Syntese av smittsomme Bacteriophages i en E. coli -basert Cell-free uttrykk System

Bioengineering

Your institution must subscribe to JoVE's Bioengineering section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

En ny generasjon av celle-fri transkripsjon-oversettelse er konstruert for å konstruere biokjemiske systemer i vitro gjennom utførelsen av genet kretser. I denne artikkelen beskriver vi hvordan bacteriophages, som MS2, ΦΧ174 og T7, er synthesized fra sine genom bruker en alle E. coli cellen uten TXTL systemet.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Rustad, M., Eastlund, A., Marshall, R., Jardine, P., Noireaux, V. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (126), e56144, doi:10.3791/56144 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

En ny generasjon av celle-fri transkripsjon-oversettelse (TXTL) systemer, konstruert for å ha en større fleksibilitet og modularitet, gi romanen evner å utføre grunnleggende og anvendt vitenskap i reagensglasset reaksjoner. Det siste tiåret blitt celle-fri TXTL en kraftfull teknikk for et bredt spekter av romanen tverrfaglig forskning områder knyttet til kvantitative og syntetisk biologi. De nye TXTL plattformene er spesielt nyttig å konstruere og avhøre biokjemiske systemer gjennom utførelsen av syntetiske eller genet kretser. In vitro TXTL har vist praktisk å raskt prototype regulatoriske elementer og biologiske nettverk som recapitulate molekylær selvtillit forsamlingen mekanismer funnet i levende systemer. I denne artikkelen beskriver vi hvordan smittsomme bacteriophages, som MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), og T7 (dsDNA), er helt synthesized fra sine genom i ett-potten reaksjoner med en alle Escherichia coli, celle-ledig TXTL system. Syntese av de tre coliphages er kvantifisert bruker plakk analysen. Vi viser hvordan avkastningen av syntetisk phage avhenger av biokjemiske innstillingene av reaksjoner. Molekylær trengsel, emulert gjennom en kontrollert konsentrasjon av PEG 8000, påvirker hvor mye syntetisk phages av bestillinger av størrelsen. Vi beskriver også hvordan du forsterke phages og hvordan å rense deres genomer. Protokoller og resultatene som presenteres i dette arbeidet skal være av interesse for tverrfaglig forskere involvert i celle-fri syntetisk biologi og bioteknologi.

Introduction

Det siste tiåret, er celle-frie uttrykk teknologien konstruert for å adresse novel søknader i emergent tverrfaglig forskning områder knyttet til syntetiske og kvantitativ biologi. Opprinnelig brukt til å uttrykke proteiner uavhengig av en levende organisme, er nye cellen uten TXTL systemene utviklet for både grunnleggende og anvendt vitenskap1,2, utvide betydelig omfanget av denne teknologien. Den nye generasjonen av TXTL er utformet for å være brukervennlig, mer effektiv (nå 2 mg/mL av proteinsyntese i satsvis modus3), mer allsidig på nivå med transkripsjon4og modulbasert slik enkelt integrere romanen naturlig eller syntetiske funksjoner som utvider funksjonaliteten til eksisterende biologiske systemer5,6. Spesielt har celle-fri TXTL-systemer blitt hendig for rask prototyping genetiske programmer, for eksempel regulatoriske elementer eller liten genetisk kretser7,8,9, ved å redusere design-bygge-test Bla til noen dager. Bemerkelsesverdig, nye TXTL systemene er også i stand til å behandle store DNA programmer som fullstendig syntese av coliphages10,11, demonstrere sterke nok forestillinger å støtte rekonstituering aktiv genomisk DNA kodet levende enheter.

TXTL systemer presenterer mange tekniske fordeler sammenlignet med tradisjonelle i vitro konstruktiv biokjemiske analyser. Cellen gratis TXTL linker prosessen av genuttrykk til det endelige produktet i en redusert og åpent miljø, i motsetning til komplekse cytoplasm i en levende celle. TXTL bruker DNA rekonstruere biokjemiske systemer i vitro, som med moderne DNA montering teknikker, er rimelig og rask i tillegg ikke krever kresne protein rensing trinnene. Celle-frie uttrykk gir direkte tilgang til de fleste av komponentene i de biokjemiske reaksjonene, slik at en dypere Disseksjon av molekylære interaksjoner12. En TXTL reaksjon, kan man endre biokjemiske og Biofysiske innstillingene på vilje, som er nesten umulig i en levende celle. Gitt disse fordelene og nylige forbedringer, blir TXTL teknologien mer og mer populær som en alternativ plattform for syntetiske og kvantitativ biologi. Mens forskningen fellesskapet med TXTL er raskt voksende og TXTL blir en standardteknologi i bioteknologi, er det viktig å forstå hvordan man bruker slike plattformer for å utvikle tilstrekkelig praksis knyttet til gjennomføringen av TXTL reaksjoner og til den tolkning av resultatene.

I denne artikkelen beskriver vi hvordan du bruker en alle E. coli TXTL system for å syntetisere, i ett-potten reaksjoner, bacteriophages fra sine genom11, som MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), og T7 (dsDNA, 40 kb). Vi viser hvordan mengden phages syntetisert endringer med hensyn til noen av biokjemiske innstillingene av reaksjoner (magnesium og kalium konsentrasjoner). Molekylær trengsel, emulert gjennom et spekter av PEG 8000 konsentrasjoner har en dramatisk effekt på phage syntese over flere størrelsesordener. Realisering av slike store biokjemiske systemer i én reagensglasset reaksjoner som recapitulate samtidig prosessene av transkripsjon, oversettelse, og selv-montering, er interessant for adressering grunnleggende spørsmål knyttet til biologi og biofysikk 10 (gene regulering, selvtillit forsamlingen), så vel som for utvikling av programmer, for eksempel gjenbruk phage funksjoner for å bygge nye nanostrukturer13. I tillegg til en praktisk på TXTL gir vi metoder for phage forsterkning, genomet utvinning og rensing og phage kvantifisering av plakk analysen. Metodene i dette manuskriptet er aktuelle for forskere som E. coli ekstrakt basert celle-frie systemer og er interessert i bacteriophages.

Protokollene i dette arbeidet kan oppsummeres som følger: 1) Phage forsterkning (dag 1: forberede inoculation celler, dag 2: enkelt plakk, flere phage vekst, og konsentrasjon og dag 3: rensing av phage), 2) Double-strandet genomet DNA utvinning (fenol/kloroform ekstraksjon), og 3) Cell-free phage reaksjon og titer eksperimentet (dag 1: plate vertsceller og gjøre agar plater, dag 2: celle-fri reaksjon og verten celle før kultur og dag 3: verten celle kultur og phage titer).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Merk: de følgende forsterkning og utvinning metoden er hovedsakelig generalizable for mange double-strandet DNA phage, eksempelvis bacteriophage T7, enterobacteria phage T4 eller enterobacteria phage λ (L). De brukes hovedsakelig for en phage som genomet ikke er lett tilgjengelig for kjøp fra kommersielle kilder.

1. phage utvidelse

Merk: single-plakk, flere syklus (SPMC) phage produksjon teknikken er godt beskrevet for T4 phage i Chen, et al. 14 følgende phage forsterkning og DNA utvinning metoden er en generalisering for bruk med E. coli double-strandet DNA phages, f.eks, T7, T4 eller L. Den ultimate suksessen protokollen er sterkt avhengig av valgte verten celle belastningen ' s evne til å tåle superinfection forhold. Hvis verten cellene er ustabile under superinfection, eller superinfection er aldri nådd, og lyse er aldri nådd i denne avgjørende fasen, er det best å fortsette med en protokoll som confluent lyse. Dette inkluderer skille mobilnettet rusk gjennom høyhastighets sentrifugering, og phage pelleting med ultracentrifugation-hastigheter. Alle følgende betingelser og parametere er ment som generelle utgangspunkt. De optimale vilkårene for en lokal vert cellen linje kan være annerledes; bestemme og overholder de riktige betingelsene.

  1. Forberede Inoculation celler
    1. vaksinere 10 mL Luria-Bertani (LB) medier i en 15 mL kultur rør med E. coli vertsceller, f.eks B eller K12.
    2. Sted i en shaker 250 rpm og 37 ° C. la over natten å vokse til metning.
  2. Single-plakk, flere syklusen phage vekst og konsentrasjon
    1. for å forberede en tallerken med kompetent phage plaketter, varme flere LB-agar plater ved 37 ° C i 1 time eller over natten.
    2. Forberede flere fortynninger av phage lager (f.eks T7, T4 eller L) av kjente konsentrasjon i LB medier, satsing for ~ 10 2 -10 3 phage/mL.
    3. Legge til 100 µL av natten vekst av konsentrert verten cellene til hver plate.
    4. Velg volumer av tilberedes phage fortynninger tilsvarer et utvalg fra 10-100 phage/plate. Legge til den nødvendige mengden phage fortynninger hver plate (f.eks, 100 µL av 10 3 phage/mL, dette bør gi ~ 100 plaketter). Inkuber plater på 37 ° C og starte en tidtaker telle opp (+ 0 h). Inkuber for 4-5 h.
    5. Forberede 49 mL LB medier i 250 mL kolbe og sted i roterende shaker 250 rpm og 37 ° C.
    6. På + 2,5 t, fortynnet celler 50 x ved å legge 1 mL av mettet cellekultur fra overnatting veksten i en forvarmes kolbe som inneholder 49 mL LB medium. Når cellene når loggen vekst (+ 4-5 h), måle absorbans ved 600 nm (OD 600). Bestemme konsentrasjonen av celler ved hjelp av konvertering OD 600 av 1,0 = 8 x 10 8 cellen/mL.
    7. Dilute 2 x 10 7 cellen/mL bruker flere LB vekst medier. Fjerne agar plate inneholder phage plaketter settefiskanlegg. Umiddelbart bruke enden av en steril Pasteur pipette kjernen og fjerne en enkelt plakk. Blåse plakk i utvannet cellene og Inkuber på 37 ° C for en ekstra 2 h (+ 6-7 h).
    8. Test for full infeksjon ved å ta et 500 µL utvalg i en 1,5 mL tube legge 10 µL kloroform (CHCL 3) og umiddelbart vortexing i høy hastighet. Observer Hvis løsningen har avklart. Når cellene er fullt ut infisert, ruge for en annen 2 h (+ 8-9 h).
      Merk: Hvis cellene er fullt ut infisert, de vil raskt lyse (< 2 min) og avklare løsningen. Andre resultater er vurdert i diskusjonen delen nedenfor. Cellene vil bli superinfected, men vil ikke lyse opp til dette punktet. Hvis lyse begynner, DNase og høsting av sentrifugering må begynne umiddelbart å hindre phage fornedrelse.
    9. Legge til DNase til 5 µg/mL og sentrifuger cellene 8000 x g på 4 ° C pellets. Kast nedbryting. Resuspend pellets i 10 mL 1 x TRIS magnesiumklorid (TM) (50 mM Tris ved pH 7,8, 10 mM MgCl 2) buffer med 5 µg/mL DNase. Legg til 500 µL CHCL 3 og vortex i høy hastighet til lyse cellene. Avklare med sentrifugering 12.000 x g i 10 min 4 ° C. Decant nedbryting i en 15 mL konisk rør og butikk på 4 ° C.

2. Rensing av Phage

Merk: sukrose rensing er i stor grad avhengig av størrelsen på phage. Betraktninger for masse phage isoleres må gjøres og justere gradient forhold utført. Siste viral titers over 10 13 phage/ml er lett oppnåelig med denne metoden.

  1. Forberede 12 mL av 5% og 45% w/v sukrose i 1 x TM buffer.
  2. Klar 4 x 5-45% sukrose graderinger av pipettering 2,5 mL av 45% sukrose inn i 4 ultracentrifuge rør. Topp med ~ 2.6 mL av 5% sukrose, stoppe når væske når 2 mm fra kanten av røret.
    Merk: Plassere Pipetter i kontakt med overflaten av sukrose løsningen og veldig sakte dispensere væske. Lettere sukrose løsningen vil flyte over tyngre danner en distinkt grense. En riktig lagdelt løsning vil ha ~ 1 mm grensesnitt hvis holdt mot bakgrunnen lys.
  3. Blande graderingene av tilt-tube rotasjon bruker en forløpning danner instrumentet for 43 s på 86° 23 RPM. Hvis ikke umiddelbart behov, dekk med parafin film og lagre på 4 ° C.
  4. Fjerne 500 µL fra toppen av hver forberedt sukrose gradert 1 mL hindre og saldo innenfor ± 0,002 g.
  5. Pool phage suspensjon fra alle rør (trinn 1.2.9). Bruker en 1 mL pipette, legge til 500 µL av suspensjon ved å bringe spissen i kontakt med flytende overflaten og veldig sakte dispensing volumet på toppen av sukrose gradient, pass på å ikke blande gjennom rask pipettering. Sentrifuge 70.000 x g for 20 min på 4 ° C.
    Merk: Balanse forberedt graderingene til innenfor ± 0,002 g. mindre phages kan ta opptil 1 h.
  6. Fjerne phage band bruker sterile sprøyter og sløv kanyle.
    Merk: Sett fra siden, phage bandet vil være tykk og melkeaktig forhold til omgivelsene, ca 5 mm inne høyde, og ligger halvveis ned sentrifuge røret.
    1. Submerge en stump kanyle i løsningen til spissen er sentrert på aller øverste kanten av bandet phage. Fjerne bandet ved å tegne på sprøytestempelet til fleste phage bandet har blitt fjernet.
  7. Legge sukrose volumet med suspendert phage til 3-4 ultracentrifuge rør. Legge til mer enn 1,5 mL/t. Fyll til ~ 3-4 mm fra toppen av røret kaldt 1 x TM. Dekk med parafin film og Inverter for å blande. Tilbake i en ultracentrifuge og spinn 145.000 x g 1t på 4 ° C til pellets. Mindre phages kan ta opptil 2 h.
  8. Raskt hell av nedbryting og avløp opp ned på disponibel kluter. Tørk inn siden av rør med steril bomull swab å fjerne overflødig nedbryting.
  9. Dele 200-400 µL kaldt 1 x TM alle pellets og resuspend over natten på 4 ° C, ingen risting kreves.
    Merk: Hvis pellet ikke er feilfri, f.eks trevlet biter av membran, DNA, etc., basseng og utføre flere sentrifugering i en microcentrifuge på 17 000 x g.
  10. Dagen før titers, forberede en kultur av E. coli vertsceller i 10 mL LB vekst medier og la i en risting inkubator satt til 250 rpm og 37 ° C over natten. Inkuber riktig mengde kultur plater ved 37 ° C i minst 1 time før titers av phage aksjen.
    Merk: Antall plater å ruge er avhengig av antall fortynninger av phage aksje å være belagt: hver unike fortynning av phage aksjer krever to kultur plater (f.eks fire forskjellige fortynninger av phage lager krever åtte kultur plater).
  11. Forberede 100 mL top agar ved å legge til 2.5 g LB og 0,6 g bacto-agar en 100 mL flaske. Løs opp faste stoffer i deionisert vann i et volum av 100 mL og autoclave. Etter autoklav, sakte Inverter flasken 6 - 8 ganger til homogenize agar hele løsningen. Plasser flasken i 45 ° C vannbad i 15-20 min til equilibrate temperaturen .
  12. Klargjør fortsettelsene fortynning av phage aksjer med LB løsningen.
    1. Legge 990 µL LB 10 µL phage lager for en 100-fold fortynning. Vortex til homogenize. En fortynning faktor på 10, legge 100 µL phage aksjer til 900 µL lb Vortex til homogenize.
    2. Gjenta over fortynning serien så mange ganger som nødvendig for å oppnå en countable rekke plaketter (10-100 plaketter).
      Merk: For å oppnå dette, fortynne phage lager 2-3 størrelsesordener mindre enn forventet phage avkastning i forhold til phage/mL reaksjon. For eksempel hvis en bestemt phage lager inneholder 10 11 smittsomme phage/mL, plate phage aksjen på en 10 8-brett eller 10 9-brett fortynning.
  13. Forberede et område phage titers ved montering 14 mL kultur rør (antall kultur rør er lik antall phage lager fortynninger å være belagt). Plasser utvannet phage lager prøvene fra trinn 2.12 og vert bakterieceller fra trinn 2.10 på ice.
  14. Forberede en master blanding av pipettering 5,25 mL top agar (trinn 2.11), 220 µL fortynnet phage prøver (trinn 2.12), og 50 µL vert bakterielle celler (trinn 2.10) til en 14 mL kultur rør. Cap kultur tunnelbane og vortex i høy hastighet.
    1. Lagre gjenværende phage løsningen på 4 ° C.
  15. Hente to kultur plater (trinn 2.10) fra 37 ° C inkubator. Legge til 2,5 mL av master mix sakte til midten av første platen (uten bobler). Forsiktig rotere platen for hånd for å distribuere master blandingen jevnt slik at det dekker hele kultur plate. Gjenta med platen. Vente 20 minutter for å sikre herding av de øverste agar. Inkuber plater ved 37 ° C i 4-7 h.
  16. Teller plaketter og bestemme phage konsentrasjonen for hver reaksjon prøve.
    Merk: Plaketter vises som 1-2 mm klare sirkler i ugjennomsiktig teppet vert celler. Se figur 1 representant resultater. En vellykket phage produksjon vil resultere i siste konsentrasjoner av 10 12 -10 13 phage/mL.

3. Double-strandet genomet DNA utvinning

Merk: fortynning, risting, og sentrifugering skritt må være optimalisert for å utvikle en tykk, solid protein grenselag mellom fenol og vandig faser. Dette genererer høyeste renhet genomer som er fri for protein forurensninger. Den første fortynning er avhengig av den endelige phage titer. En ekstremt høy titer phage lager (≥ 10 13 phage/mL) må en 10-20-fold fortynning før ekstraksjon, mens lave titer aksjer (~ 10 10 -10 11 phage/mL) kan bare trenger en 2-fold eller ingen. Hvis det er vanskelig å danne en solid protein-laget i de etterfølgende trinnene eller vandig suspensjon for klissete å være gode på grunn av den høye DNA konsentrasjonen, vurdere en høyere fortynning av phage aksjer før du fortsetter utvinning. I noen genomet-håndtering trinn, er det viktig å bruke wide-fødte pipette-spisser når pipettering noen vandig faser. Mange phage genomer er ganske stor og lett fragmentert gjennom pipette klipping. I tillegg en vortexing bør unngås uttrykkelig som dette vil sterkt skråstille genomer.

  1. Fortynne en del av phage aksjer fra trinn 2.9 400 µL med 1 x TM buffer i en fersk 1,5 mL tube.
  2. Legge til en lik mengde Tris:Phenol:Chloroform fortynning. Riste blandingen forsiktig på en laboratorium rocker, eller for hånd, for 5 min. sentrifuge den resulterende emulsjonen 17000 x g i en Borstemmaskin centrifuge for 5-10 min.
    Merk: En distinkt, hvit protein lag på overflaten av den underliggende fenol fasen finnes.
  3. Fjerne den øvre vandige fasen slik ny ta vare ikke for å forstyrre interphase grenselinjen.
  4. Gjenta trinnene 3.2 3,3 ytterligere 2 ganger totalt 3 fenol utdrag. Overføre den vandige fasen til en frisk rør og legge til en lik mengde CHCl 3. Rister og sentrifuger (trinn 3.2). Overføre vandig DNA prøven til en ren tube.
  5. Beregne volumet av renset DNA. Legg 0,4 mengder 3 M natrium acetate (CH 3 COONa) og 3 mengder 95% etanol (EtOH). Plasser i 20 ° C fryseren for natten nedbør. Sentrifuger 17000 x g i en Borstemmaskin centrifuge for 10-15 min.
    Merk: DNA vil umiddelbart tørke og vises som en masse i suspensjon i røret. Det riktige resulterende pellet er hvit og godt pakket mot bunnen av røret.
  6. Fjerne og slette nedbryting av dekantere vin eller pipettering. Legge til 500 µL 70% EtOH og forsiktig rist røret til pellet flyter gratis fra bunnen av røret. Sentrifuge 17000 x g for 5 min. Fjern og kast EtOH, ta vare ikke forstyrre pellet.
  7. Gjenta trinn 3.6. Luften tørr pellet på Borstemmaskin for 30-60 min. legge 50 µL ddH 2 O til pellet og ruge 1t på RT eller overnatting på 4 ° C til resuspend. Bestemme DNA konsentrasjonen med absorpsjon målinger på 280 nm.
    Merk: De forventede konsentrasjonene er 0,5-5 µg/µL bruker denne teknikken. Dele den totale genomisk Molekylvekten å bestemme endelige genomet konsentrasjonen.

4. Cellen gratis Phage reaksjon og Phage Titer eksperimentet

  1. forberede 25 g LB medium og 15 g bacto-agar solid, hell i en 1 L flaske og legge deionisert vann til 1 L. Autoclave.
  2. Etter sterilisering, invertere flasken sakte 6 - 8 ganger å ta vare å unngå dannelse av bobler. Flaske inversjon vil homogenize agar solid hele 1 L løsningen. Plasser flasken i en 58 ° C vannbad for 20 min før utlevering på kultur tallerkener.
  3. Når temperaturen i LB-agar løsningen har equilibrated, forberede en flamme ved kultur platene å sterilisere omgivelser nær åpne kultur platene. Holde 1 L flasken i vannbad å unngå herding av agar mens dele. Legge til 25 mL i en 100 x 15 mm kultur plate. 1 L vil produsere 40 kultur plater.
  4. Sette en kultur plate og la stivne minst 1t på RT; denne platen skal brukes for plating verten cellene. La andre 39 kultur platene stivne for 2 dager i rett butikk på 4 ° C eller bruke umiddelbart for å lage titers.
  5. Plate verten cellene av striper riktig bakterielle belastningen (f.eks vert B for T7) som ble lagret ved-80 ° C, på LB-agar kultur plate. Strek ved siden av åpen flamme til forurensning i miljøet unngås. Ruge over natten på 37 ° C. Verten cellene har ingen antibiotikaresistens så det er viktig å arbeide i et sterilt miljø.
  6. Cell-free reaksjon
    Merk: Celle-fri TXTL reaksjonene består av 33% råolje E. coli ekstra (8.9-9,9 mg/mL protein) med de andre 67% består av reaksjon buffer og phage genom. Det rå ekstrakt er utarbeidet som tidligere beskrevet 15 , 16. Siste reaksjon er: 8,9-9,9 mg/mL protein (fra rå ekstrakt), 3-6 mM Mg-glutamat, 40-100 mM K-glutamat, 2-4% pinne 8000, 3-4 mM hver aminosyre, utarbeidet som beskrevet tidligere 17, og en energi mix løsning, beskrevet tidligere 15, består av 0,33-3.33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP og GTP, 0,9 mM CTP og UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM leir, fra 0.068 mM folinic syre, 1 mM spermidine og 30 mM 3-PGA. DNA-type phages krever genomet konsentrasjoner av 0,5-10 nM og RNA-type phages krever en rekke 50-150 nM. Siste reaksjon konsentrasjoner er unike for det bestemte phage syntetisert og vil falle innenfor beskrevet ovenfor. For optimal oksygenering av reaksjoner være siste reaksjon volumene mellom 10-20 µL. Det er små variasjoner i reaksjon protokoll, avhengig av form av genomisk molekylet. Lineær genomet molekyler krever for eksempel en tilleggskomponent i reaksjonen å hemme fordøyelsen av lineær DNA stykker av recBCD enzymet i det rå ekstrakt.
    1. Fullstendig den " reaksjon detaljer " delen i tabell 1 (PhageTXTL_JOVE) ved å angi antall reaksjoner og siste bindet reaksjon.
    2. Utforme eksperimentet ved å bestemme konstant komponenter og variabel komponenter av reaksjonen. Angi brøk volum prosenten av master mix, som er forholdet mellom det totale volumet av konstant reaksjon komponentene av siste reaksjon volumet og antallet eksempler. Angi lager og endelige konsentrasjoner av reaksjon reagenser i den " Master reaksjon oppskrift " delen i PhageTXTL_JOVE. Angi lager og endelige konsentrasjoner av den variable reagent(s) skal testes.
      Merk: Volum av reaksjon komponenter automatisk beregnes basert på master miks-volum og endelige volumet av hver individuelle reaksjon.
    3. Fjerne den nødvendige mengden av rør (angitt i den " rør å tine " delen av PhageTXTL_JOVE.xlsx) av råolje celle ekstrakt og buffer energimiksen aminosyre blanding av 20 ° C eller-80 ° C og tine på ice.
      Merk: Når tint, kombinere flere dele som komponenter (om nødvendig).
    4. Aliquot det angitte volumet av råolje ekstrakt, 33% av det endelige reaksjon volumet, inn i et microcentrifuge rør.
    5. Forberede master mix per tabell 1. Homogenize alle komponenter under " Master reaksjon oppskrift " av vortexing. Legge til riktige volumet for hver komponent i det rå ekstrakt.
    6. Hvis arbeider med en phage med lineær DNA genomet (f.eks T7) Legg 1 µM av gam protein av bacteriophage lambda reaksjon 11. Vortex homogenize løsningen og plassere reaksjonen på is 5 min. Dette hemmer fordøyelsen lineær DNA stykker av recBCD komplekset, som endogene i råolje utdrag.
    7. Etter den siste komponenten som tabell 1, homogenize reaksjonen av vortexing. Delt master mix inn n microcentrifuge rørene.
      Merk: Volumet av hver deling er produktet av brøk master mix volum prosent og det siste bindet av reaksjonen. For eksempel brøk master mix volum prosent av 90% og endelige reaksjon volumet av 12 µL, volumet av hver deling er 10,8 µL.
    8. Legge angitte volumene variabel komponentene til master mix array (se tabell 1). Tilsett vann til hver reaksjon å nå ønsket endelige reaksjon volumet. Homogenize hver reaksjon av vortexing. Inkuber microcentrifuge rør på 29 ° C i minst 8 timer eller over natten.
  7. Verten celle før kultur
    Merk: natten før kulturen er utvannet 50:1 å sikre at verten cellene som brukes for titer eksperimentet er i midten av Logg fase, noe som øker infeksjon effektivitet. Midten av Logg cellene deretter nytt konsentrert av 10-fold og lagret på is.
    1. Bruker et sterilt pipette tips, vaksinere en kultur tube 5 mL LB med 3-5 sunn verten celle kolonier. Arbeid ved siden av åpen flamme å unngå forurensning.
    2. Ruge kultur røret i en risting inkubator på 37 ° C og 250 rpm for 16 timer eller over natten. Celler kan nå metning fase av morgendagen.
  8. Vert celle kultur og prøve forberedelse til phage titer
    1. dispensere 50 mL LB i en 500 mL Erlenmeyer kolbe og dekk med aluminiumsfolie. Varme flasken ved 37 ° C i 20 min.
    2. Aliquot 1 mL av verten celle overnatting før kultur i forvarmes lb ruge for 3-4 h på 37 ° C og riste på 250 rpm.
    3. Sentrifuger 50 mL verten cellekultur i 10 min på 5000 x g. forkaste pund
    4. Resuspend pellets med kalde (4 ° C) 5 mL LB og holde på ice.
    5. En time før du starter eksperimentet titer ruge kultur platene på 37 ° C.
      Merk: Hver unike phage reaksjon (og tilsvarende fortynningsfaktoren) benytte to plater. I tillegg ruge 4 plater for eksperimentell kontroller (se figur 1 for representant positive og negative kontroller).
    6. Forberede 100 mL top agar (trinn 2.11).
  9. Forberede en seriell fortynning av celle-fri reaksjon med LB løsning som beskrevet i delen 2.12.
  10. Phage titer
    Merk: Begynner platen etter kultur retter har inkubert minst 1 h og den øverste agar var i vannbad 45 ° C i 15-20 min etter fjerning fra autoclave.
    1. Titer siste celle-fri reaksjon-LB løsning som beskrevet i del 2, trinn 2.14-2,16.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi viser fire representant resultater. I figur 1, presenterer vi et sett med negative kontroller slik at celle-fri TXTL systemet og phage DNA aksjer ikke er forurenset med levende E. coli celler. Vi bekrefte at cellen uten TXTL systemet er intakt E. coli celle forurensning av kontaktflate både en ikke-ruges og inkubert reaksjon løsning blottet for genomisk DNA (figur 1A og figur 1B). Hvis cellen uten TXTL systemet var forurenset med E. coli celler, ville vekst være observert på tallerkenen. Videre bekrefte vi at reaksjonen celle-fri og derfor ikke mulig miljøgifter celler, er ansvarlige for syntese av phage ved plating ikke ruges og inkubert reaksjoner med phage genomet (figur 1C og Figur 1D). Platen med ikke-ruges reaksjonen (figur 1C) viser null plakk mens platen med inkubert reaksjonen (figur 1D) viser plakk, viser cellen uten TXTL systemet var ansvarlig for phage syntese.

I figur 2sammenligne vi en homogen versus ikke-homogen plakk analysen. Figur 2 B illustrerer en gradering av plakk over kultur plate, som er sub-optimale i forhold til en homogen plakk tetthet av platen i figur 2A. Kilden til dette observert resultat er fra rask kjøling av master blanding av topp agar, prøve og vert bakterieceller når utlevert til en kultur plate under den phage titer delen av eksperimentet. For å unngå en ikke-homogen spredning av phage plaketter, kontrollerer du at kultur platene er equilibrated 37 ° c før du starter phage titer eksperimentet.

Et kritisk steg til riktig telle phages er å utvanne den phage løsningen tilstrekkelig å få mellom 50 og 200 plaketter per plate (Figur 3). Under dette området, er det vanskelig å fastslå sanne statistikk, og over dette området, plaketter overlappe, forebygge nøyaktig teller. Antall phages syntetisert i TXTL avhenger av biokjemiske innstillingene, for eksempel konsentrasjon av salter (kalium og magnesium), molekylær crowders og av genomer. I Figur 4viser vi noen eksempler på tester for phages T7 og ΦΧ174. For en phage som reproduserer sin DNA, som T7, vi observerer en høy effektivitet av phage syntese i celle-fri reaksjonen: tre smittsomme phages er synthesized per genomet molekyl i reaksjonen. Man kan forvente en lavere effektivitet reaksjon for en phage som ikke replikerer sin DNA, som ΦΧ174: syntetisert smittsomme phage til genomet molekylet er 1:5.

Figure 1
Figur 1: Plakk analysen kontroller og vellykket smittsomme phage produksjonen ved hjelp av en celle-fri (CFR) reaksjonssystemet. (A) ingen genomet ble lagt og ingen inkubering (0 min som inkubasjonstiden) CFR ble utført. Reaksjonen var deretter belagt uten vert E. coli. Resultatet viser ingen levedyktig verten celle forurensning av CFR. (B) ingen genomet ble lagt og CFR ble inkubert 12 h på 29 ° C og belagt uten vert E. coli. Resultatene viser ingen levedyktig verten celle forurensning av CFR, selv etter inkubasjon. (C) 1 nM genomet følger med ingen inkubasjon CFR (0 min som inkubasjonstiden) og belagt med verten E. coli. Resultatet viser ingen phage forurensning av genomet løsningen. (D) 1 nM genom inkludert og CFR ruges 12t på 29 ° C. og belagt med vert E. coli. Resultatene viser vellykket smittsomme phage replikering i CFR. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Homogen versus ikke-homogen spredning av phage reaksjonen under titer eksperimentet. En mulig effekt av utfører en phage titer på kultur platene ikke equilibrated til en temperatur på 37 ° C er ikke-homogen spredningen av phage reaksjonen over kultur plate. Et godt resultat viser en homogen spredning av phage reaksjonen vises i (A), der plaketter er jevnt fordelt over overflaten på platen. En sub-optimal resultatet vises i (B), der plaketter er konsentrert i nedre venstre del av kultur plate. Dette kan skje med topp-agar, phage reaksjon, og verten celle master blanding er utlevert til en kultur plate som ikke er ved en temperatur på 37 ° C. Flertallet av master mix stivner i regionen nederst til venstre, og en homogen spredning er ikke mulig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3 : Angi en passende fortynningsfaktoren for titers av en celle-fri phage reaksjon. (A) denne platen viser et rimelig countable antall plaketter. Fortynningsfaktoren for titer del av eksperimentet utvannet avkastningen av phage reaksjonen nok å forlate et countable antall plaketter på tallerkenen. Omvendt med (B) fortynningsfaktoren var for lavt forhold til avkastningen av syntetisk phage, og må justeres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Karakteristikk av celle-fri syntese av phages ΦΧ174 og T7. (A) antall syntetisk ΦΧ174 og T7 phages (PFU/mL: plaque danner enheter per milliliter) målt som en funksjon av PEG 8000 konsentrasjon i celle-fri reaksjonen, etter 16 h med inkubering på 29 ° C. (B) mange syntetisk ΦΧ174 og T7 phages som en funksjon av magnesium-glutamat konsentrasjon i celle-fri reaksjonen, målt etter 16 h med inkubering på 29 ° C. (C) antall syntetisk ΦΧ174 phage som en funksjon av ΦΧ174 DNA genomet konsentrasjon i celle-fri reaksjonen, målt etter 16 h med inkubering på 29 ° C. (D) antall syntetisk T7 phage som en funksjon av T7 DNA genomet konsentrasjon i celle-fri reaksjonen, målt etter 16 h med inkubering på 29 ° C. Alle feilfelt vises er standardavvik av tre gjentatte forsøk. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Table 1
Tabell 1: reaksjon komposisjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Etter teknikken i Chen, et al. 14 for SPMC, et viktig skritt er nådd når riktig betingelsene for superinfection. Parameteren som nærmest styrer en vert belastning evne til å tåle superinfection er ofte den første konsentrasjonen av den infisere phage. Verten cellene må være i logaritmisk vekstfase før første infeksjon med en svært liten mengde phage. Til slutt, phage kommer også logaritmisk vekst og målet er å tillate phage numrene å raskt overgå celletall, slik at flere eksemplarer av phage i hver vert celle. Dette tvinger cellen i en kvasi stabil tilstand hvor det ikke gjennomgå lysis. Hvis denne tilstanden ikke nås, vil cellene gjennomgår gjennomgripende, confluent lyse, og slipp deres viral belastning. Hvis superinfection ikke kan nås med de ovennevnte første viral konsentrasjonene, lavere første mangfoldet av infeksjon med en faktor av ti før et senere forsøk. Hvis verten cellene lyse før innhøsting, og superinfection ikke er nådd, Fortsett umiddelbart med en separat rensing prosedyren. Legge til DNase jeg 5 µg/mL og 500 µL CHCl3 å fullføre alle mobilnettet lysis. Fortsette å virvle for en ekstra 5 minutter og deretter virvel 10.000 x g fjerne mobilnettet rusk. Dekanter og sentrifuge nedbryting på 75 000 x g 1-2 h pellets til phage og resuspend over natten i 1 mL totalt 1 x TM buffer på 4 ° C uten å riste. Når du tester for superinfection ved hjelp av en liten mengde celler, er det mulig å måle hvor nær celler er til lysis av hvor raskt de lyse når utsatt for den ekstra kloroform. Hvis cellene lyse og løsningen tydeliggjør nesten umiddelbart, cellen vegger er svært ustabil og celler skal høstes umiddelbart for å hindre store gjennomgripende lysis. Hvis testen lyses innen 1-3 min, kan de større volumene fortsette å superinfect for opptil 2 h, avhengig av den lokale stammen av E. coli i bruk. Hvis cellene ikke lyse innen 5 min phage vekst har ikke fanget opp til E. coli vekst og primære inkubasjon bør fortsette. Utfør testen igjen i 30-60 minutter.

Når rensende phage på forberedt sukrose gradering, vises i phage som en veldig tykk, pearlescent mellom en tredjedel og to tredjedeler av veien ned røret. Forutsatt en relativt vellykket lyse og mobilnettet rest rensing trinn, kan det være andre, lett band men ingen av lignende tetthet eller størrelse. Store, ugjennomsiktig bandet inneholder phage og skal fjernes fra løsning med sterile sprøyter og sløv kanyle.

Når begynner den tredje delen av protokollen, celle-fri reaksjon og phage titer, er det best å bruke fersk kultur plater (mindre enn en uke gamle) for verten bakterier platen (fra trinn 3,5) samt kultur platene brukes for titer analyse (fra trinn 3,21). Dette vil fremme sterkere vekst av verten bakterier celler og høyere infeksjon effektivitet for phage titer. Phage kultur plater må være pre ruges på 37 ° C i minst 1 time før den phage titer delen av protokollen. Uten pre-inkubering av phage kultur platene, vil ikke topp-agar løsningen (inneholder syntetisk phage og vert cellekultur) homogent distribuere over overflaten på kultur plate. I stedet stivner topp-agar løsningen homogent på overflaten (figur 2b). Dette øker sannsynligheten for flere phages lokalisere på samme sted, som kan forårsake lavt av phage avkastning i celle-fri reaksjonen.

Hver plakk representerer hendelsen av en syntetisk phage infisere en vert celle, replikere i vert cellen og lysing vert cellen. Plaketter vokser i størrelse under inkubasjonstiden fra de avkom phage infisere nabo vert cellene fra hendelsen innledende infeksjon. Hvis ingen plaketter er observert, er det mulig at fortynningsfaktoren i protokollen delen 4.6 er for høy resulterer i en lav sannsynlighet at noen syntetisk phage infiserer en vert celle. For å bøte på dette redusere fortynningsfaktoren av 3-4 størrelsesordener (eller nødvendig), og gjenta titer eksperimentet. Omvendt, fortynningsfaktoren kan være for høy resulterer i plaketter som dekker hele overflaten av kultur plate, noe som gjør det umulig å telle phage avkastningen. I dette tilfellet øke fortynningsfaktoren av 3-4 størrelsesordener (eller nødvendig). For et godt karakterisert phage, avkastningen av celle-fri reaksjonen vil bli kjent og eneste fortynningsfaktoren per reaksjon poeng vil være nødvendig for titer eksperimentet. Når karakterisere en ny phage, er det best å ta 2-3 ulike fortynning faktorer per reaksjon poeng, slik at en av fortynninger vil gi en countable plakett (se Figur 3 for forskjeller mellom en countable og utallige antall plaketter på en plate).

Hvis ingen plakk er observert etter endring fortynningsfaktoren for phage titer, kan dette indikere at celle-fri reaksjonen var mislykket at genuttrykk ikke oppstår. En mulig forklaring på dette kan være strukturell skade av reagenser/phage DNA på grunn av homogenisering av celle-fri reaksjonen av vortexing. For å bøte på dette problemet, gjenta reaksjonen og homogenize trykke forsiktig reaksjon røret fem å syv timene med en finger eller sakte blande reaksjon med en pipette fem å syv timene.

Cellen gratis reaksjonssystemet stammer fra E. coli og inneholder endogenously både E. coli RNA polymerase og den primære sigma faktoren, sigma 70, som sammen danner holoenzyme nødvendig å gjenkjenne viktigste formidler konsensus sekvenser av E. coli gener. I tillegg kan celle-fri reaksjonssystemet recapitulate hele sigma faktor transkripsjon ordningen av exogenously leverer seks andre E. coli sigma faktor gener under promoter konsensus sekvensen av sigma 70. Dette gjør at evnen til å syntetisere alle bacteriophages som genomer er kompatible med E. colitranskripsjon/oversettelse maskiner. Dette går ut en del av bacteriophage som ikke kan studerte eller syntetiserte med celle-fri reaksjonssystemet benyttes her.

Cellen gratis transkripsjon/oversettelse plattformen gir en imponerende grad av kontroll og fleksibilitet av reaksjonen forhold sammenlignet i vivo metoder for studien. Vi kan fininnstille mange biokjemiske og genetiske komponenter av en phage reaksjonen og direkte observere effektene i mindre enn 24 t, som vist i Figur 4 for molekylær trengsel. Effekten av molekylære crowders, som PEG, på det selv-montering av macromolecular komplekser er teoretisk beskrevet og demonstrert i vitro18,19,20. Molekylær crowding er en entropi drevet mekanisme som øker association konstant store biomolecular strukturer. Celle-fri tilnærming kan forskeren å undersøke komplisert biologiske prosesser som biofysikk av selvtillit forsamlingen med modellsystemer, som bacteriophages, uten iboende begrensninger i vivo arbeid.

Denne plattformen kan også undersøke nytten av phages i anvendt. Komponenter av phage genomer kan repurposed og raskt testet i en celle-fri reaksjon system med mål å innlemme resultatene til romanen nanostrukturer. Bacteriophages kan endres for å øke selektivitet av verten celle infeksjon, hvilke ville fremme verktøyet phage terapi som et alternativ for antibiotika-resistente bakterier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære den følgende konkurrerende økonomisk interesse (r): Noireaux laboratorium mottar forskningsmidler fra MYcroarray, en distributør av MYtxtl celle-fri protein uttrykk kit.

Acknowledgements

Dette materialet er basert på arbeid støttes av Office of Naval Research prisen tallet N00014 med filendringsvarsler-13-1-0074 (V.N.), menneskelige Frontier Science programmet gi nummer RGP0037/2015 (til V.N.), og Binational Science Foundation gi 2014400 (til V.N.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ultracentrifugation tubes Beckman Coulter 344057
Conical tubes Falcon 352070
Gradient maker BioComp Gradient Master see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula Monoject 8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips Fischerbrand 02-707-134
Plaque counter New Brunswik Scientific Colony Counter Model C-110
Culture tubes Fischerbrand 14-961-33
Cell-free system Mycroarray Inc Mytxtl
BioComp Gradient Master BioComp Instruments Model 105ME
LB agar plate recipe 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. (2011).
  2. Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. (2011).
  3. Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
  4. Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1, (1), 29-41 (2012).
  5. Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. (2015).
  6. Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
  7. Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, (22), 12672-12677 (2003).
  8. Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3, (6), 387-397 (2014).
  9. Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. (2015).
  10. Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1, (9), 408-413 (2012).
  11. Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. (2016).
  12. Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106, (4), 048104 (2011).
  13. Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7, (3), 638-641 (2007).
  14. Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69, (4), 2119-2125 (1995).
  15. Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
  16. Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. (2010).
  17. Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58, (1), 40-43 (2015).
  18. Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
  19. Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10, (1), 34-39 (2000).
  20. Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics