologia e a ultraestrutura de espécimes biológicos que são muito pequenos para serem vistos com um microscópio de luz tradicional 1 , 2 , 3 , 4 . Os TEMs disparam elétrons através de um espécimen muito fino produzindo uma imagem de maior resolução, pois os elétrons têm um comprimento de onda muito menor do que a luz. As regiões da amostra que dobram ou bloqueiam elétrons aparecem escuras, enquanto as regiões que são elétron lucent aparecem brancas.

A falta de matéria densa por elétrons torna os vírus difíceis de visualizar sob um TEM porque eles não podem espalhar elétrons. A coloração negativa é o método mais comum usado para criar contraste e visualizar vírus com TEM. O primeiro procedimento de coloração negativa foi proposto por Brenner e Horne em 1959, com base em um experimento onde Hall (1955) e Huxley (1957) observaramO aparecimento de estruturas biológicas em contraste inverso quando imerso em uma substância densamente elétrica 5 . O processo de coloração negativa foi praticamente inalterado ao longo do último meio século. A coloração negativa envolve a aplicação sucinta de uma solução de sal de metal pesado a uma amostra em uma grade TEM na tentativa de cercar o vírus com material denso sem infiltrar o vírus 6 . Isso cria uma borda escura e revela a forma da partícula 5 . Este estudo utiliza dois reagentes para coloração negativa, acetato de uranilo (UA) e ácido fosfotendssico de potássio (PTA). Ambas as manchas são comumente usadas para manchar negativamente pequenas amostras biológicas, como vírus, complexos de proteínas e nanopartículas 7 , 8 , 9 .

A técnica de coloração negativa convencional é a tecnologia manual de coloração negativa de gotículasNique 7 . Este método requer manuseio preciso de grades TEM pequenas e frágeis com fórceps para aplicar pequenas quantidades de amostra de vírus, manchas e enxaguamentos. O protocolo de preparação típico envolve a aplicação de uma gota de suspensão de amostra na superfície de uma grade de TEM revestida por película ( Figura 1A ). Após a anexação da amostra à superfície do filme, a grade é enxaguada para remover vírus não aderentes e corada com UA ou PTA por alguns segundos a um minuto, dependendo do tipo de amostra. O excesso de líquido é perverso para fora da grade, tocando um pedaço de papel de filtro na borda da grade.

O método de gota manual exige que cada grade seja feita individualmente. Se não for manuseado com cuidado, as grades de TEM revestidas são facilmente perfuradas, dobradas ou contaminadas. O processamento de múltiplas amostras pode levar a dificuldades no rastreamento das redes e na garantia de coloração consistente para cada amostra. Este procedimento de coloração manual é muito maisÉ difícil quando conduzido nos laboratórios de biocombustível (BSL) -3 e -4 biocontainment, devido ao equipamento de proteção pessoal (PPE) necessário para esses ambientes. O PPE é pesado e o ambiente de biocontainment é muito mais turbulento em comparação com um laboratório regular. O pessoal que trabalha nos laboratórios de biocontainment da BSL-3 é obrigado a usar 2 pares de luvas e trabalhar em um gabinete de biossegurança (BSC). Esta dupla camada de luvas reduz a sensibilidade tátil e restringe os movimentos finos do motor. O fluxo de ar do BSC que protege o usuário e ajuda a prevenir a contaminação da amostra pode fazer com que as amostras e as manchas secam muito rapidamente, afetando assim a qualidade da mancha. O forte fluxo de ar turbulento no BSC também pode destruir rapidamente uma grade que não está bem protegida. Nos laboratórios BSL-4 biocontainment, existem requisitos de segurança adicionais. O pessoal é obrigado a usar um traje de pressão positiva, o que restringe os movimentos físicos e a capacidade de ver e manipular claramenteGrades ulate. O técnico que trabalha no BSL-4 também usa pelo menos 2 pares de luvas, sendo o par externo uma luva grossa que reduz consideravelmente a destreza e a sensação tátil. Finalmente, as pinças usadas para lidar com grades TEM são afiadas, representando um risco para o técnico devido à sua capacidade de perfurar luvas. Com cápsulas contendo grades, fórceps não são necessárias, proporcionando assim uma alternativa segura e sem pinça para manipular grades em biocontainment. Finalmente, as cápsulas também fornecem uma maneira eficaz de armazenar grades durante o processamento, descontaminação de vapor de osmium e durante o armazenamento; Mantendo as redes organizadas e protegidas contra danos.

Neste relatório, apresentamos um novo método para grades TEM de coloração negativa em laboratórios de biocontainment que utilizam cápsulas mPrep / g, um dispositivo baseado em cápsulas para manuseio e coloração de grade 10 , 11 , 12 . O acompanhamento da cápsulaModifica duas redes TEM, minimiza o manejo direto e reduz o potencial de danos na grade. A cápsula se liga diretamente a uma pipeta de um ou vários canais da mesma maneira que uma ponta de pipeta, permitindo a aplicação de vários líquidos a grades contidas. Isso permite a preparação simultânea de múltiplas amostras com grades duplicadas ( Figura 1B ). Para a mancha negativa com cápsulas, a amostra de vírus é aspirada na cápsula e mantida durante 10 min para permitir que os vírus se adsorvem nas superfícies da grade. As redes com vírus adsorvido são subsequentemente lavadas com água desionizada (dI) e coradas com UA ou PTA durante alguns segundos a 1 min. Este processo usa os mesmos passos do protocolo e reagentes como o método manual de gotículas; A diferença é que todo o trabalho ocorre dentro da cápsula sem manipulação física das grades. ( Figuras 1C , 1D ).

O objetivo deste estudo foi avaliar as cápsulas comoUm novo método para coloração negativa de amostras de vírus em ambientes de biocontainment. Este estudo também examinou a qualidade das imagens TEM produzidas a partir de dois procedimentos de inativação de vírus diferentes: 1) inativação rápida, com 1% de vapor de tetróxido de ósmio e 2) inativação de 24 h com 2% de glutaraldeído. Ambos foram conduzidos usando as cápsulas. Finalmente, avaliamos duas manchas negativas de uso comum, UA e PTA, para uso na cápsula. 13

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Protocol

1. Preparação da experiência em um ambiente BSL-2 antes de trabalhar com as amostras de vírus

  1. Prepare ou compre Formvar e placas de cobre TEM revestidas de carbono, geralmente 200-400 mesh.
  2. Insira as grades TEM revestidas em cápsulas.
    1. Use uma lente ampliada para tornar este processo fácil de executar. Uma ou duas grades podem ser inseridas em cada cápsula. As cápsulas pré-carregadas podem ser compradas para eliminar este passo, se desejado.
  3. Transfira as cápsulas com grades revestidas de TEM inseridas, juntamente com outros suprimentos e reagentes, para o armazenamento biocontenho onde os vírus serão manchados negativamente.

2. O método da cápsula para coloração negativa em Biocontainment usando Glutaraldeído aquoso e 1% de inibição de vapor de tetraxido de ósmio

  1. Dentro do BSC de biocontainment, aspirar 40 μL de suspensão de vírus na cápsula anexada a uma pipeta.
    NOTA: A pipeta permanece em anexoE cápsula até que o processo seja concluído. A preparação de vírus está de acordo com nossa publicação anterior 14 .
  2. Coloque a pipeta no seu lado por 10 min com grelhas orientadas horizontalmente. Isto é para promover uma distribuição uniforme de partículas de vírus nas grades revestidas.
  3. Inactive o vírus dentro da cápsula dentro do BSC biocontainment.
    1. Pegue a pipeta e pressione o êmbolo para distribuir a solução de vírus em um recipiente de lixo.
    2. Aspirar 40 μL de fixador de glutaraldeído a 2% nas cápsulas.
      Cuidado: O glutaraldeído é um produto químico perigoso e requer proteção adequada. O glutaraldeído pode ser usado por breves períodos em um BSC normal, mas o reagente aberto prolongado requer trabalhar em um BSC canalizado ou exaustor químico.
    3. Coloque a pipeta no seu lado por 20 min. Isto é para garantir que as amostras estejam bem corrigidas.
    4. Expulsar o fixador e aspirar 40 μL de água dI nas cápsulas para wArrumar o fixador. Repita este passo de lavagem para um total de 3 ciclos de enxágue.
  4. Aspirar 40 μL de 1% de acetato de uranil (UA) ou 1% de ácido fosforumosssêmico de potássio (PTA) nas cápsulas e permitir que se sente durante 30 s.
    NOTA: O tempo de coloração pode variar de 10 s para 1 min com base na amostra de vírus.
    Cuidado: UA é um emissor alfa e uma toxina cumulativa. Controle-o com a proteção apropriada.
  5. Remova a cápsula da pipeta e remova as grelhas tocando um pedaço de papel de filtro na borda das grades enquanto as grades permanecem dentro da cápsula.
  6. Procedimento de inactivação de vapor de tetróxido de osmio.
    1. Coloque a cápsula, com a tampa aberta, em um tubo de centrífuga de 50 mL contendo papel de filtro embebido em uma solução de tetróxido de ósmio a 1%.
      Cuidado: o tetróxido de ósmio é extremamente tóxico com baixa pressão de vapor. Ele deve ser usado em um BSC canalizado ou exaustor químico. Controle-o com a proteção apropriada. Post warningInformações na área de trabalho.
    2. Selar o tubo de centrífuga de 50 mL por 1 h para permitir a permeação completa do vapor de tetróxido de ósmio. Em seguida, subsequentemente, descontaminar e transferir o tubo para fora da conexão de bioconstrução para a instalação de BSL-2 EM.
  7. Remova as grades EM da cápsula.
    1. Na instalação BSL-2 EM, retire a cápsula do tubo de centrífuga e coloque-a sobre uma pipeta.
    2. Aspirar 40 μL de água dI na cápsula e distribuir a água em um recipiente de lixo três vezes.
    3. Remova a cápsula da pipeta e remova as grades usando papel de filtro para tocar a borda das grades.
    4. Após a secagem ao ar, armazene as grelhas para imagens subseqüentes TEM.

3. O Método da Cápsula para Inativação em Biocontainment com 2% de Glutaraldeído, Seguido por Coloração Negativa em um Laboratório BSL-2

  1. Procedimento de inativação de vírus.
      Cuidado: O glutaraldeído é um produto químico perigoso e requer proteção adequada. O glutaraldeído pode ser usado por breves períodos em um BSC normal, mas o reagente aberto prolongado requer trabalhar em um BSC canalizado ou exaustor químico.
    1. Inactive vírus com fixador durante um mínimo de 24 h antes da embalagem, descontaminação e transfira-o para a instalação BSL-2 EM.
  2. Na instalação de BSL-2 EM, aspirar o vírus e a mistura fixadora na cápsula, contendo duas grades de TEM, anexadas a uma pipeta.
  3. Coloque a pipeta horizontalmente durante 10 min com as grades orientadas horizontalmente.
    NOTA: Isto é para promover uma distribuição uniforme de partículas de vírus nas grades TEM.
  4. Pegue a pipeta e pressione o êmbolo para expulsar o vírus para um recipiente de lixo. Aspirar 40 μL de dIÁgua nas cápsulas e expulse-o para o recipiente de lixo para 3 ciclos de enxágue.
  5. Aspirar 40 μL de 1% de UA ou 1% de PTA nas cápsulas por 30 s.
    NOTA: O tempo de coloração variou de 10 s a 1 min com base na amostra de vírus.
    Cuidado: UA é um emissor alfa e uma toxina cumulativa. Controle-o com a proteção apropriada.
  6. Remova a cápsula da pipeta e remova as grelhas tocando na borda das grades em um pedaço de papel de filtro. Ar secar as grades e armazená-las para imagens subseqüentes TEM.

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Representative Results

O método da cápsula produz uma coloração negativa de boa qualidade para imagens TEM:

Primeiro, avaliamos a qualidade das imagens geradas usando tanto o método manual da gota e os métodos da cápsula para coloração negativa do ebolavírus do Zaire. Os ebolavírus são membros da família Filoviridae , juntamente com o vírus Marburg. O ebolavírus é tipicamente de 80 a 100 nm de diâmetro e pode ter mais de 1000 nm de comprimento. O Ebolavirus deve ser tratado em um ambiente de biocontainment BSL-4. A Figura 2 mostra imagens geradas usando o método de gotícula manual e o método de cápsula para coloração negativa. A Figura 2A (método manual de gotícula) e a Figura 2B (método de cápsula) mostram amostras de ebolavírus que possuem detalhes claramente definidos com estruturas de nucleocápsidos no centro do virião e glicoproteína de ebolavírus visívelS na superfície. Assim, tanto os métodos de cápsulas quanto de gotículas têm a capacidade de produzir imagens de TEM de qualidade semelhantes.

Compare e avalie a qualidade da imagem EM após inativação rápida com glutaraldeído aquoso e 1% de vapor de tetróxido de ósmio versus inativação de 24 horas com 2% de glutaraldeído aquoso, utilizando o método da cápsula:

Avaliamos a qualidade das imagens TEM geradas a partir de dois métodos diferentes de inativação da amostra usando o vírus Chikungunya. O vírus Chikungunya é um membro do gênero Alphavirus na família Togaviridae . É esférico com um diâmetro de 60-70 nm. O virião contém um envelope rico em glicoproteínas que formam espinhas triméricas na superfície viral. O vírus Chikungunya deve ser tratado na BSL-3. A inactivação rápida é conseguida usando 2% de glutaraldeído durante 20 minutos seguido de uma exposição de 1 h a 1% de vapor de tetróxido de ósmio, com todo o negProcesso de coloração ativa ocorrendo em uma cápsula dentro de um BSC no laboratório de biocontainment ( Figura 1C ). No entanto, quando se utiliza 2% de glutaraldeído durante 24 h para inativar o vírus, a inativação ocorre dentro de um ambiente de biocontainment, mas o procedimento de mancha negativa de 1% é realizado usando o método da cápsula em um laboratório BSL-2 ( Figura 1D ). Esses procedimentos de inativação não produzem as mesmas imagens de qualidade ( Figura 3 ). É claro a partir da Figura 3 que a fixação no glutaraldeído sem a presença de tetróxido de ósmio ( Figura 3A , 3B ) mostra detalhes mais ultraestruturais do que as amostras preparadas com glutaraldeído e tetróxido de ósmio ( Figura 3C , 3D ).

O método da cápsula funciona bem usando acetato de uranilo (UA) e fosfatoÁcido otungstico (PTA) como manchas negativas para amostras fixadas com aldeído.

Exemplos de coloração negativa de UA e PTA usando o método da cápsula são mostrados na Figura 4 sobre partículas de vírus semelhantes a aldeídos (VLPs). As VLPs são proteínas montadas em estruturas semelhantes a vírus, mas não contêm nenhum material genético viral. Eles são tipicamente usados ​​no desenvolvimento de vacinas e para pesquisa viral básica. A coloração negativa é uma ferramenta valiosa para avaliar a montagem e morfologia do VLP. Usamos UA e PTA para coloração negativa de VLPs com o método da cápsula. Ambas as manchas exibem resultados de alta qualidade com glicoproteínas fronteiras visíveis e claramente definidas das VLP Ebola nano-VLPs 15 ( Figura 4A , 4B ) e Leukemia Murina VLPs 16 ( Figura 4C , 4D ).


Figura 1: Visão geral dos métodos de coloração negativa. ( A ) O método de gotícula manual é executado através de sequências de grades TEM de gotículas de gotícula para gotícula de espécimes, enxaguamentos e manchas. ( B ) Configuração do método da cápsula com grades e aplicação da suspensão da amostra. ( C ) Procedimento típico usando o método da cápsula em bioconservação com inativação de curto prazo com 1% de vapor de tetróxido de ósmio. ( D ) Procedimento recomendado usando o método da cápsula em biocontenhamento com inativação de longo prazo com 2% de glutaraldeído. Figura foi anteriormente publicada e reutilizada com permissões da referência 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.


Figura 2: Comparação de partículas de Ebolavirus manchadas negativas de PTA a 1%. ( A ) Negativo corado com o método de gotícula manual. ( B ) Negativo corado usando o método da cápsula. Figura foi anteriormente publicada e reutilizada com permissões da referência 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3
Figura 3: 1% de coloração negativa UA com o método de cápsula do vírus Chikungunya usando diferentes procedimentos de inativação. ( A , B ) inactivação durante um mínimo de 24 h com apenas 2% de glutaraldeído. ( C ,D) Inactivação rápida com 2% de glutaraldeído e 1% de vapor de tetróxido de ósmio. Figura foi anteriormente publicada e reutilizada com permissões da referência 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 4
Figura 4: Exemplos de ácido fosfo -ungstico (PTA) e acetato de uranilo (UA) partículas semelhantes a vírus manchadas negativamente (VLPs) usando o método de cápsula. ( A ) Visão geral de baixa ampliação de 1% de PVA ebola nano-VLP manchadas. ( B ) imagem TEM de alta ampliação mostrando detalhes estruturais de NVA-VLP ebola manchada com PTA. ( C ) Visão geral de baixa ampliação de 1% de VLP de leucemia murina manchada por UA. ( D ) imagem TEM de alta ampliação mostrando detDoenças de VLP com leucemia murina manchada com glicoproteína de ebolavírus em sua superfície. Figura foi anteriormente publicada e reutilizada com permissões da referência 13 . Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

A coloração negativa é uma técnica TEM valiosa para avaliação e dimensionamento de vírus, complexos de proteínas e nanopartículas. A preparação de gotículas destes espécimes por movimentação manual de grades de reagente a manchas negativas tem sido o protocolo clássico há mais de meio século. É um processo simples, mas requer experiência adquirida através do treinamento para conclusão bem-sucedida. A excelente coloração negativa ainda é considerada um conjunto de habilidades state-of-the-art e altamente desejado em muitos laboratórios TEM. O método da cápsula tem várias vantagens distintas em relação ao método manual de gotículas, especialmente em laboratórios de biocontainment. Primeiro, o método manual de gotículas requer treinamento e experiência substancial antes que ele possa ser realizado com sucesso, enquanto o método de cápsula fácil de usar pode ser realizado por técnicos de nível de entrada por simples pipetagem. O maior desafio com o método manual de gotículas é a manipulação bem sucedida das grades TEM com fórceps em BSL-3 e BSL-4 PPE devido tO sensação tátil e destreza muito reduzidas. As grades de TEM revestidas frágeis são facilmente danificadas ou perfuradas por fórceps. O dano à grade de TEM revestida geralmente não é revelado até que seja visualizado com TEM. Uma segunda vantagem das cápsulas é que as grades TEM são manipuladas diretamente quando são inseridas em cápsulas e quando são removidas para inserção no microscópio eletrônico. Seja trabalhando no laboratório de biocontainment ou na instalação de BSL-2 EM, não há manipulação de grade direta. Uma terceira vantagem do método da cápsula é que ambos os lados da grade são cobertos por vírus e manchas. Isso pode ser útil quando a concentração da amostra é baixa; No entanto, isso pode causar muita amostra se a concentração for alta ou resultar em diluição da amostra antes da utilização.

A coloração negativa de múltiplas grades usando a técnica manual de gotículas é demorada porque cada amostra precisa ser preparada e manchada individualmente. Isso leva a dificuldades obtaiConsistente consistente, reproduzível. Além disso, manter um registro de muitas redes individuais é sempre um desafio. Cada cápsula contém duas redes e várias cápsulas podem ser anexadas a uma pipeta multicanal, simplificando o processo. Portanto, as cápsulas garantem que as redes sejam coradas usando um processo muito similar, em condições de amostra consistentes e, ao mesmo tempo. As cápsulas podem ser rotuladas para ajudar na organização, reduzindo assim o potencial de mistura ou identificação incorreta de grades. Outro problema comum enfrentado ao usar o método de gotícula manual é a contaminação da grade. Isso pode ocorrer quando as grades são deixadas ao ar livre por muito tempo ou são descartadas. A cápsula protege as grades TEM do ar livre e mantém-as de forma segura para que elas nunca sejam descartadas. As cápsulas proporcionam maior controle experimental e repetibilidade ao preparar e coloração negativa porque a cápsula é um ambiente mais controlado.

As cápsulas podem ser compradas pré-carregadas se oSired. Carregar manualmente grades nas cápsulas leva alguma prática para garantir que as redes não estejam danificadas. O método da cápsula também requer um pouco mais de amostra e mancha do que o método manual de gotículas. O método da cápsula requer pelo menos 40 μL de amostra, em comparação com o método manual de gotículas, que pode ser feito com apenas 8 μL.

A inativação de vírus é uma parte importante da coloração negativa em BSL-3 e BSL-4, pois permite que o vírus inativado seja retirado dos laboratórios de biocontainment para imagens na instalação de EM. A inativação usando fixadores tem o benefício adicional de corrigir o vírus, evitando a degradação. Existem duas formas diferentes de inativar a amostra de vírus, ambas examinadas neste estudo. O primeiro adere o vírus às grades de TEM revestidas, corrige os vírus durante 20 minutos em uma solução de glutaraldeído a 2%, seguido de 1 h de exposição da grade ao vapor de tetróxido de ósmio ( Figura 1C ). Esta inativaçãoO método iónico é vantajoso porque economiza tempo ao permitir que a amostra seja retirada do laboratório de biocontainment após 1 h e 20 min. Também evita a diluição do vírus antes da aplicação na grade TEM revestida, por isso pode ser necessário que amostras suspeitem estar perto do limite de detecção de TEM. No entanto, o vapor de tetróxido de ósmio a 1% reduz a qualidade das imagens de TEM, pois o ósmio pode ainda manchar a amostra ( Figura 3 ). Os relatórios anteriores mostram que uma exposição de 5 minutos ao vapor de tetróxido de ósmio proporciona ótimos resultados quando a coloração negativa; No entanto, uma exposição mais longa necessária para a desativação viral absoluta gerou uma mistura de coloração positiva e negativa 17 . O segundo método de inativação envolve um mínimo de 24 h em uma solução de glutaraldeído a 2% e não requer tratamento com vapor de tetróxidos de ósmio ( Figura 1D ). Este segundo método leva mais tempo para ser concluído à medida que a amostra não é removida do arquivo de restauração de biocontainmentPor 24 h, mas pode ser vantajoso porque permite que a coloração negativa seja feita fora do biocontainment em um ambiente BSL-2 e elimina a necessidade de tetróxido de ósmio perigoso. Nossos resultados demonstram que 24 h de inativação de glutaraldeído produz imagens de TEM de maior qualidade do que quando as amostras são tratadas com vapor de tetróxido de ósmio ( Figura 3 ).

Duas manchas negativas foram utilizadas nesta experiência: UA e PTA. Ambas as manchas são usadas como uma solução de 1%. UA, o acetato sal de urânio, funciona bem como uma mancha negativa porque os átomos de urânio denso espalham elétrons 5 . PTA, um ácido heteropólio, funciona de forma semelhante como uma mancha negativa devido a átomos de tungstênio densos 5 . A PTA às vezes é preferível ao AU porque é muito menos tóxico, e apenas um irritante suave, se inalado ou contatado. Quando amostras não colhidas de coloração negativa, o menor pH de UA deve ser considerado como que pode causar danos tO a amostra. Os vírus utilizados nesta experiência requerem fixação para inativação, de modo que tanto a UA como a PTA alcançaram resultados semelhantes e nenhuma vantagem distinta pode ser detectada para qualquer mancha. Ambas as manchas são fáceis de trabalhar e ambas produzem imagens de TEM de qualidade semelhante ( Figura 4 ).

Em geral, o método da cápsula é mais fácil de usar em um ambiente de biocontainment e pode ser usado como alternativa ao método manual de gotículas. O uso de cápsulas facilita os defeitos de manipulação da amostra e produz imagens de TEM de boa qualidade. As imagens produzidas usando o método da cápsula são comparáveis ​​às imagens produzidas usando o método de gotícula manual. A inativação curta do vírus com o tetróxido de ósmio melhora a velocidade, mas só deve ser usada se a qualidade da imagem for aceitável, ou é suspeitado que a diluição do vírus aponte abaixo do limite de detecção TEM para o procedimento. Tanto a UA como a PTA proporcionam resultados semelhantes com as amostras de vírus fixas utilizadas neste estudo; HoPorém, os resultados podem ser diferentes ao colher vírus não fixados.

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Disclosures

As opiniões, interpretações, conclusões e recomendações contidas no artigo são as dos autores e não são necessariamente aprovadas pelo Exército dos EUA ou pelo Departamento de Defesa.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer e agradecer ao Dr. John Carra e Rowena Schokman pelo fornecimento de Nano-VLP Ebola purificados, Dr. Rajini Mudhasani por fornecer o vírus Chikungunya e Dr. Charles (Jason) Shoemaker por fornecer VLP de Leucemia Murina que expressa glicoproteínas de Ebolavirus. Também gostaríamos de agradecer MAJ Carl Soffler por facilitar o Programa de Estágio de Verão (SIP) e o Programa de Aprendizagem de Ciência e Engenharia (SEAP) e a Dra. Catherine Wilhelmsen para o treinamento em segurança de laboratório.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

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References

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