利用视网膜成像研究痴呆

Medicine

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Summary

视网膜与大脑有着显著的相似性, 因此它是研究脑性中血管和神经元结构的独特窗口。本协议描述了一种利用视网膜成像技术研究痴呆症的方法。这种方法对痴呆的诊断和风险评估有潜在的帮助。

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Chan, V. T., Tso, T. H., Tang, F., Tham, C., Mok, V., Chen, C., Wong, T. Y., Cheung, C. Y. Using Retinal Imaging to Study Dementia. J. Vis. Exp. (129), e56137, doi:10.3791/56137 (2017).

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Abstract

视网膜提供了一个独特的 "窗口" 来研究大脑中的老年痴呆的病理生理过程, 因为它是中枢神经系统 (CNS) 的延伸, 与大脑在胚胎起源、解剖特征和生理特性。 视网膜的血管和神经元结构现在可以很容易地被形象化和性使用视网膜成像技术, 包括眼底摄影和光学相干断层扫描 (OCT), 和量化半自动使用计算机辅助分析程序。研究视网膜和痴呆的血管和神经元变化之间的联系可以提高我们对痴呆症的认识, 并可能有助于诊断和风险评估。 本议定书的目的是描述一种量化和分析视网膜血管和神经元结构的方法, 这可能与痴呆有关。该协议还提供了一些例子, 视网膜变化的主题与痴呆, 并讨论技术问题和目前的局限性, 视网膜成像。

Introduction

由于预期寿命的增加, 痴呆已成为一个重大的医疗问题, 导致重大的社会和经济健康负担全球1,2,3,4,5。今天, 一个人在美国发展老年痴呆症 (AD), 最常见的形式的痴呆, 每六十六年代6。据估计, 到公元 2050, 1亿1500万人将受到 AD7的影响。

视网膜提供了一个独特的 "窗口", 以研究痴呆, 由于其类似的解剖和生理特性与大脑。在血管方面, 视网膜动脉和静脉, 测量直径100至300µm, 与脑小血管有相似的特征, 如无吻合的端动脉, 屏障功能, 和调节8,9. 在神经元结构方面, 视网膜节细胞 (视网膜) 与中枢神经系统 (CNS) 10 的神经元有着典型的特性。视网膜是突出的连接与大脑, 因为他们形成的视神经和项目的视觉信号从视网膜到外侧膝状核和优越的丘。视神经, 类似于中枢神经系统中的许多神经纤维, 由突髓, ensheathed 于脑膜层。值得注意的是, 对视神经的污辱会导致其他中枢神经系统轴突的类似反应, 如轴突逆行和顺变性、瘢痕形成、髓鞘破坏、继发变性和神经营养异常水平因素和神经递质11,12,13,14。一些 AD 患者的视觉症状的出现也可以通过视网膜和大脑之间的强关联来解释15,16。因此, 有人建议, 视网膜可能反映痴呆的病理过程中的大脑和视网膜成像可以用来研究痴呆症。

视网膜血管和神经元结构现在可以可视化性利用视网膜成像技术。例如, 视网膜眼底照片可以使用眼底照相机捕捉, 而视网膜血管的特征 (例如,血管口径、曲折和分形维数) 可以通过计算机辅助分析进行量化程序.此外, 还可以使用光学相干断层扫描 (OCT) 测量视网膜神经元结构 (如神经节细胞-内状层的厚度 [GC-光子) 和视网膜神经纤维层 [纤维]) 的参数, 并使用内置分析算法。

鉴于视网膜成像对研究痴呆的重要性, 本议定书的目的是描述一种成像和分析视网膜血管和神经元结构在体内使用视网膜成像技术的方法。该协议还提供了一些例子, 视网膜变化的主题与痴呆, 并讨论技术问题和目前的局限性, 视网膜成像。

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Protocol

此处描述的所有方法均已得到香港当地临床研究伦理委员会的批准.

注意: 为了简单起见, 在 材料表中列出的设备 用于说明视网膜成像的过程和随后的分析。利用新加坡 I 船评估计划 (湿婆) 17 (新加坡国立大学, 新加坡), 对视网膜血管参数的测量进行了说明。然而, 应该指出的是, 可以采用一套不同的设备, 因为基本原则仍然是相似的.

1. 准备视网膜成像的对象

  1. 放大主题和 #8217; 学生使用散的代理。等待至少15分钟, 以建立足够的瞳孔扩张.

2。使用计算机辅助分析程序测量眼底照片中的视网膜血管参数

Figure 1
图 1:示意图显示了测量视网膜血管参数的过程。 ( ) 使用眼底照相机获取以光盘为中心的眼底照片。 图 1A 图 2A 是两张具有最佳质量的眼底照片。( B ) 将眼底照片上载到基于云的服务器, 并输入相关的研究细节, 包括图像转换因子 (ICF)。其他计算机辅助分析程序可以使用 non-cloud-based 的方法来组织和存储图像。( C ) 在计算机辅助分析程序中打开眼底照片。( D ) 标记光盘中心的位置, ( E ) 提示软件自动检测光盘边缘并放置测量网格。( F ) 根据船只的路径建造船只脉象, 并放置容器盖以估计船只的直径。( G ) 手动调整不正确的容器脉象和容器盖。( H ) 测量视网膜血管参数的频谱, 包括血管口径、曲折、分形维数和分岔。步骤 ( D ) 到步骤 ( F ), 步骤 ( H ) 可以由某些计算机辅助的分析程序自动执行。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 使用眼底照相机捕获眼底照片.
    1. 打开眼底摄像机并在计算机上启动图像捕获程序。将主体的下巴适当地放在 chinrest 上, 前额放在头带上。移动控制杆, 使光束正确对准主语和 #8217 的瞳孔.
    2. 对齐光照点, 直到取景器两侧都显示为最小。移动外固定靶以引导主体和 #8217 的眼睛, 直到视盘位于取景器的中心, 而感兴趣的区域 (ROI) 也在边界内。调整对焦旋钮聚焦于视网膜.
    3. 主体要坚定地观察外部固定目标, 确保主体和 #8217; 眼睛里没有泪水.
    4. 按住快门按钮以捕获图像 ( 图 1A ).
    5. 检查捕获的眼底照片的质量, 使用 图 2A 作为标准。丢弃图像并重复图像获取过程 (即, 步骤2.1.1 到 2.1.4) 如果瞳孔放大 ( 图 2B ), 则视盘不在图像的中心 ( 图 2C ), 或图像不集中 ( 图 2D ).
    6. 以 TIFF 格式保存图像, 以层级分辨率 (, 大约3000像素 x 2000 像素, 在 150 dpi 以上).
      注意: 可以在此暂停协议.
    7. 重复步骤2.1.1 到2.1.6 以获取其他主题的眼底照片.
    8. 随机选择10% 图像样本, 并测量这些图像中的光盘高度 ( 图 3 )。使用公式计算图像转换因子 (icf):
      icf = 1800 和 #181; m/(采样的图像的视盘的平均像素高度)
    9. 将捕获的眼底照片上载到基于云的服务器, 并输入相关的研究详细信息, 包括图像转换因子 (ICF) ( 图 1B ).
      注意: 协议可以在此处暂停。其他计算机辅助分析程序可能使用其他 non-cloud-based 方法来组织图像并记录 ICF.

Figure 2
图 2: 眼底照片的最佳和次优质量. 图像采集后必须立即检查眼底照片的图像质量, 因为图像质量直接影响后续的视网膜血管参数测量。如果观察到这些文物中的一个, 则应丢弃该图像。这些图像是使用50和 #176; 眼底摄像头拍摄的。 请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 图像转换因子 (ICF) 的计算。为了计算 ICF, 从研究中随机选择10% 样本 (步骤 1)。然后, 从采样的图像 (步骤 2) 中测量视盘的高度 (以像素为单位)。使用公式计算 icf: icf = 1800 和 #181; m/(采样图像的光盘的平均像素高度), 其中1800和 #181; m 近似于普通光盘的高度 (步骤 3)。由于放大效果和图像分辨率不同于相机, 所以有必要为每个使用的相机计算一个精确的 ICF。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 在计算机辅助分析程序中打开眼底照片。为视网膜血管构筑血管脉象和导管盖.
    注: 在本节中, 湿婆程序用于说明程序。然而, 湿婆计划可以被其他可用的计算机辅助分析程序替代。此外, 在打开眼底照片 ( 步骤 2.2.1) 时, 某些计算机辅助分析程序会自动执行2.2.2 到2.2.3 的步骤。
    1. 使用计算机辅助分析程序打开眼底照片 ( 图 1C )。
    2. 标记光盘中心的位置 ( 图 1D )。
      1. 单击 "#8220; OD 中心和 #8221; 左侧功能面板上的按钮; 鼠标光标将被绿色圆圈替换.
      2. 将绿色圆圈移至光盘中心 (OD), 并 left-click 以修复圆.
      3. 提示软件自动放置测量网格, 构造容器脉象和 lay 容器盖 ( 图 1E 1F )。 注: 容器盖是测量船只内部流明的近似宽度的度量线。
        1. 单击并 #8220; 查找 od 和 #8221; 按钮以提示软件检测 od 边缘并将四同心圆作为测量网格, 基于 od 中心的位置.
        2. 单击 #8220;P 工艺和 #8221; 按钮启动自动跟踪过程.
  2. 手动调整不正确的容器脉象。开始检查从 12 o 和 #8217; 时钟位置顺时针的方式, 以确保所有船只脉象的验证.
    1. 检查是否准确地检测到了光盘, 并正确放置了测量网格。如果最里层的圆圈没有准确地勾勒出光盘边缘 ( 图 4A ), 请手动调整测量网格, 然后按照步骤2.2.2 到 2.2.3.
    2. 左键单击以选择带有不正确容器类型 (微动脉与静脉) 的容器跟踪, 然后单击 #8220; 容器 (T) 型和 #8221; 按钮更改容器类型.
      注: 动脉以红色标记, 静脉标记为蓝色。根据静脉的生理差异, 可以区分出微动脉。例如, 静脉的颜色通常较深, 比微动脉宽。具有相同容器类型的容器通常不会相互交叉.
    3. 将不完整的容器脉象以下步骤2.3.3.1 到 2.3.3.2 ( 图 4B )。
      1. 使用光标单击不完整容器跟踪的远端。左键单击沿船只路径的点, 以延长船只追踪.
      2. 当到达容器的远端时停止跟踪过程。如果容器的远端位于测量网格之外 (请参见 图 4B ), 则停止在最外层的白色圆圈进行跟踪.
      3. 如果在交叉站点 ( 图 4C ) 上未正确跟踪容器路径, 则
    4. 调整容器脉象。
      1. 单击 "#8220"; 选择并 #8221; 按钮, 然后单击不正确的船只跟踪点。单击 "#8220;" (k) 赛格和 #8221; 按钮在选定的点上断开船只跟踪。选择断开连接的段, 然后单击 #8220;(D el) 赛格和 #8221; 按钮将其删除.
      2. 使用步骤2.3.3.1 和2.3.3.2 重新构造新的容器跟踪.

Figure 4
图 4: 自动的常见错误. 船舶自动跟踪不完全准确, 需要进行手动调整, 以确保测量的准确性。此图显示了自动的常见错误, 并演示了手动调整后的最佳结果。( A ) 光盘中心被错误地标记, 这会导致测量网格的偏差, 这可能会影响随后的测量。理想情况下, 测量网格的最内圈应该勾勒出视盘边缘。( B ) 不完整的船只追踪可能导致不正确地测量分形维数、曲折、 船只的路径应追查到船只的末端。如果容器的远端落在测量网格之外, 则可以在最外层的白色圆圈处停止跟踪。( C ) 在交叉点的船只脉象有较高的错误倾向, 因此需要特别注意。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 在所有容器段上放置容器盖, 并手动停用不正确的盖子.
    1. 单击 "#8220"; 查找封面和 #8221; 按钮可自动在所有容器段上放置容器盖.
    2. 检查是否正确放置了所有容器盖。左键单击并拖动光标以停用容器盖如果盖不垂直于容器壁 ( 图 5A ), 则容器路径被另一容器 ( 图 5B ) 遮蔽, 或包括高估或低估容器腔的宽度 ( 图 5C ).

Figure 5
图 5: 不正确的容器盖. 此图显示了不正确的容器盖的示例, 应将其停用并排除在随后的测量中。如果不垂直于容器 ( A ), 则应停用容器盖。此外, 如果被追查的船只在另一船只 ( B ) 下被遮蔽, 或船只盖不能代表船只的大致宽度 ( C ), 也应停用船只盖。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 测量来自容器脉象和容器盖的视网膜血管参数
    注意: 步骤2.5 由计算机辅助分析程序自动执行。
    1. 将区域 0.5-1.0 盘直径从光盘边缘标记为区域 B, 并将区域 0.5-2.0 盘直径从光盘边距显示为区域 C 18 ( 图 6A ), 根据社区动脉粥样硬化风险修正协议 (ARIC) 研究 19 .
    2. 使用从 ARIC 研究中修改的广泛采用的方法 19 20 21 , 从 B 区和区域 C 测量视网膜血管口径, 22 , 23 , 24 , 25 , 26 ( 图 6B )。
      1. 测量六最大的动脉和六最大静脉的血管覆盖长度, 以估计视网膜血管口径.
      2. 将视网膜动脉和静脉口径分别概括为视网膜中央动脉等效物 (CRAE) 和视网膜中央静脉等效物 (CRVE) 17 , 使用修订后的 Knudtson 和 #8211;P-哈伯德公式 18 , 19 .
    3. 将 C 区中的所有容器标识为宽度和 #62; 40 和 #181; m. 计算视网膜动脉和静脉曲折从总的平方曲率积分沿容器脉象和正常化的价值与总弧长, 鞠躬, 和点的拐点 27 , 28 .
    4. 使用已建立的 #8220 计算区域 C 中的总、动脉和静脉分形维数; 框计数方法和 #8221; 29 , 30 , 31
      1. 将图像分成一系列大小相等的正方形.
      2. 计算包含容器脉象部分的框数.
      3. 使用不同大小的一系列同等大小的正方形重复该过程.
      4. 将包含该容器的箱数的对数与脉象框大小的对数进行绘制, 并计算结果线的斜率; 这是分形维数.
    5. 在区域 C 中识别具有第一分岔的容器, 并计算角度 (和 #952 在前两个子容器之间;), 32 ( 图 6C )。计算平均值以获得平均分支角.
    6. 使用公式计算区域 C 中的分支系数:
      (d 1 2 + d 2 2 )/d 0 2 , 其中 d 0 是平均主干口径, d 1 和 d 2 是平均分支口径 ( 图 6C ).
  2. 关闭分级窗口。单击并 #8220; 发送和 #8221; 在弹出式对话框中, 将分级图像上载到基于云的服务器, 并记录自动测量的视网膜血管参数.

Figure 6
图 6: 视网膜血管的量化。( A ) 区域 b (定义为距离光盘边缘 0.5-1.0 圆盘直径) 用于根据社区研究中的动脉粥样硬化风险测量 b 区的血管口径。区域 c (定义为 0.5-2.0 圆盘直径远离光盘边缘) 用于测量 c 区的容器口径和视网膜血管网络参数 (如曲折、分形维数和分岔) 的频谱。( B ) 容器盖是用于估计视网膜血管口径 (或直径) 的测量线。不正确的容器盖应手动排除在测量之外。( c ) 对于在 C 区内有第一个分支的所有容器, 程序自动测量分支角 (和 #952 第一个分支的;)。此外, 还使用公式计算分支系数: 分支系数 = (d 1 2 + d 2 2 )/d 0 2 , 其中 d 0 是主干口径, d 1 和 d 2 是分支口径。 请单击此处查看此图的较大版本.

3. 评估 GC 和纤维的厚度

Figure 7

图 7: 显示测量纤维和气相色谱厚度的过程的原理图. 光学相干断层扫描 (OCT) 可用于测量神经节细胞-内状层 (GC) 和视网膜神经纤维层 (纤维) 的厚度。( A, B )使用内置和 #8220 测量色谱和纤维厚度; 黄斑立方体和 #8221; 和 #8220; 光盘立方体和 #8221; 分别扫描协议。( C, D )图像采集后立即检查图像质量。如果信号强度小于 6, 或检测到运动伪影, 则丢弃图像并重复扫描。( E, F )然后, 提示内置的分析程序自动分析扫描结果, 并生成一份解释报告。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 使用光学相干层析 (OCT) 执行图像采集.
    1. 打开 OCT 程序并选择和 #8220; 黄斑立方体和 #8221; 扫描协议以启动新的黄斑扫描 ( 图 7A ).
    2. 通过调整 chinrest 在虹膜视区中定位瞳孔。如果瞳孔大小太小, 请降低光照.
    3. 单击 #8220; 自动对焦和 #8221; 按钮, 然后 #8220; 优化和 #8221; 按钮以提高图像质量.
    4. 指示主题在开始扫描前会立即闪烁几次.
    5. 单击 #8220; 捕获和 #8221; 按钮在按钮周围的边框变为绿色时开始扫描。在图像采集过程中, 指导主体关注视觉固定目标, 以避免运动伪影.
    6. 查看扫描质量使用 图 7C 作为标准。如果信号强度小于 6 ( 图 8A ), 或检测到运动伪制品 (由血管的不连续性指示) ( 图 8B ), 则放弃扫描结果并重复扫描.
    7. 保存扫描结果.
    8. 重复步骤3.1.1 到3.1.7 另一只眼睛.
    9. 执行与 #8220 的光学神经头扫描; 光盘立方体和 #8221; 扫描协议以下步骤3.1.2 到 3.1.9 ( 图 7B 7D ).

Figure 8
图 8: 光学相干层析成像的次优结果. 光学相干层析成像 (OCT) 的常见次优结果包括 ( A ) 信号强度差 (强度值和 #60; 6), 以及 ( B ) 运动制品。扫描质量应立即审查后, 图像采集, 并应重复扫描, 如果这些文物遇到。 请单击此处查看此图的较大版本.

  1. 生成黄斑色谱-光子厚度的分析打印输出.
    1. 选择 #8220; 黄斑立方体和 #8221; 在分析界面中扫描两个眼睛的记录.
    2. 单击 #8220; 神经节细胞 OU 分析和 #8221; 启动自动分析算法以评估扫描的 GC-彩光厚度 ( 图 7E ).
      注意: 步骤3.2.2 由分析算法自动完成。
      1. 生成一个 14.13 mm 2 中心椭圆环, 分别具有 0.6 mm 和 2.4 mm 的水平内和外半径, 分别为 0.5 mm 和 2.0 mm 的垂直内部和外部半径.
        注意: 椭圆环的大小和形状与黄斑解剖学紧密吻合, 因而与正常眼中视网膜最厚的区域对应 33 , 34 。环形环内环的面积是不被测量的, 因为这个区域的气相色谱是非常薄的.
      2. 将纤维的外边界和内部状层 (光子) 的外边界分段, 以找到 GC 光子 ( 图 9 ).
      3. 在凹环中测量黄斑色谱的平均、最小和六扇形 (superotemporal、高级、superonasal、inferonasal、下位、inferotemporal) 厚度tered 椭圆环.
      4. 将测量的 GC-光子厚度与设备和 #8217 的内部规范年龄匹配数据库进行比较, 并生成偏差图和意义图
      5. 在分析打印输出上报告测量结果.
    3. 以. pdf 格式保存分析打印输出.

Figure 9

图 9: 用于视网膜神经元结构的评估. 用视神经头 (ONH) 算法测量视网膜神经纤维层 (纤维), 用神经节细胞分析 (配合力) 算法测量神经节细胞内状层。ONH 算法对纤维的内边界和外界进行了分段, 以测量纤维的厚度。该算法检测视网膜神经纤维层 (纤维) 和内状层 (光子) 的外边界, 以产生神经节细胞层 (协合) 和彩光的复合厚度。协鑫和彩光的厚度是一起测量的, 因为协鑫和光子的边界在解剖学上是模糊的。然而, 协鑫和彩光的组合厚度 ( GC) 仍然是视网膜的健康. 请点击这里查看更大版本的图

  1. 生成纤维厚度 ( 图 7F ) 的分析打印输出.
    1. 选择 #8220; 光盘多维数据集和 #8221; 在分析界面中扫描两个眼睛的记录.
    2. 单击 #8220; ONH 和纤维 OU 分析和 #8221; 启动自动分析算法以评估扫描的纤维厚度.
      注意: 3.3.2.1 到3.3.2.6 的步骤可以通过分析算法自动完成。
      1. 测量每个扫描点的纤维厚度并生成纤维厚度映射.
      2. 通过检测扫描中心附近的一个暗点来识别光盘, 该黑点的大小和形状与光盘的范围一致.
      3. 在纤维厚度图上, 将直径3.46 毫米的测量网格放置在光盘周围.
      4. 测量和计算全球, 四象限 (时间, 高级, 鼻和下位), 和十二时钟小时 parapapillary 纤维厚度的度量网格.
      5. 将测量的纤维厚度与设备和 #8217 的内部规范年龄匹配数据库进行比较, 并生成一个偏差映射和一个重要映射.
      6. 在分析打印输出上报告测量结果.
    3. 以. pdf 格式保存分析打印输出.

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Representative Results

Figure 10
图 10:一个例子, 以显示在正常的主题和一个广告主题之间的视网膜血管的差异.与正常人相比, AD 的眼底照片显示狭窄的血管口径 (CRAE 区 B、116.4 µm vs. 156.4 µm;CRVE 区 B, 186.9 µm vs. 207.5 µm;CRAE 区 C, 138.5 µm vs. 165.8 µm;CRVE 区 C, 206.6 µm vs. 232.2 µm), 更小的视网膜血管分形维度 (总分形维数, 1.472 vs. 1.517; 动脉分维, 1.246 vs. 1.316; 静脉分形维数, 1.253 vs. 1.273) 和更高的视网膜血管 tortuosities (动脉曲折 [104], 0.61 vs. 0.48; 静脉曲折 [104], 1.41 vs. 0.50)。 这些图像是使用50度眼底相机捕获的, 并使用该协议中描述的方法进行分析。请单击此处查看此图的较大版本.

视网膜血管参数的解释:与我们的协议, 视网膜血管参数可以从眼底照片测量。这些参数表明视网膜血管的状态, 这可能反过来反映脑血管的类似变化。图 10显示了从广告主题和健康主题获得的眼底照片。在表 1中报告的视网膜血管参数是使用本协议中描述的方法从这些眼底照片中测量的。

特设 正常
B 区 CRAE (µm) 116。4 156。4
B 区 CRVE (µm) 186。9 207。5
CRAE 区 C (µm) 138。5 165。8
CRVE 区 C (µm) 206。6 232。2
总分形维数 1.472 1.517
动脉分形维数 1.246 1.316
静脉分形维数 1.253 1.273
动脉曲折 (x104) 0.61 0.48
静脉曲折 (x104) 1.41 0.50
动脉分支系数 2.43 1.49
动脉分支角 (°) 67.17 81.16
静脉分支系数 1.42 1.62
静脉分支角 (°) 60.11 73.19

表 1: AD 主题和正常主题之间的视网膜血管参数差异.视网膜血管参数的测量从眼底照片中显示的图 10。与正常的主题相比, AD 的主体表现为血管口径 (CRAE 和 CRVE) 和分形维数的减少, 但曲折的增加。此外, AD 主体的分支角和分支系数也偏离了各自的最优值。

视网膜血管口径
与正常的主题相比, AD 主题的眼底照片 (图 10) 在 C 区 (分别为138.47 µm 和206.61 µm) 的 CRAE 和 CRVE 均呈下降趋势 (分别为165.82 µm 和232.22 µm)。 CRAE 和 CRVE 总结视网膜血管的口径, 分别接近视网膜动脉和静脉内腔的宽度。因此, CRAE 和 CRVE 的减少表明在视网膜动脉和静脉都有广义的狭窄, 并提示微血管功能障碍35

视网膜血管网络参数
首先, AD 主题的视网膜动脉和静脉 tortuosities (0.613 x 10-4和 1.41 x 10-4分别) 高于正常主题 (0.476 x 10-4和 0.501 x 10-4.较高的血管 tortuosities 表明, 视网膜血管在 AD 主题中通常是较平直的。

其次, AD 学科也减少了视网膜分维数 (总分形维度, 1.472; 动脉分维数, 1.246; 静脉分形维数, 1.253) 与健康主语 (总分形维数, 1.517; 动脉分形维数, 1.316;静脉分形维数, 1.273)。由于分形维度代表了 "全球" 的措施, 总结了视网膜血管 network30 的分支复杂性, 减少的分形维数表明, 在 AD 主题中, 视网膜血管是较不复杂的。

三是 AD 主体的视网膜分岔参数偏离最优值。具体地说, AD 主题的动脉和静脉分支角 (分别为67.17°和 60.109°) 离最佳值更远, 这是大约 75o 36, 与正常主题相比 (81.16°和73.19°, 分别)。此外, AD 主体 (2.432) 的动脉分支系数也严重背离了最优值, 这大约是 1.2636。这表示跨分支37的总横截面面积增加。

视网膜神经元参数的解释
通过我们的协议, 我们应该能够获得两个分析打印输出, 显示纤维和 GC 光子的平均和扇形厚度 (分别由图 11A11B所示)。 虽然纤维测量反映了视网膜的髓轴突的健康状况, 但 GC-彩光测量显示了视网膜细胞体和树突的健康状况。由于研资局细胞体的大小是其轴突直径的10-20 倍, GC-彩光厚度已被证明与认知损伤的38有更强的相关性。

在这两份报告中, 显示了三张地图来帮助解释, 即 (a) 厚度图、(b) 偏差图和 (c) 重要地图。在厚度图中, 暖色代表更高的厚度值, 较冷的颜色代表较低的厚度值;换言之, 橙/黄环密度越浓, 视网膜层越厚。该软件还将测量的厚度与设备的内部规范年龄匹配数据库进行比较, 并生成偏差图和意义图。在偏差图中, 如果厚度值低于99% 或在 95–99% centile 范围内, 则 super-pixel 会分别显示为红色或黄色。在意义图, 视网膜层被分成不同的部分, 因为视网膜不太可能受到痴呆的均匀影响。每个区段的厚度值被报告, 并且每个区段也 color-coded 匹配比较结果, 与价值在正常范围之内在绿色 (p = 5–95%), 界限价值在黄色 (1% 和 #60;p 和 #60; 5%), 并且值在正常范围外面红色 (p和 #60; 1%)。

在 AD 主题中, 纤维和 GC 的分析输出分别显示在图 11A图 11B中。在这两份报告的厚度图中, 暖色的褪色和淡蓝色区域的出现表明, 在 AD 主题中, 色谱和纤维变薄。虽然 GC 的细化表明, 研资局的损失, 纤维的细化表明, 研资局轴突的损失。另外, 重要地图的几个区段被标记用红色或黄色, 暗示纤维和 GC-彩光厚度的相应区域在广告主题减少。细化的确切区域也可以通过偏差图中的红色或黄色 super-pixels 来可视化。

Figure 11
图 11: 从 AD 主题中分析视网膜神经元结构的打印输出.在厚度图中存在较多的淡蓝色区域, 表明 AD 中的纤维和气相色谱变薄。与规范的年龄匹配种群相比, 稀疏度的大小被认为是不正常的;红色区段指示相应的区域的厚度价值在正常范围之外 (p 和 #60; 1%), 而黄色区段在对应的区域表明边界价值 (1% 和 #60;p 和 #60; 5%)。纤维和气相色谱细化的确切区域也可以通过偏差图进行可视化, 其中红色和黄色 super-pixels (红色箭头) 表示相应斑点的厚度值在99% 或95–99% 百分点范围内下降,分别.这些图谱表明, 纤维和气相色谱厚度在 AD 主题中都异常减少。请单击此处查看此图的较大版本.

不可或 Ungradable 视网膜图像: 眼底照片或 OCT 扫描可能不可由于几个原因。关于 OCT 扫描, GC-彩光或纤维的分割失败可能是由于视网膜疾病, 如年龄相关的黄斑变性, 糖尿病视网膜病变, 和前膜。图 12A演示了糖尿病性黄斑水肿导致的分割失败的例子。它还表明, OCT 扫描质量和厚度测量可以影响的干眼39, 白内障40,41,42,43, 蚊和其他玻璃体混浊44,45. 对于眼底照片, 视网膜血管参数的测量也可能受到媒体不透明 (如白内障) 的影响, 而这种不透明度会对视网膜脉管的可见性 (图 12B) 造成干扰。

Figure 12
图 12: 不可视网膜图像.虽然大多数次优的结果可以避免使用所描述的方法, 一些类型的视网膜图像是不可, 应丢弃。(A) 由于视网膜病变 (包括与年龄相关的黄斑变性、糖尿病视网膜病和前膜), 某些 OCT 扫描可能会出现分割失败。这一数字表明, 由于糖尿病黄斑水肿的分割失败。(B) 视网膜血管的可见性可以通过不透明 (如白内障引起的不透明) 而减少。这个数字表明, 严重的媒体不透明可以掩盖视网膜血管和渲染图像不可。请单击此处查看此图的较大版本.

参数 测量区域 解释和报告协会与广告
视网膜血管口径
视网膜中央动脉当量 (CRAE) B 区 #38 ♦视网膜中央动脉当量 (CRAE) 和视网膜中央静脉当量 (CRVE) 的变化表明, 广义视网膜血管狭窄或扩大, 并可能提示微血管功能障碍35
♦据报道, 增加 CRVE 与事件性痴呆46, 血管性痴呆46, 并减少 CRVE 和 CRAE 与阿尔茨海默病相关的47,48
视网膜中央静脉当量 (CRVE) B 区 #38
视网膜血管网络参数
分形维数 (dF) C 区 ♦分形维数是一个 "宏观" 的度量, 它概括了视网膜血管网络的分支复杂性30;较大的值表示更复杂的分支模式。
♦减少视网膜分形维数与痴呆有关47,48,59和认知功能60
曲折
侵权)
C 区 ♦曲折反映了视网膜血管的一般直线度, 更小的曲折值表示视网膜血管更直。
♦建议增加静脉曲折和动脉曲折与 AD62.
分支角度
八)
C 区 ♦ BA 的最佳值约为 75o 36
♦分支角的改变可显示血流的变化63,64, 内皮功能障碍65,66和氧饱和度的衰减67
分支系数 (BC) C 区 ♦ BC 的最佳值约为 1.2636
♦偏离最优值可能会增加能源成本, 降低循环和新陈代谢的效率37

表 2: 对主要视网膜血管参数的解释.血管口径与视网膜血管网参数是计算机辅助分析程序报告的两个主要参数类别。CRAE 和 CRVE 文件广义视网膜血管狭窄或扩大, 反映微妙的视网膜微血管功能障碍。视网膜血管网络参数捕获的 "最优性" 和 "效率" 的血液分布在视网膜网络, 这反过来反映了完整的脑微循环。

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Discussion

本协议描述了在视网膜体内量化神经元和血管变化的过程。由于视网膜与大脑有着相似的胚胎来源、解剖特征和生理特性, 这些视网膜的变化可能反映了大脑中血管和神经元结构的类似变化。

图 10表 1所示, 与健康主题相比, AD 主题显示的容器口径减少。据报道, 减少 CRVE 和 CRAE 是与阿尔茨海默氏病相关的46,47, 尽管这并不一致观察到48

此外, AD 的主题也显示了减少分维度, 增加血管 tortuosities, 和次优分支系数和分支角度相比, 健康的主题。这些变化表明, 视网膜血管网络的全球几何形态的改变49,50,51,5253,54, 55,56。由于血管网络的分支模式, 根据默里的原则, 是结构发展, 以尽量减少能量所需的维持血流57, 这些参数也捕获的程度的 "最优性" 和 "效率"在视网膜血管网络中的血液分布, 这可能反过来反映脑微循环的完整性58。据报道, 减少视网膜分形维度与痴呆有关47,48,59和认知 function60,and 可能与导致视网膜微血管损伤有关缺氧61。 增加的静脉和动脉 tortuosities 也显示与 AD62相关。对于视网膜分叉参数, sub-optimality 分支角度表明, AD 学科的视网膜血管网络降低了组织灌注的效率, 增加了能量损失37。分支角度的改变也可能显示血流的变化63,64, 内皮功能障碍65,66, 以及氧饱和度的衰减67。此外, 偏离最佳分枝系数值也可能增加能源成本, 降低循环和新陈代谢的效率37。两者结合在一起, 血管网络参数的变化 (即分形维数、曲折、分支角和分支系数) 提示微血管参与 AD 病理。报告的主要视网膜血管参数与 AD 的关联在表 2中进行了总结, 并且还详细介绍了以前的8586869

图 11所示, AD 主题也显示了纤维和 GC 的厚度降低。虽然协鑫和彩光的厚度只能报告在一起, 因为它们的解剖边界不明确, 组合厚度 (GC-光子) 是视网膜的健康的指示,38。越来越明显的是, 稀疏的 GC-光子38和纤维70,71,72,73,74,75,76 7778与 AD 关联。最近, 一 large-scale 的人口研究还报告说, 更薄的纤维与较差的认知功能, 如较差的前瞻记忆, 和较差的数字和口头推理性能79。此外, 在非 AD 痴呆808182中还报告了纤维的细化。

视网膜成像的关键步骤
为了获得准确的结果, 必须正确地执行协议中的几个步骤。在图像采集过程中, 掌握 OCT 和眼底摄影的成像过程是很重要的, 因为长时间的成像会引起眼睛疲劳, 从而增加运动伪影的可能性。另外, 在图像采集过程中要对图像进行对比和饱和, 以避免图像处理后期的粗调整。不同的研究队列和相机类型可以改变对比度和饱和。

在测量视网膜血管参数时, 对研究中使用的每台相机都要进行 ICF 的计算, 以适应放大效果和图像分辨率的差异。ICF 的调整对于精确测量尺寸参数包括视网膜血管口径非常重要。此外, 在用计算机辅助分析程序对眼底照片进行分级时, 应根据参与者的特点对平地机进行屏蔽, 因为分级过程涉及一定量的人工调整。此外, 学生应接受适当的培训, 他们的测量可靠性应首先评估, 然后再分级的图像。

在 B 区和 C 区报告视网膜血管口径也很重要。据认为, C 区的容器口径更敏感, 更精确, 更小的标准误差17, 可能是因为在视网膜中包含更多的外围小血管, 这在解剖学上和生理学上更类似于大脑中的小血管。然而, 区域 b 的口径也应报告为 b 区内的口径测量在许多流行病学研究中得到广泛应用。

应指出的是, 本议定书所使用的设备和计算机辅助分析程序仅供说明之用, 并可利用其他视网膜成像技术获得类似的结果。但是, 在大多数情况下, 不同测量系统报告的数值参数不应交替解释为83。业 et al. 已经开发了一种算法, 用于转换三常用的软件测量视网膜血管口径, 这可能是有用的比较不同的研究结果83

视网膜成像的意义
磁共振成像 (MRI) 和正电子发射断层扫描 (PET) 成像是两个广泛使用的活体成像方法来研究痴呆。然而, MRI 的应用受到其空间分辨率的限制, 以检测少于500μ m 的细微变性变化。pet 成像的使用也受到其昂贵的成本和宠物设施的可用性的限制。此外, 虽然脑血管病已与痴呆症有联系84,85,86>>,87,88,89,90, 当前的神经影像技术不允许直接评估脑小血管的改变, 如脑动脉狭窄, 改变血管曲折, 毛细血管微动脉瘤。因此, 研究痴呆的补充方法是可取的。视网膜成像显示了一些功能, 使其不同于其他神经影像技术, 并允许它为痴呆研究提供新的见解。

首先, 与中枢神经系统的其他部分相比, 视网膜具有非侵入性成像的高度可得。由于瞳孔允许双向通道的照明和成像的光线, 视网膜 vascualture 可以直接和快速的影像使用眼底相机, 这是一个经典的视网膜成像技术的基础上, 单眼间接眼底.眼底摄影表现出高灵敏度、特异性、inter-examination 和 intra-examination 协议91。此外,在体内视网膜神经元结构的横断面图像也可以被 OCT 基于低干涉测量原理捕获929394 95,96。因此, 视网膜成像可以使纵向和非侵入性成像的成本相对较低, 以观察痴呆对中枢神经系统的影响。

其次, 视网膜神经元结构被组织为可区分的层, 每个层代表神经元结构的特定元素。例如, 气相色谱代表了视网膜的细胞体和树突, 而纤维代表了视网膜的轴突. 值得注意的是, 现在可以用先进的分割算法实现视网膜神经元层的精确标定, 如 gc-光子和纤维。33,97和任何表现为神经元结构畸变的痴呆病理学都可以很容易地检测到。

第三, 利用计算机辅助分析程序, 对视网膜图像进行客观、半自动和标准化的评估是可行的。如本协议所示, 计算机辅助分析程序可以自动跟踪眼底摄影捕获的视网膜血管, 并根据追踪结果, 测量血管参数的频谱, 如口径、tortuosities、分形维数和分支角。在追踪过程中, 学生只需要验证船只脉象的准确性, 如有必要, 手动调整不正确的脉象容器。先前的研究报告, intragrader 和 intergrader 的可靠性是中等到高49。同样, OCT 内置分析算法也可以自动测量纤维和 GC-光子厚度的参数, 并将结果与规范的年龄匹配数据库98进行比较。视网膜成像的半自动性质有助于提高测量效率和一致性, 减少每年级学生所需的工作量。年级学生也可以迅速掌握测量和解释视网膜参数的技能, 而不学习太多先进的眼科或神经学知识。因此, 视网膜成像可以很容易地应用在一个种群的设置。

最后, 视网膜成像技术现在可以图像的分辨率为几微米的视网膜, 这至少是一个数量级比可以实现与传统的神经影像技术。例如, 光谱域-OCT 现在可以图像的视网膜在三维体积的高轴向分辨率 (例如几微米) 和高度的再现性,99,100,101 ,102,103,104,105。这使得直接可视化和量化的微妙变化的视网膜, 包括研资局轴突, 眼延长中枢神经系统。通过测量视网膜血管参数, 也可以直接评估痴呆与微血管改变之间的关联。

在一起, 视网膜成像可以收集独特的信息的脑血管和神经元结构, 有别于目前的脑成像技术, 表明视网膜成像可以提供一种互补的方法来研究痴呆的病理学9,35,58,68106,107,108

方法的局限性
视网膜成像是一种越来越流行的方法来可视化和量化的微血管和神经元结构在视网膜8,109。但是, 本议定书的读者应该意识到其潜在的局限性, 以便对结果进行批判性的解释。

首先, 眼底照片和 OCT 图像的质量会受到一系列眼部因素的影响。例如, 折射率和轴向长度的变化可能会影响视网膜血管口径110的放大倍数和视维度。视网膜色素沉着、媒体混浊、摄影技术、照相机类型 (例如、散、non-mydriatic、hand-held) 和图像质量 (例如、亮度、焦点和对比度) 的差异也可能会引入其他变化源和影响测量111,112,113,114,115,116。此外, 如果图像采集时间延长, 运动文物在老年患者中可能是常见的。

其次, 视网膜血管和神经元结构可能受到许多系统性和局部病理过程的影响, 因此某些视网膜表现并不特定于某一特定疾病。例如, 视网膜动脉狭窄与全身外周血管收缩和高血压相关, 而视网膜静脉扩大与内皮功能障碍、炎症、微血管缺氧相关,117和疾病如心血管疾病118和糖尿病视网膜病变119。纤维变薄也观察到其他神经退行性疾病, 包括青光眼, 帕金森病, 多发性硬化症10。也值得注意的是, 年龄相关的减少视网膜及其轴突也可以发生没有痴呆99,120

第三, 视网膜改变和痴呆之间的关联仍然没有定论。例如, 较小的船只口径与广告的协会没有复制的威廉姆斯et al.59, 与新加坡眼疾流行病学研究发现的动脉口径与 AD 的相关性也在调整为混杂心血管因子48后丢失。此外, AD 中增加的静脉和动脉 tortuosities 也不被一致地观察到47,59。还指出, 动脉分形维数与痴呆的关系在完全调整模型中丢失"xref" > 59

第四, 本阶段的计算机辅助分析程序仅半自动, 需要经过训练的年级学生49121进行手动调整。人工输入, 即使遵循标准化的协议, 也可能在视网膜测量中引入额外的变异性。

该方法的未来应用
鉴于视网膜及其与中枢神经系统其他部分的相似性, 视网膜是研究痴呆对脑微血管和神经元结构影响的极好的 "窗口"。由于痴呆现在被认为涉及血管过程84,85,86,87,88,89,90,122, 成像和量化的视网膜微血管使用本议定书也可能提供新的洞察到显微血管的病因 (与血管病因) 的痴呆症10,35,58,106,108,123并帮助我们了解不同的痴呆亚型。

此外, 视网膜成像可能会被用于临床设置, 以方便对痴呆的前临床诊断或风险评估, 确认临床诊断 AD, 并监测疾病进展或对治疗的反应。视网膜成像在人口筛查中的应用特别耐人寻味, 因为神经元和微血管的变化, 可能被类似的视网膜变化所反映, 发生的早于皮质萎缩和认知衰退的出现。124,125. 研究表明, 轻度认知功能障碍 (MCI) 和 AD 患者与健康对照相比, 纤维和气相色谱厚度降低, 但在纤维和气相色谱厚度上的差异MCI 和那些与 ad 没有统计学意义的8, 表明纤维和 GC-彩光的细化是 ad 病理学的早期事件。然而, 视网膜成像措施与痴呆症之间的关联强度仅是适度的, 而且一些 AD 的视网膜相关性没有被一致观察到8,47,48,59,109. 这一协议可能会被更多的前瞻性临床研究与大的队列, 以评估临床应用的视网膜成像在前诊断 AD。

在视网膜成像技术的最新进展, 如超宽场视网膜成像和 OCT 血管造影, 可以让我们获得更多的信息从视网膜。超宽场视网膜成像技术, 基于共焦激光扫描显微镜和凹椭圆镜相结合的原理, 可以在没有瞳孔的情况下, 在一个图像中捕获多达 200o的视网膜, 而不需要放大126 ,127。这使得更广泛的评估周围的视网膜病变, 这可能提供更多的信息, 整个视网膜血管的17。据报道, 超宽场视网膜成像在血管分割和宽度估计方面都能取得满意的效果128。此外, OCT-血管造影的发明也允许 non-dye-based 的视网膜毛细血管网络的映射, 这可能提供更多的信息与痴呆有关的微血管变化。在图像分析方法方面, 需要更多的研究来探索其他的最先进的图像处理和定量方法, 如树拓扑估计129, 以分析这些新的成像方式所捕捉到的图像。

Figure 13
图 13: 视网膜成像是研究与痴呆有关的血管和神经元变化的潜在的有价值的工具.有人建议, 痴呆症是与神经元损伤和小血管疾病的大脑。由于视网膜作为中枢神经系统的延伸, 与大脑有着显著的相似性, 这些病理改变可能反映在视网膜中, 视网膜是神经元和血管的损伤。利用这一协议, 视网膜神经元的变化可以量化为纤维和 GC-光子厚度的变化使用光学相干断层扫描 (OCT), 而视网膜血管的变化可以量化为血管口径和血管网络的变化参数使用眼底摄影和计算机辅助分析程序。研究视网膜变化和痴呆之间的关联可能会为痴呆症的病理学提供新的见解, 并有可能有助于诊断和风险评估。请单击此处查看此图的较大版本.

本议定书描述了一种非侵入性的, 定量的和半自动的方法来研究痴呆使用视网膜成像技术 (图 13)。考虑到视网膜的可及性及其与大脑的牢固联系, 视网膜成像可能会为痴呆症提供新的见解, 并有可能帮助痴呆的诊断和风险评估。然而, 在这个阶段报告的协会仍然有争议, 需要进一步的研究来评估视网膜成像的潜在效用。还应指出, 在评估痴呆症方面, 彻底的临床评估仍然是必不可少的。

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Disclosures

我们对新加坡国立大学计算机学院的技术支持表示感谢。

Acknowledgments

关于潜在的金融关系, 作者发明是新加坡 I 船评估 (湿婆) 项目中使用的一份文件。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Non-mydriatic Retinal Camera  Topcon, Inc, Tokyo, Japan TRC 50DX  N/A
Singapore I Vessel Assessment Program National University of Singapore Version 4.0 N/A
CIRRUS HD-OCT  Carl Zeiss Meditec, Inc, Dublin, CA Model 4000 N/A
Mydriatic Agents  N/A N/A Prepared from 1% tropicamide and 2.5% phenylephrine hydrochloride

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