Integreringsfri avledning av humane inducerte pluripotente stamceller ved bruk av Laminin 521 Matrix

Developmental Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Developmental Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Robust avledning av humant indusert pluripotent stamceller (hiPS) celler ble oppnådd ved å bruke ikke-integrering av Sendai virus (SeV) vektor-mediert omprogrammering av dermale fibroblaster. HiPS-cellevedlikehold og klonal ekspansjon ble utført ved hjelp av xenofri og kjemisk definerte kulturbetingelser med rekombinant human laminin 521 (LN-521) matriks og essensielt E8 (E8) medium.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Uhlin, E., Marin Navarro, A., Rönnholm, H., Day, K., Kele, M., Falk, A. Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix. J. Vis. Exp. (125), e56146, doi:10.3791/56146 (2017).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Xenofrie og fullt definerte forhold er nøkkelparametere for robust og reproducerbar generering av homogene humane induserte pluripotente stamceller (hiPS) celler. Vedlikehold av hiPS-celler på materceller eller udefinerte matriser er utsatt for batchavvik, patogen forurensning og risiko for immunogenicitet. Ved å benytte den definerte rekombinante humane laminin 521 (LN-521) matrisen i kombinasjon med xenofri og definerte mediaformuleringer, reduseres variabiliteten og muliggjør konsistent generering av hiPS-celler. Sendai-viruset (SeV) -vektoren er et ikke-integrasjonsbasert RNA-basert system, og dermed omgå bekymringer forbundet med den potensielle forstyrrende effekten på genomets integritet integrering vektorer kan ha. Videre har disse vektorene vist relativt høy effektivitet ved omprogrammeringen av dermale fibroblaster. I tillegg letter enzymatisk enkelcellepassering av celler homogen vedlikehold av hiPS-celler uten betydelig tidligere erfaring med stamcellerLl kultur. Her beskriver vi en protokoll som er grundig testet og utviklet med fokus på reproduserbarhet og brukervennlighet, og gir en robust og praktisk måte å generere definerte og xenofri humane hiPS-celler fra fibroblaster.

Introduction

Siden den første avledning av hiPS-cellelinjer av Takahashi et al. 1 , 2 , hiPS-celler har gitt et nyttig verktøy for sykdomsmodellering, medikamentfunn og som kildemateriale for generering av celleterapier i regenerativ medisin 3 . HiPS-cellekultur har lenge vært avhengig av samkultur med fibroblastføderceller 4 , 5 eller på Matrigel 6 og med mediaformuleringer inneholdende føtalt bovint serum (FBS). Batch-to-batch-avvik er en vanlig følge av de ubetingede egenskapene til disse kulturbetingelsene, noe som resulterer i uforutsigbare variasjoner, noe som er en viktig bidragsyter til upålitigheten til disse protokollene 7 . Utviklingen av definert medium slik som essensielle 8 (E8) 8 og definerte cellekulturmatriser, for eksempel LN-521 9 , tillaterS for etablering av svært reproduserbare protokoller og hjelpemiddel ved robust generering og vedlikehold av homogene HiPS-celler 7 , 8 , 9 , 10 .

Utvikling av integrasjonsfri omprogrammeringsteknikker har vært et sprang fremover. Opprinnelig var omprogrammering avhengig av retrovirale vektorer som tilfeldigvis integrerte i genomet med forstyrrende effekter på genomisk integritet 11 . Fremskritt i omprogrammeringsmetoder inkluderer utvikling av RNA-baserte vektorer. RNA-vektorer har en fordel i forhold til den DNA-baserte omprogrammeringsmetoden som utilsiktet integrasjon gjennom genomisk rekombination er ikke mulig 12 . SeV-vektorer gir høy og forbigående ekspresjon av eksogene faktorer gjennom enkeltstrenget RNA uten en DNA-fase 11 . De omprogrammerende vektorer levert av SeVBlir fortynnet gjennom celleutvidelse og til slutt skuret fra kultur som gir en fotgjengerfri måte å omprogrammere. Deretter er vedlikehold av pluripoten avhengig av endogen ekspression av pluripoten-genene 2 .

Som banebrytende hiPS-cellebaserte terapier begynner å bevege seg i kliniske studier, er kravene til standardiserte batcher, reproduserbarhet og sikkerhet viktige problemer for å ta opp 13 . Derfor bør produkter av animalsk opprinnelse unngås. For eksempel har bruken av xenogene produkter vært forbundet med risiko for ikke-humant patogenforurensning. Også celler som er dyrket i nærvær av dyreavledede kulturkomponenter, har vist seg å inkorporere ikke-humane silisiumsyrer i cellemembraner som truer med å gjøre avledte celler immunogene 14 . Derfor er behovet for å eliminere xenogene produkter nødvendig for fremtidige kliniske sysler. Denne protokollen gjelder xeIngen fri og definert kultur i vedlikehold av hiPS-celler beveger celler nærmere klinisk overholdelse.

Denne protokollen beskriver en konsekvent, svært reproduserbar og brukervennlig metode som genererer standardiserte hiPS-celler fra fibroblaster. Det tilbyr også et brukervennlig kultursystem for vedlikehold av etablerte hiPS-celler. Denne protokollen har blitt brukt til å utlede mer enn 300 hiPS-cellelinjer i det svenske nasjonale menneskelige iPS Core-anlegget ved Karolinska Institutet, hvorav noen linjer tidligere er beskrevet 15 , 16 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Samlingen av pasientmateriale og avledning av hiPS-celler er godkjent av Etikkvurderingsrådet, Stockholm 28. mars 2012, Registreringsnummer: 2012 / 208-31 / 3. Cellekulturstrinn bør utføres i biosikkerhetskapsler med mindre annet er nevnt. Bruk alltid sterile håndteringsteknikker når du arbeider med celler. La media, plater og reagenser nå romtemperatur før de startes. Inkubér celler ved 37 ° C, 5% CO2 i høy luftfuktighet.

1. Isolering av humane fibroblaster fra dermal biopsi

  1. Preparater av kulturmedium, fordøyelsesenzymer, belegg av retter og dissekeringsverktøy.
    1. Forbered Fibroblast Medium: 44,5 mL Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM), 5 mL Fetal bovint serum (FBS) og 500 μL Penicillin / Streptomycin (PEST) (se tabell 1 ), lagre ved 4 ° C.
    2. Forbered fordøyelsesenzymer ved en arbeidskonsentrasjon på 1 mg / ml: weiGh alikvoter av 4 mg dispase og kollagenase type I pulver i separate 15 ml rør og oppløs i 4 ml DMEM / F12 + 1% PEST. Steriliser den enzymatiske løsningen ved å passere den gjennom en 0,22 μm sil. Forbered fersk enzymløsninger hver gang.
    3. Coat en brønn i en 6-brønn vevskulturplate (eller 35 mm vevskulturskål) per biopsi dissekert med 1 ml 0,1% gelatin i fosfatbuffert saltvann (DPBS). Inkuber ved romtemperatur i 30 minutter.
    4. Autoklaver ett sett med kirurgiske saks og tau per biopsi for disseksjon.
  2. Biopsi håndtering
    MERK: Behandle biopsier så fort som mulig etter at de er tatt. Oppbevares i PBS + 1% PEST i opptil 48 timer ved 4 ° C. Biopsi bør være 2 - 4 mm i diameter i størrelse og i samsvar med etiske tillatelser.
    1. Overfør biopsien til en 35 mm tallerken. Flytt biopsien til en ny 35 mm rett og nedsen biopsien i 2 ml 70% etanol i 30 s.
    2. Flytt biopsien til en tredjedel35 mm rett og vask med 1 ml steril Hank Balanced Salt Solution (HBSS) supplert med 1% PEST.
    3. Overfør biopsien til en fjerde 35 mm rett, tilsett 1 ml nyopparbeidet 0,1% dispasløsning.
    4. Klipp hudbiopsien i 1 - 2 mm 3 stk. I parabolen ved hjelp av kirurgiske saks og tau og deretter overfør biopsi-brikker, inkludert dispase-løsningen, i et 15 ml rør. Legg til ytterligere 2 ml dispase.
    5. Skyll 35 mm fatet med en 1 ml dispase løsning og overfør til 15 ml rør.
    6. Inkubér biopsien ved 4 ° C over natten.
    7. Tilsett 4 ml 0,1% kollagenase I til røret og inkuber ved 37 ° C i 4 timer.
    8. Sentrifuger de fordøyede cellene 300 xg i 3 minutter, aspirer supernatanten og resuspender fordøyelsen i 2 ml fibroblast medium.
    9. Fjern gelatinoppløsningen fra 6-brønn vevskulturplaten. Overfør cellesuspensjonen inkludert eventuelle gjenværende biter til 6-brønners vevskulturplate (eller 35-mM vevskulturfett) precoated med 0,1% gelatin i DPBS.
    10. Bytt medium hver tredje dag.
  3. Utvidelse av humane fibroblaster
    MERK: Fibroblaster er klare til å passere til en T25 (25 cm 2 ) vevskulturflaske når 80% sammenfaller ( figur 2B ). Fibroblaster når vanligvis 80% konfluens innen 7 dager. Det kan imidlertid variere mye tid, men det bør ikke være mer enn 4 uker.
    1. Aspiratmedium og vask en gang med 2,5 ml DPBS.
    2. Fjern DPBS og tilsett 1 mL trypsin-EDTA (0,05%) og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller til celler viser avrundede kanter og begynner å løsne.
    3. Tilsett 2 ml fibroblast medium, hvis nødvendig, skyll cellene som sikrer riktig disassociation av celler. Overfør celleoppløsningen til et 15 ml rør og sentrifuger ved 300 xg i 3 minutter.
    4. Kast supernatanten og resuspender cellepellet i 5 ml fibroblast medium og plate fibroblaster i enPå-belagt cellevevskultur-T25-kolbe. Når du ekspanderer fibroblaster etter dette trinnet, dissocieres som beskrevet ovenfor og frø 12 x 10 3 celler / cm2.
    5. Når konfluente celler er klare til å bli frosset, utvides eller plater for omprogrammering. Frys ned to runder fibroblast før noen omprogrammering er startet (se neste avsnitt for fryseprosedyre). Reprogrammeringseffektivitet er generelt høyere for nedre passasjefibroblaster, celler ved passasje 2-4 er optimale. Imidlertid er vellykket omprogrammering av fibroblaster opp til passasje 10 utført ved anvendelse av denne protokollen.
  4. Frysing og tining av fibroblaster
    1. Klargjør friskt fibroblastfrysemedium: 90% FBS + 10% dimetylsulfoksyd (DMSO). Oppbevares ved 4 ° C ( tabell 1 ). Når det er sammenflyttet, kan T25-vevskulturkolven fryses inn i tre kryokler. Forbered 500 μl fibroblastfrysemedium per flaske frosset.
    2. For å fryse celler, dissocierer cElls som beskrevet i trinn 1.3, teller celler ved bruk av et hemocytometer og overfør deler av 3 x 10 5 celler til 15 ml rør. Spinnrør ved 300 xg i 3 min. Aspirer supernatant.
    3. Resuspender cellepellets i 500 μl 4 ˚C fibroblast frysemedium og overfør til cryovials. Plasser hetteglassene i en frysebeholder og inkuber celler ved -80 ° C i 24 timer før de overføres til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
    4. For å tine cellene, senk bunndelen av cryovialet i 37 ° C vann. Når fortynnet, overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og tilsett 5 ml fibroblastmedium. Spinceller 300 xg i 3 min.
    5. Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i 5 ml fibroblast medium. Overfør celler til en ikke-belagt T25 vævskulturflaske og inkuber i 37 ° C.

2. SeV Vector Reprogramming of Fibroblasts

  1. Fremstilling av vektormalikvoter FORSIKTIG: Håndter seV under biosikkerhetsnivå 2 inneslutning. Se produsentens protokoll og lokale retningslinjer 17 . Virustiter varierer mellom batchene.
    1. Før du utarbeider alikvoter, beregne mengden vektor som trengs for 5 x 10 4 celler i henhold til produsentens protokoll ( f.eks . CytoTune 2.0). Virustiter varierer generelt fra 8 x 10 7 - 1,5 x 10 8 . Tine og kombinere vektorer 5: 5: 3 (KOS MOI = 5, hc-myc MOI = 5 og hKlf4 = MOI 3). Del mengden beregnet for omprogrammeringen av 5 x 10 4 celler i autoklaverte 1,5 ml rør. Fortynn virus-alikvoter med fibroblastmedium til et sluttvolum på 250 pl for omprogrammering.
      MERK: Hvert hetteglass gjelder for omprogrammering av en brønn i en 24-brønners vevskulturplate med 5 x 10 4 fibroblaster. Oppbevar virus-alikvoter ved -80 ° C.
  2. SeV Vector transduksjon
    1. Aspiratcelle cuMedium og vask med 1 ml DPBS. Aspirer DPBS og tilsett 1 ml Trypsin-EDTA (0,05%). Inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller til celler løsnes.
    2. Tilsett 2 ml fibroblast medium og resuspender cellene og overfør til et 15 ml rør. Sentrifuger 300 xg i 3 minutter.
    3. Aspirer supernatanten og resuspender pelleten i 2 ml fibroblast medium.
    4. Telle fibroblaster ved å bruke en hemocytometer og frø 5 x 10 4 celler i en brønn i en 24-brønd vevskulturplate. Inkubér celler ved 37 ° C over natten.
    5. Aspiratcellekulturmedium, tilsett 250 μl av SeV-løsningen og inkuber ved 37 ° C over natten.
    6. Bytt medium daglig til frisk fibroblast medium. Tillat transduserte celler å vokse i 7 dager før de blir passert til LN-521 belagte plater. Forbered LN-521-plater dagen før passasjen. Se 2.3.1 for beleggingsprosedyr.
  3. Replatering av transduserte fibroblaster
    1. Fremstilling av LN-521 belagte retter: Fortynn LN-521 i DPBS til en sluttkonsentrasjon på 0,63 μg / cm2. Pipett 2 ml av LN-521-oppløsningen per 60 mm vevskulturskål. Tetning 60-mm vevskulturretten ved bruk av parafilm. Inkuber over natten ved 4 ° C.
    2. Forbered essensielle 8 medium (E8) alikvoter for lettere håndtering: 48,5 ml E8-medium, 1 ml E8-supplement og 500 μL PEST ( Tabell 1 ).
    3. 7 dager etter transduksjon, passerer cellene til en LN-521-belagt 60 mm vevskulturskål. Tilsett 250 μL Trypsin-EDTA (0,05%) og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter eller til celler har løsrevet. Tilsett 2 ml fibroblast medium og sentrifugerceller i 3 minutter ved 300 x g.
    4. Aspirer supernatanten. Resuspender pelleten i 2 ml fibroblast medium og teller celler i et hemocytometer. Aspirer LN-521-oppløsning fra den precoated platen og frø 4 x 10 4 celler i 5 ml fibroblast medium i LN-521 precoated 60 mm parabolen. Legg til Rho-kinaseinhibitor Y-27632(ROCKi) til en endelig konsentrasjon på 5 μM. Inkuber i 37 ° C over natten.
    5. Viktig, neste dag, bytt medium til E8 medium. Bytt E8 medium daglig. HiPS-cellekolonier vil dukke opp innen 2 - 3 uker.

3. Plukking av kolonier og utvidelse av hiPS-celler

MERK: Følgende trinn utføres utenfor biosikkerhetsskapet under et stereomikroskop. Bruk av hårnettet og prosedyremasker anbefales. Arbeid forsiktig så du ikke forurenser cellekulturen.

  1. Forbered LN-521-belagte vevskultur 24-brønnsplater dagen før du plukker. Fortynn LN-521 i DPBS 0,63 μg / cm2. Pipetter 250 μL av LN-521-oppløsningen i en brønn i en 24-brønn vevskulturplate. Tetningsplater ved bruk av parafilm. Inkuber over natten ved 4 ° C.
    MERK: Kolonier er klare til å bli plukket når de når en størrelse> 1 mm i diameter. Kolonier skal vise skarpe kanter og vokse i homogen monOlayere ( figur 2D ).
  2. Aspirer LN-521-oppløsningen og tilsett 500 μl E8 i en brønn i en 24-brønn vevskulturplate.
  3. Klipp kolonier i mindre stykker med en skalpell i et rutenett som mønster under et stereomikroskop. Skrape cellelagene mekanisk fra parabolen og overfør arkene med en 200 μL pipette til den forberedte brønnen ( Figur 2D -2E ). Velg kolonier i separate brønner.
  4. Tillat at celler festes uten å bytte medium i 48 timer. Deretter endrer E8 medium daglig.
  5. Når koloniene har nådd en størrelse på> 5 mm, passerer enzymatisk celler som enkeltceller til en ny brønn på en LN-521-belagt plate.
  6. Aspirere cellekulturmediet fra celler og vask med 250 μl DPBS.
  7. Aspirat DPBS. Tilsett 250 μl dissocieringsreagens og inkuber i 3 minutter ved 37 ° C.
  8. Vær oppmerksom på at cellene har begynt å runde opp. LøsneCeller fra platen ved å skylle cellene med dissocieringsreagens noen få ganger.
  9. Tilsett 500 μl E8 medium til et 15 ml rør. Overfør cellene i dissocieringsreagenset til røret og sentrifuger i 3 minutter ved 300 x g.
  10. Aspirer LN-521-oppløsningen fra LN-521 precoated brønn og tilsett 500 μL romtemperatur E8 medium.
  11. Aspirer supernatanten og resuspender cellepellet i 500 μl E8-medium.
  12. Telle cellene ved hjelp av et hemocytometer og frø 2,5 x 10 4 - 5 x 10 4 celler i den forberedte LN-521 precoated brønnen (1,25 x 104-4,5 x 104 celler / cm2). Cellkulturformat kan enkelt oppskaleres for å passe til det tiltenkte formål.
  13. Legg til ROCKi til en endelig konsentrasjon på 10 μM. Inkuber celler ved 37 ° C.
  14. Bytt E8 medium daglig. Celler er vanligvis klare til å passere etter 4 - 6 dager. Enzymatisk passerer celler som enkeltceller som beskrevet ovenfor når det er omtrent 90% sammenflyttende.
    MERK: Reprogrammeringsvektorer blir fortynnet under hiPS-cellekspansjon og kan ikke påvises etter passasje 12. Celler som er upartisk omprogrammert, slutter å sprede seg rundt passasje 6 - 10 eller miste sin karakteristiske pluripotente stamcellemorfologi ( figur 3B ).
  15. Frysing og opptining av hiPS-celler
    1. For å fryse celler, dissocierer enzymatisk celler som enkle celler som beskrevet ovenfor, teller celler i et hemocytometer og overfører 2,5 x 10 5 celler til et 15 ml rør som inneholder 1 ml E8 medium. Sentrifuger ved 300 xg i 3 min. Aspirer supernatanten.
    2. Resuspender cellepelleten i 250 μl 4 ° C PSC-kryomedium og overfør til en cryovial. Plasser hetteglasset i en frysebeholder og inkuber celler ved -80 ° C i 24 timer før de overføres til flytende nitrogen for langtidsoppbevaring.
    3. For å tine celler, lag en precoated LN-521 brønn i en 24-brønn vevskulturPlate ved å aspirere LN-521-løsningen og tilsette 250 μl E8-medium. Senk bunnen av kryogen i 37 ° C vann til bare en liten isbit forblir.
    4. Tilsett 250 μl E8 Medium til cryovialet og overfør cellesuspensjonen til et 15 ml rør og tilsett 1 ml E8-medium. Spinceller 300 xg i 3 min.
    5. Fjern supernatanten og resuspender cellepellet i 250 μL romtemperatur E8 medium. Overfør cellesuspensjonen til den preparerte brønnen og tilsett 1% cellelevbarhetstillegg eller 10 μM ROCKi. Inkuber vevskulturplaten ved 37 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fra biopsi til hiPS-celler

Hele prosessen fra biopsi til etablerte hiPS-celler, fjernet fra omprogrammeringsvektor og klar for karakterisering, tar omtrent 16 uker ( figur 1 ). En mer detaljert tidslinje er spesifisert i figur 2A . Ca 4 uker er nødvendig for å etablere og utvide fibroblastkulturer. De første hiPS-cellekoloniene begynte å dukke opp om tre uker etter Sendai-vektortransduksjon. Kolonier ble plukket mekanisk for første passasje og passerte deretter enzymatisk som enkeltceller.

Etablering av humane fibroblast kulturer

Når menneskelige fibroblastkulturer hadde vokst til konfluens og vist akseptert morfologi, ble de først utvidet og frosset for to passagerEs før de blir plettet for transduksjon ( figur 2B ).

Reprogrammering av humane fibroblaster ved bruk av SeV-vektorer

Økt nivå av celledød ble funnet i dagene etter seV-transduksjonen, og små endringer i fibroblastmorfologi ble observert. Fremveksten av de første hiPS koloniene ble detektert fra dag 12 etter transduksjonen ( figur 2A , 2C ). Kolonier som var klare til å bli plukket, ble forventet om tre til 4 uker etter transduksjon ( figur 2A , 2D ). Seedceller i mengdene som er angitt i denne protokollen resulterte i en overflod av kolonier som kommer opp (<20). Selektiv plukking av kolonier som viser gunstig morfologi anbefales. Kolonien har foretrukket inkluderte flattede kompakte celler, vekst som homogene monolag, særpreget indi Viduelle celler med skarp kant mot omkringliggende fibroblaster ( figur 2D ). HiPS-cellekoloniene ble kuttet i et gitterlignende mønster ved bruk av en skalpell og mekanisk passasje ( Figur 2E ). Plukket hiPS-kloner ble igjen i 48 timer for å feste platen uten medium forandring. HiPS-cellekloner var svært homogene, men få fibroblaster som stammer fra omprogrammeringsplaten ble tolerert under de to første passasjer ( figur 2F ). Plukking av kolonier med masete grenser og stor ukompakt heterogen cellemasse bør unngås ( figur 2G ). Oppnådde hiPS-cellelinjer vokste som tette monolag, med stort kjerne-til-cytoplasmforhold og hadde definert lysende grenser. I motsetning hevdet ikke-homogene kolonier som ikke oppfyller disse kriteriene ble kassert ( Figur 2H ) for å unngå kulturer av blandede cellepopulasjoner.

P "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Validering av hiPS-cellekloner

Pluripotens karakterisering av avledede celler ble utført etter at SeV-vektoren var tapt, og vedlikeholdet av pluripotent tilstand ble drevet av uttrykket av endogene faktorer. Før du fortsetter med hiPS-cellevalidering, må du sørge for at SeV-vektoruttrykket har gått tapt. Etter denne protokollen er ikke SeV-vektor-RNA lenger påvist ved passasje 12 ifølge vår erfaring, og dermed et egnet utgangspunkt for karakterisering ( Figur 3A ). Immunocytokjemisk farging for pluripotensmarkører OCT4, SSEA4 og NANOG bør gi et homogent positivt resultat ( figur 3B ). Cellekulturer som inneholder delvis omprogrammerte celler som ikke uttrykte pluripotencyfaktorer, ble kassert ( figur 3C ). MRNA ekspresjon av endogene pluripotency gener er vist av sanntid-PC R (RT-PCR) i figur 3D .

Pluripotente stamceller bør lett kunne skille seg inn i de tre kimlagene. HiPS-celledifferensieringspotensialet ble vurdert ved dannelse av embryoidlegemer (EB) 18 . Frie flytende EB'er generert fra hiPS-celler er vist i figur 3E og mRNA-ekspresjon av kimlags-spesifikke markører etter 21 dager med EB-differensiering er representert i figur 3F .

Figur 1
Figur 1: Flytdiagram fra hudbiopsi til hiPS-celler.
Oversikt over de viktigste trinnene i protokollen. Illustrasjonen inkluderer biopsiinnsamling, isolering av fibroblaster, SeV-transduksjon, plukning av kolonier og klonal ekspansjon av hiPS-celler.E.jove.com/files/ftp_upload/56146/56146fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2: Kritiske trinn i genereringen av hiPS-celler.
(A)
Tidslinje markerer viktige tidspunkter i protokollen, inkludert fibroblastplating, SeV-transduksjon, medium endringer og belegg. Passasje 12 av hiPS-celler er uthevet som starten på karakteriseringseksperimenter. (B) Lysfelt bilde av konfluente fibroblaster i kultur med typisk morfologi. (C) Fremvekst av hiPS-cellekolonier fra transduserte fibroblaster. (D) Klar til å velge koloni som viser fortrinnsegenskaper, flat komprimert cellemasse, skillebare individuelle celler med skarpe kanter mot omkringliggende fibroblaster (Passage 0). (E) hiPSCellekolonier kuttes i et gitterlignende mønster og passerer mekanisk . (F) Adhered koloni etter noen få dager med vekst. De adhertede hiPS-cellene er omgitt av et uvanlig høyt antall fibroblaster som stammer fra omprogrammeringsplaten. Fibroblaster kan skrapes av platen og vil mest sannsynlig forsvinne med etterfølgende enkeltceller-passasjer (passasje 1). (G) Kolonier som viser morfologi, og som ikke minner om fullt omprogrammerte celler; Masete grenser, stor ukompakt heterogen cellemasse. (H) Bright feltbilde som eksemplifiserer en tidlig, homogen, fullstendig omprogrammert hiPS-cellelinje sammenlignet med en svært heterogen cellelinje. Skalestenger angir 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3 Figur 3: Karakterisering av hiPS-celler.
(A)
RT-PCR av SeV vektorspesifikke markører. HiPS-celler ved passasje 3 blir brukt som positiv kontroll for omprogrammeringsvektorene. Ved passasje 12 er celler negative for ekspresjon av virusspesifikke markører Sendai-spesifikk ryggrad (SeV B), Sendai-spesifikk KLF4 (KLF4 SeV), Sendai-spesifikk cMYC (cMYC SeV), PCR-kontroll (GAPDH) og ingen mal (-). (B) Representativt eksempel på fullt omprogrammert homogen hiPS-cellelinje ved passasje 12. Lysbildet av hiPS-celler viser at celler vokser i tette monolag med skarpe luminescerende kanter og med store kjerner og liten cytoplasma. Immunocytokjemisk farging av pluripotensmarkører OCT4, NANOG, SSEA4 og nukleær farging 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) som demonstrerer homogen positiv ekspresjon. (C) Cellelinje som utviser heterogen ekspression for pluripotensmarkør NANOG. KulturenE inneholder delvis omprogrammerte celler og bør kasseres. (D) RT-PCR av mRNA-ekspresjon av pluripotensmarkører NANOG, OCT4, PCR-kontroll (GAPDH) og ingen mal (-) som indikerer ekspresjonen av pluripotensmarkører. (E) Frie flytende embryoidlegemer dannet fra hiPS-celler. (F) RT-PCR etter 21 dager med embryoid kroppsdifferensiering viser at avledede hiPS-celler er i stand til å differensiere til de tre bakterie lagene. Endodermale markører AFP og GATA4, mesodermale markører RUNX og HAND1, ektodermale markører NCAM og NESTIN, PCR-kontroll (GAPDH) og ingen mal (-). Skalestenger angir 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det forventede resultatet av denne protokollen er den vellykkede generasjonen av flere klonalt avledede hiPS-cellelinjer. Viktig er fremgangsmåten for vedlikehold og utvidelse av etablerte hiPS-celler som er beskrevet her, pålitelig og kan utføres med liten tidligere erfaring med stamcellekultur. Enzymatisk enkelcellepassasje med ROCKi sammen med LN-521-matrisen er kjent for å opprettholde celler som karyotypisk normal, pluripotent og lett i stand til å differensiere samtidig som indukt heterogenitet at kolonibasert passasje kan stimulere 10 , 19 , 20 . HiPS-celler kultivert på LN-521 kan passeres som enkeltceller uten tillegg av ROCKi 10 , men tillegget av ROCKi gjør protokollen enklere for mindre erfarne handlere og reduserer tiden som kreves for hiPS-celle-avledning.

Programmeringseffektivitet er geNesten ikke et problem med denne protokollen; SeV-vektorer har relativt høy reprogrammeringseffektivitet> 1% for fibroblaster 11 . Fremveksten av en overflod av kolonier (<20) forventes. Det anbefales å velge tre ganger antall kolonier som trengs. Det har blitt observert at en del av plukket kloner ikke klamper etter plukkingen. Ekstra kolonier kan også være nødvendig for å kompensere for delvis omprogrammerte kolonier. Delvis omprogrammerte kolonier er i noen tilfeller i stand til å adhere og vokse støttet av eksogent uttrykk av pluripoten-segener av SeV-vektorene. Etter hvert som SeV-vektorer er fortynnet, vil disse cellene slutte å proliferere og dissociere, vanligvis tilsynelatende rundt passasje 6-8. Heterogeniteten til kulturen er også et tegn på delvis omprogrammering og heterogene linjer bør kasseres ( figur 2H ).

Det optimale valget av reprogrammeringsvektorer og kulturbetingelser er avhengig avFormålet med cellene som genereres. For å unngå batch-to-batch-avvik som påvirker resultatene, anbefales det imidlertid å definere bestemte forhold. Valget av et ikke-integrerende vektorsystem foreslås for å bevare genomisk integritet av omprogrammerte celler. SeV-vektorer ble valgt i denne protokollen på grunn av robustheten, relativt høy effektivitet og lave hender på tid som kreves. SeV-vektorene fortynnes under celledelingene og er ikke detekterbare rundt passasje 12, og sikrer således at genererte data ikke påvirkes av eksogent uttrykk. På grunn av de grundige krav som er satt på celler beregnet for kliniske formål, kan SeV reprogrammering være en barriere for klinisk oversettelse siden det er vanskelig å bevise at fullstendig avstengning av alt vektormateriale er vanskelig. MRNA-mediert omprogrammering kan være fordelaktig ved å utlede celler med tilsiktet bruk i celleterapier 12 . Disse metodene er imidlertid langt mer arbeidsintensive og mer kompliserte å bruke 21 . Metoden her deSkrevet for fibroblastkultur er også uegnet for kliniske anvendelser. Siden både FBS og gelatin er xenogene og udefinerte, bør du vurdere å bytte disse til definerte xenofri produkter 22 .

Steril håndteringsteknikker og vanlig mykoplasmainfeksjonstest anbefales mens du arbeider med noen form for cellekultur. Menneskeskinn inneholder mange mikroorganismer som kan trives under de forholdene cellene dyrkes i hvis de ikke håndteres riktig. Det anbefales derfor å være ekstra årvåken i håndteringen av hudbiopsier og i de første dagene av kulturen etter biopsibehandling. Etablering av fibroblastkultur fra hudbiopsier er faktisk en tidkrevende prosess. Etter behandling av hudbiopsi vil det i begynnelsen være svake tegn på fibroblastceller vedhæftende. Vent derfor minst en uke for å finne noen fibroblastceller som viser forventet morfologi i kulturen. Tiden som trengs for etableringen av fibroblasterIn vitro kulturer fra biopsier er avhengig av en rekke faktorer, inkludert størrelsen på biopsi, donorens alder og hvordan biopsien har blitt håndtert siden den ble tatt. Det er foretrukket å omprogrammere tidlige passasjefibroblaster for optimal omprogrammeringseffektivitet 23 .

Sammendrag beskriver vi her en fast, robust og brukervennlig metode for generering av høyt homogene hiPS-celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter for å rapportere.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av SSF (B13-0074) og VINNOVA (2016-04134) finansieringsagenter.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dispase Life Technologies 171105-041 Biopsy digestion
Collagenase Sigma C0130 Biopsy digestion
Gelatin Sigma G1393 Fibroblast matrix
IMDM Life Technologies 21980002-032 Fibroblast medium
FBS Invitrogen 10270106 Fibroblast medium
Penicillin/Streptomycin Life Technologies 15070-063 Antibiotic
Essential 8 media ThermFisher Scientific A1517001 iPS cell culture media
LN-521 Biolamina LN521-03 iPS cell culture matrix
TrypLE select 1X ThermoFisher Scientific 12563011 Dissociation reagent
Rho-kinase inhibitor Y27632 Millipore SCM075 Rho-kinase inhibitor (ROCKi)
CytoTune – iPS 2.0 reprogramming kit Life Technologies A1377801 Sendai virus reprogramming vector
35 mm tissue culture dish Sarstedt 83.3900.300 Cell culture
60 mm tissue culture dishes Sarstedt 83.3901.300 Cell culture
24 well tissue culture plates Sarstedt 83.3922.300 Cell culture
T25 tissue culture flasks VWR 734-2311 Cell culture
15 mL tubes Corning 430791 Centrifuge tubes
1.5 mL tube Eppendorf 0030123.301 1.5 mL tube
CoolCell cell LX Biocision BCS-405 Freezing container
DMSO Sigma D2650-100ml Fibroblast freezing
Cryovials 1.8 mL VWR 479-6847 Cryovials
PSC Cryopreservation Kit Gibco A2644601 PSC CryomediumRevitaCell supplement
Trypsin-EDTA (0.05%) ThermoFisherScientific 25300054 Fibroblast dissociation enzyme
DMEM/F12 Life Technologies 31331-028 Digestive enzymes dilutant
DPBS Life Technologies 14190-094 PBS
HBSS ThermoFIsher Scientific 14025-050 Biopsy preparation
Haemocytometer Sigma BRAND, 718920 Cell counting
Parafilm VWR 291-1213 Sealing plates for storage

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, (5), 861-872 (2007).
  2. Jin, Z. B., Okamoto, S., Xiang, P., Takahashi, M. Integration-free induced pluripotent stem cells derived from retinitis pigmentosa patient for disease modeling. Stem Cells Transl Med. 1, (6), 503-509 (2012).
  3. Zhou, H., Ding, S. Evolution of induced pluripotent stem cell technology. Curr Opin Hematol. 17, (4), 276-280 (2010).
  4. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, (5391), 1145-1147 (1998).
  5. Hovatta, O., et al. A culture system using human foreskin fibroblasts as feeder cells allows production of human embryonic stem cells. Hum Reprod. 18, (7), 1404-1409 (2003).
  6. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nat Methods. 3, (8), 637-646 (2006).
  7. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotech. 28, (6), 611-615 (2010).
  8. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Meth. 8, (5), 424-429 (2011).
  9. Rodin, S., Antonsson, L., Hovatta, O., Tryggvason, K. Monolayer culturing and cloning of human pluripotent stem cells on laminin-521-based matrices under xeno-free and chemically defined conditions. Nat Protoc. 9, (10), 2354-2368 (2014).
  10. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195 (2014).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85, (8), 348-362 (2009).
  12. Warren, L., et al. Highly Efficient Reprogramming to Pluripotency and Directed Differentiation of Human Cells with Synthetic Modified mRNA. Cell Stem Cell. 7, (5), 618-630 (2010).
  13. Unger, C., Skottman, H., Blomberg, P., Dilber, M. S., Hovatta, O. Good manufacturing practice and clinical-grade human embryonic stem cell lines. Hum Mol Genet. 17, (R1), R48-R53 (2008).
  14. Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., Varki, A. Human embryonic stem cells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat Med. 11, (2), 228-232 (2005).
  15. Kele, M., et al. Generation of human iPS cell line CTL07-II from human fibroblasts, under defined and xeno-free conditions. Stem Cell Research. 17, (3), 474-478 (2016).
  16. Uhlin, E., et al. Derivation of human iPS cell lines from monozygotic twins in defined and xeno free conditions. Stem Cell Research. 18, 22-25 (2017).
  17. Center for Disease Control and Prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 5th ed, U.S. Department of Health and Human Services. Available from: https://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/bmbl.pdf (2009).
  18. Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6, (2), 88-95 (2000).
  19. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14, (1), 13-26 (2014).
  20. Jacobs, K., et al. Higher-Density Culture in Human Embryonic Stem Cells Results in DNA Damage and Genome Instability. Stem Cell Reports. 6, (3), 330-341 (2016).
  21. Schlaeger, T. M., et al. A comparison of non-integrating reprogramming methods. Nat Biotech. 33, (1), 58-63 (2015).
  22. Nichole Wetton, C. C., Zarrabi MacArthur, A. ryan, Lakshmipathy, U. ma Ideal Xeno-Free Culture Conditions For Human Fibroblasts That Facilitate Efficient Reprogramming. Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/posters/xeno-free-culture-conditions-fibroblasts-poster.pdf (2016).
  23. Trokovic, R., Weltner, J., Noisa, P., Raivio, T., Otonkoski, T. Combined negative effect of donor age and time in culture on the reprogramming efficiency into induced pluripotent stem cells. Stem Cell Res. 15, (1), 254-262 (2015).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics