סינתזה של Bacteriophages זיהומיות e. coli -תא ללא ביטוי מערכת מבוססת

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

דור חדש של פלטפורמות תרגום תמלול חופשי תא תוכנן לבנות מערכות ביוכימיות במבחנה באמצעות הביצוע של ג'ין מעגלים. במאמר זה, אנו מתארים איך הם bacteriophages, כגון MS2, ΦΧ174 ו- T7, מסונתז מן הגנום שלהם באמצעות e. coli כל ללא תא TXTL המערכת.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

דור חדש של מערכות ללא תא תמלול-תרגום (TXTL), מתוכנן יש רב-תכליתיות גדולה יותר, מודולריות, לספק יכולות הרומן לבצע מדעי בסיסי ויישומי בתגובות מבחנה. בעשור האחרון, ללא תא TXTL הפך טכניקה חזקה עבור מגוון רחב של מחקר רב תחומי חדשניים בתחומים הקשורים כמותיים וסינתטיים ביולוגיה. פלטפורמות חדשות TXTL שימושיים בעיקר לבנות ולחקור מערכות הביוכימי דרך הביצוע של מעגלים ג'ין סינטטי או טבעי. במבחנה TXTL הוכיחה נוח במהירות רכיבי רגולטוריות אב-טיפוס, רשתות ביולוגיות כמו גם באשר לסכם מולקולרית הרכבה עצמית מנגנונים נמצאו במערכות החיים. במאמר זה, אנו מתארים איך זיהומיות bacteriophages, כגון MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), ו- T7 (dsDNA), הם לגמרי מסונתז מן הגנום שלהם בתגובות סיר אחד באמצעות של Escherichia coliכל, ללא תאים של מערכת TXTL. סינתזה של coliphages שלושה זה לכמת באמצעות וזמינותו פלאק. אנו מראים איך התשואה של phage מסונתז תלוי בהגדרות הביוכימי של התגובות. הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוז מבוקר של פג 8000, משפיעה על כמות phages מסונתז על ידי הוראותיו של מגניטודות. אנו נסביר גם כיצד להגביר את phages ואיך לטהר את הגנום שלהם. קבוצת פרוטוקולים ותוצאות הציג בעבודה זו צריך להיות עניין רב תחומיים החוקרים המעורבים ב ביולוגיה סינתטית ללא תא וב בביו-הנדסה.

Introduction

בעשור האחרון, הטכנולוגיה ביטוי נטולת תא מהונדס כתובת יישומים חדשניים בביולוגיה הקשור סינטתיים, כמותיים אזורי מחקר רב-תחומיים מתהווה. השתמשו במקור לבטא חלבונים עצמאית של אורגניזם חי, מערכות TXTL נטול תאים חדשים פותחו שני מדעי בסיסי ויישומי1,2, מרחיבה משמעותית את ההיקף בטכנולוגיה זו. הדור החדש של פלטפורמות TXTL תוכנן להיות ידידותי למשתמש, יעיל יותר (בדרך להשגת 2 מ"ג/מ"ל של סינתזת חלבונים אצווה מצב3), יותר ברמה של שעתוק4, ועם זאת מודולרי על מנת לשלב בקלות הרומן טבעי או פונקציות סינתטי להרחיב את היכולות של מערכות ביולוגיות קיימות5,6. בפרט, ללא תא TXTL מערכות הפכו להיות שימושי עבור שטנץ מהירה של תוכניות גנטי, כגון גורמים רגולטוריים או המעגלים גנטי קטן7,8,9, על-ידי הפחתת העיצוב-לבנות-המבחן מחזור מספר ימים. למרבה הפלא, המערכות TXTL חדש גם הם מסוגלים עיבוד תוכניות דנ א גדולים כגון הסינתזה מלאה של coliphages10,11, הוכחת חזקה מספיק הופעות כדי לתמוך את בנייתו מחדש של פעיל גנומית ה-DNA מקודד ישויות החיים.

TXTL מערכות להציג יתרונות טכניים רבים לעומת המסורתי במבחנה בונה הביוכימי מבחני. ללא תא TXTL מקשר את התהליך של ביטוי גנים המוצר הסופי בסביבה מופחתת ופתוח, בניגוד הציטופלסמה מורכבת של תא חי. TXTL משתמש דנ א כדי לשחזר מערכות ביוכימיות במבחנה, באמצעות טכניקות מודרניות של מכלול ה-DNA, וזה, במחיר נוח, מהיר בנוסף לדרישה לא בררן חלבון טיהור צעדים. תא ללא ביטוי מספקת גישה ישירה אל רוב הרכיבים השונים תגובות ביוכימיות, ובכך מאפשר ניתוח עמוק יותר אינטראקציות מולקולרית12. בתגובה TXTL, אחד באפשרותך לשנות את ההגדרות הביוכימי, ביופיזיקלי כרצונו, שבו כמעט בלתי אפשרי בתא החי. לאור יתרונות ושיפורים אחרונים אלה, הטכנולוגיה TXTL הופכת לפופולרית יותר ויותר כמו פלטפורמה חלופי עבור ביולוגיה סינתטית ולא כמותית. בעוד קהילת המחקר באמצעות TXTL מתפתחת במהירות, TXTL הופך להיות טכנולוגיה סטנדרטית בביו-הנדסה, זה חיוני כדי להבין כיצד משתמשים כזה פלטפורמות כדי לפתח נאותה שהיו קשורים ההוצאה להורג של תגובות TXTL ולחוות פרשנות של התוצאות.

במאמר זה, אנו מסבירים כיצד להשתמש במערכת TXTL כל של החיידק לסנתז, בתגובות סיר אחד, bacteriophages מ שלהם הגנום11, כגון MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), ו- T7 (dsDNA, 40 kb). אנו מראים איך כמות phages מסונתז שינויים ביחס כמה הגדרות הביוכימי של התגובות (ריכוזים מגנזיום ואשלגן). הצפיפות המולקולרית, מדומה דרך ריכוזים טווח של פג 8000, יש השפעה דרמטית על סינתזה phage במספר סדרי גודל. מימוש מערכות הביוכימי גדולים כאלה בתגובות מבחנה אחת אשר מסכם את הדברים במקביל את התהליכים של תמלול, תרגום, הרכבה עצמית, מעניין למיעון שאלות בסיסיות הקשורות לביולוגיה וביופיזיקה 10 (הכונה הרכבה עצמית), כמו גם עבור פיתוח יישומים, כגון שינוי פונקציות phage לבנות nanostructures חדש13. בנוסף מעשית על TXTL, אנו מספקים שיטות phage הגברה, חילוץ הגנום, טיהור של כימות phage מאת וזמינותו פלאק. השיטות שהוצגו בכתב היד מתאימים לחוקרים להשתמש במערכות ללא תא תמצית מבוסס e. coli , מעוניינים bacteriophages.

הפרוטוקולים הציג בעבודה זו ניתן לסכם כדלקמן: 1) Phage הגברה (יום 1: להכין חיסון תאי, יום 2: יחיד פלאק, מרובים phage צמיחה, ואת לריכוז יום 3: טיהור של phage), 2) מיצוי DNA הגנום גדילי כפול (פנול/כלורופורם מיצוי), ו-3) ללא תא התגובה phage וניסוי כייל נוגדנים (יום 1: צלחת התאים המארחים ולעשות פלטות אגר, יום 2: התגובה ללא תא ומנחה תא תרבות קדם, ו יום 3: מארח תא phage ותרבות כייל נוגדנים).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: השלבים הבאים הגברה ושיטת מיצוי הם במידה רבה להכליל עבור רבים כפול גדילי DNA phage, למשל, bacteriophage T7, אנטרובקטריופאג phage T4 או אנטרובקטריופאג phage λ (L). הם משמשים בעיקר phage הגנום שלו אינה זמינה לרכישה ממקורות מסחריים.

1. הגברה phage

הערה: הטכניקה הייצור phage (SPMC) יחיד-פלאק, מחזור רב מתואר היטב עבור phage T4 חן, et al. 14 הבאים phage הגברה ו- DNA שיטת החילוץ הוא הכללה לשימוש עם e. coli כפול גדילי DNA phages, למשל, T7, T4 או ל' ההצלחה האולטימטיבי של הפרוטוקול בכבדות תלויה במתח התא המארח שנבחר ' s היכולת לעמוד בתנאים superinfection. אם התאים מארח לא יציבים תחת superinfection, או superinfection היא לא הגיעה, פירוק לא הגיעה במהלך שלב קריטי זה, עדיף להמשיך עם פרוטוקול פירוק confluent. זה כולל הפרדת ההריסות הסלולר באמצעות צנטריפוגה במהירות גבוהה, phage pelleting במהירויות ultracentrifugation. כל התנאים הבאים ואת הפרמטרים מיועדים כנקודת התחלה כללי. התנאים האופטימליים עבור קו תא מארח מקומי עשוי להיות שונה; לקבוע, לדבוק התנאים המתאימים.

  1. להכין חיסון תאי
    1. לחסן 10 מ"ל לוריא-Bertani (LB) מדיה בשפופרת תרבות 15 מ"ל עם התאים המארחים e. coli, למשל, B או K12.
    2. המקום ב שייקר מוגדר 250 סל"ד ו-37 ° ג להשאיר למשך הלילה לגדול כדי הרוויה.
  2. יחיד-פלאק, צמיחה phage מחזור רב וריכוז
    1. כדי להכין צלחת של הפלאק phage המוסמכת, לחמם מספר צלחות LB-אגר ב 37 ° C עבור 1 h, או למשך הלילה.
    2. להכין מספר דילולים phage מניות (למשל, T7, T4 או L) ריכוז ידוע בתקשורת ליברות, מכוון ~ 10 2-10 3 phage/mL....
    3. להוסיף 100 µL של לילה צמיחת התאים המארחים מרוכז על כל צלחת.
    4. בחר כרכי-מוכנה phage דילולים המתאים לטווח של 10-100 phage/צלחת. להוסיף את הנפח הנדרש של דילולים phage כל צלחת (לדוגמה, µL 100 של phage 3 10/mL; זה צריך לייצר לוחות ~ 100). דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס ולהתחיל להמציא ספירת טיימר (+ 0 h). תקופת דגירה של 4-5 ח'
    5. להכין 49 מ ל LB מדיה הבקבוק 250 מ ל ובמקום שייקר רוטרי מוגדר 250 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס.
    6. - + H 2.5, שתדללו תאים 50 x על-ידי הוספת 1 מ"ל של תרבית תאים רווי מגידול לילה לתוך בקבוקון מראש ומחוממת המכיל 49 מ ל LB בינוני. ברגע התאים להגיע לצמיחה יומן (+ h 4-5), למדוד את ספיגת על 600 nm (OD 600). לקבוע את הריכוז של תאים באמצעות המרה OD 600 של 1.0 = 8 x 10 8 תאים למ"ל.
    7. Dilute 2 x 10 7 תא/mL באמצעות מדיה נוספים של צמיחה ליברות. הסר את לוחית אגר המכיל את הפלאק phage מן החממה. מיד להשתמש סוף פיפטה פסטר סטרילי ליבה ולהסיר שלט יחיד. לפוצץ את הפלקיו לתוך התאים מדולל, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 נוספים (+ h 6-7).
    8. מבחן מלא זיהום על ידי לקיחת דגימת 500 µL לתוך צינור 1.5 mL, הוספת 10 µL כלורופורם (CHCL 3), מיד vortexing במהירות גבוהה. שים לב אם הפתרון הוא הבהיר. ברגע תאים נגועים לחלוטין, תקופת דגירה של עוד 2 h (+ h 8-9).
      הערה: אם התאים נגועים לחלוטין, הם במהירות lyse (< 2 דקות) ולהבהיר את הפתרון. תוצרים נלווים נחשבים דיון בסעיף שלהלן. התאים להיות superinfected, אך לא lyse עד לנקודה זו. אם פירוק מתחילה, התוספת של DNase קצירת על ידי צנטריפוגה חייבים להתחיל מיד למנוע השפלה phage.
    9. להוסיף DNase 5 µg/mL, צנטריפוגה תאים ב g 8,000 x ב 4 ° C כדי גלולה. למחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב 10 מ"ל של x TRIS 1 מגנזיום כלורי (TM) (50 מ מ טריס ב- pH 7.8, 10 מ מ MgCl 2) מאגר עם 5 µg/mL DNase. להוסיף 500 µL של CHCL 3 ו מערבולת במהירויות גבוהות lyse התאים. להבהיר על ידי צנטריפוגה ב g x 12,000 10 דקות ב-4 ° C. Decant תגובת שיקוע לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל החנות ב-4 מעלות צלזיוס

2. טיהור של Phage

הערה: סוכרוז טיהור תלויה במידה רבה בגודל של phage. שיקולים של המונים phage להיות מבודד יהיה חייב להתבצע וביצע התאמות לתנאים הדרגתיות. האחרונים ויראלי titers של מעל 10 13 phage/mL השגה בקלות באמצעות שיטה זו.

  1. להכין 12 מ של סוכרוז w/v 5% ו- 45% 1 x מאגר TM-
  2. הכנת 4 x 5-45% סוכרוז מעברי צבע על-ידי pipetting 2.5 מ של 45% סוכרוז לתוך צינורות ultracentrifuge 4. למעלה עם ~ מ 2.6 ל 5% סוכרוז, ומפסיק כאשר הנוזל מגיע 2 מ מ בקצה הצינור.
    הערה: הנח את הטיפ פיפטה במגע עם משטח של הפתרון סוכרוז, לאט מאוד לוותר על נוזלי. הפתרון סוכרוז בהיר יותר יצוף מעל כבד, ויוצרים גבול ברור. פתרון בשכבות כראוי יהיה ממשק ~ 1 מ מ אם שנערכה נגד אור רקע.
  3. לערבב את מעברי צבע על ידי סיבוב הטיה-שפופרת באמצעות מעבר צבע ויוצרים נכשיר 43 s ב ° 86-23 סל ד. אם יש צורך. לא באופן מיידי, לכסות עם סרט פרפין ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
  4. µL 500 להסיר מהחלק העליון של כל אחד מוכן סוכרוז הדרגתי עם pipettor 1 מ"ל, איזון בתוך ± 0.002 g...
  5. בריכה המתלים phage משפופרות כל (שלב 1.2.9). באמצעות פיפטה של 1 מ"ל, להוסיף 500 µL של התליה על ידי מביא את הטיפ במגע עם משטח נוזלי, לאט מאוד מחלק את עוצמת הקול על החלק העליון של מעבר הצבע סוכרוז, נזהר לא לערבב דרך מהירה pipetting. צנטריפוגה ב 70,000 x g כעשרים דקות ב 4 º C
    הערה: איזון מעברי הצבע מוכן כדי בתוך ± 0.002 g. phages קטן עשוי להימשך עד 1 ח'
  6. להסיר את הלהקות phage באמצעות מזרק סטרילי ואת בצינורית בוטה.
    הערה: כאשר במבט מהצד, הלהקה phage יהיה חלבי ועבה לעומת הסביבה, כ 5 מ מ גובה, והוא ממוקם בחצי הדרך דרך צינור צנטריפוגה.
    1. Submerge סיגריה בצינורית לתוך הפתרון עד הקצה ממורכזת על הקצה העליון מאוד של הלהקה phage. הסר את הלהקה על ידי ציור על הבוכנה המזרק עד הרוב המכריע של הלהקה phage הוסר.
  7. להוסיף האחסון סוכרוז עם phage על תנאי 3-4 ultracentrifuge צינורות. להוסיף יותר מ 1.5 mL/צינור. מילוי כדי ~ 3-4 מ מ מתוך החלק העליון של הצינור עם קר 1 x TM. מכסה עם סרט פרפין, היפוך לערבב. בחזרה בבית, ultracentrifuge ו ספין-145,000 g x עבור h 1 ב 4 ° C כדי גלולה. Phages קטן יותר יכול לקחת עד 2 ה
  8. יוצקים את תגובת שיקוע ובמהירות לנקז במהופך על מגבונים חד פעמיים. לנגב את החלק הפנימי של צינור עם אוזניים סטרילי כדי להסיר עודפי תגובת שיקוע.
  9. לחלק 200-400 µL קר 1 x TM על-פני כל גללים ו resuspend בין לילה ב 4 ° C; אי אפשר לנער נדרש.
    הערה: אם בגדר אינו נקי, כגון: בכיפות פיסות ממברנה, דנ א, וכדומה, בריכה ולבצע צנטריפוגה נוספים ב- microcentrifuge-17,000 ג x
  10. היום לפני ביצוע titers, להכין תרבות של e. coli התאים המארחים בתקשורת הצמיחה 10 מ ל LB, להשאיר חממה חזק מוגדר 250 סל ד ו- 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. דגירה את הכמות המתאימה של תרבות צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה לפני ביצוע titers של המניה phage.
    הערה: מספר צלחות דגירה תלויה במספר של דילולים phage מניות כדי להיות מצופה: כל דילול ייחודי של מניות phage דורש שתי צלחות תרבות (למשל, בארבע דילולים שונים של מניות phage דורשות שמונה צלחות תרבות).
  11. להכין 100 מ של אגר העליון על-ידי הוספת 2.5 g ק ג ו- 0.6 g מה נשארתי-אגר בקבוק 100 מ. להמיס המוצקים במים יונים באמצעי אחסון של 100 מ ל, תא לחץ. לאחר החיטוי, לאט להפוך את הבקבוק 6 - 8 פעמים כדי homogenize את אגר ברחבי הפתרון. מקם את הבקבוק באמבט מים 45 º C למשך 15-20 דקות עד equilibrate הטמפרטורה .
  12. להכין טורי דילול מניות phage עם הפתרון LB-
    1. µL להוסיף 990 LB 10 phage µL במניה לדילול 100-fold. המערבולת homogenize. עבור גורם לדילול של 10, להוסיף µL 100 מניות phage 900 µL המערבולת LB. homogenize.
    2. חוזרת הסדרה דילול לעיל כמה פעמים לפי הצורך כדי לקבל מספר אפשר לספור של הפלאק (10-100 הפלאק).
      הערה: כדי להשיג זאת, לדלל המניה phage 2-3 סדרי גודל פחות מאשר התשואה הצפויה phage מבחינת התגובה phage/mL. לדוגמה, אם מניה phage מסוים מכיל 10 11 זיהומיות phage/mL, צלחת המניה phage ב 10 8-קיפול או 10 9-מקפלים דילול.
  13. להתכונן אזור phage titers על ידי הרכבת צינורות תרבות 14 מ"ל (מספר צינורות תרבות שווה מספר phage דילולים מניות כדי להיות מצופה). במקום הדגימות מניות phage מדולל מהשלב 2.12, התאים חיידקי מארח מהשלב 2.10 על קרח
  14. להכין תערובת בסיס על-ידי pipetting מ"ל ו 5.25 העליון אגר (שלב 2.11), 220 µL מדולל phage דגימות (שלב 2.12) ולאחר 50 µL מארח תאים חיידקיים (שלב 2.10) לתרבות מ 14 ל צינור. קאפ את תרבות שפופרת ואת מערבולת במהירות גבוהה-
    1. אחסן את הפתרון phage הנותרים 4 ° C.
  15. להחזיר התרבות שתי צלחות (שלב 2.10) מן החממה 37 º C. להוסיף 2.5 מ של מיקס מאסטר לאט במרכז צלחת הראשונה (ללא בועות). סובב בעדינות את הצלחת ביד כדי להפיץ את תערובת הבסיס באופן שווה כך על פני לוח תרבות שלמה. חזור עם לוחית השני. לחכות 20 דקות כדי להבטיח ייבוש של אגר העליון. דגירה צלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4-7 ח'
  16. נחשב הפלאק ולקבוע את הריכוז phage עבור כל דגימה התגובה.
    הערה: שלטי יופיעו כעיגולים ברור 1-2 מ מ בשטיח אטום של התאים המארחים. לקבלת תוצאות נציג, ראה איור 1. הפקה מוצלחת phage תגרום בריכוזים הסופי של 10 12-10 13 phage/mL-

3. גדילי כפול מיצוי DNA הגנום

הערה: דילול, רועדת, צנטריפוגה צעדים חייב להיות אופטימיזציה לפתח שכבה עבה, מוצק חלבון גבול בין פנול שלבים מימית. זה יוצר הגנום טוהר הגבוהה חופשיים של חלבון מזהמים. דילול הראשונית תלויה כייל phage הסופי. מניות phage כייל נוגדנים גבוה ביותר (≥ phage 13 10/mL) עשוי להזדקק לדילול 10-20-קיפול לפני החילוץ, בעוד יזדקק רק מניות כייל נמוך (~ 10 10-10 11 phage/mL) 2-fold או אף אחד. אם זה קשה ליצור שכבת חלבון מוצק בצעדים העוקבים או המתלה מימית הוא דביק מדי להיות ישימה בשל הריכוז הגבוה של ה-DNA, שקול לדילול גבוה יותר של מניות phage לפני שתמשיך החילוץ. במהלך צעד הגנום-טיפול כלשהו, חשוב להשתמש רחב נשא פיפטה טיפים כאשר pipetting כל שלבי מימית. הגנום phage רבים וגדולים די בקלות מפוצלים באמצעות פיפטה הטיה. בנוסף, כל vortexing במפורש להימנע כמה זה חמור להטיה הגנום.

  1. לדלל חלק phage מניות מ שלב 2.9-400 µL עם 1 x TM המאגר בצינור mL 1.5 טריים.
  2. להוסיף אמצעי שווה של Tris:Phenol:Chloroform הדילול. לנער את התערובת בעדינות על כיסא נדנדה מעבדה, או בעבודת יד, עבור 5 דק Centrifuge האמולסיה תוצאות ב g x 17,000 ומפרידה benchtop במשך 5-10 דקות
    הערה: שכבת חלבון ברורים, לבן על פני השטח של השלב הבסיסי פנול קיים.
  3. להסיר את שלב מימית העליון צינור מטפל שלא להפריע את הגבול לאטמוספרה.
  4. חזור על צעדים 3.2-3.3 נוספים 2 פעמים בסך הכל 3 עקירות פנול. להעביר את פאזה מימית צינור טריים ולהוסיף אמצעי שווה של CHCl 3. טלטול, צנטריפוגה (שלב 3.2). להעביר את דגימת DNA מימית צינור נקי.
  5. מעריכים את אמצעי האחסון של ה-DNA מטוהרים. מוסיפים 0.4 כרכים של 3 מ' סודיום אצטט (CH 3 COONa) שלושה כרכים של 95% אתנול (EtOH). מניחים במקפיא-20 ° C עבור לילה משקעים. צנטריפוגה ב g x 17,000 ומפרידה benchtop במשך 10-15 דקות
    הערה: ה-DNA מיד מייבשים ולהיות גלוי כמו מסה ההשעיה בצינור. בגדר וכתוצאה מכך ראוי הוא לבן, ארוזה היטב בתחתית השפופרת.
  6. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע decanting או pipetting. להוסיף 500 µL 70% EtOH וללחוץ בעדינות את הצינורית עד בגדר צף חינם מהחלק התחתון של צינור. צנטריפוגה-17,000 g x עבור 5 דק להסיר ולמחוק EtOH, מקפיד לא להפריע בגדר.
  7. חזור על שלב 3.6. האוויר יבש בגדר על benchtop במשך 30-60 דק להוסיף 50 µL ddH 2 O כדי בגדר תקופת דגירה של 1 h RT או לילה ב 4 ° C עד resuspend. לקבוע את ריכוז הדנ א באמצעות מדידות הקליטה ב 280 ננומטר.
    הערה: ריכוז הצפוי הם 0.5-5 µg/µL בעזרת טכניקה זו. לחלק ב- סה כ משקל מולקולרי גנומית כדי לקבוע ריכוז הגנום הסופי.

4. ללא תא Phage התגובה וניסוי כייל נוגדנים Phage

  1. להכין 25 גרם ליברות בינוני ויציב מה נשארתי-אגר 15 גרם, שופכים לתוך בקבוק 1 ליטר, ולהוסיף מים יונים 1 ל' אוטוקלב.
  2. לאחר עיקור, להפוך את הבקבוק באיטיות 6 - 8 פעמים לדאוג כדי למנוע היווצרות בועות. היפוך הבקבוק homogenize המוצק אגר ברחבי הפתרון 1 ליטר. למקם את הבקבוק בתוך אמבט מים 58 מעלות כעשרים דקות לפני dispensing על גבי לוחות תרבות.
  3. ברגע הטמפרטורה של הפתרון LB-אגר יש equilibrated, להכין להבה ליד הלוחות תרבות לחטא הסביבה ליד הלוחות תרבות הפתוחים. שמור את הבקבוק 1 ליטר באמבט מים כדי למנוע ייבוש של אגר בעת ביצוע של aliquots. להוסיף 25 מ לתוך צלחת תרבות 100 מ"מ x 15 מ"מ. 1 ליטר יהיה לייצר הצלחות תרבות 40.
  4. לוח תרבות אחד להפריש ולתת לחזק במשך לפחות שעה-RT; הצלחת הזו תשמש עבור ציפוי התאים מארח. תן שאר הצלחות 39 תרבות לחזק במשך יומיים בחנות RT. ב 4 ° C או להשתמש מיד להכנת titers.
  5. צלחת התאים מארח על-ידי ומבטא את המתח בקטריאלי המתאים (לדוגמה, מחשב מארח B עבור T7) זה היה מאוחסן ב- 80 ° C, על גבי צלחת תרבות LB-אגר. פס ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום סביבתי. דגירה בין לילה ב 37 º C. התאים מארח יש עמידות לאנטיביוטיקה אין אז עובד בסביבה סטרילית חיוני.
  6. התגובה ללא תא
    הערה: התגובות TXTL נטול תאים מורכבים 33% גולמי e. coli לחלץ (חלבון 8.9-9.9 מ"ג/מ"ל) % 67 אחרים מורכבת התגובה מאגר ו phage הגנום. תמצית גולמי מוכן כמו בעבר תיאר 15 , 16. תגובה אחרונה התנאים: חלבון 8.9-9.9 mg/mL (מתמצית גולמי), 3-6 מ מ Mg-גלוטמט, 40-100 מ מ K-גלוטמט, 2-4% יתד 8000, 3-4 מ מ של כל חומצת אמינו, מוכנים כמו שתואר לעיל 17 ולאחר פתרון תמהיל האנרגיה, תיאר בעבר 15, המורכב 0.33-3.33 DTT, מ מ 50 מ מ. HEPES, מ מ 1.5 ATP ו- GTP, מ מ CTP, זוג שזור, 0.2 מ"ג/מ"ל tRNA, 0.26 מ מ CoA, 0.33 מ מ NAD, 0.75 מ מ מחנה, חומצה פולינית מ"מ 0.068, spermidine 1 מ מ ו- 30 מ מ 3-PGA. דנ א-סוג phages דורשים ריכוזים הגנום של 0.5-10 ננומטר, מסוג RNA phages דורשת טווח של 50-150 ננומטר. התגובה האחרונה ריכוזים ייחודית phage מסוים מסונתז, תיפול בטווחים שתוארו לעיל. עבור חמצון אופטימלית של התגובות, כרכים התגובה הסופי צריך להיות בין 10-20 µL. ישנן וריאציות קטנות בפרוטוקול התגובה, אשר תלויים צורת המולקולה גנומית. לדוגמה, הגנום ליניארי מולקולות דרוש מרכיב חשוב נוסף בתגובה לעכב את העיכול של חתיכות DNA ליניארי על ידי האנזים recBCD נוכח תמצית גולמי.
    1. להשלים " התגובה פרטים " בסעיף טבלה 1 (PhageTXTL_JOVE) על-ידי הזנת המספר הכולל של תגובות ונפח הסופי של תגובה.
    2. תכנון הניסוי על-ידי קביעת הרכיבים קבוע ואת מרכיבי המשתנה של התגובה. הזן את האחוז נפח החלקי של המיקס ראשיים, אשר הוא היחס מהנפח הכולל של רכיבי התגובה קבוע למוצר של התגובה האחרונה אמצעי האחסון, מספר הדגימות. הזן את המלאי הסופי ריכוזי ריאגנטים התגובה ב " מאסטר תערובת התגובה מתכון " בסעיף PhageTXTL_JOVE. הזן את המלאי הסופי ריכוזי reagent(s) המשתנה ייבדק.
      הערה: אמצעי האחסון של רכיבי התגובה באופן אוטומטי יחושב בהתבסס על מיקס מאסטר ונפח האחסון הסופי של כל תגובה בודדים.
    3. להסיר את הסכום הדרוש של צינורות (המצוין " צינורות להפשיר " בסעיף PhageTXTL_JOVE.xlsx) של תמצית תא גולמי, תמהיל מאגר האנרגיה חומצת אמינו לערבב מ-20 ° C או -80 ° C ו הפשרה על קרח
      הערה: פעם הקרת, לשלב מספר aliquots של כמו רכיבים (במקרה הצורך)-
    4. Aliquot הנפח המצוין של גולמי לחלץ, 33% של אמצעי האחסון התגובה האחרונה, לתוך צינור microcentrifuge.
    5. להכין את תערובת הבסיס לפי טבלה 1. Homogenize כל הרכיבים תחת " מאסטר תערובת התגובה מתכון " על ידי vortexing. להוסיף נפח מתאים של כל רכיב תמצית גולמי.
    6. אם עובד עם phage עם גנום DNA ליניארי (למשל, T7), להוסיף 1 מיקרומטר של החלבון גאם של למדא bacteriophage תגובה 11. מערבולת כדי homogenize את הפתרון, ומניחים את התגובה על קרח למשך 5 דקות. זה מעכב עיכול החלקים DNA ליניארי על-ידי recBCD מורכבות, אשר הוא אנדוגני תמצית גולמי.
    7. לאחר הוספת הרכיב האחרון לפי טבלה 1, homogenize את התגובה על ידי vortexing. לפצל את תערובת הבסיס לתוך צינורות microcentrifuge n.
      הערה: הנפח של כל פיצול הוא התוצר של האחוז נפח מיקס מאסטר החלקי, הנפח הסופי של התגובה. לדוגמה, אחוז נפח מיקס מאסטר החלקי של 90%, את עוצמת התגובה האחרונה 12 µL, הנפח של כל פיצול הוא 10.8 µL.
    8. להוסיף את אמצעי האחסון שצוין מרכיבי המשתנה של המערך מיקס מאסטר (ראה טבלה 1). להוסיף מים כל התגובה להגיע שעוצמת התגובה הסופי הרצוי. Homogenize כל תגובה על-ידי vortexing. דגירה הצינורות microcentrifuge ב 29 מעלות צלזיוס לפחות 8 שעות או לילה.
  7. תרבות טרום תא מארחת
    הערה: התרבות מראש לילה הוא מדולל 50:1 כדי להבטיח כי התאים מארח המשמש את הניסוי כייל נוגדנים בשלב אמצע יומן, אשר מגביר את יעילות זיהום. התאים באמצע יומן מחדש מרוכז על-ידי 10-fold ואז ומאוחסנים על קרח.
    1. באמצעות טיפ פיפטה סטרילי, לחסן שפופרת תרבות של 5 מ"ל ליברות עם 3-5 מארח בריא תא מושבות. עבודה ליד להבה פתוחה כדי למנוע זיהום.
    2. דגירה הצינור תרבות בתוך חממה חזק ב 37 ° C ו 250 סל"ד במשך 16 שעות או לילה. תאים יכול להגיע שלב רוויה ביום שלמחרת.
  8. לארח תא תרבות, לדוגמה כהכנה phage כייל נוגדנים
    1. לוותר על 50 מ ל LB לתוך הבקבוק Erlenmeyer 500 מ"ל לכסות ברדיד אלומיניום. לחמם את הבקבוק ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות
    2. Aliquot 1 מ"ל של המארח תא לילה מראש התרבות לתוך מראש ומחוממת LB. תקופת דגירה של 3-4 h ב- 37 ° C, ומנענע ב 250 סל"ד.
    3. צנטריפוגה התרבות התא המארח 50 מ ל 10 דקות ב ג x 5,000 למחוק את LB.
    4. Resuspend בגדר קר (4 ° C) מ ל LB ולשמור על קרח
    5. שעה אחת לפני תחילת הניסוי כייל נוגדנים, דגירה הלוחות התרבות ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: כל התגובה phage ייחודי (וגם גורם לדילול המתאימים) יהיה לנצל שתי צלחות. בנוסף, דגירה ארבע פלטות עבור פקדים ניסיוני (ראה איור 1 עבור פקדים נציג חיוביים ושליליים).
    6. להכין 100 מ של העליון אגר (שלב 2.11).
  9. להכין לדילול טורי התגובה ללא תא עם פתרון LB כמתואר בסעיף 2.12.
  10. Phage כייל נוגדנים
    הערה: להתחיל צלחת אחרי תרבות מנות יש הדגירה במשך לפחות שעה אגר העליון היה באמבטיה מים 45 º C למשך 15-20 דקות לאחר ההסרה של החיטוי.
    1. כייל הסופי התא ללא תגובה-LB פתרון כמתואר בסעיף 2, צעדים 2.14-2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

אנו מראים תוצאות נציג ארבע. איור 1, אנו מציגים קבוצה של פקדים שלילי כדי להבטיח כי מערכת TXTL ללא תאים, המניות DNA phage לא נגועים עם חיים התאים e. coli . אנו מאמתים כי מערכת TXTL נטולת תא הינה ללא פגע e. coli תא זיהום על ידי ציפוי שני התגובה שאינו מתפשט, מודגרות פתרון הריק של הדנ א (איור 1א' ואיור 1B). אם המערכת TXTL נטולת תא היה מזוהם עם תאים e. coli , צמיחה תיענה על הצלחת. יתר על כן, אנו מאמתים כי התגובה ללא תאים ותאים ולכן לא כל מזהם אפשרי, אחראים על הסינתזה של phage על ידי ציפוי שאינו מתפשט מודגרות תגובות עם הגנום phage (איור 1C ו איור 1D). הצלחת עם התגובה שאינו מתפשט (איור 1C) מציג רובד אפס בעוד לצלחת עם התגובה incubated (איור 1D) מראה פלאק, המציין שמערכת TXTL נטולת תא היה אחראי phage סינתזה.

איור 2, אנו משווים הומוגניות לעומת assay רובד inhomogeneous. איור 2 B מדגים הדרגתי של צפיפות רובד מעבר לצלחת תרבות, המהווה תת אופטימלית לעומת צפיפות לוח הומוגני של צלחת איור 2א. המקור של זה נצפתה והתוצאה היא של התקררות מהירה מיקס מאסטר של העליון אגר, לדוגמה, מחשב מארח תאים חיידקיים כאשר ויתרו על צלחת תרבות במהלך החלק כייל נוגדנים phage של הניסוי. כדי למנוע התפשטות של inhomogeneous phage הפלאק, ודא כי הלוחות תרבות הם equilibrated עד 37 ° C לפני תחילת הניסוי כייל נוגדנים phage.

שלב קריטי לספור כראוי phages הוא כדי לדלל את הפתרון phage מספיק כדי לקבל בין 50 ל- 200 שלטי לכל צלחת (איור 3). מתחת לטווח זה, זה קשה לקבוע סטטיסטיקה אמיתית, מעל הטווח, שלטי חופפים, מניעת עבירות מדויק. מספר phages מסונתז TXTL תלוי בהגדרות ביוכימיים, כגון הריכוז של מלחי (אשלגן, מגנזיום), של הקראודרים מולקולריים ועל הגנום. איור 4, אנו מראים כמה דוגמאות של בדיקות phages T7 וΦΧ174. עבור phage המשכפלת את ה-DNA שלו, כגון T7, נתבונן יעילות גבוהה של סינתזה phage התגובה ללא תא: שלושה phages זיהומיות הן מסונתז לכל מולקולה הגנום התגובה. אפשר לצפות ליעילות נמוכה של תגובות עבור phage זה לא לשכפל את הדנ א, כגון ΦΧ174: היחס בין phage זיהומיות מסונתז על מולקולה הגנום הוא 1:5.

Figure 1
איור 1: פלאק assay פקדים והפקה מוצלחים phage זיהומיות באמצעות מערכת התגובה ללא תא (CFR). (א) גנום לא נוספה ובוצע ללא דגירה (0 דקות כמו זמן הדגירה) של CFR. התגובה הייתה מצופה ואז בלי מארח e. coli. התוצאה מראה אף מארח קיימא תא זיהום של CFR. (B) גנום לא נוספה ו CFR היה מתפשט 12 שעות ב 29 ° C, מצופה ללא מארח e. coli. התוצאות מראות אף מארח קיימא תא זיהום של CFR, גם לאחר דגירה. (C) 1 ננומטר הגנום כלולים עם אין דגירה של CFR (0 דקות כמו זמן הדגירה), מצופה מארח e. coli. התוצאה מראה שום זיהום phage הפתרון הגנום. (ד) 1 ננומטר הגנום כללו ו- CFR הדגירה 12 h ב- 29 מעלות צלזיוס. מצופה עם המארח e. coli. התוצאות מציגות שכפול מוצלחת phage זיהומיות ב CFR. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הומוגניות לעומת התפשטות phage התגובה במהלך הניסוי כייל נוגדנים inhomogeneous. השפעה אפשרית של ביצוע כייל phage על צלחות תרבות לא equilibrated לטמפרטורה של 37 ° C היא התפשטות inhomogeneous של התגובה phage מעבר לצלחת תרבות. תוצאה טובה הצגה כפולה הומוגנית של תגובה phage מוצג (A), איפה הפלאק מופצים בצורה שווה על פני השטח של הצלחת. תוצאה תת אופטימלית מוצג (B), איפה הפלאק מרוכזים בחלק השמאלית התחתונה של צלחת תרבות. הדבר יכול להתרחש עם העליון-אגר, התגובה phage, ואת המארח תא מיקס מאסטר הם ויתרו על צלחת תרבות שאינה בטמפרטורה של 37 ° C. הרוב המכריע של המיקס מאסטר בגרגירים האזור השמאלית התחתונה, בכפולה הומוגנית אינה אפשרית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הגדרת גורם לדילול המתאים עבור titers של תגובה phage ללא תא. (א) הצלחת הזו מציג מספר סביר אפשר לספור של הפלאק. הגורם דילול המשמש עבור החלק כייל של הניסוי מדולל את התשואה של התגובה phage מספיק כדי להשאיר מספר שלטי אפשר לספור על הצלחת. לעומת זאת ב (B) הגורם דילול היה נמוך מדי ביחס התשואה של phage מסונתז, והוא צריך להיות מותאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : אפיון של הסינתזה נטול תאים של phages ΦΧ174 ו- T7. (א) מספר ΦΧ174 מסונתז T7 phages (PFU/mL: plaque יחידות ויוצרים למיליליטר) כמו פונקציה של יתד ריכוז 8000 התגובה ללא תאים, נמדד לאחר 16 h של דגירה-29 מעלות צלזיוס. (B) מספר ΦΧ174 מסונתז T7 phages כפונקציה של ריכוז המגנזיום-גלוטמט התגובה ללא תאים, נמדד לאחר 16 h של דגירה-29 מעלות צלזיוס. (ג) מספר ΦΧ174 מסונתז phage כפונקציה של ΦΧ174 ה-DNA הגנום ריכוז התגובה ללא תאים, נמדד לאחר 16 h של דגירה-29 מעלות צלזיוס. (ד) מספר מסונתז phage T7 כפונקציה של ריכוז גנום T7 DNA התגובה ללא תאים, נמדד לאחר 16 h של דגירה-29 מעלות צלזיוס. כל קווי השגיאה המוצגות הן סטיות תקן של שלושה מחקרים חוזרים ונשנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Table 1
טבלה 1: תגובת הרכב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעקבות הטכניקה חן, et al. 14 עבור SPMC, שלב קריטי נגיש בקביעת תנאי נאותה superinfection. הפרמטר השולט ביותר היכולת של זן מארח לעמוד superinfection הוא לעתים קרובות הריכוז ההתחלתי של phage המזהם. התאים מארח חייב להיות בשלב הצמיחה לוגריתמי לפני זיהום ראשוני עם כמות קטנה מאוד של phage. בסופו של דבר, phage גם תגיע גדילה לוגריתמי, המטרה היא לאפשר את המספרים phage במהירות שהאמצע הרוזן התא, המאפשר עותקים מרובים של phage בכל תא המארח. פעולה זו מאלצת את התא למצב יציב ומעין איפה זה לא יעבור פירוק. אם מצב זה לא הושגה, התאים עוברים פירוק מדורגים, confluent, לשחרר את המטען הנגיפי שלהם. אם superinfection לא ניתן להשיג באמצעות ריכוז ויראלי הראשוני לעיל, להוריד את הריבוי הראשונית של זיהום לפי פקטור של 10 לפני ביצוע הנסיון הבא. אם התאים מארח lyse לפני הקטיף, superinfection לא הושגה, להמשיך מיד עם הליך נפרד טיהור. להוסיף DNase I 5 µg/mL ו- 500 µL CHCl3 כדי לסיים את פירוק התאית כל. ממשיכים מערבולת של 5 דקות נוספות ואז צנטריפוגה ב 10,000 g x כדי להסיר את הלכלוך הסלולר. Decant, centrifuge את תגובת שיקוע ב 75,000 g x עבור 1-2 h הצניפה phage את, resuspend בין לילה במאגר TM סה כ 1 x 1 מ"ל ב 4 ° C ללא רועד. כאשר בודקים superinfection באמצעות אמצעי אחסון קטן של תאים, זה אפשרי לאמוד כמה קרוב תאים כדי פירוק על ידי כמה מהר הם lyse כאשר נחשפים ההרדמה שנוספו. אם התאים lyse הפתרון. מבהיר באופן כמעט מיידי, קירות התא הם מאוד לא יציב, תאים צריך להיות שנקטפו מיד כדי למנוע פירוק בקנה מידה גדול בהתאם להיררכית הקשרים. אם הבדיקה הנה קטעי. העיתונים בתוך 1-3 דקות, אמצעי האחסון גדול יכול להמשיך superinfect עבור עד 2 שעות, בהתאם המתח המקומי של e. coli נמצא בשימוש. אם התאים לא lyse בתוך 5 דקות, צמיחה phage לא תפס לצמיחה e. coli , הדגירה העיקרי צריך להמשיך. בצע שוב את הבדיקה ב- 30-60 דקות.

כאשר לטיהור phage על מעבר הדרגתי סוכרוז מוכן, phage יופיע בתור להקה עבה מאוד, פנינה בין שליש שני שליש הדרך דרך צינור. בהנחה של פירוק מוצלחת יחסית ועל שלב טיהור שריד הסלולר, ייתכן להקות אחרות, קלות אבל אין דבר דומה צפיפות או גודל. הלהקה גדול, אטום מכיל את phage והוא להסיר הפתרון עם מזרק סטרילי ואת בצינורית בוטה.

בעת התחלת המקטע השלישי של הפרוטוקול, התגובה ללא תא ואת phage כייל נוגדנים, מומלץ לשימוש תרבות טריים צלחות (פחות שבוע) את הצלחת חיידקים המארח (מתוך שלב 3.5) וגם את הצלחות תרבות המשמש לניתוח כייל נוגדנים (מתוך שלב 3.21). זה לקדם צמיחה חזקה יותר של תאי חיידקים מארח ויעילות זיהום גבוה יותר עבור כייל phage. Phage תרבות צלחות חייב להיות מראש מודגרות ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 1 h לפני תחילת החלק כייל נוגדנים phage של הפרוטוקול. ללא דגירה מראש של הלוחות תרבות phage, הפתרון העליון-אגר (מכיל התרבות התא מסונתז, phage ומנחה) לא homogeneously תפיץ על פני-השטח של צלחת תרבות. במקום זאת, הפתרון העליון-אגר יחזק homogeneously על פני השטח (איור 2b). פעולה זו מגדילה את ההסתברות של phages מרובים ההתאמה לשפות אחרות באותו מקום, אשר יכול לגרום אל תזלזל של phage התשואה של התגובה ללא תא.

כל רובד מייצג את האירוע של אחד phage מסונתז מדביק תא המארח, שכפול בתוך התא המארח, lysing התא המארח. שלטי גדלים בגודלם במהלך תקופת הדגירה מתאי רומא phage המזהם השכן מארח מהאירוע זיהום ראשוני. אם אין שלטי שנצפו, זה אפשרי כי הגורם דילול ב פרוטוקול סעיף 4.6 הוא גבוה מדי, וכתוצאה מכך סבירות נמוכה כי כל phage מסונתז מדביק תא המארח. כדי לתקן זאת, להקטין את הגורם דילול על ידי 3-4 סדרי גודל (או לפי הצורך), חזור על הניסוי כייל נוגדנים. לעומת זאת, הגורם דילול יכול להיות גבוה מדי, וכתוצאה מכך הפלאק המתפרסות על-פני השטח כולו של צלחת תרבות, ולכן אפשר למנות את התשואה phage. במקרה זה, להגדיל את הגורם דילול על ידי 3-4 סדרי גודל (או לפי הצורך). עבור phage מאופיין היטב, התשואה של התגובה ללא תא תוכר, גורם לדילול אחד בלבד לכל נקודת התגובה יהיה צורך הניסוי כייל נוגדנים. אפיון של phage חדש, מומלץ לכלול 2-3 גורמים שונים דילול לכל נקודת התגובה, המבטיח כי אחד דילולים תניב שלט אפשר לספור (ראו איור 3 הבדלים בין מספר אפשר לספור, הנפולת של הפלאק על צלחת).

אם אין שלט נצפית לאחר שינוי הגורם דילול של כייל phage, זה יכול להצביע כי התגובה ללא תא הצליחה בכך ביטוי גנים לא התרחשה. הסבר אפשרי זה יכול להיות הנזק המבני של ריאגנטים/phage DNA עקב המגון התגובה ללא תא על-ידי vortexing. כדי לתקן בעיה זו, חזור על התגובה, homogenize על-ידי הקשה בעדינות את הצינור התגובה חמש עד שבע פעמים עם האצבע, או על ידי ערבוב לאט את התגובה עם פיפטה חמש עד שבע פעמים.

מערכת התגובה ללא תא מקורו של e. coli ומכיל endogenously e. coli RNA פולימראז והן הגורם העיקרי סיגמא sigma 70, אשר המצטרפות holoenzyme את הצורך להכיר הקונצנזוס האמרגן הראשי רצפים של e. coli גנים. בנוסף, מערכת התגובה ללא תא יכול לסכם ערכת כולו סיגמא פקטור שעתוק הרציונאלית exogenously שישה אחרים e. coli פקטור סיגמה גנים תחת רצף קונצנזוס יזם סיגמה 70. פעולה זו מאפשרת את היכולת לסנתז bacteriophages כל הגנום שלו תואמים מכונות תרגום/תמלול של e. coli. זה משאיר בחוץ תת-קבוצה של bacteriophage יכולים למד או מסונתז עם מערכת התגובה ללא תא מנוצל כאן

הפלטפורמה ללא תא תעתיק/תרגום מאפשר רמה מרשים של שליטה וגמישות של תנאי ריאקציה בהשוואה ויוו שיטות מחקר. אנו יכולים דק לכוון ביוכימיים רבים ורכיבים גנטי של תגובת phage, לצפות ישירות את ההשפעות תוך פחות מ 24 שעות, כפי שמוצג באיור 4 עבור הצפיפות המולקולרית. ההשפעות של הקראודרים מולקולרית, כגון פג, על הרכבה עצמית של מתחמי macromolecular היה תיאורטית המתוארת, והפגינו במבחנה18,19,20. הצפיפות המולקולרית היא אנטרופיה המונעת על ידי מנגנון זה מגביר את האגודה הקבוע של מבנים גדולים למערכות ביולוגיות. הגישה נטולת התא מאפשר החוקר לחקור תהליכים ביולוגיים מורכבים כמו ביופיזיקה של הרכבה עצמית עם דגם מערכות, כמו bacteriophages, ללא המגבלות מהותי של עבודה ויוו .

פלטפורמה זו גם מאפשר החקירה של השירות של phages בשדות יישומית. מרכיבי הגנום phage ניתן לשנות את ייעודו, במהירות נבדקו במערכת התגובה ללא תא עם המטרה של שילוב תוצאות nanostructures רומן. יכול להיות שונה bacteriophages על מנת להגביר את מידת הבררנות של זיהום התא המארח, אשר תקדם את התועלת של הטיפול phage בתור חלופה עבור חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים את interest(s) הפיננסיים מתחרים הבאים: מעבדה Noireaux מקבל וקרנות מחקר MYcroarray, מפיץ של ערכת ביטוי חלבון נטול תא MYtxtl.

Acknowledgements

חומר זה מבוסס על עבודה נתמכת על-ידי Office של המחקר הימי פרס מספר N00014-13-1-0074 (V.N.), תוכנית המדע הגבול האנושי להעניק מספר RGP0037/2015 (V.N.), הקרן הדו-לאומית למדע להעניק 2014400 (V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1, (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3, (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1, (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106, (4), 048104 (2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7, (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69, (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58, (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10, (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics