Aedes aegypti 모기 감염 Wolbachia 유지

Biology

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Summary

Aedes aegypti 모기 Wolbachia 감염 arboviruses의 전송을 억제 하는 자연적인 인구에 발표 되는. 우리 실험실 적응 및 선택 최소화 하기 위해 예방 조치를 복용 실험 및 필드 릴리스, 후면 Ae aegypti Wolbachia 감염 실험실에서 하는 방법을 설명 합니다.

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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

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Abstract

실험적 감염 Wolbachia aedes aegypti 모기는 뎅기열, chikungunya, Zika 등 arboviruses의 확산을 제어 하는 프로그램에서 활용 되고있다. Wolbachia-감염 된 모기 호환 되지 않는 matings 통해 인구 크기를 줄이거나 또는 바이러스 전송 내 화물은 모기와 인구 변환 필드에 나올 수 있습니다. 성공할이 전략에 대 한 실험실에서 필드에 출시 모기 네이티브 모기와 경쟁 해야 합니다. 그러나, 실험실에서 모기를 유지 될 수 있습니다 근 친, 유전적 부동 및 실험실 적응 분야에서 자신의 체력을 줄일 수 있으며 실험의 결과 혼동 수 있습니다. 테스트 하려면 배포에 대 한 다른 Wolbachia 감염의 적합성 분야에서 그것은 여러 세대에 걸쳐 제어 된 실험실 환경에서 모기를 유지 하는 데 필요한. 우리 모두 Wolbachia적합 실험실에서 Ae aegypti 모기를 유지 하기 위한 간단한 프로토콜 설명-감염 및 야생-타입 모기. 방법 실험실 적응을 최소화 하 고 필드 모기에 실험의 관련성을 높이기 위해 outcrossing 구현. 또한, 식민지는 오픈 필드 자료에 대 한 자신의 적합성을 극대화 하기 위해 최적의 조건에서 유지 됩니다.

Introduction

Aedes aegypti 모기는 뎅기열, Zika chikungunya1를 포함 하 여 세계에서 가장 중요 한 arboviruses의 일부를 전송 합니다. 이러한 바이러스 Ae aegypti 열 대 지방에 널리 분포2,,34를 확장 하는 계속 되 고 세계 보건에 대 한 증가 위협 되 고 있다. 여성 애 aegypti 우선적으로 인간의 피5 에 피드 하 고 따라서 인구는 가장 조밀한 도시 지역에서 특히 인 간에 게 가까운 근접에서 사는 경향이. 인간과이 가까운 협회를 통해 그들은 또한 타이어, 냄비, 하 수구 및 물 탱크6,7을 포함 하 여 인공 서식 지에서 번 식에 적응 했습니다. Ae aegypti 또한 쉽게 어디 그들은 유지 될 수 있는 어떤 특별 한 필요 조건 없이 Aedes8, 다른 종족과 달리 필드에서 직접 수집 후 실험실 환경에 적응 9,10. 유지 보수의 용이성 그들의 분야의 광범위 한 범위에 실험실에서 널리 공부 그들 본, 전송할 수 있습니다 궁극적으로 질병 모기 제어를 목표로 하는 것.

전통적으로, arboviral 제어 모기 인구를 줄이기 위해 살충제의 사용에 크게 의존 합니다. 그러나, 접근 수정된 모기 실험실에서 양육 하 고 자연적인 인구에 발표에서 증가 관심이 있다. 출시 된 모기는 유전자에11,12,13, 생물학14,15, 방사선 조사16, 화학 치료17,18를 통해 수정할 수 있습니다. 또는 결합 된 기법19 모기 인구를 억제 하거나 arboviral 전송20내 화물은 모기와 함께 그들을 대체 합니다.

Wolbachia 박테리아 arboviruses. 에 대 한 생물 학적 제어 에이전트로 현재 사용 되 고 있다 여러 변종의 Wolbachia 최근 Ae aegypti 배아 microinjection21,22,,2324를 사용 하 여 실험적으로로 소개 되었다. 이러한 변종 유포 및 떨어지면서 그들의 전송 잠재적인23,25,,2627,28 모기에 복제 하는 arboviruses의 용량을 줄일 . 그러나 Wolbachia 감염 감염 된 남성과 감염 되지 않은 여성22친구 때 특정 긴장 무 균을 유도 하는, 자손에 게 어머니에서 전송 됩니다. Wolbachia-감염 된 남성 최근에 다른 Aedes15,29에서 설명 하는 천연 모기 인구를 억제 하에 따라서 나올 수 있습니다. 그러나, 이후 Wolbachia 또한 Ae aegyptiarboviral 전송 억제, 모기 수 또한 나올 가난한 벡터 본토 인구를 바꿉니다. Ae aegypti Wolbachia 실험적으로 감염 됩니다 지금이 후자의 접근14,,3031를 사용 하 여 여러 국가에서 필드에 출시 되고있다.

Wolbachia-arboviral 컨트롤에 대 한 기반된 접근법 Wolbachia, 모기와 환경 간의 상호 작용의 소리 이해에 의존. Wolbachia 곤충의 광범위 한 범위에서 자연스럽 게 발생 하 고 모기에 도입 하는 긴장은 그들의 효과32에서 다양 한. Wolbachia 감염 신형 Ae aegypti24에 소개는, 그것은 모기 피트 니스, 재생산 및 다양 한 조건에서 arboviral 간섭에 미치는 영향에 대 한 각 스트레인을 특성화 하는 데 필요한. 실험실에서 엄격한 실험 따라서 Wolbachia 종자 분야에서 성공 하기 위한 잠재력을 평가 해야 합니다.

Wolbachia 감염 Ae aegypti 의 오픈 필드 자료 자주 출시 될 영역 당 모기의 수천 수만 수천 reared 각 주14,,3031요구할 수 있습니다. 초기 출시의 성공 그들의 통치33 과 짝짓기 성공34,35극대화에 큰 크기의 모기를 방출 하 여 개선할 수 있습니다. 그러나 모기도 그들은 행동과 필드 성능36,37에 영향을 줄 수 있는 생리에 변화를 일으킬 수 있습니다 장기 실험실 양육 분야에서 경험 하 게 됩니다 하는 조건에 적응 해야 38.

우리 애 aegypti 기본 장비를 사용 하 여 실험실에서 양육에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이 프로토콜은 두 야생-타입에 적합 및 Wolbachia-감염 모기, 후자는 요구할 수 있습니다 특별 한 관심으로 일부 Wolbachia 변종 모기 생활 역사 특색39, 에 상당한 영향을 미칠 40. 양육 조건과 밀 하 고 일관 된 크기는 벡터 역량 및 피트 니스 실험에 대 한 중요 하 고 모기는 필드 릴리스41에 대 한 건강 보장의 모기를 생산 하는 식품에 대 한 경쟁 방지 . 우리는 또한 선택 압력을 감소 시켜 실험실 적응 및 근 친 결혼을 최소화 하기 위해 예방 조치를 취해야 하 고 큰, 임의의 풀에서 샘플링은 되도록 다음 세대. 그러나, 실험실 환경 분명히 다른 필드 조건, 그리고 편안한 조건에서 장기적인 유지 관리 릴리스 필드37,42,43에 따라 모기의 피트 니스를 줄일 수 있습니다. . 우리가 따라서 크로스 여성 필드 수집 남성 주기적으로 실험실 라인에서 식민지 유전자 실험 비교에 대 한 유사 고는 대상 필드 인구39적응의 결과로. 방법 어떤 특수 장비를 필요로 하지 않는 및 필드 출시에 대 한 주당 개인의 수천의 수만 후방에 확장할 수 있습니다. 프로토콜은 또한 곤충 자연 인구에 설립에 대 한 운명에 대 한 중요 한 고려 사항 시간과 세대를 걸쳐 모기의 피트 니스 우선순위. 이 프로토콜은 특히 모기와 필드에 relatability의 일관 된 품질은 중요 한 실험적인 비교에 대 한 Ae aegypti의 유지 보수를 필요로 하는 대부분의 실험실에 적합 합니다.

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Protocol

멜버른 인간의 윤리 위원회의 대학에 의해 승인 되었다 혈액 인간 주제에 모기의 먹이 (승인 #: 0723847). 제공 하는 모든 자원 봉사자 정보 서 면된 동의.

1. 애벌레 양육

참고: 모기는 26 ± 0.5 ° C 및 50-70% 상대 습도,이 식민지 유지 관리 프로토콜에 대 한 12시 12분 h (빛: 다크) photoperiod와에서 개최 됩니다. 이러한 조건을 평균 기후 조건, 호주 및 최적의 열 범위 Ae aegypti 생존과 개발44,,4546대와 비슷합니다. 높은 온도 Wolbachia 감염 모기 식민지에서의 손실 될 수 있습니다 고 피할된47이어야 한다. 우리는 근 친 결혼;을 최소화 하기 위해 인구 당 적어도 500 개인 유지 더 작은 크기의 식민지 유지 피트 니스 결과 [로스 미 발표] 가질 수 있습니다. 이러한 조건과 가정 적절 한 영양에서 평균 세대 시간은 ( 표 1참조)는 28 일 이다.

  1. 물고기 음식의 ~ 300 mg에 트레이 (그림 1A) (역방향 삼 투 물 또는 세 수도 물, 수돗물 사용 전에 h 24 쟁반에 두어서 생성), 물 3 L를 포함 하는 기판에 계란을 잠수함 (분쇄 한 태블릿 테이블의 자료를 참조 하십시오)와 해칭48유도 활성 건조 효 모의 몇 가지 곡물.
  2. 해칭, 후에 1 일 물 (그림 1B)의 4 L을 포함 하는 쟁반에 약 500 애벌레를 전송, 리모콘 카운터를 사용 하 여 계산 하는 유리 피 펫을 사용 합니다. 각 트레이를 두 짓 눌린된 물고기 음식 정제를 추가 합니다. 필요한 경우, 애벌레 (그림 1A), 양육에 대 한 다양 한 크기의 용기를 사용 하지만 애벌레 밀도 밀을 피하기 위해 0.5 애벌레/mL 이하로 유지.
  3. 확인 매일 트레이 애벌레가 충분 한 음식; 매 2 일 쟁반에 약 2 개의 식품 정제를 추가 합니다. 식품 광고 libitum 제공 하지만 0.5 mg/유 충/일은 개발 동기 이며, 신체 크기를 보장 하기 위해이 기간 동안 사용할 수 있는 일치 하는, 실험의 결과 혼동 수 있습니다 그렇지 않으면 보장 (대표 결과 참조).
  4. 애벌레의 지나치게 하지 않도록 주의 특히 작은 양육 용기 덜 물 면적 및 볼륨. 물 흐린 경우 또는 경우 상당한 애벌레 사망률, 신선한 물;로 대체 사망률은 애벌레 최적으로 먹이 면 무시할 수 있어야 합니다.

2. 성인 출현

참고: 애벌레 먹이 잘 하는 경우 부 화 후 5 일에서 pupate에 시작 되 고 대부분 부 화 후 7 일에 의해 pupate 한다. 성인 26 ° C에서 최적으로 유지 하는 경우 pupation 후 약 2 일 신흥 시작 됩니다 ( 대표 결과참조). 애벌레의 개발 때 하지 Wolbachia 감염에 의해 일반적으로 영향을 받는 충분 한 음식23,,3949제공 됩니다.

  1. 부 화 후 7 일 좋은 메쉬를 통해 용지함의 전체 내용을 부 어 (기 공 크기 0.4 m m). Ovicups에서 나중에 사용에 대 한 필터링 된 애벌레 물을 유지 ("혈액 먹이 산란" 섹션 참조). 메쉬를 반전 하 고 번데기를 전송 하는 물 200 mL와 함께 플라스틱 용기에 그것을 찍어. 모든 애벌레 남아 있으면 추가 음식을 제공 합니다.
  2. 10% 자당 해결책 (그림 1 층)의 2 개의 컵 및 건조 (그림 1E)을 방지 하기 위해 젖은 솜 털의 2 개의 컵을 제공 하 여 성인 출현 케이지 (그림 1C)을 준비 합니다.
  3. 번데기 섹스에 의해 정렬할 필요가 없는 경우 pupae의 lidded 컨테이너 감 금 소에 놓고 뚜껑을 약간 성인으로 등장할 수 있도록 열려 떠나. 또는, 익사를 최소화 하기 위해 컨테이너를 통해 거꾸로 깔때기를 놓습니다. 케이지 방지 느린 개발자에 대 한 선택에서 컨테이너를 제거 하기 전에 모든 성인 등장 확인 합니다.

3. 번데기 Outcrossing 대 파는

  1. 번데기는 섹스 (예를 들어, outcrossing 위한)에 의해 정렬할 필요가, 플라스틱 쟁반 애벌레에서 번데기 하 고 별도 남녀 (그림 2) 플라스틱 용기 (그림 1A)에 물 200 mL와 함께 모든 24 h 각 성의 원하는 번호까지 에 도달 했습니다. 용기에 뚜껑을 배치 하 고 폐쇄 그들을 두고.
  2. 성인은 컨테이너;으로 나타날 것입니다. 감 금 소 (그림 2C)로 발표 하기 전에 그들의 섹스를 확인 합니다. 어른 sexed 하지 올바르게 출현의 24 시간 이내 흡 인기와 성적 성숙에 도달 하기 전에 제거 합니다. 일단 남녀 확인 되었습니다, 감 금 소 모든 24 h에 성인을 릴리스.
  3. Wolbachia를-자연적인 인구에 유사한 유전 배경의 감염 된 식민지 outcross Wolbachia추가 하 여-의 여성을 실험실 식민지에서 감 금 소에 감염 되지 않은 남성 ovitraps에 의해 수집 된 계란에서 파생 된 감염 필드39, 인구 당 500 개인의 소정의 밀도 유지.
    1. 적어도 87.5% 필드 인구39유전자와 유사한 식민지를 생산 하기 위해 적어도 3 개의 연속 세대 outcrossing 반복 합니다. 중요:이 단계에서 남녀 올바른지 확인 (단계 3.1 참조).
  4. 여성 애 aegypti 는 일반적으로 내 화물50짝짓기의 시간 더 수정입니다. 때 식민지 outcrossing, 허용 여성 남성 2 일에 대 한 별도 연습장에 성숙 하 고 다음으로 남성 여성을 발음에 모든 남성에 게 동등한 기회를 제공 하.

4. 혈액 먹이 산란

  1. 적어도 3 일 후에 마지막 여성 혈액 충분 한 시간을 성숙 수 있도록 수 유 전에 나왔다 기다립니다. 혈액 특히 장 수22,,2449저하 Wolbachia 감염 모기에 대 한 과도 한 사망을 방지 하기 위해 출현 후 2 주 이내 여성을 피드. 먹이 속도 향상 시킬 수 유 전날 설탕 컵을 제거 합니다.
    1. 여성 모기 먹이를 수 있도록으로 그들의 팔 뚝을 삽입 하는 자원 봉사를 부탁 드립니다. 대부분 여성 투입 5 분 이내에 피드 해야 하지만 느린 모이 통에 대 한 선택 영역을 줄이기 위해 15 분, 또는 때까지 모든 암컷은 눈에 띄게 부풀어 오른; 장에 팔 뚝을 두고 물린에서 손을 보호 하기 위해 라텍스 장갑은 옵션 이지만 권장.
    2. 혈액 수 유 후 2 일으로 계란을 낳 기 위해 여성에 대 한 애벌레 양육 물을 포함 하 고 샌드 페이퍼 (그림 1G) (또는 필터 종이 (그림 1 H))의 스트립을 늘어서 두 개의 플라스틱 컵을 놓습니다. 부분적으로 그것을 축축한 유지 하는 물에서 샌드 페이퍼 스트립 잠수함. 물 산란 컵 밖에 서 그들의 알을 낳은에서 여성을 방지 하기 위해 다른 소스를 제거 합니다.
      참고:는 컵에 수돗물을 사용할 수 있습니다 하지만 애벌레 양육 물 산란51,52 장려 및 여성 더 동기적으로 그들의 알을 낳는 것입니다.

5. 달걀 수집 및 컨디셔닝

  1. 여성은 바로 위에 물 선; 샌드 페이퍼에 알 것 이다 수집 하 고 더 많은 계란이 마련 매일 샌드 페이퍼 스트립 교체. Note는 산란 최대 1 주일까지 계속 수 있습니다.
  2. 부드럽게 30 종이 타월에 blotting에 의해 부분적으로 건조 샌드 페이퍼 스트립 s, 계란을 꺼내 려 하지 않도록 주의 복용. 그리고 건조 종이 타월의 시트에서 스트립 포장 접착 비닐 봉투 (그림 1I)에 배치 합니다.
  3. (그림 3) 해 현미경 계란의 상태를 확인 하십시오. 샌드 페이퍼 스트립 너무 젖, 계란 물 (그림 3B), 침수 되 고 전에 해치 수 있습니다 하지만 너무 가혹 하 게 건조, 달걀 (그림 3C) 축소 수 있습니다.
  4. 계란 3 일 후 컬렉션 넘어 언제 든 해치 할 수 있습니다. 차세대 개인의 큰 임의의 수영장에서 샘플링은 되도록 물의 동일한 컨테이너에 있는 모든 일에 걸쳐 수집한 각 식민지에서 모든 달걀을 부 화 한다.
  5. 장기 보관을 위해 계란에에서 계속 높은 (> 80%) 습도에 봉인 된 컨테이너 약 20 ° c.에 이러한 조건 하에서 높은 해치 요금53,54를 유지 하면서 몇 달 동안 Wolbachia 없이 계란을 저장할 수 있습니다.
  6. 일부 Wolbachia 감염 크게 나이49,55와 계란의 가능성을 줄일 수, 해치 Wolbachia에서 계란-라인 컬렉션 관련에 대 한 과도 한 사망을 방지 하기 위해 1 주일 이내 감염 변종입니다. 혈액 더 많은 알 필요 하면 1 주일 후 다시 여성을 피드.
하루 단계
0 해치 계란
1 쟁반에 수 애벌레
7 애벌레와 번데기 식민지 연습장에 전송
17 혈액 피드 여성 성인
21 계란을 수집 시작
25 계란을 수집 완료
28 해치 계란

표 1: 개요 26 Ae aegypti 식민지 유지 관리 일정의 ° c. 계란의 부 화는 여성의 혈액 공급의 타이밍은 유연 하지만, 이러한 단계에서 긴 기간 피해 야 한다 특히 모기가 Wolbachia, 사망률을 최소화 하기 위해 감염에 대 한. 이 일정에 따라 최적으로 애벌레는 먹이 빠르게 또는 느리게 개발 하거나 모든 생활 단계에서 성숙 하는 모기에 대 한 선택을 최소화 합니다.

Figure 1
그림 1: 장비 실험실에서 Ae aegypti 양육. 부 화 계란 또는 애벌레 500, 볼륨을 양육에 대 한 사용 (A) 플라스틱 용기 750과 5000 mL (왼쪽에서 오른쪽). 물 4 L에 보통 500 애벌레 제어 밀도에 애벌레를 양육에 사용 되는 (B) 쟁반 (C) 19.7 L 및 (D) 3 패 케이지 주택 성인 사용. 25 성인의 밀도 또는 리터 당 충분 한 공간을 제공 하기 위해 유지 되어야 한다. (E) 성인 물 소스로 제공 촉촉한 솜 털과 35 mL 컵. 자당 솔루션 코드 또는 치과 심지를 통해 제공 하는 설탕의 근원으로 (F) 35 mL 컵. (HG-) 컵 애벌레 양육 물으로 채워지고 늘어서 샌드 페이퍼 또는 필터 종이의 산란 기판 (G , H, 각각). () 지퍼 잠금 가방 샌드 페이퍼 스트립 또는 필터 종이의 저장을 위해 사용. 샌드 페이퍼에 검은 반점은 모기 계란. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 측면 (A) 및 pupae와 성인 Ae aegypti (C) 보여주는 그들의 성적 동종이 형의 등 쪽 (B) 플레이. 남성은 왼쪽 및 오른쪽 각 패널에 여성에 배치 됩니다. 먹 일 때 최적으로, 남성과 여성의 번데기 크기;으로 구분 됩니다. 여성 남성 (A) 보다 더 큰 고 아첨 측면 (B)는 남성에 비해 상대적으로 주먹코 cephalothorax. 성인 남성은 그들의 plumose 안테나와 긴 palps에 의해 주로 여성 모든 양육 조건에 쉽게 구별입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3입니다. 다른 조건 하에서 4 일 오래 된 Ae aegypti 계란. (A) 본래 어떤 보이는 수 분 하지 않고 높은 (> 80%)의 습도 유지 하는 샌드 페이퍼 스트립에 계란. 올바르게 유지 관리 하는 경우 해치 요금 야생-타입 Ae aegypti 에 대 한 90% 이상 이어야 한다. (B) 계란 물 (조 숙한 해칭)에 빠져들 되 고 전에 해치 분리 된 달걀 모자와 보이는 유 충에 의해 구별 된다. 샌드 페이퍼 스트립 너무 촉촉한 유지 했다 나타냅니다. (C) 알을 너무 가혹 하 게 건조 축소 수 있습니다, 그리고 그들의 오목한 모양에 의해 명확 하 게 볼 수 있습니다. 샌드 페이퍼 뻣 뻣 한 경우 또한 알이 너무 건조 수 있습니다 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Representative Results

그림 4 에서는 Ae aegypti 애벌레의 개발에 차선의 영양의 효과 보여 줍니다. 때 컨테이너 애벌레 하루 당 식품의 0.25 밀리 그램 제공 됩니다 또는, 개발 시간 증가 둘 다 남성과 여성, 하 고 음식의 0.5 mg와 용기에 보다 적게 동기 제공 됩니다. 적절 한 음식 애벌레의 개발 기간을 통해 제공 되지 않은 경우 유지 관리 일정에 부정적인 영향을 미칠 수이. 느린 개발 개인에 대 한 선택 되 고의 위험에 노출 되어, 혈액 공급이 지연 될 수 있습니다, 그리고 복제 발생 하기 전에 성인 사망률의 위험이 있다.

그림 5 에서는 다양 한 영양 정권 아래 reared Ae aegypti 성인의 날개 길이 (바디 크기의 견적). 날개 길이 수 컷과 암컷의 실질적으로 감소 영양이 최적이 더 가변 되 고. 균일 한 바디 크기는 중요 한 실험적인 비교에 대 한 바디 크기와 긍정적으로 관련 통치, 큰 모기 필드 조건33,,3435 아래 큰 피트 니스를 전시 하는 것으로 예상 된다 .

위의 특성에 Wolbachia 감염의 효과 다른 연구에서 설명 하지만 일반적으로 아무 효과23,,3949작은.

Figure 4
그림 4: Ae.aegypti (A) 성과 (B) 남성 26 ° c.에 다른 음식 정권에서 성인 기에 개발의 누적 비율 100 애벌레 식품의 다른 수준을 제공 하는 500 mL 물 (mL 당 0.2 애벌레의 애벌레의 밀도), 용기에 reared 했다 (참조 테이블의 재료) 그리고 그들의 개발 시간에 대 한 득점. 성인 기에 살아남은 애벌레만 포함 되었습니다. 오차 막대는 표준 오류, n = 4 복제 당 치료. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 날개 길이 Ae.aegypti (A) 여성 및 (B) 남성 26 ° c.에 다른 음식 정권에서 개발 100 애벌레 500 mL 물 (mL 당 0.2 애벌레의 애벌레의 밀도)의 용기에 reared 되었고 음식의 다른 수준으로 제공. 성인의 하위 집합 다음 앞에서 설명한 방법56를 사용 하 여 그들의 날개 길이 측정 했다. 오차 막대는 표준 편차. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

여기에 제시 된 Wolbachia의 유지 보수에 대 한 프로토콜에 따라-감염 된 Ae aegypti 일관성 있는 품질의 건강 한 모기 실험에 대 한 생산 및 필드 자료 열을 확인 해야. (참조57참조) 모기의 대량 양의 생산 우선 순위를 지정 하는 다른 프로토콜, 달리 방법 모두 세대 편안한 양육 조건, 구현 하 여 고에서 자신의 체력을 극대화에 집중 근 친, 선택 및 실험실 적응을 최소화 하 여 세대. 이 프로토콜도 Ae aegypti Wolbachia 감염을 위해 특별히 설계 되었습니다 그러나 Ae aegypti의 모든 종류에 적합 해야 한다. 그러나, 그것은 인구 억제57,58를 달성 하기 위해 높은 숫자를 필요로 하는 살 균 또는 호환 되지 않는 곤충 자료에 필요한 수 있는 (순서 주 당 수백만), 대량 양을 양육 적합 합니다.

신중 하 게 따라야 합니다 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 그것은 최적의 애벌레 먹이 및 그들의 발달의 기간에 대 한과 밀을 방지 해야 합니다. 모기 동기적으로 개발 하 고 일관 된 크기의 이렇게 하면. 특별 한도 주의 해야 때 컨디셔닝 계란; 애벌레 수 아주 쉽게 너무 빨리 부 화 또는 계란 산란 기판은 너무 습식 또는 건식, 각각 하는 경우만 수 있습니다. 프로토콜의 모든 단계에서 각 단계를 완료 하려면 가능한 식민지에서 많은 개인을 위한 충분 한 시간을 허용 하는 것이 좋습니다. 개발, 성숙, 혈액 피드, oviposit 또는 부 화 하는 개인에 대 한 선택 유전 변이의 손실 이어질 가능성이 것입니다.

우리 주의 Wolbachia의 유지 보수에 대 한 몇 가지 추가 고려 사항-위의 프로토콜에 설명 되지 않은 모기를 감염. 그것은 Wolbachia 감염 실험실 식민지에서 손실 될 수에 대 한 가능한 그리고 그러므로 식민지 그들의 Wolbachia 감염 상태에 대 한 정기적으로 모니터링 될 것이 좋습니다. 정량적 중 합 효소 연쇄 반응 (정량)49,59Wolbachia에서 적어도 30 명의 테스트를 사용 하 여-모든 세대 라인에 감염. 만약 어떤 개인이 적절 한 Wolbachia 감염에 대 한 부정적인 테스트, 식민지 영향을 받는 식민지에서 가능한 많은 암컷을 분리 하 고 다음만, 감염 된 엄마 로부터 자손을 사용 하 여 다음 세대를 발견 하 여 정화 수 있습니다. 일부 Wolbachia 긴장 실험실 식민지에서의 손실의 원인은 크게 알려진, 하지만 높은 온도 Wolbachia 감염47, 손실이 발생할 수 있습니다으로 온도 제어의 실패에 의해 설명 될 수 있습니다. 60.

식민지와 실험 수 또한 될 오염 다른 라인에서 개인과 양육 때 케어 촬영 되지 않습니다 경우. 오염 애벌레, 계란, 감 금 소를 mislabeling의 배치를 혼합의 부주의 pipetting에서 발생할 수 있습니다 또는 십자가에 번데기를 제대로 파는. Wolbachia 감염 종류와 식민지를 처리 하는 경우에 따라서 특별 한 배려를가지고 한다. 모든 산란 컵, 쟁반과 새 장에 그들을 재사용 하기 전에 양육 애벌레의 각 새로운 트레이 취급 하기 전에 펫 청소 하 고 각 메시를 청소 하는 철저 하 게 깨끗 한 다른 컨테이너에 애벌레와 번데기를 전송할 때 시간. 샌드 페이퍼 처리 제거 하 고 신선한 종이 타 올을 사용 하 여 각 건조 스트립, 성인, 연습장에 그들을 해제 하기 전에 올바른 섹스 인지 확인 하 고 어떤 탈북자 신속 하 게 처리 하는 경우에 또한, 계란에 대 한 손가락을 검사 합니다. 이러한 예방 조치를 복용 대부분 오염 피해 야 하지만 식민지 여전히 정기적으로 모니터링 해야 진단 분석59를 사용 하 여.

여성 애 aegypti 필요 혈액 식사, 알을 낳 기 위해 그리고 다양 한 방법으로, 막 먹이 시스템57, 절제 된 동물61 그리고, 조금 적게, 인공 혈액62에에서 그들을 제공 하는 전 세계 실험실 . 그러나 실험적인 Wolbachia 감염 모기 종종 비 인간 혈액에 가난 하 게 실행 하 고 감소 통치와 해치 속도, 그리고 그들의 자손63, Wolbachia 의 불완전 한 전송 전시 수 있습니다, 64 , 65. 인간의 냄새는 암컷의 가치인 또한, 필드에 나올 모기에 대 한 중요 하 고이 능력37타협 수 있습니다 세포 막 또는 다른 동물을 통해 그들을 먹이 유지. 일부 상황에서 다른 방법 필요 하지만 우리 따라서이 식민지 유지 관리 프로토콜에 대 한 인간 자원 봉사자의 팔 뚝을 사용 하도록 선택할. Arboviruses, 직접 작업할 때 다른 수단을 통해 혈액을 공급 해야 하 고 주의 해야 arboviruses의 transovarial 전송66을 발생할 수 있습니다 식민지 높은 바이러스 부하와 함께 필드 인구에서 발생 하는 경우. 인간의 자원 봉사자 전송의 위험이 있을 수 있으므로 그들은 최근 arboviral 발병 국가 방문 하는 경우 또한 아니라 혈액 피드를 해야 합니다.

우리의 유지 보수 프로토콜 연구실 적응과 선택 압력을 최소화 하는 것을 목표로 하지만 개선의 여지가 있다. Leftwich 외. 42 오픈 필드 자료에 대 한 모기의 피트 니스를 유지, 더 다양 하 고 자연 애벌레 다이어트의 사용을 포함 하 여, 감 금 소에서 성인의 밀도 감소 및 복잡 한 환경을 제공 추가 권장 사항을 제공 합니다. 현재 유지 보수 프로토콜 설명 [로스 미 발표] 실험실 적응 때문 피트 니스 변경의 증거는 이러한 고려 사항 더 큰 단계로 Ae aegypti 의 적합성을 강화 수 있습니다. 몇 가지 추가 조치는 제한 된 공간과 리소스, 실험실에 대 한 실현 되지 않을 수 있습니다 하지만 그럼에도 불구 하 고 조사 하 고 가치가 있다. 큰 인구 크기를 유지, 프로토콜을 양육 하 고 구현 통해 주요 선택 압력을 피하고 정기적인 필드 모기 outcrossing 도움이 될 오픈 필드 자료에 대 한 Ae aegypti 의 높은 적합성을 보장. 접근에 관련 된 원칙을 조작 하거나 자연 인구 억제 릴리스에 대 한 다른 질병 벡터 종 양육에 적용할 수 있습니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

Acknowledgements

우리는 Heng 린 응, 크리스 패튼, Petrina 존슨 및 우리의 식민지 유지 관리 방법의 개발에 그들의 공헌에 대 한 클레어 Doig 및 원고를 개선 하는 데 도움이 그들의 제안에 대 한 3 명의 익명 검토자 인정 합니다. 우리의 연구 국민 건강에서 아에 프로그램 그랜트와 장학금에 의해 지원 됩니다 그리고 의료 연구 위원회 및 번역 Wellcome 트러스트에서 부여. 파 한 호주 정부 연구 훈련 프로그램 장학금의 받는 사람입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

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