Utilizzazione di capsule per la colorazione negativa di campioni virali all'interno del Biocontainment

Published 7/19/2017
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Immunology and Infection

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Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per i campioni di virus di colorazione negativi che possono essere facilmente utilizzati nei laboratori BSL-2, -3, o -4. Comprende l'utilizzo di una innovativa capsula di elaborazione che protegge la griglia di microscopia elettronica di trasmissione e fornisce all'utente la gestione più agevole negli ambienti più turbolenti all'interno del biocontainment.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è usata per osservare l'ultrastruttura di virus e altri patogeni microbici con risoluzione nanometrica. La maggior parte dei materiali biologici non contengono elementi densi in grado di spargere elettroni per creare un'immagine; Pertanto, è necessaria una macchia negativa che pone sali duri di metalli pesanti intorno al campione. Per visualizzare i virus in sospensione sotto il TEM devono essere applicati a piccole griglie rivestite con una superficie trasparente solo in nanometri spesse. A causa della loro piccola dimensione e fragilità, queste griglie sono difficili da gestire e facilmente mosse dalle correnti d'aria. La superficie sottile è facilmente danneggiata, lasciando difficile o impossibile l'immagine. I virus infettivi devono essere trattati in un armadio di biosicurezza (BSC) e alcuni richiedono un ambiente di laboratorio per la bioconvenzione. La colorazione dei virus nei livelli di biosicurezza (BSL) -3 e -4 è particolarmente impegnativa perché questi ambienti sono più turbolenti e sono richiesti tecniciO indossare equipaggiamento protettivo personale (PPE), che diminuisce la destrezza.

In questo studio abbiamo valutato un nuovo dispositivo per aiutare i virus di colorazione negativi nel biocontain. Il dispositivo è una capsula che funziona come una punta specializzata della pipetta. Una volta che le griglie vengono caricate nella capsula, l'utente semplicemente aspira i reagenti nella capsula per consegnare il virus e le macchie alla griglia incapsulata, eliminando così la manipolazione degli utenti delle griglie. Anche se questa tecnica è stata progettata appositamente per l'uso in biocontain di BSL-3 o -4, può facilitare la preparazione del campione in qualsiasi ambiente di laboratorio, consentendo una facile colorazione negativa del virus. Questo stesso metodo può essere applicato anche per preparare campioni TEM negativi negativi di nanoparticelle, macromolecole e campioni simili.

Introduction

La microscopia elettronica di trasmissione (TEM) è uno strumento efficace per visualizzare la morfologia e l'ultrastruttura di campioni biologici troppo piccoli da vedere con un tradizionale microscopio leggero 1 , 2 , 3 , 4 . I TEM sparano gli elettroni attraverso un esemplare molto sottile che produce un'immagine di risoluzione più elevata in quanto gli elettroni hanno una lunghezza d'onda molto più breve della luce. Le regioni del campione che piegano o bloccano gli elettroni appaiono scuri, mentre le regioni che sono elettricamente lucenti appaiono bianche.

La mancanza di materia elettronica densa rende difficile la visualizzazione di virus sotto un TEM perché non possono spargere elettroni. La colorazione negativa è il metodo più comune utilizzato per creare il contrasto e visualizzare i virus con un TEM. La prima procedura di colorazione negativa è stata proposta da Brenner e Horne nel 1959, basata su un esperimento in cui Hall (1955) e Huxley (1957) osservanoVeda l'apparizione di strutture biologiche in contrasto contrario quando immerse in una sostanza elettronica-densa 5 . Il processo di colorazione negativa è stato praticamente invariato nel corso del mezzo secolo. La colorazione negativa comporta brevemente l'applicazione di una soluzione salina di metalli pesanti ad un campione su una griglia TEM nel tentativo di circondare il virus con materiale densa senza infiltrarsi il virus 6 . Questo crea un bordo scuro e rivela la forma della particella 5 . Questo studio utilizza due reagenti per la colorazione negativa, l'uranil acetato (UA) e l'acido fosfatugnitico di potassio (PTA). Entrambe queste macchie sono comunemente utilizzate per negare negativamente piccoli campioni biologici, come i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle 7 , 8 , 9 .

La tradizionale tecnica di colorazione negativa è la tecnica di colorazione negativa a goccia manualeNique 7 . Questo metodo richiede una precisa manipolazione di piccole e fragili griglie TEM con pinze per applicare piccole quantità di campioni di virus, macchia e risciacqui. Il tipico protocollo di preparazione prevede l'applicazione di una gocciolina di sospensione campione sulla superficie di una griglia TEM rivestita con film ( Figura 1A ). Dopo aver attaccato il campione alla superficie del film, la griglia viene risciacquata per rimuovere virus non aderenti e macchiata con UA ​​o PTA per alcuni secondi a un minuto, a seconda del tipo di campione. Il liquido in eccesso è malvagio lontano dalla griglia toccando un pezzo di carta filtrante al bordo della griglia.

Il metodo manuale a goccia richiede che ciascuna griglia venga creata singolarmente. Se non vengono trattati con cura, le reti TEM rivestite sono facilmente forate, piegate o contaminate. L'elaborazione di più campioni può portare a difficoltà nel monitoraggio delle griglie e nel garantire una colorazione coerente per ciascun campione. Questa procedura di colorazione manuale è molto più dÈ difficile se effettuato nei laboratori di bioconducibilità a livello di biosicurezza (BSL) -3 e -4, a causa delle necessarie attrezzature protettive (PPE) necessarie per questi ambienti. Il PPE è ingombrante e l'ambiente di bioconvettività è molto più turbolento rispetto ad un normale laboratorio. I dipendenti che lavorano nei laboratori di bioconducibilità BSL-3 sono tenuti a indossare 2 coppie di guanti e lavorare in un armadio di biosicurezza (BSC). Questo doppio strato di guanti riduce la sensibilità tattile e limita il movimento fine del motore. Il flusso d'aria del BSC che protegge l'utente e aiuta a prevenire la contaminazione del campione può causare che i campioni e le macchie si asciugano troppo rapidamente, compromettendo così la qualità della macchia. Il forte flusso d'aria turbolento nel BSC può anche rapidamente soffiare via una griglia non ben assicurata. Nei laboratori di bioconducibilità BSL-4 ci sono ulteriori requisiti di sicurezza. Il personale è tenuto a indossare un aspetto positivo, che limita ulteriormente il movimento fisico e la capacità di vedere e manipolare chiaramenteGriglie di ulate. Il tecnico che lavora in BSL-4 indossa anche almeno 2 paia di guanti, con la coppia esterna che è un guanto spesso che riduce notevolmente la destrezza e la sensazione tattile. Infine, le pinze utilizzate per gestire le griglie TEM sono taglienti, presentando così un rischio per il tecnico a causa della loro capacità di puntare i guanti. Con le capsule contenenti griglie, le pinze non sono necessarie, offrendo così un'alternativa sicura e priva di pesi per la manipolazione di griglie nel biocontainment. Infine, le capsule forniscono anche un modo efficace per memorizzare le griglie durante la lavorazione, la decontaminazione del vapore osmio e durante lo stoccaggio; Mantenendo così le griglie organizzate e sicure da danni.

In questo rapporto, introduciamo un nuovo metodo per le griglie TEM di colorazione negativa nei laboratori di biocontainment che utilizza le capsule mPrep / g, un dispositivo basato sulla capsula per la gestione e la colorazione delle griglie 10 , 11 , 12 . La capsula accomModifica due griglie TEM, minimizza la gestione diretta e riduce il potenziale di danni alla griglia. La capsula si attacca direttamente a una pipetta singola o multicanale nello stesso modo di una punta pipetta, permettendo l'applicazione di vari liquidi nelle griglie contenute all'interno. Ciò consente la preparazione simultanea di campioni multipli con griglie duplicate ( Figura 1B ). Alla macchia negativa con capsule il campione di virus viene aspirato nella capsula e mantenuto per 10 minuti per lasciare che i virus assorbono sulle superfici della griglia. Le griglie con virus adsorbito vengono successivamente lavate con acqua deionizzata (dI) e macchiate con UA ​​o PTA per alcuni secondi a 1 min. Questo processo utilizza gli stessi passaggi di protocollo e reagenti come il metodo manuale a goccia; La differenza è che tutto il lavoro avviene all'interno della capsula senza alcuna manipolazione fisica delle griglie. ( Figure 1C , 1D ).

Lo scopo di questo studio era valutare le capsule comeUn nuovo metodo per la colorazione negativa di campioni di virus negli ambienti di bioconvestimento. Questo studio ha inoltre esaminato la qualità delle immagini TEM prodotte da due diverse procedure di inattivazione del virus: 1) inattivazione rapida, con 1% osmio tetroxido vapore, e 2) 24 ore di inattivazione con glutaraldeide 2%. Entrambe sono state condotte usando le capsule. Infine, abbiamo valutato due macchie negative usuali, UA e PTA, per l'uso nella capsula. 13

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Protocol

1. Preparazione dell'esperimento in un ambiente BSL-2 prima di utilizzare i campioni di virus

  1. Preparare o acquistare Formvar e griglie di rame TEM, rivestite di carbonio, di solito 200-400 maglie.
  2. Inserire le griglie TEM rivestite in capsule.
    1. Utilizza una lente ingrandita per rendere questo processo facile da eseguire. Una o due griglie possono essere inserite in ciascuna capsula. Le capsule pre-caricate possono essere acquistate per eliminare questa fase se lo si desidera.
  3. Trasferire le capsule con griglie trattate con TEM, insieme ad altre forniture e reagenti, al bioconvettore dove i virus saranno negativamente macchiati.

2. Il metodo della capsula per la colorazione negativa nel biocontainment usando la glutaraldeide acquosa e l'inattivazione del vapore di ossido di ossido di osmio dell'1%

  1. All'interno del biocontain BSC, aspirare 40 μL di sospensione virale nella capsula attaccata ad una pipetta.
    NOTA: la pipetta rimane attaccata a thE la capsula fino al completamento del processo. La preparazione del virus è secondo la nostra precedente pubblicazione 14 .
  2. Posizionare la pipetta sul fianco per 10 min con griglie orientate orizzontalmente. Questo è quello di promuovere una distribuzione uniforme di particelle di virus sulle griglie ricoperte.
  3. Inattivare il virus all'interno della capsula all'interno del biocontainment BSC.
    1. Prendere la pipetta e premere lo stantuffo per distribuire la soluzione di virus in un contenitore di rifiuti.
    2. Aspirare 40 μL di fissatore di glutaraldeide al 2% nelle capsule.
      Attenzione: La glutaraldeide è una sostanza chimica pericolosa e richiede una protezione adeguata. La glutaraldeide può essere impiegata per brevi periodi in un normale BSC, ma il reagente aperto aperto richiede la lavorazione in un cappuccio fumettato BSC o chimico.
    3. Posizionare la pipetta sul fianco per 20 min. Ciò è per garantire che i campioni siano ben fissati.
    4. Espelle il fissativo e aspira 40 μL di acqua dI nelle capsule fino aCenere via il fissativo. Ripetere questo passaggio di lavaggio per un totale di 3 cicli di lavaggio.
  4. Aspirare 40 μL di 1% di uranil acetato (UA) o di 1% di acido fosfatastico di potassio (PTA) nelle capsule e lasciare riposare per 30 s.
    NOTA: il tempo di colorazione può variare da 10 s a 1 min in base al campione di virus.
    Attenzione: UA è un emettitore alfa e una tossina cumulativa. Maneggiare con una protezione adeguata.
  5. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie toccando un pezzo di carta filtrante al bordo delle griglie mentre le griglie rimangono all'interno della capsula.
  6. Procedura di inattivazione del vapore di ossido di tetra ossido.
    1. Posizionare la capsula, con il coperchio aperto, in un tubo centrifuga da 50 ml contenente carta filtrante imbevuto in una soluzione tetrossido di osmio dell'1%.
      Attenzione: Il tetrossido di osmium è estremamente tossico e con bassa pressione di vapore. Deve essere utilizzato in un canale fumettato BSC o chimico. Maneggiare con una protezione adeguata. Messaggio di avvisoInformazioni nell'area di lavoro.
    2. Sigillare il tubo di centrifuga da 50 ml per 1 h per consentire la completa permeazione del vapore di ossido di ossido di osmium. Quindi, successivamente decontaminare e trasferire il tubo dal biocontainer alla struttura BSL-2 EM.
  7. Rimuovere le griglie EM dalla capsula.
    1. Nella funzione BSL-2 EM, rimuovere la capsula dal tubo di centrifuga e metterla su una pipetta.
    2. Aspirare 40 μL di acqua dI nella capsula e dispensare l'acqua in un contenitore di rifiuti tre volte.
    3. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie con la carta filtrante per toccare il bordo delle griglie.
    4. Dopo essiccazione ad aria, conservare le griglie per la successiva imaging TEM.

3. Il metodo della capsula per l'inattivazione nel biocontainment con il 2% di glutaraldehide, seguito da una colorazione negativa in un laboratorio BSL-2

  1. Procedura di inattivazione del virus.
      Attenzione: La glutaraldeide è una sostanza chimica pericolosa e richiede una protezione adeguata. La glutaraldeide può essere impiegata per brevi periodi in un normale BSC, ma il reagente aperto aperto richiede la lavorazione in un cappuccio fumettato BSC o chimico.
    1. Inattivare i virus con fissativo per almeno 24 ore prima dell'imballaggio, della decontaminazione e trasferirlo allo stabilimento BSL-2 EM.
  2. Nell'impianto BS-2 EM, aspirare il virus e la miscela fissativa nella capsula, contenente due griglie TEM, attaccate ad una pipetta.
  3. Posizionare la pipetta orizzontalmente per 10 minuti con le griglie orientate orizzontalmente.
    NOTA: si tratta di promuovere una distribuzione uniforme di particelle di virus sulle griglie TEM.
  4. Raccogliere la pipetta e premere lo stantuffo per espellere il virus in un contenitore di rifiuti. Aspirare 40 μL di dIL'acqua nelle capsule e lo espelle nel contenitore dei rifiuti per 3 cicli di risciacquo.
  5. Aspirare 40 μL di 1% UA o 1% PTA nelle capsule per 30 s.
    NOTA: Il tempo di colorazione varia da 10 s a 1 min sulla base del campione di virus.
    Attenzione: UA è un emettitore alfa e una tossina cumulativa. Maneggiare con una protezione adeguata.
  6. Rimuovere la capsula dalla pipetta e asciugare le griglie toccando il bordo delle griglie su un pezzo di carta filtrante. Aria asciugare le griglie e memorizzarle per la successiva imaging TEM.

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Representative Results

Il metodo della capsula produce una colorazione negativa di buona qualità per l'imaging TEM:

In primo luogo, abbiamo valutato la qualità delle immagini generate usando sia il metodo manuale a goccia che i metodi della capsula per la colorazione negativa Zaire ebolavirus. Gli ebolavirus sono membri della famiglia Filoviridae , insieme al virus di Marburg. Ebolavirus è in genere da 80 a 100 nm di diametro e può essere di lunghezza superiore a 1.000 nm. Ebolavirus deve essere gestito in un ambiente di biocontainer BSL-4. La Figura 2 mostra le immagini generate utilizzando il metodo a goccia manuale e il metodo della capsula per la colorazione negativa. La figura 2A (metodo a goccia manuale) e la figura 2B (metodo della capsula) mostrano campioni di ebolavirus che presentano dettagli chiaramente definiti con le strutture nucleocapsidiche al centro della virione e la glicoproteina visibile dell'ebolavirusS sulla superficie. Così, sia i capsula che i metodi di goccia hanno la capacità di produrre immagini simili di qualità TEM.

Confronta e valuta la qualità dell'imm EM dopo una rapida inattivazione con la glutaraldeide acquosa e il vapore ossido di ossido di ossido di ossido 1% contro l'inattivazione di 24 ore con la glutaraldeide acquosa al 2%, utilizzando il metodo della capsula:

Abbiamo valutato la qualità delle immagini TEM generate da due diversi metodi di inattivazione del campione usando il virus Chikungunya. Il virus Chikungunya è un membro del genere Alphavirus nella famiglia Togaviridae . È sferica con un diametro di 60-70 nm. La virione contiene una busta ricca di glicoproteine ​​che formano picchi trimerici sulla superficie virale. Il virus di Chikungunya deve essere gestito in BSL-3. L'inattivazione rapida viene ottenuta usando la glutaraldeide di 2% per 20 minuti seguita da un esposizione di 1 ora al vapore di ossido di ossido di osmium 1%, con l'intero negativoIl processo di colorazione attiva che si verifica in una capsula all'interno di un BSC nel laboratorio di biocontainment ( Figura 1C ). Tuttavia, quando si utilizza la glutaraldeide al 2% per 24 ore per inattivare il virus, l'inattivazione si verifica all'interno di un ambiente di biocontain, ma la procedura di colorazione negativa dell'1% UA viene eseguita usando il metodo della capsula in un laboratorio BSL-2 ( Figura 1D ). Queste procedure di inattivazione non producono le stesse immagini di qualità ( Figura 3 ). È chiaro dalla figura 3 che la fissazione in glutaraldeide senza presenza di tetroxido osmico ( Figura 3A , 3B ) mostra più dettaglio ultrastrutturale rispetto ai campioni preparati con glutaraldeide e ossido di osmium ( Figura 3C , 3D ).

Il metodo della capsula funziona bene utilizzando Uranil acetato (UA) e fosfatoAcido otungstico (PTA) come macchie negative per campioni fissi di aldeide.

Esempi di colorazione negativa di UA e PTA utilizzando il metodo della capsula sono mostrati nella figura 4 sulle particelle virali-simili fisse di aldeide (VLPs). I VLP sono proteine ​​assemblate in strutture del virus, ma non contengono alcun materiale genetico virale. Sono tipicamente utilizzati per lo sviluppo di vaccini e per la ricerca virale di base. La colorazione negativa è uno strumento prezioso per valutare l'assemblaggio VLP e la morfologia. Abbiamo utilizzato sia UA che PTA per la colorazione negativa di VLP con il metodo della capsula. Entrambe le macchie mostrano risultati di alta qualità con glicoproteine ​​visibili e chiaramente definiti i confini delle Ebola nano-VLPs 15 ( Figura 4A , 4B ) e le Leucemia Murina VLPs 16 ( Figura 4C , 4D ).


Figura 1: Panoramica dei metodi di colorazione negativi. ( A ) Il metodo manuale di gocciolamento viene eseguito da griglie TEM in sequenza in movimento dalla gocciolina alla gocciolina di campioni, risciacqui e macchie. ( B ) Impostazione del metodo della capsula con griglie ed applicazione della sospensione del campione. ( C ) Procedura tipica con il metodo della capsula nel biocontainment con inattivazione a breve termine con vapore ossido di ossido di ossido 1%. ( D ) Procedura raccomandata che utilizza il metodo della capsula in biocontain con inattivazione a lungo termine con 2% di glutaraldeide. La figura è stata precedentemente pubblicata e riutilizzata con autorizzazioni di riferimento 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.


Figura 2: confronto di 1% di particelle di Etagavirus macchiate negative di PTA. ( A ) Trattamento negativo con il metodo manuale a goccia. ( B ) Negativo macchiato con il metodo della capsula. La figura è stata precedentemente pubblicata e riutilizzata con autorizzazioni di riferimento 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3
Figura 3: 1% UA negativa colorazione con il metodo della capsula del virus Chikungunya utilizzando diverse procedure di inattivazione. ( A , B ) per almeno 24 ore con solo 2% di glutaraldeide. ( C ,D) Inattivazione rapida con 2% di glutaraldeide e 1% di ossido di ossido di osmium. La figura è stata precedentemente pubblicata e riutilizzata con autorizzazioni di riferimento 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4
Figura 4: Esempi di Acido Phosphotungstic (PTA) e Uranil Acetato (UA) Negativamente macchiati come Virus-Like-Particles (VLPs) utilizzando il Metodo Capsule. ( A ) Bassa panoramica di ingrandimento di 1% PTA macchiati ebola nano-VLPs. ( B ) L'elevata immagine TEM di ingrandimento che mostra i dettagli strutturali di EBA nano-VLP macchiati di PTA. ( C ) Bassa visualizzazione di ingrandimento di 1% di UA macchiata leucemia VLP murina. ( D ) Alta immagine di ingrandimento TEM che mostra i detti strutturaliAils di VLP di Leucemia murina macchiata con la glicoproteina ebolavirus sulla loro superficie. La figura è stata precedentemente pubblicata e riutilizzata con autorizzazioni di riferimento 13 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

La colorazione negativa è una preziosa tecnica TEM per valutare e dimensionare i virus, i complessi proteici e le nanoparticelle. La preparazione di goccioline di questi campioni mediante movimentazione manuale di griglie dal reagente a macchie negative è stata il classico protocollo da più di mezzo secolo. È un processo semplice, ma richiede competenze acquisite attraverso la formazione per il completamento del successo. Ottima colorazione negativa è ancora considerata un set di abilità all'avanguardia e altamente desiderata in molti laboratori TEM. Il metodo della capsula ha diversi vantaggi distinti rispetto al metodo manuale di gocciolamento, specialmente nei laboratori di bioconducenza. Innanzitutto, il metodo manuale di gocciolamento richiede una formazione e un'esperienza sostanziale prima che possa essere eseguito con successo, mentre il metodo di facile utilizzo del capsula può essere eseguito dai tecnici di entry level mediante pipettazione semplice. La sfida più grande con il metodo manuale di gocciolamento è la corretta gestione delle griglie TEM con pinze in BSL-3 e BSL-4 PPE dovuteO la sensazione tattile e la destrezza notevolmente ridotta. Le griglie TEM rivestite fragili sono facilmente danneggiate o forate da pinze. Il danneggiamento della griglia TEM rivestita non viene spesso rivelato fino a quando non viene visualizzato con un TEM. Un secondo vantaggio delle capsule è che le griglie TEM vengono gestite direttamente quando vengono inserite in capsule e quando vengono rimosse per l'inserimento nel microscopio elettronico. Sia che si tratti di lavorare nel laboratorio di bioconvestimento o nell'impianto BSL-2 EM, non esiste una gestione diretta della griglia. Un terzo vantaggio del metodo della capsula è che entrambi i lati della griglia sono coperti da virus e macchie. Ciò può essere utile quando la concentrazione del campione è bassa; Tuttavia questo potrebbe causare un numero troppo elevato di campioni se la concentrazione è elevata o provoca una diluizione del campione prima dell'uso.

Le griglie multiple con la tecnica di gocciolamento manuale richiedono molto tempo perché ciascun campione deve essere preparato e macchiato individualmente. Ciò porta a difficoltàUna colorazione coerente e riproducibile. Inoltre, tenere traccia di molte griglie individuali è sempre una sfida. Ogni capsula contiene due griglie e possono essere collegate più capsule ad una pipetta multicanale, semplificando il processo. Di conseguenza, le capsule assicurano che le griglie vengano macchiate con un processo molto simile, in condizioni di campionamento costanti e allo stesso tempo. Le capsule possono essere etichettate per aiutare nell'organizzazione, riducendo così il potenziale di miscelazione o di identificazione errata delle griglie. Un altro problema comune incontrato quando si utilizza il metodo manuale di gocciolina è la contaminazione della griglia. Ciò può avvenire quando le griglie rimangono nell'aria aperta per troppo tempo o vengono lasciate cadere. La capsula protegge le griglie TEM dall'aria aperta e le tiene in modo sicuro in modo da non cadere mai. Le capsule forniscono un maggiore controllo sperimentale e la ripetibilità durante la preparazione e la colorazione negativa perché la capsula è un ambiente più controllato.

Le capsule possono essere acquistate pre-caricate se degenerò. Caricamento manualmente delle griglie nelle capsule richiede qualche pratica per garantire che le griglie non vengano danneggiate. Il metodo della capsula richiede anche un po 'più di campioni e macchie rispetto al metodo manuale della gocciolina. Il metodo della capsula richiede almeno 40 μL di campione, rispetto al metodo manuale di goccia, che può essere fatto con appena 8 μL.

L'inattivazione del virus è una parte importante della colorazione negativa in BSL-3 e BSL-4, in quanto consente il rilevamento del virus inattivato dai laboratori di bioconducenza per la formazione di immagini nella struttura EM. L'inattivazione con fixatives ha il vantaggio aggiuntivo di fissare il virus, impedendo il degrado. Esistono due modi diversi per inattivare il campione di virus, entrambi studiati in questo studio. Il primo aderisce il virus alle griglie TEM rivestite, fissa i virus per 20 minuti in una soluzione di glutaraldeide al 2%, seguita da un'esposizione di 1 ora di griglia al vapore di ossido di ossido di osmium ( figura 1C ). Questo inattivoIon è vantaggioso in quanto consente di risparmiare tempo permettendo di prelevare il campione dal laboratorio di bioconvenzione dopo 1 h e 20 min. Previene anche la diluizione del virus prima dell'applicazione alla griglia TEM rivestita, per cui potrebbe essere necessario che i campioni siano sospetti vicino al limite di rilevazione TEM. Tuttavia, il vapore di ossido di ossido di ossido 1% riduce la qualità delle immagini TEM poichè l'osmio può ulteriormente macchiare il campione ( Figura 3 ). I rapporti precedenti mostrano un'esposizione di 5 minuti al vapore di ossido di ossido di osmio fornisce grandi risultati quando la colorazione negativa; Tuttavia, l'esposizione più lunga richiesta per la disattivazione virale assoluta ha generato una miscela di colorazione positiva e negativa 17 . Il secondo metodo di inattivazione prevede un minimo di 24 ore in una soluzione di glutaraldeide al 2% e non richiede il trattamento con vapore di ossido di tetroxide ( Figura 1D ). Questo secondo metodo richiede più tempo da completare poiché il campione non viene rimosso dal laboratorio di biocontainPer 24 ore, ma può essere vantaggioso perché consente la colorazione negativa da svolgere al di fuori del biocontain in un ambiente BSL-2 e elimina la necessità di tetroxido osmio pericoloso. I nostri risultati dimostrano che 24 ore di inattivazione di glutaraldeide producono immagini TEM di qualità superiore rispetto a quando i campioni vengono trattati con vapore di ossido di ossido di osmium ( Figura 3 ).

Due macchie negative sono state utilizzate in questo esperimento: UA e PTA. Entrambe le macchie vengono utilizzate come soluzione di 1%. L'UA, il sale acetato dell'uranio, funziona bene come una macchia negativa perché gli atomi di uranio denso dispersero gli elettroni 5 . PTA, un acido eteropolico, funziona altrettanto bene come una macchia negativa dovuta agli atomi di tungsteno densi 5 . A volte è preferibile la PTA rispetto all'AA perché è molto meno tossico e solo un lieve irritante se viene inalato o contattato. Nel caso di campioni non difettosi di colorazione negativa, è necessario considerare il pH inferiore di UA in quanto potrebbe causare danniO il campione. I virus utilizzati in questo esperimento richiedono la fissazione per l'inattivazione, quindi sia UA che PTA hanno ottenuto risultati simili e nessun vantaggio distinto può essere rilevato per la macchia. Entrambe le macchie sono facili da lavorare e entrambe producono immagini simili di qualità TEM ( Figura 4 ).

Nel complesso, il metodo della capsula è più facile da utilizzare in un ambiente di biocontain e può essere utilizzato come alternativa al metodo manuale di gocciolato. L'uso di capsule semplifica i difetti di manipolazione del campione e produce immagini TEM di buona qualità. Le immagini prodotte usando il metodo della capsula sono paragonabili alle immagini prodotte usando il metodo a goccia manuale. La breve inattivazione del virus con il tetroxido di osmium migliora la velocità, ma dovrebbe essere utilizzata solo se la qualità dell'immagine ridotta è accettabile o si sospetta che il diluizione del virus lo metta al di sotto del limite di rilevamento TEM per la procedura. Sia UA che PTA forniscono risultati simili con i campioni di virus fissi utilizzati in questo studio; HoWever, i risultati possono essere diversi quando si colorano i virus non flessibili.

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Disclosures

Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni contenute nell'articolo sono quelle degli autori e non sono necessariamente approvate dall'esercito statunitense o dal Dipartimento della Difesa.

Acknowledgements

Vorremmo riconoscere e ringraziare il Dott. John Carra e Rowena Schokman per aver fornito i nano-VLP Ebola purificati, il Dr. Rajini Mudhasani per la fornitura del virus Chikungunya e il Dott. Charles (Jason) Shoemaker per la fornitura di VLP di leucemia murina che esprimono glicoproteine ​​Ebolavirus. Vorremmo inoltre ringraziare MAJ Carl Soffler per facilitare il programma di tirocinio estivo (SIP) e il programma di apprendistato per la scienza e l'ingegneria (SEAP) e la dottoressa Catherine Wilhelmsen per la formazione sulla sicurezza del laboratorio.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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