Verwendung von Kapseln zur Negativfärbung von Virusproben im Biocontainment

Published 7/19/2017
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Immunology and Infection

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Summary

Dieses Protokoll liefert eine Anleitung für Negativfärbevirusproben, die leicht in BSL-2-, -3- oder -4-Laboratorien verwendet werden können. Es beinhaltet die Verwendung einer innovativen Verarbeitungskapsel, die das Transmissionselektronenmikroskopie-Gitter schützt und dem Anwender eine leichtere Handhabung in den turbulenteren Umgebungen im Biokontainment ermöglicht.

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Blancett, C. D., Monninger, M. K., Nguessan, C. A., Kuehl, K. A., Rossi, C. A., Olschner, S. P., et al. Utilization of Capsules for Negative Staining of Viral Samples within Biocontainment. J. Vis. Exp. (125), e56122, doi:10.3791/56122 (2017).

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Abstract

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) dient zur Beobachtung der Ultrastruktur von Viren und anderen mikrobiellen Pathogenen mit Nanometerauflösung. Die meisten biologischen Materialien enthalten keine dichten Elemente, die in der Lage sind, Elektronen zu streuen, um ein Bild zu erzeugen; Daher ist ein negativer Fleck, der dichte Schwermetallsalze um die Probe platziert, erforderlich. Um Viren in Suspension unter dem TEM zu visualisieren, müssen sie auf kleine Gitter aufgetragen werden, die mit einer transparenten Oberfläche beschichtet sind, die nur Nanometer dick ist. Aufgrund ihrer geringen Größe und ihrer Zerbrechlichkeit sind diese Gitter schwer zu handhaben und leicht durch Luftströme zu bewegen. Die dünne Oberfläche wird leicht beschädigt, so dass die Probe schwierig oder unmöglich abbilden kann. Infektionsviren müssen in einem Biosicherheitsschrank (BSC) behandelt werden, und einige erfordern eine Biocontainment-Laborumgebung. Die Färbung von Viren in Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 ist besonders anspruchsvoll, da diese Umgebungen turbulenter sind und Techniker erforderlich sindO trage persönliche Schutzausrüstung (PSA), die Geschicklichkeit verringert.

In dieser Studie haben wir ein neues Gerät zur Unterstützung von negativen Färbeviren im Biokontainment evaluiert. Das Gerät ist eine Kapsel, die als spezialisierte Pipettenspitze arbeitet. Sobald die Gitter in die Kapsel geladen sind, saugt der Benutzer Reagenzien einfach in die Kapsel, um das Virus und die Flecken an das verkapselte Gitter zu liefern, wodurch die Handhabung von Gittern eliminiert wird. Obwohl diese Technik speziell für die Verwendung in BSL-3 oder -4 Biocontainment entwickelt wurde, kann sie die Probenvorbereitung in jeder Laborumgebung erleichtern, indem sie eine leichte Negativfärbung des Virus ermöglicht. Dieselbe Methode kann auch angewendet werden, um negativ gefärbte TEM-Proben von Nanopartikeln, Makromolekülen und ähnlichen Proben herzustellen.

Introduction

Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) ist ein effektives Werkzeug für die Betrachtung der Morphologie und der Ultrastruktur von biologischen Proben, die zu klein sind, um mit einem herkömmlichen Lichtmikroskop 1 , 2 , 3 , 4 zu sehen . TEMs schießen Elektronen durch eine sehr dünne Probe, die ein Bild mit höherer Auflösung erzeugt, da Elektronen eine viel kürzere Wellenlänge als Licht haben. Regionen der Probe, die Elektronen biegen oder blockieren, erscheinen dunkel, während Regionen, die elektronen licht sind, weiß erscheinen.

Mangel an Elektronen dichten Materie macht Viren schwer zu sehen unter einem TEM, weil sie nicht streuen können Elektronen. Negative Färbung ist die häufigste Methode, die verwendet wird, um Kontrast zu erzeugen und Viren mit einem TEM zu betrachten. Das erste Negativfärbeverfahren wurde von Brenner und Horne im Jahre 1959 vorgeschlagen, basierend auf einem Experiment, bei dem Hall (1955) und Huxley (1957) Beobachter warenVed das Auftreten von biologischen Strukturen im umgekehrten Kontrast beim Eintauchen in eine elektronendichte Substanz 5 . Der Prozess der negativen Färbung ist in der letzten Hälfte des Jahrhunderts nahezu unverändert gewesen. Negative Färbung beinhaltet das kurzzeitige Aufbringen einer Schwermetallsalzlösung auf eine Probe auf einem TEM-Gitter in einem Versuch, das Virus mit dichten Materialien zu umgeben, ohne das Virus 6 zu infiltrieren. Dies schafft eine dunkle Grenze und zeigt die Partikelform 5 . Diese Studie verwendet zwei Reagenzien für Negativfärbung, Uranylacetat (UA) und Kaliumphosphowolframsäure (PTA). Beide dieser Flecken werden gewöhnlich verwendet, um kleine biologische Proben, wie Viren, Proteinkomplexe und Nanopartikel 7 , 8 , 9 , negativ zu färben.

Die herkömmliche Negativ-Färbetechnik ist die manuelle Tröpfchen-Negativ-FärbungstechnologieNique 7 Diese Methode erfordert eine präzise Handhabung von kleinen, zerbrechlichen TEM-Gittern mit einer Pinzette, um kleine Mengen an Virusproben, Flecken und Spülungen aufzutragen. Das typische Herstellungsprotokoll beinhaltet das Aufbringen eines Tröpfchens der Probensuspension auf die Oberfläche eines mit einem Film beschichteten TEM-Gitters ( 1A ). Nach dem Anbringen der Probe an die Filmoberfläche wird das Gitter gespült, um nicht-adhärente Viren zu entfernen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis zu einer Minute gefärbt zu werden, abhängig von der Art der Probe. Überschüssige Flüssigkeit wird vom Gitter weggerissen, indem man ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berührt.

Die manuelle Tröpfchenmethode erfordert, dass jedes Raster individuell hergestellt wird. Wenn nicht sorgfältig behandelt, werden beschichtete TEM-Gitter leicht durchbohrt, gebogen oder verunreinigt. Die Verarbeitung mehrerer Proben kann zu Schwierigkeiten bei der Verfolgung der Gitter führen und eine gleichmäßige Färbung für jede Probe gewährleisten. Diese manuelle Färbung ist viel mehr dWenn es in den Biosicherheitsstufen (BSL) -3 und -4 Biocontainmentlaboratorien aufgrund der für diese Umgebungen erforderlichen persönlichen Schutzausrüstung (PSA) fällig ist. PPE ist umständlich und die Biocontainment-Umgebung ist viel turbulenter im Vergleich zu einem regelmäßigen Labor. Das Personal, das in BSL-3 Biokontainmentlaboratorien arbeitet, muss 2 Paar Handschuhe tragen und in einem Biosicherheitsschrank (BSC) arbeiten. Diese doppelte Handschuhschicht reduziert die taktile Empfindlichkeit und beschränkt die Feinmotorik. Der Luftstrom des BSC, der den Benutzer schützt und hilft, die Kontamination der Proben zu verhindern, kann dazu führen, dass die Proben und Flecken zu schnell trocknen und so die Fleckenqualität beeinträchtigen. Der starke turbulente Luftstrom im BSC kann auch schnell ein Gitter wegblasen, das nicht gut gesichert ist. In BSL-4 Biocontainment-Labors gibt es zusätzliche Sicherheitsanforderungen. Das Personal muss einen positiven Druckanzug tragen, der die physische Bewegung und die Fähigkeit, deutlich zu sehen und zu manipieren, weiter einschränktGitter wässern. Der Techniker, der in BSL-4 arbeitet, trägt auch mindestens 2 Paar Handschuhe, wobei das äußere Paar ein dicker Handschuh ist, der die Geschicklichkeit und die taktile Empfindung stark reduziert. Schließlich ist die Pinzette, die verwendet wird, um TEM-Gitter zu handhaben, scharf, wodurch ein Risiko für den Techniker aufgrund ihrer Fähigkeit, Pünktchen Handschuhe. Bei Kapseln, die Gitter enthalten, sind keine Pinzetten notwendig, so dass eine sichere, zangenfreie Alternative zur Manipulation von Gittern in Biokontainmenten geschaffen wird. Schließlich bieten die Kapseln auch einen wirksamen Weg, um Gitter während der Verarbeitung, Osmiumdampf-Dekontamination und während der Lagerung zu speichern; Wodurch die Gitter organisiert und vor Schäden geschützt sind.

In diesem Bericht stellen wir eine neue Methode zur Negativfärbung von TEM-Gittern in Biokontainmentlaboratorien vor, die mPrep / g-Kapseln, eine kapselbasierte Vorrichtung zur Netzhandhabung und Färbung 10 , 11 , 12, einsetzt . Die KapselModifiziert zwei TEM-Gitter, minimiert die direkte Handhabung und reduziert das Potenzial für Netzschäden. Die Kapsel haftet direkt an einer Einzel- oder Mehrkanalpipette in der gleichen Weise wie eine Pipettenspitze, so dass die Anwendung von verschiedenen Flüssigkeiten auf Gitter, die darin enthalten sind. Dies ermöglicht die gleichzeitige Vorbereitung mehrerer Proben mit doppelten Gittern ( Abbildung 1B ). Zu negativen Flecken mit Kapseln wird die Virusprobe in die Kapsel angesaugt und für 10 min gehalten, um die Viren auf die Gitteroberflächen adsorbieren zu lassen. Die Gitter mit adsorbiertem Virus werden anschließend mit deionisiertem (dI) Wasser gewaschen und mit UA oder PTA für einige Sekunden bis 1 min gefärbt. Dieses Verfahren verwendet dieselben Protokollschritte und Reagenzien wie die manuelle Tröpfchenmethode; Der Unterschied ist, dass alle Arbeiten innerhalb der Kapsel ohne physische Handhabung der Gitter auftreten. ( Fig. 1C , 1D ).

Der Zweck dieser Studie war es, Kapseln als zu bewertenEine neue Methode zur Negativfärbung von Virusproben in Biokontainmentumgebungen. Diese Studie untersuchte auch die Qualität von TEM-Bildern, die aus zwei verschiedenen Virusinaktivierungsverfahren hergestellt wurden: 1) schnelle Inaktivierung mit 1% Osmiumtetroxiddampf und 2) einer 24 h Inaktivierung mit 2% Glutaraldehyd. Beide wurden unter Verwendung der Kapseln durchgeführt. Schließlich haben wir zwei häufig verwendete Negativflecken, UA und PTA, zur Verwendung in der Kapsel ausgewertet. 13

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Protocol

1. Versuchsvorbereitung in einer BSL-2-Umgebung vor dem Arbeiten mit den Virusproben

  1. Vorbereiten oder kaufen Formvar und Kohlenstoff beschichtet TEM Kupfer Gitter, in der Regel 200-400 Mesh.
  2. Setzen Sie die beschichteten TEM-Gitter in Kapseln ein.
    1. Verwenden Sie ein vergrößertes Objektiv, um diesen Vorgang einfach durchzuführen. Ein oder zwei Gitter können in jede Kapsel eingeführt werden. Vorgeladene Kapseln können gekauft werden, um diesen Schritt zu beseitigen, falls gewünscht.
  3. Übertragen Sie die Kapseln mit eingefügten TEM-beschichteten Gittern, zusammen mit anderen Vorräten und Reagenzien, zur Biokontainmentierung, wo die Viren negativ gefärbt werden.

2. Das Kapselverfahren für die Negativfärbung im Biocontainment unter Verwendung von wässrigem Glutaraldehyd und 1% Osmiumtetroxiddampfinaktivierung

  1. Innerhalb des Biocontainment BSC saugt man 40 μl Virussuspension in die an eine Pipette gebundene Kapsel.
    HINWEIS: Die Pipette bleibt an thE Kapsel, bis der Prozess abgeschlossen ist. Virusvorbereitung erfolgt nach unserer vorherigen Publikation 14 .
  2. Legen Sie die Pipette 10 Minuten lang mit Gittern auf die Seite. Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die beschichteten Gitter fördern.
  3. Inaktivieren Sie das Virus innerhalb der Kapsel innerhalb des Biocontainment BSC.
    1. Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um die Viruslösung in einen Abfallbehälter zu geben.
    2. 40 μl 2% Glutaraldehyd-Fixiermittel in die Kapseln geben.
      Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube.
    3. Legen Sie die Pipette 20 Minuten lang auf die Seite. Damit ist sichergestellt, dass die Proben gut fixiert sind.
    4. Das Fixiermittel ausschütten und 40 μl dI Wasser in die Kapseln zu w absaugenAsche weg das Fixiermittel. Wiederholen Sie diesen Waschschritt für insgesamt 3 Spülzyklen.
  4. 40 μl entweder 1% Uranylacetat (UA) oder 1% Kaliumphosphowolframsäure (PTA) in die Kapseln geben und 30 s sitzen lassen.
    HINWEIS: Die Färbezeit kann von 10 s bis 1 min variieren, basierend auf Virusprobe.
    Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz.
  5. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter, indem Sie ein Stück Filterpapier an den Rand des Gitters berühren, während die Gitter in der Kapsel verbleiben.
  6. Osmium-Tetroxid-Dampf-Inaktivierungsverfahren.
    1. Legen Sie die Kapsel mit offenem Deckel in ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen, das Filterpapier enthält, das in einer 1% igen Osmiumtetroxidlösung eingetaucht ist.
      Achtung: Osmium-Tetroxid ist bei niedrigem Dampfdruck extrem giftig. Es muss in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube verwendet werden. Handhabung mit entsprechendem Schutz. PostwarnungInformationen im Arbeitsbereich.
    2. Das 50-ml-Zentrifugenröhrchen für 1 h abdichten, um eine vollständige Permeation des Osmiumtetroxiddampfs zu ermöglichen. Anschließend anschließend das Röhrchen aus dem Biocontainment in die BSL-2 EM-Anlage dekontaminieren und übertragen.
  7. EM-Gitter aus der Kapsel entfernen.
    1. In der BSL-2 EM-Anlage die Kapsel aus dem Zentrifugenröhrchen entfernen und auf eine Pipette legen.
    2. 40 μl dI Wasser in die Kapsel geben und das Wasser dreimal in einen Abfallbehälter geben.
    3. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter mit Filterpapier, um den Rand der Gitter zu berühren.
    4. Nach der Lufttrocknung die Gitter für die anschließende TEM-Bildgebung aufbewahren.

3. Die Kapselmethode zur Inaktivierung im Biokontainment mit 2% Glutaraldehyd, gefolgt von einer Negativfärbung in einem BSL-2-Labor

  1. Virusinaktivierungsverfahren.
      Achtung: Glutaraldehyd ist eine gefährliche Chemikalie und erfordert einen geeigneten Schutz. Glutaraldehyd kann für kurze Zeiträume in einem normalen BSC verwendet werden, aber verlängertes offenes Reagenz erfordert das Arbeiten in einer geführten BSC oder chemischen Dunstabzugshaube.
    1. Inaktivierung von Viren mit Fixiermittel für mindestens 24 Stunden vor der Verpackung, Dekontamination und Überführung an die BSL-2 EM-Anlage.
  2. In der BSL-2 EM-Anlage die Virus- und Fixiermischung in die Kapsel einspülen, die zwei TEM-Gitter enthält, die an einer Pipette befestigt sind.
  3. Die Pipette für 10 min mit den horizontal ausgerichteten Gittern horizontal platzieren.
    HINWEIS: Dies soll eine gleichmäßige Verteilung von Viruspartikeln auf die TEM-Gitter fördern.
  4. Nehmen Sie die Pipette auf und drücken Sie den Kolben, um das Virus in einen Abfallbehälter zu vertreiben. Ansaugen von 40 & mgr; l dIWasser in die Kapseln geben und in den Abfallbehälter für 3 Spülzyklen ausstoßen.
  5. 40 μl entweder 1% UA oder 1% PTA in die Kapseln für 30 s einatmen.
    HINWEIS: Die Färbezeit variierte von 10 s bis 1 min auf der Grundlage von Virusproben.
    Achtung: UA ist ein Alpha-Emitter und ein kumulatives Toxin. Handhabung mit entsprechendem Schutz.
  6. Entfernen Sie die Kapsel aus der Pipette und trocknen Sie die Gitter durch Berühren der Kante der Gitter zu einem Stück Filterpapier. Die Gitter trocknen und für die nachfolgende TEM-Bildgebung aufbewahren.

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Representative Results

Die Kapselmethode produziert gute Qualität Negativfärbung für TEM-Bildgebung:

Zuerst haben wir die Qualität der Bilder ausgewertet, die durch die Verwendung der manuellen Tröpfchenmethode und der Kapselmethoden für die Negativfärbung von Zaire ebolavirus erzeugt wurden. Ebolaviren sind Mitglieder der Filoviridae Familie, zusammen mit Marburg Virus. Ebolavirus hat typischerweise einen Durchmesser von 80 bis 100 nm und kann über 1000 nm lang sein. Ebolavirus muss in einer BSL-4 Biocontainmentumgebung behandelt werden. Abbildung 2 zeigt Bilder, die mit dem manuellen Tröpfchenverfahren und dem Kapselverfahren für die Negativfärbung erzeugt wurden. Abbildung 2A (manuelles Tröpfchenverfahren) und Abbildung 2B (Kapselmethode) zeigen Ebolavirusproben, die klar definierte Details mit Nukleokapsidstrukturen im Zentrum des Virions und sichtbarem Ebolavirus-Glykoprotein aufweisenS auf der Oberfläche. Somit haben sowohl die Kapsel- als auch die Tröpfchenmethoden die Fähigkeit, ähnliche TEM-Bilder zu erzeugen.

Vergleichen und bewerten die EM-Bildqualität nach einer schnellen Inaktivierung mit wässrigem Glutaraldehyd und 1% Osmiumtetroxiddampf gegen 24 Stunden Inaktivierung mit 2% igem wässrigem Glutaraldehyd nach dem Kapselverfahren:

Wir untersuchten die Qualität von TEM-Bildern, die aus zwei verschiedenen Methoden der Probeninaktivierung mit Chikungunya-Virus erzeugt wurden. Chikungunya-Virus ist ein Mitglied der Alphavirus- Gattung in der Familie Togaviridae . Es ist sphärisch mit einem Durchmesser von 60-70 nm. Das Virion enthält eine Hülle, die reich an Glykoproteinen ist, die trimere Spikes auf der viralen Oberfläche bilden. Chikungunya-Virus muss in BSL-3 behandelt werden. Eine schnelle Inaktivierung wird mit 2% Glutaraldehyd für 20 min erreicht, gefolgt von einer 1 h Exposition gegenüber 1% Osmiumtetroxiddampf mit dem gesamten negAtive-Färbeprozess, der in einer Kapsel innerhalb eines BSC im Biocontainment-Labor auftritt ( Abbildung 1C ). Bei der Verwendung von 2% Glutaraldehyd für 24 h, um das Virus zu inaktivieren, erfolgt die Inaktivierung innerhalb einer Biocontainmentumgebung, aber das 1% UA-Negativfleckverfahren wird nach dem Kapselverfahren in einem BSL-2-Labor durchgeführt ( Abbildung 1D ). Diese Inaktivierungsverfahren erzeugen nicht die gleichen Qualitätsbilder ( Abbildung 3 ). Aus Abbildung 3 geht hervor, dass die Fixierung in Glutaraldehyd ohne die Anwesenheit von Osmiumtetroxid ( Abbildung 3A , 3B ) mehr ultrastrukturelles Detail zeigt als Proben, die mit Glutaraldehyd und Osmiumtetroxid hergestellt wurden ( Abbildung 3C , 3D ).

Das Kapselverfahren arbeitet gut mit Uranylacetat (UA) und PhosphatOtungstinsäure (PTA) als negative Flecken für aldehydfeste Proben.

Beispiele für UA- und PTA-Negativfärbung unter Verwendung des Kapselverfahrens sind in Fig. 4 auf Aldehyd-fixierten Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) gezeigt. Die VLPs sind Proteine, die in virusähnliche Strukturen zusammengebaut sind, aber kein virales genetisches Material enthalten. Sie werden typischerweise in der Impfstoffentwicklung und für die grundlegende Virusforschung eingesetzt. Negative Färbung ist ein wertvolles Werkzeug zur Bewertung der VLP-Montage und Morphologie. Wir verwendeten sowohl UA als auch PTA für die negative Färbung von VLPs mit der Kapselmethode. Beide Flecken zeigen qualitativ hochwertige Ergebnisse mit Glykoproteinen sichtbare und klar definierte Grenzen der Ebola nano-VLPs 15 ( Abbildung 4A , 4B ) und Murine Leukämie VLPs 16 ( Abbildung 4C , 4D ).


Abbildung 1: Negative Färbemethoden Übersicht. ( A ) Manuelles Tröpfchenverfahren wird durch sequentielles Verschieben von TEM-Gittern aus Tröpfchen zu Tröpfchen von Proben, Spülungen und Flecken durchgeführt. ( B ) Einstellen der Kapselmethode mit Gittern und Anwendung der Probensuspension ( C ) Typisches Verfahren nach dem Kapselverfahren bei der Biokontainmentierung mit kurzzeitiger Inaktivierung mit 1% Osmiumtetroxiddampf. ( D ) Empfohlenes Verfahren unter Verwendung der Kapselmethode bei der Biokontainmentierung mit Langzeitinaktivierung mit 2% Glutaraldehyd. Abbildung wurde zuvor veröffentlicht und mit Berechtigungen aus Referenz 13 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.


Abbildung 2: Vergleich von 1% PTA-negativ gefärbten Ebolavirus-Partikeln. ( A ) Negativ gefärbt mit der manuellen Tröpfchenmethode. ( B ) Negativ gefärbt nach der Kapselmethode. Abbildung wurde zuvor veröffentlicht und mit Berechtigungen aus Referenz 13 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3
Abbildung 3: 1% UA Negative Färbung mit der Kapsel Methode des Chikungunya-Virus unter Verwendung verschiedener Inaktivierungsverfahren. ( A , B ) Inaktivierung für mindestens 24 h mit nur 2% Glutaraldehyd. ( C ,D) Schnelle Inaktivierung mit 2% Glutaraldehyd und 1% Osmiumtetroxiddampf. Abbildung wurde zuvor veröffentlicht und mit Berechtigungen aus Referenz 13 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4
Abbildung 4: Beispiele für Phosphowolframsäure (PTA) und Uranylacetat (UA) Negativ gefärbte Virus-Like-Particles (VLPs) nach dem Capsule-Verfahren. ( A ) Niedrige Vergrößerungsübersicht von 1% PTA gefärbten Ebola Nano-VLPs. ( B ) TEM-Bild mit hoher Vergrößerung, das strukturelle Details von PTA-gefärbten Ebola-Nano-VLPs zeigt. ( C ) Niedrige Vergrößerungsübersicht von 1% UA gefärbten Murine Leukämie VLPs. ( D ) Hochvergrößerungs-TEM-Bild mit strukturellen detAils von UA ​​gefärbten Murine Leukämie VLPs mit Ebolavirus Glykoprotein auf ihrer Oberfläche. Abbildung wurde zuvor veröffentlicht und mit Berechtigungen aus Referenz 13 wiederverwendet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Discussion

Negative Färbung ist eine wertvolle TEM-Technik zur Bewertung und Größenbestimmung von Viren, Proteinkomplexen und Nanopartikeln. Die Tröpfchenpräparation dieser Proben durch manuelles Bewegen von Gittern von Reagenz zu negativen Flecken ist seit mehr als einem halben Jahrhundert das klassische Protokoll. Es ist ein einfacher Prozess, aber erfordert Know-how durch Training für den erfolgreichen Abschluss gewonnen. Ausgezeichnete Negativfärbung gilt nach wie vor als hochmoderne Kompetenz und ist in vielen TEM-Labors sehr erwünscht. Die Kapselmethode hat gegenüber der manuellen Tröpfchenmethode, insbesondere in Biocontainmentlaboratorien, einige deutliche Vorteile. Zuerst erfordert das manuelle Tröpfchen-Verfahren umfangreiche Schulungen und Erfahrungen, bevor es erfolgreich durchgeführt werden kann, während die einfach zu bedienende Kapsel-Methode durch Einstiegstechniker durch einfaches Pipettieren erreicht werden kann. Die größte Herausforderung bei der manuellen Tröpfchenmethode ist die erfolgreiche Handhabung der TEM-Gitter mit Pinzette in BSL-3 und BSL-4 PSAO die stark reduzierte taktile Empfindung und Geschicklichkeit. Zerbrechlich beschichtete TEM-Gitter sind leicht beschädigt oder durch Pinzette durchbohrt. Eine Beschädigung des beschichteten TEM-Gitters wird oft nicht aufgedeckt, bis es mit einem TEM betrachtet wird. Ein zweiter Vorteil von Kapseln ist, dass TEM-Gitter nur direkt behandelt werden, wenn sie in Kapseln eingefügt werden und wenn sie zum Einsetzen in das Elektronenmikroskop entfernt werden. Ob im Biocontainment-Labor oder in der BSL-2 EM-Anlage, es gibt keine direkte Netzabwicklung. Ein dritter Vorteil der Kapselmethode ist, dass beide Seiten des Gitters mit Viren und Flecken bedeckt sind. Dies kann nützlich sein, wenn die Probenkonzentration niedrig ist; Dies könnte jedoch zu viel Probe verursachen, wenn die Konzentration hoch ist oder eine Verdünnung der Probe vor der Verwendung zur Folge hat.

Negative Färbung mehrerer Gitter mit der manuellen Tröpfchentechnik ist zeitaufwendig, da jede Probe individuell vorbereitet und gefärbt werden muss. Das führt zu Schwierigkeiten obtaiEine konsistente, reproduzierbare Färbung. Darüber hinaus ist die Verfolgung vieler Einzelnetze immer eine Herausforderung. Jede Kapsel hält zwei Gitter und mehrere Kapseln können an einer Mehrkanalpipette befestigt werden, um den Prozess zu straffen. Daher sorgen Kapseln dafür, dass die Gitter unter Verwendung eines sehr ähnlichen Verfahrens unter gleichbleibenden Probenbedingungen gefärbt werden und gleichzeitig. Die Kapseln können beschriftet werden, um in der Organisation zu helfen, wodurch das Potential für das Mischen oder die Fehlidentifizierung von Gittern reduziert wird. Ein weiteres gemeinsames Problem bei der Verwendung der manuellen Tröpfchenmethode ist die Netzkontamination. Dies kann auftreten, wenn die Gitter im Freien zu lange gelassen werden oder fallen gelassen werden. Die Kapsel schützt die TEM-Gitter aus der freien Luft und hält sie sicher, so dass sie nie fallen gelassen werden. Kapseln bieten eine größere experimentelle Kontrolle und Wiederholbarkeit bei der Vorbereitung und Negativfärbung, da die Kapsel eine kontrolliertere Umgebung ist.

Die Kapseln können vorinstalliert werden, wenn deGeheiratet Manuelles Einlegen von Gittern in die Kapseln braucht einige Übungen, um sicherzustellen, dass Gitter nicht beschädigt werden. Die Kapselmethode erfordert auch etwas mehr Probe und Fleck als die manuelle Tröpfchenmethode. Die Kapselmethode erfordert mindestens 40 μl Probe, verglichen mit der manuellen Tröpfchenmethode, die mit bis zu 8 μl durchgeführt werden kann.

Die Virusinaktivierung ist ein wichtiger Bestandteil der negativen Färbung in BSL-3 und BSL-4, da es ermöglicht, dass das inaktivierte Virus aus den Biocontainment-Labors zur Bildgebung in der EM-Anlage entnommen wird. Die Inaktivierung mit Fixiermitteln hat den zusätzlichen Vorteil, das Virus zu fixieren und den Abbau zu verhindern. Es gibt zwei verschiedene Möglichkeiten, die Virusprobe zu inaktivieren, die beide in dieser Studie untersucht wurden. Die erste haftet das Virus an beschichteten TEM-Gittern, fixiert die Viren für 20 min in einer 2% Glutaraldehydlösung, gefolgt von 1 h Exposition des Gitters mit Osmiumtetroxiddampf ( Abbildung 1C ). Diese InaktivitätIonen-Verfahren ist vorteilhaft, weil es Zeit spart, indem es ermöglicht, dass die Probe nach 1 h und 20 min aus dem Biocontainment-Labor entnommen wird. Es verhindert auch die Verdünnung des Virus vor dem Auftragen auf das beschichtete TEM-Gitter, so dass es notwendig sein kann für Proben, die vermutlich in der Nähe der TEM-Nachweisgrenze liegen. Jedoch verringert 1% Osmiumtetroxiddampf die Qualität von TEM-Bildern, da das Osmium die Probe weiter färben kann ( Abbildung 3 ). Frühere Berichte zeigen eine 5-minütige Exposition gegenüber Osmium-Tetroxid-Dampf bietet gute Ergebnisse bei negativen Färbung; Eine längere Exposition, die für eine absolute virale Deaktivierung erforderlich war, erzeugte jedoch eine Mischung aus positiver und negativer Färbung 17 . Das zweite Inaktivierungsverfahren umfasst mindestens 24 h in einer 2% igen Glutaraldehydlösung und erfordert keine Osmiumtetroxiddampfbehandlung ( Abbildung 1D ). Diese zweite Methode dauert länger, wenn die Probe nicht aus dem biocontainment labo entfernt wirdRational für 24 h, kann aber vorteilhaft sein, weil es die Negativfärbung außerhalb des Biokontainments in einer BSL-2-Umgebung ermöglicht und die Notwendigkeit von gefährlichem Osmiumtetroxid eliminiert. Unsere Ergebnisse zeigen, dass 24 h Glutaraldehyd-Inaktivierung TEM-Bilder mit höherer Qualität erzeugen, als wenn Proben mit Osmiumtetroxiddampf behandelt werden ( Abbildung 3 ).

Zwei negative Flecken wurden in diesem Experiment verwendet: UA und PTA. Beide Flecken werden als 1% ige Lösung verwendet. UA, das Acetatsalz von Uran, funktioniert gut als eine negative stain weil dichte Uranatome Elektronen streuen 5. PTA, eine Heteropolysäure, funktioniert ebenso gut wie ein negativer Fleck durch dichte Wolframatome 5 . PTA ist manchmal bevorzugt über UA, weil es viel weniger giftig ist, und nur ein mildes Reizmittel, wenn inhaliert oder kontaktiert. Bei negativer Färbung von unfixierten Proben muss der niedrigere pH-Wert von UA ​​als Schäden betrachtet werdenO die Probe. Die in diesem Experiment verwendeten Viren erfordern eine Fixierung für die Inaktivierung, so dass sowohl UA als auch PTA ähnliche Ergebnisse erzielten und kein deutlicher Vorteil für beide Flecken nachgewiesen werden konnte. Beide Flecken sind einfach zu bearbeiten, und beide produzieren ähnliche TEM-Bilder ( Abbildung 4 ).

Insgesamt ist die Kapselmethode in einer Biocontainment-Umgebung einfacher zu verwenden und kann als Alternative zur manuellen Tröpfchenmethode eingesetzt werden. Die Verwendung von Kapseln erleichtert Probenmanipulationsdefekte und liefert gute TEM-Bilder. Die nach dem Kapselverfahren hergestellten Bilder sind vergleichbar mit Bildern, die nach dem manuellen Tröpfchenverfahren hergestellt wurden. Kurze Virusinaktivierung mit Osmium-Tetroxid verbessert die Geschwindigkeit, sollte aber nur verwendet werden, wenn eine reduzierte Bildqualität akzeptabel ist, oder es wird vermutet, dass die Verdünnung des Virus unter die TEM-Nachweisgrenze für das Verfahren gestellt wird. Sowohl UA als auch PTA liefern ähnliche Ergebnisse mit den in dieser Studie verwendeten festen Virusproben; HoWever, die Ergebnisse können unterschiedlich sein, wenn sie unfixierte Viren färben.

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Disclosures

Meinungen, Interpretationen, Schlussfolgerungen und Empfehlungen im Artikel sind die der Autoren und werden nicht unbedingt von der US-Armee oder dem Verteidigungsministerium unterstützt.

Acknowledgements

Wir danken Dr. John Carra und Rowena Schokman für die Bereitstellung gereinigter Ebola Nano-VLPs, Dr. Rajini Mudhasani für die Bereitstellung von Chikungunya Virus und Dr. Charles (Jason) Schuhmacher für die Bereitstellung von Murine Leukämie VLPs, die Ebolavirus Glykoproteine ​​exprimieren. Wir möchten uns auch bei MAJ Carl Soffler für die Erleichterung des Summer Praktikumsprogramms (SIP) und des Science and Engineering Apprenticeship Program (SEAP) und Dr. Catherine Wilhelmsen für die Laborsicherheitstraining bedanken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Formvar/carbon coated TEM grids SPI 3420C-MB 200 mesh Cu Pk/100
mPrep/g capsules EMS 85010-01 box
mPrep/f couplers EMS 85010-11 standard 16/Pk
glutaraldehdyde EMS 16320 50% solution, EM grade
Osmium Tetroxide EMS 19190 4% aqueous solution
Uranyl Acetate EMS 22400 powder
Potassium phosphotungstic acid EMS 19500 powder
filter paper Whatman 1450-090 size 50
Tranmission Electron Microscope JEOL JEM-1011 TEM

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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