Синтез инфекционных бактериофагов в E. coli-на основе свободных клеток выражение системы

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Новое поколение свободных клеток транскрипции перевод платформ был инженерии построить биохимических систем в vitro через исполнение цепи гена. В этой статье мы опишем, как бактериофагов, таких как MS2, ΦΧ174 и Т7, синтезируются из их геном, с использованием всех в свободных клеток E. coli TXTL системы.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Новое поколение систем свободных клеток транскрипции перевод (TXTL), для большей гибкости и модульности, предоставляют новые возможности для выполнения базовых и прикладных наук в пробирке реакция. За последнее десятилетие свободных клеток TXTL стала мощным инструментом для широкого круга новых междисциплинарных исследований районах связанные с количественным и синтетических биологии. Новые платформы TXTL особенно полезны для строительства и допросить биохимических систем через выполнение синтетических или природных гена цепей. В пробирке TXTL оказалось удобно быстро прототип регуляторных элементов и биологических сетей также относительно пилки молекулярной самосборки нашли механизмов в живых системах. В этой статье мы расскажем как инфекционные бактериофагов, например мс2 (РНК), ΦΧ174 (ssDNA) и Т7 (dsDNA), полностью синтезируются из их геном в реакциях одно горшок с помощью всех Escherichia coli, свободных клеток TXTL системы. Синтез трех Коли количественно с помощью assay металлической пластинкы. Мы покажем, как доходность синтезированных Фаговые зависит от биохимических параметров реакций. Молекулярные скученности, подражания через контролируемые концентрации PEG 8000, влияет на количество синтезированных бактериофаги приказами величин. Мы также описывают, как усилить бактериофаги и очистить их геномов. Набор протоколов и результаты, представленные в этой работе должна представлять интерес для многодисциплинарного исследователей, участвующих в свободной ячейке синтетической биологии и биотехнологии.

Introduction

За последнее десятилетие адрес Роман приложениям в эмерджентных междисциплинарных исследований областей, связанных с синтетическими и количественных биологии была разработана технология ячейки свободного выражения. Первоначально используется для выражения независимо от живого организма белки, новые клетки-TXTL систем были разработаны для оба фундаментальных и прикладных наук1,2, значительно расширение сферы применения этой технологии. Новое поколение TXTL платформ была разработана чтобы быть удобным для пользователя, более эффективным (достигнув 2 мг/мл синтеза белка в пакетный режим3), более универсальным на уровне транскрипции4и модульные тем чтобы легко интегрировать Роман природных или синтетических функций, которые расширяют возможности существующих биологических систем5,6. В частности свободных клеток TXTL системы стали удобно для быстрого прототипирования генетических программ, таких как регуляторных элементов или небольших генетической цепи7,8,9, уменьшая дизайн строить тест цикла на несколько дней. Удивительно, новый TXTL системы способны также обработки больших программ ДНК, таких как полный синтез Коли10,11, демонстрируя сильный достаточно выступления в поддержку воссоздания активных геномной ДНК закодированы живых существ.

TXTL систем представляют многие технические преимущества, по сравнению с традиционными в vitro конструктивного биохимических анализов. Бесплатный сотовый TXTL связывает процесс экспрессии генов конечного продукта в ограниченной и открытой среды, в отличие от сложных цитоплазме живой клетки. TXTL использует ДНК для воссоздания биохимических систем в пробирке, который, с современными методами Ассамблеи ДНК, является доступным и быстрым в дополнение к не требующие требовательных белка очистки шагов. Клетки свободной выражение обеспечивает прямой доступ к большинству компонентов в биохимических реакциях, таким образом позволяя глубже рассечение молекулярных взаимодействий12. В TXTL реакции можно изменить биохимические и биофизические параметры по желанию, который почти невозможно в живой клетке. Учитывая эти преимущества и недавние улучшения, TXTL технология становится все более и более популярным как альтернативную платформу для синтетических и количественных биологии. В то время как научно-исследовательское сообщество, с помощью TXTL стремительно растет и TXTL становится стандартной технологии в биоинженерии, важно, чтобы понять, как использовать такие платформы, с тем чтобы разработать адекватные практики, связанные с исполнением TXTL реакций и к Интерпретация результатов.

В этой статье, мы опишем, как использовать все системы TXTL E. coli синтезировать в один горшок реакциях, бактериофаги от их геном11, таких как MS2 (РНК, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb) и Т7 (dsDNA, 40 КБ). Мы покажем, как количество бактериофаги синтезированных изменения в отношении некоторых биохимических параметров реакций (концентрации магния и калия). Молекулярные скученности, подражания через диапазон PEG 8000 концентрации, имеет огромное влияние на синтез Фаговые на несколько порядков. Реализация таких больших биохимических систем в одной пробирке реакциях, которые одновременно пилки процессы транскрипции, перевод и самостоятельной сборки, это интересно для решения основных вопросов, связанных с биологии и биофизики 10 (ген регулирование, самостоятельной сборки), а также для разработки приложений, таких как повторное использование фага функций для построения новых наноструктур13. Помимо практических на TXTL мы предоставляем методы для Фаговые амплификации, геном добычи и очистки и ФАГ количественной оценки в assay металлической пластинкы. Методы, представленные в этой рукописи являются подходящими для исследователей, которые используют E. coli экстракт на основе клеток-систем и заинтересованы в бактериофагов.

Протоколов, представленных в этой работе можно резюмировать следующим: 1) фага амплификации (1 день: подготовить прививка клетки, день 2: Одноместный зубного налета, несколько Фаговые роста, концентрации и день 3: Очистка ФАГ), 2) Double-stranded экстракции ДНК генома (извлечение фенола/хлороформ) и 3) свободных клеток Фаговые реакции и титр эксперимента (1 день: плиты клетки хозяина и сделать плиты агара, день 2: реакции свободных клеток и принимающей ячейки до культуры и день 3: принимающей ячейки культуры и ФАГ титр).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Примечание: следующие шаги усиления и метод извлечения значительной степени обобщаемым для многих двуцепочечной ДНК фага, например, бактериофага Т7, энтеробактерий ФАГ T4 или энтеробактерий Фаговые λ (L). Они используются преимущественно для фага, чей геном не доступны для покупки из коммерческих источников.

1. Фаговые усилители

Примечание: технология производства Фаговые сингл доска, мульти цикла (ГФПК) хорошо описана для ФАГ T4 в Чэнь, et al. 14 следующие Фаговые амплификации и ДНК извлечения метод представляет собой обобщение для использования с E. coli двуцепочечной ДНК бактериофаги, например, Т7, T4 или L. Конечный успех Протокола в значительной степени зависит от выбранного узла клеток штамма ' s способность выдерживать условия суперинфекции. Если клетки хозяина неустойчивы под суперинфекция, или суперинфекции никогда не достиг, и лизис никогда не будет достигнуто в ходе этого критического этапа, то лучше приступить вырожденная лизис протокол. Это включает в себя разделение сотовой мусора через высокоскоростной центрифугирования и ФАГ гранулирование на ultracentrifugation скоростях. Все следующие условия и параметры предназначены в качестве общей отправной точки. Оптимальные условия для локального хоста клеток линии могут быть разными; определить и соблюдать соответствующие условия.

  1. Подготовить прививка клетки
    1. инокуляции 10 мл Бертани Лурия (LB) СМИ в трубке культуры 15 мл с E. coli клеток хозяина, например, B или K12.
    2. Место в шейкере, равным 250 об/мин и 37 ° C. оставить на ночь вырастет до насыщения.
  2. Сингл доска, фаг мульти цикл роста и концентрация
    1. подготовить тарелку компетентных Фаговые бляшки, теплый несколько LB-агар пластин при 37 ° C за 1 ч, или на ночь.
    2. Подготовить несколько разведений Фаговые акций (например, Т7, T4 или L) известной концентрации LB средств массовой информации, направленных на ~ 10 2 -10 3 ФАГ/мл.
    3. Добавить 100 мкл ночь роста клеток концентрированной хозяина к каждой табличке.
    4. Выбрать тома подготовленных Фаговые разведений соответствующий диапазон от 10-100 Фаговые/пластины. Добавьте необходимый объем Фаговые разведений на каждой пластине (например, 100 мкл 10 3 ФАГ/мл; это следует производить ~ 100 бляшки). Инкубировать пластины при 37 ° C и начать таймер-вверх (+ 0 h). Инкубируйте 4-5 ч.
    5. Подготовить 49 мл LB СМИ в 250 мл флакон и место в Ротари шейкер, равным 250 об/мин и 37 ° C.
    6. На + 2,5 ч, разбавляют клеток 50 x, добавив 1 мл насыщенного клеточной культуры от ночи роста в подогретым флакон, содержащий 49 мл LB среднего. После того, как клетки прирост журнала (+ 4-5 ч), измерения оптической плотности на 600 Нм (600 OD). Определить концентрацию клеток с использованием преобразования ОД 600 1,0 = 8 x 10 8 клеток/мл.
    7. Развести до 2 x 10 7 клеток/мл с помощью дополнительных фунтов роста средств массовой информации. Снять пластину агар, содержащий Фаговые бляшки из инкубатора. Немедленно используйте в конце стерильные пипетки Пастера для основных и удалить один налет. Удар бляшки в разреженных клетки и инкубировать при 37 ° C для дополнительных 2 h (+ 6-7 ч) и.
    8. Тест для полного инфекции, приняв 500 мкл пример в 1,5 мл, добавление 10 мкл хлороформ (3 КХКЛ) и сразу же vortexing на высокой скорости. Соблюдайте, если решение прояснил. После того, как клетки полностью инфицированных, инкубировать еще 2 h (+ 8-9 h).
      Примечание: Если клетки полностью инфицированы, они будут быстро лизируют (< 2 мин) и уточнить решение. Другие исходы, считаются обсуждения ниже в разделе. Клетки будут superinfected, но не будет лизируют вплоть до этой точки. Если лизис начинается, DNase и уборки центрифугированием должны немедленно приступить к предотвращению деградации ФАГ.
    9. Добавить DNase 5 мкг/мл и центрифуги клеток на 8000 x g при 4 ° C для пеллет. Выбросите супернатант. Ресуспензируйте Пелле в 10 мл магния хлорида 1 x TRIS (TM) (50 мм трис при pH 7,8, 10 мм MgCl 2) буфер с 5 мкг/мл DNase. Добавьте 500 мкл КХКЛ 3 и вихрь на высокой скорости, чтобы лизировать клетки. Уточнить центрифугированием при 12000 g x 10 мин на 4 ° C. Decant супернатант в 15 мл Конические трубки и хранить при 4 ° C.

2. Очистка фага

Примечание: сахароза очистки в значительной степени зависит от размера ФАГ. Соображения для массы Фаговые быть изолированы должны быть сделаны и корректировки градиента условий выполнено. Окончательный вирусный титры свыше 10 13 Фаговые/мл легко достижимы с помощью этого метода.

  1. Подготовить 12 мл 5% и 45% w/v сахарозы в 1 x ТМ буфера.
  2. Подготовка 4 x 5-45% сахарозы градиенты дозирования 2,5 мл 45% сахарозы в 4 ультрацентрифуга трубы. Топ с ~ 2,6 мл 5%-ая сахароза, останавливаясь, когда жидкости достигает 2 мм от края трубки.
    Примечание: Поместите наконечник пипетки контакт с поверхностью раствора сахарозы и очень медленно обойтись жидкость. Легче раствора сахарозы будет плавать на верхней части тяжелее, образуя различные границы. Должным образом слоистых решение будет иметь интерфейс ~ 1 мм, если против фона света.
  3. Mix градиентов наклон труба вращения с помощью градиента, образуя инструмент для 43 s 86 ° при 23 об/мин. При необходимости не сразу, покрыть пленкой парафина и хранить при 4 ° C.
  4. Удалить 500 мкл от верхней части каждого подготовленного градиента сахарозы с 1 мл дозаторов и баланса в пределах ± 0,002 г.
  5. Бассейн Фаговые суспензий от всех трубок (шаг 1.2.9). С помощью пипетки 1 мл, добавьте 500 мкл суспензии путем привлечения кончик контакт с поверхности жидкости и очень медленно дозирования тома на вершину сахарозы градиента, будьте осторожны, чтобы не смешивать через быстрое закупорить. Центрифуга на 70000 x g 20 мин при 4 ° C.
    Примечание: Баланс подготовленных градиентов для в пределах ± 0,002 г. меньше бактериофаги может занять до 1 ч.
  6. Удалить Фаговые полос с использованием стерильных шприцев и тупой канюлей.
    Примечание: Если смотреть со стороны, Фаговая группа будет густой и Млечный по сравнению с окрестностями, около 5 мм в высоту и находится на полпути вниз по трубе центрифуги.
    1. Submerge тупым канюли в раствор до тех пор, пока кончик центрируется в верхней полосе ФАГ. Удаление группы, опираясь на поршень шприца, до тех пор, пока большинство Фаговая группа была удалена.
  7. Добавить объем сахарозы с отсрочкой Фаговые 3-4 ультрацентрифуга трубы. Добавьте не более чем 1,5 мл. Заливка-~ 3-4 мм от верхней части трубки с холодной 1 x ТМ. Покрытие пленкой парафина и инвертировать смешивать. Место обратно в ультрацентрифугирования и спина на 145 000 x g за 1 час при температуре 4 ° C для окатышей. Меньшие бактериофаги может занять до 2-х.
  8. Быстро слить супернатант и слейте вниз на одноразовые салфетки. Протрите внутри трубки с стерильным ватным тампоном удалить избыток супернатант.
  9. Делят 200-400 мкл холодной 1 x ТМ всей гранулы и Ресуспензируйте на ночь при 4 ° C; не встряхивания требуется.
    Примечание: Если гранулы не является чистым, мембраны, например, тягучий бит ДНК и т.д., бассейн и выполнить дополнительные центрифугирования в microcentrifuge на 17.000 x г.
  10. За день до приготовления титры, подготовить культуры клеток хозяина E. coli в 10 мл LB роста СМИ и оставить в тряску инкубатора, равным 250 об/мин, 37 ° C ночь. Инкубировать соответствующее количество культуры пластин при 37 ° C для по крайней мере 1 час прежде чем титры акций ФАГ.
    Примечание: Количество пластин для инкубации зависит количество разведений акций Фаговые покрываемые: каждый уникальный разрежения Фаговые запасов требует двух пластин культуры (например, четыре различных разведениях Фаговые запасов требуют восемь культуры пластин).
  11. Подготовить 100 мл Топ агар, добавив 2.5 g LB и 0,6 г bacto агар бутылка 100 мл. Растворяют твердые в деионизированной воде в объем 100 мл и автоклав. После автоклава, медленно инвертировать бутылку 6 - 8 раз для гомогенизации агар во всем решении. Поместите бутылку в ванну с водой 45 ° C на 15-20 минут, чтобы сбалансировать температуры .
  12. Подготовить серийный разрежения Фаговые запасов с решением LB.
    1. Добавить 990 мкл фунтов до 10 мкл Фаговые сток для 100-кратного разбавления. Вортекс для гомогенизации. Для разбавления фактор 10, добавить 100 мкл акций Фаговые 900 мкл LB. Vortex для гомогенизации.
    2. Повторять выше серии разрежения, как столько раз, сколько необходимо для получения Счётное количество бляшек (10-100 бляшки).
      Примечание: Для достижения этой цели, разбавляют фага запас 2-3 порядка меньше ожидаемого Фаговые доходность с точки зрения реакции Фаговые/мл. Например, если запас особое ФАГ содержит 10 11 инфекционные Фаговые/мл, пластины Фаговые запасов на 10 8-фолд или 10 9-сложите разрежения.
  13. Подготовить площадью для Фаговые титры, монтаж 14 мл культуры трубы (количество трубок культуры равно количество запасов разведений Фаговые покрываемые). Место разреженных Фаговые Фондовый Образцы из шага 2.12 и бактериальной клетки хозяина от шага 2.10 на льду
  14. Подготовить основной микс, закупорить 5,25 мл Топ агар (шаг 2.11), 220 мкл разбавленный Фаговые образцы (шаг 2.12), и 50 мкл хост бактериальной клетки (шаг 2.10) к культуре 14 мл трубки. Крышка трубки культуры и вихрь на высокой скорости.
    1. Сохранить оставшиеся Фаговые решение на 4 ° C.
  15. Получить две культуры пластины (шаг 2.10) из инкубатора 37 ° C. Добавьте 2,5 мл мастер смеси медленно в центр первой пластины (без пузырей). Осторожно поверните пластину вручную, чтобы равномерно распределить Мастер микс, так, что он охватывает всю культуру пластины. Повторите с второй пластины. Подождите 20 минут для обеспечения затвердевание верхней агар. Инкубировать пластин при 37 ° C для 4-7 ч.
  16. Рассчитывать бляшек и определить концентрацию Фаговые для каждого образца, реакция.
    Примечание: Таблички будет отображаться как ясно круги 1-2 мм в непрозрачный ковер клеток хозяина. Смотрите Рисунок 1 для представителя результаты. Успешный Фаговые производства приведет к окончательной концентрации 10 12 -10 13 Фаговые/мл.

3. Double-stranded экстракции ДНК генома

Примечание: разбавление, тряска, и центрифугирования шаги должны быть оптимизированы для разработки толстых, прочной белка пограничный слой между фенола и водной фаз. Это создает высокой чистоты геномов, которые свободны от белковых загрязнений. Первоначальный разрежения зависит окончательный Фаговые титр. Чрезвычайно высокий титр Фаговые складе (≥ 10 13 Фаговые/мл) может понадобиться 10-20 раз разбавления до извлечения, в то время как низкий титр запасов (~ 10 10 -10 11 Фаговые/мл) может потребоваться только 2 раза или нет. Если это трудно сформировать слой твердого протеина в последующих шагах или водной суспензией слишком липким удачным из-за высокой концентрации ДНК, рассмотрим выше разрежения Фаговые запасов для продолжения добычи. На любом этапе обработки генома, важно использовать широкий родила наконечники, когда закупорить любой водной фазы. Многие Фаговые геномов довольно большой и легко фрагментированных через пипетку стрижки. Кроме того, любой vortexing следует прямо избегать, поскольку это будет сильно наклонить геномы.

  1. Разбавлять часть Фаговые акций от шага 2.9 до 400 мкл с 1 x ТМ буфера в свежий 1,5 мл.
  2. Добавить равное количество Tris:Phenol:Chloroform разбавлением. Взбалтывают смесь осторожно на лабораторных рокер, или вручную, для 5 минут центрифуга результирующая эмульсии на 17.000 x g в настольная центрифуга для 5-10 мин
    Примечание: Собственный, белый белка слой на поверхности этапа основной фенол присутствует.
  3. Удалить верхний водной фазе к новой пробке, стараясь не нарушить межфазной границы.
  4. Повторите шаги 3.2-3.3 еще 2 раза для в общей сложности 3 извлечение фенола. Передать свежие трубки водной фазе и добавить равное количество КХКЛ 3. Встряхните и центрифуги (шаг 3.2). Передача водный образец ДНК чистую пробирку.
  5. Оценить объем очищенная ДНК. Добавление 0.4 объемов ацетат натрия 3 M (CH 3 COONa) и 3 тома 95% этанола (EtOH). Место в морозильной камере-20 ° C для ночи осадков. Центрифуга на 17.000 x g в настольная центрифуга для 10-15 мин
    Примечание: Немедленно ДНК обезвоживает и становятся видимыми как массы в виде суспензии в трубку. Надлежащего результате гранулы белого и упакованном виде против нижней части трубки.
  6. Снимите и выбросьте супернатант сцеживать или закупорить. Добавьте 500 мкл 70% EtOH и осторожно встряхивайте трубку до тех пор, пока гранулы плавает свободно от нижней части трубки. Центрифуги на 17.000 g x 5 мин удалить и сбросить EtOH, заботясь, чтобы не нарушить гранулы.
  7. Повторить шаг 3,6. Воздух сухой гранула на benchtop за 30-60 мин добавьте 50 мкл ddH 2 O пеллеты и инкубировать 1 час на RT или на ночь при 4 ° C до Ресуспензируйте. Определение концентрации ДНК, используя измерения поглощения на 280 nm.
    Примечание: Ожидаемые концентрации, 0.5-5 мкг/мкл, используя эту технику. Разделите общее геномной молекулярный вес для определения концентрации окончательный генома.

4. Ячейки бесплатные Фаговые реакции и ФАГ титр эксперимент

  1. подготовить 25 g LB средний и 15 г bacto агар твердых, залейте 1 Л бутылку и Добавьте деионизированной воды до 1 л автоклава.
  2. После стерилизации, инвертировать бутылку медленно 6 - 8 раз позаботиться, чтобы избежать образования пузырьков. Инверсия бутылка будет гомогенизировать агар твердой на протяжении 1 Л раствора. Поместите бутылку в ванну воды 58 ° C 20 минут перед подачей на культуры пластин.
  3. После того, как температура раствора LB-агар достижение равновесного уровня, подготовить пламени рядом с культуры пластин для стерилизации окружающей среды возле плиты открытой культуры. Держите бутылку 1 Л на водяной бане, чтобы избежать затвердевания агар делая аликвоты. Добавьте 25 мл в 100 мм x 15 мм культуры плиту. 1 Л будет производить 40 культуры пластин.
  4. Выделить одну плиту культуры и пусть затвердеть для по крайней мере 1 час на RT; эта пластинка будет использоваться для покрытия клетки хозяина. Пусть другие 39 культуры пластин затвердеть в течение 2 дней на RT. магазине на 4 ° C или немедленно использовать для изготовления титры.
  5. Пластина клеток хозяина, мелирование соответствующие бактериальный штамм (например, хост B для T7) который хранился при температуре-80 ° C, на плиту LB-агар культуры. Полоса рядом с открытым огнем, чтобы избежать загрязнения окружающей среды. Инкубируйте на ночь на 37 ° C. Клетки хозяина имеют не антибиотикорезистентности, поэтому работает в стерильных условиях важно.
  6. Реакции клеток свободный
    Примечание: Реакции свободных клеток TXTL состоят из 33% сырой E. coli экстракт (8,9-9,9 мг/мл белка) с другими 67% состоит из буфера и ФАГ генома реакции. Незрелая выдержка подготовлена как ранее описанных 15 , 16. Условия окончательного реакции являются: белки 8,9-9,9 мг/мл (от сырой экстракт), 3-6 мм Mg глутамата, 40-100 мм K-глутаминовой кислоты, 2-4% PEG 8000, 3-4 мм каждой аминокислоты, подготовленных как описано 17 и энергии микс, описанного решения ранее 15, состоящий из 0,33-3.33 мм DTT, 50 HEPES, АТФ и ГТФ, 1,5 мм 0.9 мм CTP и UTP, 0,2 мг/мл tRNA, 0.26 мм CoA, 0,33 мм NAD, 0,75 мм лагерь, 0,068 мм folinic кислоты, спермидина 1 мм и 30 мм 3-PGA. Бактериофаги ДНК типа требуют генома концентрации 0,5-10 Нм и бактериофаги РНК типа требуют широкий спектр 50-150 Нм. Концентрации окончательной реакции являются уникальными для конкретного Фаговые синтезируется и будет падать в пределах диапазонов, описанных выше. Для оптимального оксигенации реакций окончательный реакции тома должно составлять 10-20 мкл. Есть небольшие вариации в протоколе реакции, которые зависят от формы геномной молекулы. Например линейный геном молекул требуется дополнительный компонент в реакции подавляют пищеварение линейной части ДНК в сырой экстракт ферментом recBCD.
    1. Полная " реакции детали " раздела в таблице 1 (PhageTXTL_JOVE), указав общее количество реакций и окончательный объем реакции.
    2. Дизайн эксперимент путем определения постоянных компонентов и переменных компонентов реакции. Введите процент дробных объем Мастер микс, который представляет собой отношение общего объема постоянной реакции компонентов продукта окончательной реакции объем и количество выборок. Введите фондовых и окончательный концентрации реагентов реакции в " Master Mix реакции рецепт " раздел в PhageTXTL_JOVE. Введите фондовых и окончательный концентрации переменной reagent(s) тестируемых.
      Примечание: Объемы реакции компонентов будут автоматически рассчитываться на основе объема основной микс и окончательный объем каждой индивидуальной реакции.
    3. Удалить необходимое количество трубок (указано в " трубы таять " раздел PhageTXTL_JOVE.xlsx) сырой сотовый экстракт, буфер энергобаланса и смеси аминокислот от-20 ° C или ° C-80 и оттепели на льду
      Примечание: После размораживания, объединить несколько аликвоты из как компоненты (при необходимости).
    4. Алиготе указывается объем сырой экстракт, 33% от объема окончательной реакции, в пробки microcentrifuge.
    5. Подготовить основной смеси согласно таблице 1. Гомогенизации всех компонентов под " Master Mix реакции рецепт " на vortexing. Добавьте соответствующий объем каждого компонента незрелая выдержка.
    6. Если работаете с Фаговые с линейной ДНК генома (например, T7), добавить 1 мкм Гам белка Бактериофаг лямбда реакции 11. Вихрь однородный раствор, и место реакции на льду на 5 мин. Это тормозит пищеварение линейной части ДНК, recBCD комплекс, который эндогенного в сырой экстракт.
    7. После добавления последнего компонента согласно таблице 1, гомогенизировать реакции на vortexing. Разделение мастер смесь в n microcentrifuge трубок.
      Примечание: Объем каждого Сплит-продукт процент объема дробных мастер смесь и окончательный объем реакции. Например, процент объема дробные мастер смесь 90% и окончательной реакции объем 12 мкл, объем каждого Сплит-10,8 мкл.
    8. Добавить указанные объемы переменных компонентов в массив главный микс (см. таблицу 1). Добавьте воду каждой реакции, чтобы достичь объема требуемой окончательной реакции. Однородный каждой реакции на vortexing. Инкубировать microcentrifuge трубы на 29 ° C в течение по крайней мере 8 часов или на ночь.
  7. Принимающей ячейки до культуры
    Примечание: ночь перед культура является разреженных прочитанных обеспечить клеток хозяина, используемые для эксперимента, титр в середине журнала фазе, что повышает эффективность инфекции. Середина журнала клетки затем повторно сосредоточены в 10 раз и хранится на льду.
    1. С помощью кончика стерильной пипеткой, прививать культуру трубки 5 мл LB с 3-5 здоровых принимающей ячейки колоний. Работа рядом с открытым огнем, чтобы избежать загрязнения.
    2. Инкубировать культуры трубку в тряску инкубатора при 37 ° C и 250 об/мин для 16 h или на ночь. Клетки могут достичь этапа насыщения на следующий день.
  8. Принимающей ячейки культуры и образца подготовка к ФАГ титр
    1. обойтись 50 мл фунтов в колбу Эрленмейера 500 мл и крышка с алюминиевой фольгой. Теплый настой при 37 ° C 20 мин
    2. Аликвота 1 мл принимающей ночи до культуры клеток в подогретым инкубировать фунтов за 3-4 ч при 37 ° C и тряски на 250 об/мин.
    3. Центрифуга клеточной культуры принимающей 50 мл на 10 мин на 5000 x g. отбросить фунта
    4. Ресуспензируйте лепешка с холодной (4 ° C) 5 мл LB и держать на ДВС.
    5. За один час до начала эксперимента титр, инкубировать культуры пластин при 37 ° с.
      Примечание: Каждый уникальный Фаговые реакции (и соответствующий коэффициент разрежения) будет использовать две пластины. Кроме того, инкубировать 4 пластины для экспериментальных элементов управления (см. Рисунок 1 для представителя положительной и отрицательной контроля).
    6. Подготовить 100 мл Топ агар (шаг 2.11).
  9. Подготовить серийный разрежения свободной ячейки реакции с LB решение, как описано в разделе 2.12.
  10. Бактериофаг титр
    Примечание: Начинают пластины после культуры блюда инкубированы для по крайней мере 1 час и топ агар в водяной бане 45 ° C на 15-20 мин после удаления из автоклава.
    1. Титр окончательного свободной ячейки реакции LB решение, как описано в разделе 2, шаги 2.14-2.16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Мы покажем четыре представителя результаты. На рисунке 1, мы представляем набор негативных элементов управления для обеспечения, что клетки-TXTL системы и запасы ДНК фага не загрязнены живых клетках E. coli . Мы убедитесь, что клетки-TXTL системы является свободной от нетронутыми E. coli ячейки загрязнения путем покрытия обоих не инкубировали и инкубируют реакция решение недействительным геномной ДНК (Рисунок 1A и 1 рисунокB). Если ячейка-TXTL системы был загрязненных клетках E. coli , рост будет соблюдаться на плите. Кроме того мы проверяем, что реакция клеток бесплатно и поэтому не каких-либо возможных загрязнений клетки, отвечают за синтез ФАГ, покрытие не инкубировали и инкубируют реакции с геном фаг (рис. 1C и Рисунок 1D). Пластины с не инкубировали реакции (рис. 1C) показывает нулевой зубного налета, а пластины инкубируют реакции (рис. 1D) показывает налета, о том, что система свободных клеток TXTL отвечал за ФАГ синтез.

Рисунок 2мы сравниваем однородной против assay металлической пластинкы неоднородное. Рисунок 2 B иллюстрирует градиент плотности доска через пластину культуры, которая является оптимальным по сравнению с однородной налета плотности плиты в рисунке 2A. Источник этого отметил, что результат от быстрого охлаждения мастер смесь Топ агар, выборки и принимающих бактериальных клеток когда обойтись на пластину культуры во время Фаговые титр часть эксперимента. Чтобы избежать неоднородных распространения Фаговые бляшки, убедитесь, что пластины культуры являются достижение равновесного уровня до 37 ° C перед началом эксперимента титр ФАГ.

Важнейшим шагом правильно рассчитывать бактериофаги является разбавить раствор Фаговые достаточно, чтобы получить между 50 и 200 металлических пластинк каждой пластины (рис. 3). Ниже этого диапазона трудно определить истинный статистики, и выше этот диапазон, металлические пластинкы перекрываются, предотвращая точных цифр. Количество бактериофаги, синтезируется в TXTL зависит от биохимических параметров, как концентрация солей (калия и магния), молекулярные crowders и геномов. На рисунке 4мы покажем несколько примеров тестов для бактериофаги T7 и ΦΧ174. Для фага, которая реплицирует ее ДНК, например Т7, мы отмечаем высокую эффективность Фаговые синтеза в реакции клеток бесплатно: три инфекционных бактериофаги синтезируются в геном молекулу в реакции. Можно ожидать более низкой эффективности реакции для фага, который не реплицируется ДНК, например ΦΧ174: отношение синтезированных инфекционных фага к молекула генома составляет 1:5.

Figure 1
Рисунок 1: Доска пробирного управления и успешной инфекционных Фаговые производства с использованием системы свободной ячейки реакции (CFR). (A) не генома была добавлена и не инкубации (0 мин как время инкубации) CFR была выполнена. Реакция была затем покрытием без узла E. coli. Результат показывает узел не жизнеспособных клеток загрязнение CFR. (B) не генома была добавлена и CFR инкубировали 12 h 29 ° c и покрытием без узла E. coli. Результаты показывают узел не жизнеспособных клеток загрязнение CFR, даже после инкубации. (C) 1 Нм генома с не инкубации CFR (0 мин как время инкубации) и покрыты принимающей E. coli. Результат показывает загрязнения не Фаговые генома решения. (D) 1 Нм генома включены и CFR инкубировали 12 h 29 ° c. и покрытием с принимающей E. coli. Результаты показывают успешных инфекционных Фаговые репликации в CFR. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Однородных и неоднородных распространения Фаговые реакции во время эксперимента титр. Возможный эффект выполнения Фаговые титр на культуре тарелки не достижение равновесного уровня при температуре 37 ° C является неоднородным распространение Фаговые реакции через пластину культуры. Хороший результат отображения однородное распространение Фаговые реакции показано на (A), где металлические пластинкы равномерно распределены по всей поверхности пластины. Югу оптимальный результат показан на (B), где в левой нижней части плиты культуры сосредоточены бляшек. Это может произойти с топ агар, фаг реакции и принимающей ячейки мастер смесь обойтись на пластину культуры, что не при температуре 37 ° C. Большинство мастер смесь затвердевает в регионе нижнего левого, и однородное распространение не является возможным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3 : Установка соответствующего разрежения фактором для титры реакции свободных клеток ФАГ. (A) Эта пластинка отображает разумно Счётное количество металлических пластинк. Коэффициент разрежения, используемый для титр часть эксперимента разбавленный доходность Фаговые реакции достаточно оставить Счётное количество бляшек на плите. И наоборот в (B) коэффициент разрежения была слишком низкой, в отношении доходности синтезированных ФАГ и должна быть скорректирована. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4 : Характеристика свободной ячейки синтеза бактериофаги ΦΧ174 и Т7. (A) количество синтезированных ΦΧ174 и бактериофаги T7 (ОРП/мл: plaque формирование единиц на миллилитр) как функция PEG 8000 концентрация в реакции свободных клеток, измеренная после 16 ч инкубации на 29 ° C. (B) количество синтезированных ΦΧ174 и T7 бактериофаги как функция концентрации магния глутамата в реакции свободных клеток, измеренная после 16 ч инкубации на 29 ° C. (C) количество синтезированных ΦΧ174 ФАГ как функция концентрации ДНК генома ΦΧ174 в реакции свободных клеток, измеренная после 16 ч инкубации на 29 ° C. (D) количество синтезированных фага Т7 как функция концентрации Т7 ДНК генома в реакции свободных клеток, измеряется после 16 ч инкубации на 29 ° C. Все планки погрешностей отображается являются стандартные отклонения три повторных испытаний. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Table 1
Таблица 1: состав реакции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

После технику в Чэнь, и др. 14 для ГФПК, критически важный шаг достигается при определении надлежащих условий для суперинфекции. Параметр, который наиболее близко контролирует штамм хост способность выдерживать суперинфекции часто является начальной концентрации заражение ФАГ. Клетки хозяина должны находиться в фазе логарифмического роста перед первичной инфекции с очень небольшим количеством ФАГ. В конце концов ФАГ также достигнет логарифмического роста, и цель заключается в том, чтобы позволить Фаговые цифры быстро опережать число ячеек, позволяя для нескольких копий ФАГ в каждой клетки-хозяина. Это переводит ячейку в квази стабильное состояние, где он не будет проходить lysis. Если это состояние не достигнуто, клетки проходят каскадные, вырожденная лизиса и освободить их вирусной нагрузки. Если суперинфекции не удается достичь с помощью выше начальной концентрации вирусных, ниже первоначального количества инфекции от десяти до принятия последующих попыток. Если Лизируйте клетки хозяина до сбора урожая и суперинфекции не достигнуто, немедленно приступить к отдельной очистки процедуры. Добавить DNase I-5 мкг/мл и 500 мкл КХКЛ3 для завершения всех клеточных лизис. Продолжайте вертеться на дополнительные 5 мин и затем центрифуги на 10000 x g для удаления сотовой мусора. Декантируют и центрифуги супернатант в 75 000 x g для 1-2 h Пелле ФАГ и Ресуспензируйте на ночь в буфере ТМ всего 1 x 1 мл при температуре 4 ° C без встряхивания. При тестировании с использованием небольшого количества клеток суперинфекция, это позволяет оценить, насколько близко клетки для лизиса, как быстро они лизируют когда подвергаются добавлен хлороформ. Если Лизируйте клетки и решение разъясняет почти мгновенно, стены клетки очень неустойчивы и клетки должны быть собраны немедленно для предотвращения крупномасштабных Каскад лизис. Если тест лизирует в течение 1-3 мин, большие объемы могут продолжать superinfect для до 2 часов, в зависимости от местных штамм E. coli в использовании. Если ячейки не лизировать в течение 5 мин, фаг роста не догнал рост E. coli и первичной инкубации следует продолжить. Снова выполните тест в 30-60 мин.

При очистки Фаговые на подготовленную сахарозы градиент, фаг будет отображаться как очень толстые, перламутровые полосы между одну треть и две трети пути вниз по трубе. Предполагая, сравнительно успешно лизис и клеточных остатков очистки шаг, могут существовать другие, светло полос, но ни одна из подобных плотности или размер. Большой, непрозрачные группа содержит ФАГ и должен быть удален из решения с стерильный шприц и тупой канюлей.

При запуске в третьем разделе протокола, свободных клеток реакции и ФАГ титр, лучше использовать свежие культуры пластин (менее чем одна неделя) для принимающей бактерии пластины (из шага 3.5), а также культуры пластин, используемых для анализа титр (от шага 3.21). Это будет способствовать сильнее рост клеток хозяина бактерии и более высокой эффективности инфекции для Фаговые титр. Фаговые культуры пластин необходимо предварительно инкубировали при 37 ° C как минимум 1 час перед началом Фаговые титр часть протокола. Без предварительной инкубации Фаговые культуры пластин Топ агар решение (содержащих синтезированные ФАГ и принимающих клеточной культуры) не будет распространять равномерно по всей поверхности плиты культуры. Вместо этого Топ агар решение однородно будет закрепить на поверхности (рис. 2b). Это увеличивает вероятность несколько бактериофаги, локализация в том же месте, что может вызвать занижен Фаговые доходности в реакции клеток бесплатно.

Каждая доска представляет событие одного синтезированных фага, заражение клетки-хозяина, репликация в пределах клетки-хозяина и лизировать клетки-хозяина. Бляшки расти в размерах в инкубационный период от клеток хозяина потомства Фаговые заражение соседа от первоначальной инфекции события. Если наблюдаются не бляшек, вполне возможно, что коэффициент разрежения в протоколе раздел 4.6 слишком высока, что приводит к низкой вероятностью, что любой синтезированных Фаговые заражает клетки-хозяина. Чтобы исправить это, уменьшить коэффициент разрежения по 3-4 порядка величины (или необходимости) и повторить эксперимент титр. И наоборот коэффициент разрежения может быть слишком высокой, что приводит к бляшек охватывающих всю поверхность пластины культуры, что делает невозможным подсчитать доходность ФАГ. В этом случае Увеличьте коэффициент разрежения по 3-4 порядка величины (или необходимости). Для хорошо изученных фага выход реакции свободных ячеек будет известна и коэффициент разбавления только один на точку реакция будет необходимо для эксперимента, титр. При характеристике новые Фаговые, лучше 2-3 различных разрежения факторов на точку реакции, обеспечивая, что один из разведений даст Счетной доски (см. Рисунок 3 различия между счетным и несчетное количество бляшек на тарелку).

Если нет налета наблюдается после изменения коэффициент разбавления Фаговые титр, это может означать, что реакция свободных клеток была неудачной, в том, что выражение гена не происходит. Возможное объяснение для этого могут быть структурные повреждения реагенты/Фаговые ДНК из-за гомогенизацией реакции свободных клеток, vortexing. Чтобы устранить эту проблему, повторите реакции и гомогенизации, осторожно нажав реакции трубки пять-семь раз с пальцем, или смешивая медленно реакции с пипеткой пять-семь раз.

Бесплатный сотовый реакция системы исходит от кишечной палочки и эндогенно содержит РНК-полимеразы кишечной палочки и основным фактором Сигма, Сигма 70, которые образуют Холофермент необходимо признать консенсуса основным инициатором последовательности генов E. coli . Кроме того свободных клеток реакции системы можно резюмировать весь Сигма фактор транскрипции схема экзогенно предоставляя шесть других генов Сигма фактор кишечной палочки под последовательность консенсуса промоутер sigma 70. Это позволяет возможность обобщить все бактериофагов, чьи геномов совместимы с E. coliтранскрипция/перевод машин. Это оставляет подмножество бактериофага, не изучал или синтезируются с системой реакции свободных клеток, использованы здесь.

Клетки свободный транскрипция/перевод платформа позволяет впечатляющий уровень контроля и гибкости условий реакции, по сравнению с в vivo методами исследования. Мы можем тонко настраивать множество биохимических и генетических компонентов реакции ФАГ и непосредственно наблюдать эффекты в менее чем 24 часа, как показано на рисунке 4 , для молекулярного скученности. Влияние молекулярной crowders, таких как привязки, на самостоятельной сборки макромолекулярных комплексов были теоретически описаны и продемонстрировал в vitro18,19,20. Молекулярные вытеснения является энтропии управляемый механизм, который увеличивает постоянная ассоциация крупных биомолекулярных структур. Клетки свободный подход позволяет исследователю зонд сложных биологических процессов, как биофизика самостоятельной сборки с модели систем, таких как бактериофагов, без встроенных ограничений в естественных условиях работы.

Эта платформа также позволяет для изучения полезности бактериофагов в прикладных областях. Компоненты Фаговые геномов может многоцелевых и быстро испытание в свободных клеток реакции системы с целью включения результатов Роман наноструктур. Бактериофаги могут быть изменены с целью повышения селективности принимающей ячейки инфекции, которая будет способствовать утилита ФАГ терапии в качестве альтернативы для устойчивых к антибиотикам бактерий.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют следующие конкурирующих финансовых interest(s): Noireaux лабораторных исследований средства получает от MYcroarray, дистрибьютор kit выражение протеина, клетки бесплатно MYtxtl.

Acknowledgements

Этот материал основан на работе, поддерживаемых управлением военно-морских исследований премии номер N00014-13-1-0074 (в.н.), человека пограничной науки программы предоставить номер RGP0037/2015 (в.н.), и двусторонний научный фонд предоставить 2014400 (в.н.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1, (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3, (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1, (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106, (4), 048104 (2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7, (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69, (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58, (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10, (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics